Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC jjSPKVL9zLdpwm9MXrKwpgS S0066-782X2023000400301 00301 10.36660/abc.20220169 Artigo Original Superexpressão Gênica PTEN em Tecidos Miocárdicos de Pacientes de Cirurgia de Revascularização Miocárdica 0000-0002-1347-0939 Tahtasakal Reyhan 1 2 Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito 0000-0002-5644-5442 Sener Elif Funda 1 2 Concepção e desenho da pesquisa e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante Obtenção de dados Obtenção de financiamento Redação do manuscrito 0000-0002-8879-1112 Delibasi Nesrin 2 Obtenção de dados 0000-0002-0711-4014 Hamurcu Zuhal 1 2 Obtenção de dados Redação do manuscrito 0000-0002-4597-6811 Mehmetbeyoglu Ecmel 2 Análise e interpretação dos dados 0000-0002-1228-1298 Bayram Keziban Korkmaz 3 Obtenção de dados 0000-0001-6438-8153 Gunes Isin 4 Redação do manuscrito 0000-0002-2752-7668 Goksuluk Dincer 5 Análise estatística 0000-0003-2980-8364 Emirogullari Omer Naci 6 Concepção e desenho da pesquisa e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito Erciyes University Medical Faculty Department of Medical Biology Kayseri Turquia Erciyes University Medical Faculty Department of Medical Biology, Kayseri – Turquia Erciyes University Genome and Stem Cell Center Kayseri Turquia Erciyes University Genome and Stem Cell Center, Kayseri – Turquia Ankara Yildirim Beyazit University Medical Faculty Department of Medical Genetics Ankara Turquia Ankara Yildirim Beyazit University Medical Faculty Department of Medical Genetics, Ankara – Turquia Erciyes University Medical Faculty Department of Anesthesiology and Reanimation Kayseri Turquia Erciyes University Medical Faculty Department of Anesthesiology and Reanimation, Kayseri – Turquia Erciyes University Medical Faculty Department of Department of Biostatistics and Medical Informatics Kayseri Turquia Erciyes University Medical Faculty Department of Department of Biostatistics and Medical Informatics, Kayseri – Turquia Erciyes University Medical Faculty Department of Cardiovascular Surgery Kayseri Turquia Erciyes University Medical Faculty Department of Cardiovascular Surgery, Kayseri – Turquia Correspondência: Elif Funda Sener • Erciyes University – Erciyes University Medical Faculty Departmen of Medical Biology – Erciyes University Medical Faculty Departmen of Medical Biology Talas 38280 – Turquia. E-mail: efefunda@yahoo.com

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo

 07 04 2023 2023 120 4 e20220169 10 03 2022 07 12 2022 14 12 2022 This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License Resumo Fundamento:

A doença arterial coronariana é um distúrbio complexo que causa morte em todo o mundo. Um dos genes envolvidos no desenvolvimento dessa doença pode ser o PTEN.

 Objetivos:

Nosso objetivo foi investigar a expressão gênica e proteica do PTEN em amostras de tecido e sangue retiradas de pacientes submetidos à cirurgia de revascularização miocárdica.

 Métodos:

Foram realizados estudos moleculares no Centro de estudos do genoma humano e células-tronco da Universidade Erciyes (GENKOK). Amostras do apêndice atrial direito e de sangue foram coletadas da veia central de 22 pacientes submetidos à cirurgia de revascularização miocárdica antes de iniciar e terminar a circulação extracorpórea. A expressão do PTEN foi determinada usando PCR quantitativo em tempo real e análise de Western Blot. O nível de significância aceito foi de p<0,05.

 Resultados:

Não houve diferença significativa na expressão gênica do PTEN em amostras de sangue coletadas antes e depois da circulação extracorpórea. Entretanto, foi observado um aumento substancial nos níveis de expressão gênica e proteica de P-PTEN e PTEN nas amostras de tecido. A expressão gênica miocárdica PTEN aumentou significativamente ao final da circulação extracorpórea. A expressão gênica do PTEN no período pós-circulação extracorpórea aumentou em comparação com o período pré-circulação extracorpórea, mas não foi um aumento significativo em comparação com sujeitos saudáveis do grupo de controle.

 Conclusão:

Este estudo revelou pela primeira vez o papel do gene PTEN analisando a expressão de mRNA e de proteína em pacientes com revascularização miocárdica, que se manifesta tanto em tecido miocárdico quanto em amostras de sangue. O aumento dos níveis de PTEN pode ser um marcador no tecido miocárdico para pacientes com doença arterial coronariana.

 Palavras-chave: Revascularização Miocárdica Miocárdio Expressão Gênica PTEN Fundo de Pesquisa da Erciyes University TYL-2017-7188 O presente estudo foi financiado pelo Fundo de Pesquisa da Erciyes University (Número do Projeto: TYL-2017-7188) Resultados de expressão gênica e Western Blot de pacientes com DAC. Imagens de membrana dos níveis de proteína PTEN e P-PTEN determinados por anticorpos específicos em tecidos miocárdicos de pacientes do sexo feminino/masculino (A). Achados de expressão proteica de PTEN e P-PTEN em tecido miocárdico retirado de pacientes antes e após a cirurgia. A β-actina foi usada como controle de carregamento (B). A expressão gênica do PTEN foi determinada por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) em tecidos miocárdicos retirados de pacientes em 2 momentos diferentes (C). A expressão gênica do PTEN foi determinada por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) em amostras de sangue colhidas de pacientes em 2 momentos diferentes e em amostras de sangue de controle (D). Comparações: P-PTEN AC vs. P-PTEN DC, PTEN AC vs. PTEN DC, e PTEN-T1 vs. PTEN-T2 (em amostras de sangue e tecido separadamente) via teste Wilcoxon Signed Rand; PTEN-T1 vs. Controle e PTEN-T2 vs. Controle via teste U de Mann-Whitney (*p<0,05, **p<0,001). (T1: antes da circulação extracorpórea, T2: depois da circulação extracorpórea). Introdução

Uma das causas mais comuns de morte em homens e mulheres em todo o mundo são as doenças cardiovasculares,1 e uma das mais importantes é a doença arterial coronariana (DAC), que é afetada por muitos fatores.2 Fatores genéticos, bem como fatores ambientais, desempenham um papel essencial nas DAC.3 O mecanismo genético subjacente não é totalmente compreendido, mas estima-se que a herança possa ter uma efetividade de 40 a 60% na doença arterial coronariana. Estudos de associação genômica ampla (GWAS) revelaram que mais de 30 genes foram associados às DAC.4,5

A fosfatase homóloga à tensina (o PTEN) está localizada no cromossomo 10. Ele regula negativamente os níveis intracelulares de fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato nas células e atua como um supressor tumoral ao regular negativamente a via de sinalização AKT/PKB.6,7 O PTEN participa da via de progressão do ciclo celular, transdução de sinal, apoptose, reparo do DNA, crescimento e metabolismo. Ele também está associado à aterosclerose.8 O PTEN também pode desempenhar um papel no desenvolvimento e formação das DAC. A via PI3K/Akt protege o miocárdio em todas as espécies, especialmente contra danos de isquemia-reperfusão.9 A inativação do PTEN ativa a via PI3K/Akt, diminui a área de infarto, inibe a apoptose e aumenta a sobrevida. Ela também melhora o dano cardíaco pós-isquemia-reperfusão.10 Além disso, a inativação do PTEN cardioespecífico protege contra a fibrose miocárdica e a insuficiência cardíaca em um modelo de rato hipertenso.11 O PTEN é importante nas doenças cardíacas isquêmicas associadas a diabetes e obesidade.12 Portanto, garantir a inativação do PTEN também pode levar ao aumento da sobrevida miocárdica após um episódio isquêmico.13 A diminuição do nível de PTEN está associada à hipertrofia e à remodelação do tecido cardíaco.14 Além disso, demonstrou-se que o PTEN desempenha um papel na regulação do tamanho e da contração dos cardiomiócitos.15 Ressalta-se que o PTEN é extremamente importante na regulação do equilíbrio entre a morte e a sobrevida dos cardiomiócitos.16 Entretanto, a ausência prolongada de PTEN do miocárdio está associada à hipertrofia miocárdica.15

Portanto, este estudo enfocou as alterações na expressão de PTEN em amostras do tecido miocárdico e de sangue coletadas de pacientes submetidos à cirurgia de revascularização miocárdica durante e após a cirurgia. Para enfatizar a importância do gene PTEN no prognóstico das DAC, utilizamos amostras de sangue e de miocárdio em momentos diferentes da cirurgia.

 Métodos Seleção de pacientes e de grupo de controle

O conselho institucional de ética humana da Universidade Erciyes aprovou este estudo (2016/577; 08.11.2016). Foram incluídos no estudo vinte e dois pacientes com DAC tratados no Departamento de Cirurgia Cardiovascular da Universidade de Erciyes entre 2016 e 2017 (Figura 1). O grupo de pacientes era composto de 5 mulheres e 17 homens (faixas etárias de 39 a 81 anos). Apenas pacientes com angina estável foram incluídos no estudo. Também inscrevemos 22 sujeitos saudáveis do grupo de controle para comparar os níveis sanguíneos da expressão gênica do PTEN. O grupo de controle foi formado por 5 mulheres e 17 homens saudáveis (faixas etárias de 26 a 69 anos). Idade e sexo foram pareados com o grupo de estudo. Os participantes deram consentimento informado por escrito para este estudo.

Grupo de controle, critérios do paciente e desenho do estudo. CEC: circulação extracorpórea. RNA: ácido ribonucleico; PCR: Reação em Cadeia da Polimerase Protocolo de anestesia

O mesmo protocolo de anestesia foi aplicado a todos os pacientes. Os pacientes que foram levados para a sala de cirurgia foram monitorados por ECG de 5 canais, oximetria de pulso, pressão arterial não invasiva, oximetria cerebral e entropia. Após injeção de 1,5 mg de midazolam e 50 microgramas de fentanila, um cateter arterial invasivo foi colocado na artéria radial e foi realizada uma medição invasiva da pressão arterial. Após a pré-oxigenação, foram administrados 1 mg/kg de propofol, 10 microgramas/kg de fentanila e 1 mg/kg de rocurônio na indução. Em seguida, pacientes com bons valores de entropia foram intubados. Foi inserido um cateter venoso central guiado por ultrassom. Foi realizada uma infusão de ácido tranexâmico na dose de 15 mg/kg em 1 hora, e mantida a partir de 1,5 mg/kg/h durante todo o caso. Foram usadas 10 microgramas/kg/h de fentanil, 4 mg/kg/h de propofol e 1 mg/kg/h de rocurônio no controle da anestesia. A profundidade da anestesia foi ajustada entre 45 e 60 entropias. Se necessário, o desflurano foi usado como agente inalatório. As configurações do ventilador foram TV 6 ml/kg, frequência respiratória, 12/min, PEEP de 5 cm/volume de água, com o modo de controle de volume aplicado. Caso houvesse uma redução da oximetria cerebral, as intervenções necessárias eram feitas.

 Período da cirurgia e da circulação extracorpórea

A mesma equipe de cirurgiões realizou todas as cirurgias. O procedimento cirúrgico incluiu esternotomia mediana e circulação extracorpórea (CEC) em todos os casos. CEC foi estabelecida pela canulação da aorta ascendente e uma única cânula de dois estágios no átrio direito. A proteção miocárdica foi feita com hipotermia moderada (28-32ºC), resfriamento tópico com solução salina e doses intermitentes (a cada 20 min) de cardioplegia sanguínea hipotérmica anterógrada. A cardioplegia sanguínea a quente foi administrada imediatamente antes da liberação do pinçamento aórtico. Todas as anastomoses coronárias distais foram construídas durante um único período de pinçamento aórtico, e as anastomoses proximais foram construídas sobre uma pinça de oclusão parcial durante o aquecimento. A substituição da valva aórtica foi realizada juntamente com a cirurgia de revascularização miocárdica em um caso.

Amostragem de tecidos e de sangue

Foram obtidas amostras de sangue da veia central dos pacientes em 2 momentos diferentes, antes e depois da cirurgia. Dois tecidos miocárdicos foram retirados 2-3 milímetros do átrio direito de cada paciente antes do início da CEC (T1) e ao final da CEC (T2). Foram obtidas amostras de sangue total do átrio direito de cada paciente antes do início da CEC (T1) e ao final da CEC (T2). O tecido ideal é o átrio direito como possível biomarcador no perfil proteômico do miocárdio em cirurgia de revascularização miocárdica, troca de válvula cardíaca e outros pacientes de cirurgia cardíaca.17 Portanto, o átrio direito foi a preferência em nosso estudo. Foram obtidas amostras de sangue dos sujeitos saudáveis do grupo de controle para comparar a expressão gênica do PTEN em pacientes. Todas as amostras foram imediatamente transferidas para o GENKOK para análise posterior.

 Análise de PCR quantitativo e em tempo real do gene PTEN

Todos os estudos moleculares foram realizados no Centro de estudos do genoma humano e células-tronco da Universidade Erciyes (GENKOK). O RNA total foi isolado de todas as amostras de sangue e tecidos do miocárdio usando PureZol (Bio-Rad, Hercules, CA). As concentrações de RNA foram medidas usando um espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Rockland, DE, EUA). Foram usados dois indicadores, A260/A280 e A260/A230. A razão de absorbância foi de A260/A280, e A260/A230 foi um indicador de contaminação de proteína, contaminação de sal caotrópico, polissacarídeo e/ou fenol. A transcrição reversa do RNA (1 μg) foi realizada usando o kit First Strand cDNA Synthesis (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A mistura de reação foi incubada a 65°C por 10 minutos, a 29°C por 10 minutos, a 48°C por 60 minutos, a 85°C por 5 minutos e depois a 4°C por 5 minutos. Aproximadamente 5 μl de cada cDNA foram usados para análise de PCR. As reações do ensaio qPCR foram realizadas usando LightCycler 480 Probes Master e Primer/Probes (Roche Diagnostics GmbH) em um volume de reação de 20 μl. As reações foram executadas em duplicata e o qRT-PCR foi realizado com o instrumento Light Cycler 480 II (Roche, Alemanha). As condições do ciclo foram as seguintes: desnaturação inicial a 95°C por 10 minutos, seguida de 10 segundos a 95°C, 30 segundos a 60°C e 60 segundos a 72°C, com as 3 etapas sendo de 45 ciclos. A última etapa ocorrerá em um ciclo a 40°C por 30 segundos para concluir a reação. Beta-actina (ACTB) foi selecionado como um gene de manutenção neste estudo. As mudanças na expressão gênica foram determinadas pelo método 2-ΔΔCt de quantificação relativa.

 Análise Western Blot

As proteínas totais foram extraídas de dois tecidos do átrio direito dissecados usando protocolos padrão.18 A concentração total de proteína de cada amostra foi determinada com um kit de ensaio de proteína compatível com detergente (kit DC; Bio-Rad, Hercules, CA). Cada amostra contendo 40 µg de proteína total foi analisada por eletroforese em gel de gradiente de 4-20% de dodecil sulfato de sódio (SDS)-poliacrilamida. A separação das proteínas foi realizada e transferida para membranas de difluoreto de polivinilideno. As membranas foram tratadas com 0,1 Triton X-100, solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBS-T) com 5% de leite em pó por um tempo específico. Foram examinados anticorpos PTEN primários e p-PTEN da marca Cell Signaling Technology. Após a lavagem com TBS-T, as membranas foram incubadas com um dos anticorpos secundários anticoelho ou anticamundongo (Biorad) apropriado para nosso estudo. β-actina e α/β Tubulina (primária e secundária) foram usadas como controle de carregamento. A detecção de quimioluminescência de membrana foi então realizada usando Clarity Western ECL Substrate (Biorad). As manchas foram visualizadas com um Chemidoc MP Imaging System (Biorad). Usando o programa aplicativo, o gerador de imagens foi medido com um densitômetro (Alpha Innotech, San Leandro, CA).

 Análise estatística

A análise dos dados foi realizada usando o GraphPad Prism (versão 8.01). A normalidade dos dados numéricos foi avaliada usando abordagens gráficas (gráfico Q-Q, histograma, etc.) e analíticas (teste de normalidade de Shapiro-Wilk). Resumimos dados numéricos (contínuos) (por exemplo, idade, peso, altura, níveis de expressão gênica de PTEN, tempos de pinçamento e revascularização, CK-MB e TnT) usando a média e o desvio padrão em dados normalmente distribuídos e mediana e interquartil em dados não normalmente distribuídos. As variáveis categóricas (por exemplo, sexo, tabagismo, hipertensão e diabetes, e o tipo de cirurgia) foram resumidas com frequências e porcentagens. Antes e depois da cirurgia, os níveis de expressão gênica medidos no tecido e no sangue foram comparados usando o teste de Wilcoxon, uma vez que esses valores não tinham distribuição normal. Da mesma forma, os níveis de expressão proteica antes e depois das amostras de tecido foram comparados usando o teste de Wilcoxon. Os níveis de expressão gênica em relação ao grupo de controle foram comparados em amostras de sangue usando o teste U de Mann-Whitney. Por último, calculamos os coeficientes de correlação de Spearman para explorar a relação entre os achados clínicos e laboratoriais do gene PTEN e a relação entre o tempo de pinçamento e o tempo total de revascularização. O nível de significância estatística foi definido como p<0,05 em todas as análises.

 Resultados Diagnóstico e características clínicas dos pacientes

Investigamos a expressão de mRNA e proteína do PTEN em grupos de controle e 22 pessoas com diagnóstico de DAC. A organização do estudo é apresentada na Figura 1. No grupo de estudo, havia 17 homens (77,2%) e 5 (22,8%) mulheres. A faixa etária do grupo de estudo foi de 39 a 81 anos. Todos os achados clínicos e o tipo de cirurgia estão resumidos na Tabela 1.

Características clínicas e demográficas dos pacientes
Características clínicas
Idade (39-81) 59,8±9,8
Sexo
Masculino (n,%) 17 (77,2%)
Feminino (n,%) 5 (22,8%)
Diabetes (n) 6
Hipertensão, (n) 5
Tabagismo, (n) 9
Altura (cm) 165,6±8,6
Peso (kg) 79,2±13,5
ASC (m²) 1,8±0,2
FE (%) 49,5±7,2
Pinçamento (min) 59,8±14,3
Revascularização total (min) 133±42,5
Cirurgia
CABGx1 (n) 1
CABGx2 (n) 2
CABGx3 (n) 10
CABGx4 (n) 6
CABGx5 (n) 2
SVA+CABG (n) 1

ASC: área da superfície corporal; CK-MB: creatina Quinase banda miocárdica; HDL: lipoproteína de alta densidade; LDL: lipoproteína de baixa densidade; FE: fração de ejeção; CABG: cirurgia de revascularização miocárdica; SVA: substituição da válvula aórtica.

 Achados laboratoriais gerais

Os níveis da troponina T (TnT) e da enzima CK-MB foram medidos na amostra de sangue dos pacientes (Figuras 2A e 2B). Ambos os níveis de enzimas diferiram significativamente antes e depois da operação (p<0,0001 e p=0,0002, respectivamente).

Achados bioquímicos dos pacientes. A) Níveis de CK-MB B) Níveis de troponina (Tnt). AC: antes da cirurgia, DC: depois da cirurgia. A análise estatística foi realizada por meio do teste de Wilcoxon para comparar os níveis dos achados bioquímicos antes e depois da cirurgia. Níveis de expressão de PTEN

Primeiro, comparamos amostras de sangue pré (T1) e pós-operatórias (T2) da expressão gênica do PTEN, mas esse achado não foi estatisticamente significativo (p=0,1607). Em seguida, comparamos os valores pré-operatórios das expressões gênicas do PTEN com sujeitos saudáveis do grupo de controle, que também não foi significativo (p=0,9846) (Ilustração central). Por outro lado, a expressão de PTEN em amostras de miocárdio de pacientes aumentou significativamente após a CEC em comparação com antes da CEC (p=0,0417) (Ilustração central). Os resultados de nossos Western Blots mostraram que a expressão proteica de PTEN no tecido aumentou drasticamente após os dados de expressão gênica. A expressão proteica de p-PTEN também foi significativamente aumentada em amostras de tecido miocárdico após a CEC (Ilustração central). A mediana, o quartil e os valores de p nos dados de expressão gênica do PTEN em tecidos pré e pós-operatórios, sangue e amostras de sangue de controle são mostrados na Tabela 4, e os valores medianos, interquartis e de p nos dados de expressão proteica são mostrados na Tabela 5.

 Análise de correlação

De acordo com nossa análise de correlação, houve uma correlação moderada entre os valores pós-operatórios de CK-MB e TnT (Tabela 2). As demais análises de correlação foram insignificantes, como idade, TnT e CK-MB com a expressão gênica do PTEN (r=0,1304; dados não apresentados).

Análise de correlação de Spearman dos achados clínicos e laboratoriais do gene <italic>PTEN</italic>
CK-MB T1 CK-MB T2 TnT T1 TnT T2 PTEN T1 mRNA PTEN T2 mRNA
CK-MB T1 1,000
CK-MB T2 0,411 1,000
TnT T1 0,395 0,125 1,000
TnT T2 0,422 0,663 * 0,236 1,000
PTEN T1 mRNA -0,125 0,328 0,230 0,250 1,000
PTEN T2 mRNA -0,038 0,110 -0,023 0,322 0,557 * 1,000

p<0,05

Além disso, quando a análise de correlação foi feita entre a expressão de PTEN e P-PTEN e pinçamento e tempo total de revascularização, identificou-se que, embora haja uma relação estatisticamente insignificante negativa entre PTEN e P-PTEN e pinçamento, há uma relação estatisticamente insignificante positiva entre PTEN e P-PTEN e o tempo total de revascularização (dados não mostrados). Existe apenas uma relação positiva entre PTEN e P-PTEN, e essa relação é estatisticamente significativa (r=0,90, p=0,02). (Tabela 3).

Correlação de Spearman para expressão proteica com tempo de pinçamento e tempo total de revascularização (* r= 0,90, p=0,02)
P-PTEN PTEN Tempo de pinçamento (min) Tempo total de revascularização (min)
P-PTEN 1,000
PTEN 0,90* 1,000
Tempo de pinçamento (min) -0,53 -0,31 1,000
Tempo total de revascularização (min) 0,17 0,28 0,21 1,000
Demonstração de valores medianos, interquartis e p de variáveis contínuas não normalmente distribuídas nos dados de expressão gênica em amostras de tecido e sangue pré e pós-operatório e amostras de sangue de controle
Expressão gênica do PTEN Significância (Amostras de sangue)‡
Sangue (n=22) Tecido (n=22) Controle (n=22) Pré-Op vs. Controle Pós-Op vs. Controle
Pré-Op 0,89 (0,47, 3,49) 0,83 (0,76, 1,50) 1,03 (0,41, 1,91) 0,814 0,742
Pós-Op 0,80 (0,20, 2,13) 1,55 (0,97, 2,23)
Sig. (p)† 0,072 0,053 N.A.

Resumido usando mediana (quartis). N.A.: Não se aplica.

Comparações pré-op versus pós-op pelo teste de Wilcoxon.

Versus comparações de controle quanto a amostras de sangue via teste U de Mann-Whitney.

 Demonstração de valores medianos, interquartis e p de variáveis contínuas não normalmente distribuídas nos dados de expressão proteica em amostras de tecido e sangue pré e pós-operatório
Expressão proteica do PTEN
n=8 P-PTEN PTEN
Pré-Op 0,66 (0,61, 1,14) 0,51 (0,47, 0,84)
Pós-Op 1,64 (1,23, 2,10) 1,67 (1,58, 2,28)
Sig. (p) 0,018 0,018

Resumido usando mediana (quartis) e comparado pelo teste de Wilcoxon.

 Discussão

Doenças cardiovasculares (DCV), como doença arterial coronariana (DAC), infarto do miocárdio (IM) e acidente vascular cerebral, são causas significativas de mortalidade e morbidade na população em geral em todo o mundo.2 A DAC é a causa mais comum de morte no mundo entre as doenças cardiovasculares. O PTEN tem um papel crítico na hipertrofia e sobrevida dos cardiomiócitos. Portanto, neste estudo, avaliamos a expressão gênica e proteica do PTEN em pacientes com DAC.

Mocanu et al. afirmaram que a via de sinalização PI3K/AKT é vital na proteção do miocárdio contra lesão de isquemia-reperfusão.16 Eles enfatizaram que o principal fator que leva a essa ativação é o gene PTEN. Além disso, o PTEN pode ser essencial em condições patológicas associadas a doenças cardíacas isquêmicas, como diabetes e obesidade.12 Portanto, a inativação do PTEN pode desempenhar um papel importante em condições patológicas associadas à doença cardíaca isquêmica.13

Li et al. investigaram a expressão de PTEN para explorar a relevância entre a expressão de PTEN e o desenvolvimento de DCC no tecido miocárdico de 16 pacientes mortos por imuno-histoquímica e qRT-PCR. A expressão proteica do PTEN no miocárdio foi significativamente menor em pacientes com doença cardíaca coronária em comparação com o grupo de controle saudável. Ao mesmo tempo, não houve diferença estatística na expressão de PTEN mRNA entre o grupo experimental e o de controle. Com esses resultados, eles concluíram que o PTEN pode estar envolvido na ocorrência e no desenvolvimento de DCC.19 Nosso estudo também mostrou que a expressão gênica e proteica do PTEN no tecido miocárdico aumentou após a revascularização. Pensamos que os resultados diferiam porque amostras de tecido pós-morte foram usadas no estudo mencionado acima.

As vias de sinalização PTEN/PI3K desempenham um papel crucial na patogênese da hipertrofia miocárdica. Em um estudo, descobriu-se que ela estava envolvida na remodelação miocárdica em 39 pacientes com insuficiência cardíaca congestiva (ICC). As expressões proteica do PTEN nos grupos com insuficiência cardíaca congestiva foram menores do que no grupo de controle e foram negativamente correlacionadas aos níveis de função cardíaca. Assim, eles revelaram que o PTEN pode desempenhar um papel regulador negativo no processo de remodelação miocárdica.20 A hipertrofia cardíaca, uma resposta adaptativa geral do coração, é um processo complexo no qual muitos genes atuam de maneira coordenada. Ela pode ser estimulada de várias maneiras, incluindo a via IGF-1/PI3K/Akt. Na via de sinalização PI3K, o PTEN pode ser um determinante crítico do crescimento de cardiomiócitos. Sob certas condições, pode causar apoptose, prevenir a hipertrofia e bloquear a sinalização do fator de crescimento.14 Em nosso estudo, a expressão gênica e proteica do PTEN em tecidos miocárdicos pré-operatórios aumentou significativamente após a cirurgia. Esse resultado nos mostra repetidamente que o PTEN desempenha um papel importante na reparação e aumento da sobrevivência celular, contratilidade miocárdica e viabilidade de cardiomiócitos em danos teciduais. Considerando todos esses efeitos, o PTEN será um importante marcador de prognóstico em pacientes com DAC. Um dos estudos recentes revelou que o PTEN desempenha um papel na progressão do infarto do miocárdio. Observou-se que os níveis séricos de PTEN estão aumentados em pacientes com infarto agudo do miocárdio, sugerindo que o PTEN pode ser usado como marcador preditivo de IM.21,22 Um dos estudos recentes é o de Feng et al. Em 2020, eles descobriram que o BPV como um inibidor de PTEN administrado aos camundongos melhorou a função dos vasos cardíacos após o infarto do miocárdio e consideraram que o inibidor de PTEN BPV poderia ser uma droga terapêutica candidata.23

A atividade do PTEN pode ser reduzida de duas maneiras: uma é conseguida pela inativação enzimática por fosforilação ou oxidação, e outra pela alteração do equilíbrio entre síntese e degradação do PTEN. A mudança na atividade PTEN é importante para manter o equilíbrio em muitos tipos de células. Também desempenha um papel vital na regulação do equilíbrio entre sobrevivência e morte em cardiomiócitos.16 A função do PTEN é regulada por diferentes modificações pós-traducionais, como fosforilação, acetilação, ubiquitinação e oxidação. O PTEN participa da modulação e estabilidade de suas funções supressoras de tumor. Também possui seis sítios de fosforilação envolvidos na compartimentalização subcelular.8,24 A região C-terminal do PTEN é composta por 218 aminoácidos e desempenha um papel na regulação da estabilidade e meia-vida da molécula. Essa região é rica em locais de fosforilação, e foi relatado que a fosforilação da região C-terminal do PTEN afeta a estabilidade e a função da proteína PTEN. Notavelmente, os sítios de fosforilação da caseína quinase 2 (CK2) no PTEN são conservados em espécies.25 Nosso estudo também corrobora essa ideia. Mostramos que o PTEN aumentou a fosforilação a partir do ponto S380 na cauda C. A fosforilação do resíduo S380 inibe a atividade catalítica do PTEN e estabiliza a proteína bloqueando a associação produtiva do domínio catalítico do PTEN com PI(3,4,5)P3 localizado na membrana.25

Demonstramos uma diferença significativa na expressão de PTEN dos tecidos miocárdicos durante a cirurgia. Em nosso estudo, a obtenção de amostras de sangue e tecidos em vários momentos da cirurgia foi difícil, mas diferenciou nosso trabalho dos demais. Sem o uso de pacientes saudáveis no grupo de controle, primeiro comparamos as amostras de tecido e sangue dentro do grupo, eliminando as diferenças individuais e possibilitando mostrar diferenças nos níveis de expressão na mesma ocasião. Em seguida, incluímos o grupo de controle para comparar os níveis de expressão de PTEN no sangue. A expressão gênica de PTEN no sangue pode ser reduzida por epigenética e outros mecanismos. Os efeitos da epigenética podem alterar a atividade de PTEN. Alguns miRNAs podem se ligar ao 3’UTR do PTEN (como o miR-21), alterar a proliferação de células endoteliais vasculares via PI3K-Akt e afetar as DAC.26 Alguns estudos anteriores27 sugeriram que o PTEN é regulado positivamente em células mononucleares do sangue periférico de pacientes com DAC. Isso é consistente com os achados do estudo de Zhang et al. sobre leucócitos do sangue periférico,28 e esses resultados do estudo corroboram nosso estudo. Nossos resultados diferiram dos níveis sanguíneos do estudo mencionado em comparação com os sujeitos saudáveis do grupo de controle. Os mesmos níveis de PTEN no sangue foram detectados no grupo de controle e nos pacientes.

O papel de TnI e TnT como marcadores proteicos de infarto do miocárdio foi proposto pela primeira vez há mais de 20 anos. A medição imunoquímica das concentrações de TnI ou TnT no sangue do paciente afastou os métodos tradicionais de diagnóstico de infarto do miocárdio.29 Os níveis de troponina e CK-MB referem-se a necrose e isquemia nos cardiomiócitos. A troponina T cardioespecífica (cTnT) é elevada no sangue após a injúria cardíaca.30 O aumento desses dados clínicos também está relacionado ao grau de isquemia. De acordo com a literatura, nosso estudo constatou que tanto os níveis de CK-MB quanto de troponina aumentaram significativamente após a cirurgia. Também determinamos uma correlação entre os níveis de CK-MB e TnT. Com base nesses achados, seria útil determinar a causa da diferença de troponina e CK-MB planejando estudos mais extensos e diferentes para identificar o dano estrutural no tecido miocárdico. Além das funções conhecidas da troponina, foi relatado que ela desempenha um papel na proliferação celular.31 Como mencionado acima, os níveis elevados de biomarcadores clínicos do miocárdio, tanto a expressão gênica quanto a proteica do PTEN, foram maiores após a cirurgia. Um aumento do PTEN como supressor de tumor devido ao aumento do nível de TnT também pode ser responsável por suprimir a proliferação de células danificadas.

Como em muitos sistemas, os miRNAs desempenham um papel essencial no sistema cardiovascular. Além de controlar as funções de células como cardiomiócitos, células musculares lisas, fibroblastos e células endoteliais, eles também são cruciais na fisiopatologia de doenças como infarto do miocárdio, hipertrofia, fibrose, insuficiência cardíaca, arritmia, inflamação e aterosclerose. Portanto, a investigação dos miRNAs associados ao PTEN também se beneficiará da expansão de nosso estudo e da aquisição de novos dados. Nesse sentido, nosso estudo é o primeiro na literatura. Entretanto, ao considerar as incógnitas sobre a via do PTEN, seria apropriado planejar novas investigações nessa área.

O PTEN funciona como um regulador crítico da hipertrofia e sobrevivência dos cardiomiócitos. A partir desse ponto de vista, investigamos a expressão gênica e proteica do PTEN em amostras de sangue e tecidos. Estudos utilizando sangue e tecidos miocárdicos são raros na literatura, e é um desafio realizá-los. Quando comparamos a expressão gênica do PTEN no sangue, não houve diferença entre a expressão do PTEN antes e depois da cirurgia. Também não foi encontrada nenhuma diferença quando os pacientes foram comparados com os do grupo de controle. Observamos aumento da expressão gênica e proteica no tecido após a cirurgia em comparação com antes da cirurgia. O aumento da expressão de PTEN no tecido miocárdico após a cirurgia em comparação com a amostra pré-operatória mostra repetidamente que o PTEN desempenha um papel vital na reparação do dano tecidual, na cicatrização e no aumento da sobrevida celular, da contratilidade miocárdica e da viabilidade dos cardiomiócitos. Considerando todos esses efeitos, o gene PTEN nos permitirá tomar uma medida prognóstica crítica na doença arterial coronariana nos próximos anos. Estudos moleculares nesta área são escassos, e acreditamos que nossas descobertas sobre o PTEN podem levar a estudos futuros. A limitação deste estudo é o número pequeno de pacientes. Além disso, nossos resultados podem ser corroborados pela investigação da relação entre parâmetros clínicos mais amplos e níveis de PTEN.

 Conclusão

O PTEN funciona como um regulador crítico da hipertrofia e sobrevivência dos cardiomiócitos. De acordo com os resultados obtidos neste estudo, pode-se sugerir que o gene PTEN pode ser um marcador nesse grupo de doenças, ampliando o número de pacientes para futuras investigações. Entretanto, ao considerar as incógnitas sobre a via do PTEN, seria apropriado planejar novas investigações nessa área. Estudos inovadores com amostras maiores podem ser planejados para concluir o real efeito da atividade do PTEN no miocárdio e aceitá-lo como marcador de prognóstico.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pelo Fundo de Pesquisa da Erciyes University (Número do Projeto: TYL-2017-7188)

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de mestrado de Reyhan Tahtasakal pela Erciyes University.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Erciyes University sob o número de protocolo 216/577. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.

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E-mail: efefunda@yahoo.com

Potential conflict of interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background:

Coronary artery disease is a complex disorder that causes death worldwide. One of the genes involved in developing this disease may be PTEN.

 Objectives:

This study aimed to investigate the PTEN gene and protein expression in tissue and blood samples taken from coronary bypass surgery patients.

 Methods:

Molecular studies were performed at Erciyes University Genome and Stem Cell Center (GENKOK). Right atrial appendage and blood samples were taken from the central vein of 22 coronary bypass surgery patients before starting and ending cardiopulmonary bypass. PTEN expression was determined using quantitative real-time PCR and western blot analysis. The significance level was accepted as p<0.05.

 Results:

There was no significant difference in the PTEN gene expression in blood samples taken before and after cardiopulmonary bypass. However, a substantial increase in both protein and gene expression levels of P-PTEN and PTEN was observed in the tissue samples. Myocardial expression of the PTEN gene was significantly increased at the end of the cardiopulmonary bypass. PTEN gene expression in the post-cardiopulmonary bypass period was increased when compared to the pre-bypass period, but it was insignificant when compared to healthy controls.

 Conclusion:

This study first revealed the role of the PTEN gene by analyzing both mRNA and protein expression in coronary bypass patients, appearing in both myocardial tissue and blood samples. Increased levels of PTEN may be a marker in myocardial tissue for patients with coronary artery disease.

 Keywords: Coronary Bypass Surgery Myocardium Gene Expression PTEN Research Fund of Erciyes University TYL-2017-7188 This study was partially funded by Research Fund of Erciyes University (Project Number: TYL-2017-7188). Gene expression and western blot results of the patients with CAD. Membrane images of PTEN and P-PTEN protein levels determined using specific antibodies in myocardial tissues of female/male patients (A). PTEN and P-PTEN protein expression findings in myocardial tissue taken from patients before and after surgery. β-actin was used as a loading control (B). The expression of the PTEN gene was determined by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) in myocardial tissues taken from patients at 2 different times (C). Expression of the PTEN gene was determined by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) in blood samples taken from patients at 2 different times and in control blood samples (D). Comparisons: P-PTEN BO vs. P-PTEN AO, PTEN BO vs. PTEN AO, and PTEN-T1 vs. PTEN-T2 (in blood and tissue samples separately) via Wilcoxon Signed Rand test; PTEN-T1 vs. Control and PTEN-T2 vs. Control via Mann-Whitney U test (*p<0.05, **p<0.001). (T1: before cardiopulmonary bypass, T2: after cardiopulmonary bypass). Introduction

One of the most common causes of death in men and women worldwide is cardiovascular disease,1 and one of the most important of these is coronary artery disease (CAD), which is affected by many factors.2 Genetic factors, as well as environmental factors, play an essential role in CAD.3 The underlying genetic mechanism is not fully understood, but it is estimated that 40-60% inheritance may be effective in coronary artery disease. Genome-wide association studies (GWAS) revealed that more than 30 genes were associated with CAD.4,5

Phosphatase and tensin homolog (PTEN) are located on chromosome 10. They negatively regulate intracellular phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate levels in cells and act as a tumor suppressors by negatively regulating the AKT/PKB signaling pathway.6,7 PTEN participates in the pathway of cell cycle progression, signal transduction, apoptosis, DNA repair, growth, and metabolism. It is also associated with atherosclerosis.8 PTEN may also play a role in the development and formation of CAD. The PI3K/Akt pathway protects the myocardium in all species, especially against ischemia-reperfusion damage.9 The inactivation of PTEN activates the PI3K/Akt pathway, decreases the infarct area, inhibits apoptosis, and enhances survival. It also improves post-ischemia-reperfusion heart damage.10 Furthermore, the inactivation of cardiac-specific PTEN protects against myocardial fibrosis and cardiac failure in a hypertensive mouse model.11 PTEN is important in ischemic heart diseases associated with diabetes and obesity.12 Therefore, providing PTEN’s inactivation may also increase myocardial survival following an ischemic episode.13 The decrease in the PTEN level is associated with hypertrophy and the remodeling of cardiac tissues.14 In addition, PTEN has also proven to play a role in regulating size and contraction in cardiomyocytes.15 It is emphasized that PTEN is extremely important in regulating the balance between cardiomyocyte death and survival.16 However, the long-term absence of PTEN from the myocardium is associated with myocardial hypertrophy.15

Therefore, this study focused on the changes in PTEN expression in myocardial tissue and blood samples collected from coronary artery bypass surgery patients during and after the surgery. To emphasize the importance of the PTEN gene in the prognosis of CAD, both myocardial and blood samples were used at different stages of surgery.

 Methods Patients and control selection

The institutional human ethics review board of Erciyes University approved this study (2016/577; 08.11.2016). Twenty-two patients with CAD treated at the Department of Cardiovascular Surgery of Erciyes University between 2016 and 2017 were included in the study (Figure 1). The patient group consisted of 5 women and 17 men (age ranges 39-81 years). Only patients with stable angina were included in the study. Our study also enrolled 22 healthy controls to compare the blood levels of PTEN gene expression. Controls consisted of 5 healthy women and 17 healthy men (age ranges of 26-69 years). Age and gender were matched with the study group. The participants gave written informed consent for this study.

Control group, patient’s criteria, and study design. CPB: cardiopulmonary bypass. RNA: Ribonucleic Acid; PCR: Polymerase Chain Reaction. Anesthesia protocol

The same anesthesia protocol was applied to all patients. A 5-channel ECG, pulse oximetry, noninvasive blood pressure, cerebral oximetry, and entropy monitoring were performed on the patients who were taken to the operating room. After a 1.5 mg dormicum and 50 microgram fentanyl push were made, an invasive arterial catheter was placed in the radial artery, and an invasive blood pressure measurement was performed. After preoxygenation, 1 mg/kg propofol, 10 micrograms/kg fentanyl, 1 mg/kg rocuronium were made in the induction. Patients with good entropy values were then intubated. An ultrasound-guided central venous catheter was inserted. Tranexamic acid was infused at a dose of 15 mg/kg in 1 hour and was maintained at 1.5 mg/kg/h throughout the case; 10 micrograms/kg/h fentanyl, 4 mg/kg/h propofol and 1 mg/ kg/h rocuronium were used in anesthesia management. The depth of anesthesia was adjusted between 45 and 60 entropies. If necessary, desflurane was used as an inhalation agent. Ventilator settings TV 6 ml/kg, respiratory rate 12/min, PEEP of 5 cm/water volume applied volume control mode. If there was a decrease in cerebral oximetry, necessary interventions were performed.

 Operation and cardiopulmonary bypass period

The same team of surgeons performed all operations. The operative procedure included median sternotomy and cardiopulmonary bypass (CPB) in all cases. CPB was established by the cannulation of the ascending aorta and a single two-stage cannula in the right atrium. Myocardial protection was provided with moderate hypothermia (28-32ºC), topical cooling with saline solution, and intermittent doses (every 20 min) of antegrade hypothermic blood cardioplegia. Warm blood cardioplegia was given just before releasing the aortic cross-clamping. All distal coronary anastomoses were constructed during a single period of aortic cross-clamping, and proximal anastomoses were constructed over a partial occlusion clamp during warming. Aortic valve replacement was done together with coronary bypass surgery in one case.

Tissue and blood sampling

Blood samples were obtained from the central vein of the patients at 2 different times, before and after surgery. Two myocardial tissues were taken 2-3 millimeters from each patient’s right atrium before starting CPB (T1) and at the end of CPB (T2). Whole blood samples were obtained from each patient’s right atrium before starting CPB (T1) and at the end of CPB (T2). The ideal tissue is the right atrium as a potential biomarker in a myocardial proteomic profile in coronary bypass surgery, heart valve replacement, and other cardiac surgery patients.17 Therefore, the right atrium was preferred in our study. Blood samples were taken from the healthy controls to compare PTEN gene expression in patients. All the samples were immediately transferred to GENKOK for further analysis.

 Real-time quantitative PCR analysis for PTEN gene

All molecular studies were conducted at Erciyes University Genome and Stem Cell Center (GENKOK). Total RNA was isolated from all blood samples and myocardial tissues using PureZol (Bio-Rad, Hercules, CA). RNA concentrations were measured using a nanodrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Inc., Rockland, DE, USA). Two indicators, A260/A280 and A260/A230, were used. The absorbance ratio was A260/A280, and A260/A230 was an indicator of protein contamination, chaotropic salt contamination, polysaccharide, and/or phenol. RNA (1 μg) was reverse transcribed using the First Strand cDNA Synthesis kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) according to the manufacturer’s instructions. The reaction mixture was incubated at 65°C for 10 minutes, at 29°C for 10 minutes, at 48°C for 60 minutes, at 85°C for 5 minutes, and then at 4°C for 5 minutes. Approximately 5 μl of each cDNA was used for PCR analysis. The qPCR assay reactions were performed using LightCycler 480 Probes Master and Primer/Probes (Roche Diagnostics GmbH) in a 20 μl reaction volume. Reactions were run in duplicate, and qRT-PCR was performed with Light Cycler 480 II instrument (Roche, Germany). The cycle conditions were as follows: initial denaturation at 95°C for 10 minutes, followed by 10 seconds at 95°C, 30 seconds at 60°C, and 60 seconds at 72°C, with the 3 steps including 45 cycles. The last step will occur in a cycle at 40°C for 30 seconds to complete the reaction. Beta-actin (ACTB) was selected as a housekeeping gene in this study. The changes in the gene expression were determined by the 2-ΔΔCt method of relative quantification.

 Western blot analysis

Total proteins were extracted from dissected two right atrium tissues using standard protocols.18 Each sample’s total protein concentration was determined with a detergent-compatible protein assay kit (DC kit; Bio-Rad, Hercules, CA). Each sample containing 40 µg of total protein was analyzed by loading 4-20% gradient sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis. Protein separation was performed and transferred to polyvinylidene difluoride membranes. Membranes were treated with 0.1 Triton X-100, Tris-buffered saline with 5% dry milk-Tween 20 (TBS-T) for a specific time. Cell Signaling Technology brand primary PTEN antibody and p-PTEN were examined. After washing with TBS-T, membranes were incubated with one of the anti-rabbit or anti-mouse secondary antibody (Biorad) appropriate for our study. β-actin and α/β Tubulin (primary and secondary) were used as a loading control. Membrane chemiluminescence detection was then performed using Clarity Western ECL Substrate (Biorad). Blots were imaged with a Chemidoc MP Imaging System (Biorad). Using the application program, the imager was measured with a densitometer (Alpha Innotech, San Leandro, CA).

 Statistical analysis

Data analysis was performed using the GraphPad Prism (version 8.01). The normality of numerical data was assessed using graph (Q-Q plot, histogram, etc.) and analytical approaches (Shapiro-Wilk’s normality test). We summarized numerical (continuous) data (e.g., age, weight, height, gene expression levels of PTEN, clamp and bypass times, CK-MB, and TnT) using the mean and standard deviation in normally distributed data and median and interquartile in non-normally distributed data. Categorical variables (e.g., gender, smoking status, hypertension and diabetes status, and the operation type) were summarized with frequencies and percentages. Before and after the operation, gene expression levels measured from tissue and blood were compared when using the Wilcoxon test, since these values were not normally distributed. Likewise, before and after, protein expression levels of tissue samples were compared using the Wilcoxon test. The gene expression levels against the control group were compared in blood samples using the Mann-Whitney U test. Finally, we calculated Spearman correlation coefficients to explore the relationship between clinical and laboratory findings of the PTEN gene and the relationship between cross-clamp time and total bypass time. The statistical significance level was set at p<0.05 in all analyses.

 Results Patient’s diagnosis and clinical features

This study investigated mRNA and protein expression of PTEN in control groups and 22 people with a diagnosis of CAD. The organization of the study is shown in Figure 1. In the study group, there were 17 males (77.2%) and 5 (22.8%) females. The age range of the study group was 39-81 years. All the clinical findings and the type of operation are summarized in Table 1.

Clinical and demographical characteristics of the patients
Clinical Features
Age (39-81) 59.8±9.8
Gender
Male (n,%) 17 (77.2%)
Female (n,%) 5 (22.8%)
Diabetes (n) 6
Hypertension (n) 5
Smoking (n) 9
Height (cm) 165.6±8.6
Weight (kg) 79.2±13.5
BSA (m²) 1.8±0.2
EF (%) 49.5±7.2
Cross Clamp (min) 59.8±14.3
Total Bypass (min) 133±42.5
Operation
CABGx1 (n) 1
CABGx2 (n) 2
CABGx3 (n) 10
CABGx4 (n) 6
CABGx5 (n) 2
AVR+CABG (n) 1

BSA: body surface area; CK-MB: creatine kinase myocardial band; HDL: high-density lipoprotein; LDL: low-density lipoprotein; EF: ejection fraction; CABG: coronary artery bypass graft surgery; AVR: aortic valve replacement.

 General laboratory findings

Troponin T (TnT) and CK-MB enzyme levels were measured in the blood sample of patients (Figures 2A and 2B). Both enzyme levels significantly differed before and after the operation (p<0.0001, p=0.0002, respectively).

Biochemical findings of the patients. A) CK-MB levels B) Troponin (Tnt) levels. BO: before an operation, AO: after an operation. Statistical analysis was performed using the Wilcoxon test to compare the levels of biochemical findings before and after surgery. Expression levels of PTEN

Our study first compared pre- (T1) and post-operative (T2) blood samples of PTEN gene expression, but this finding proved not to be statistically significant (p=0.1607). We then compared the pre-operative values of PTEN gene expressions with healthy controls, which also proved not to be significant (p=0.9846) (Central Illustration). On the other hand, the expression of PTEN in myocardium samples of patients significantly increased after CPB compared to before CPB (p=0.0417) (Central Illustration). Our western blot results showed that the protein expression of PTEN in the tissue increased dramatically following gene expression data. p-PTEN protein expression was also significantly increased in myocardial tissue samples after CPB (Central Illustration). Median, quartile, and p-values in PTEN gene expression data in pre- and postoperative tissue, as well as in blood and control blood samples, are shown in Table 4, and median, interquartile, and p-values in protein expression data are shown in Table 5.

 Correlation analysis

According to our correlation analysis, there was a moderate correlation between post-operative values of CK-MB and TnT (Table 2). The other correlation analysis was insignificant, including age, TnT, and CK-MB with PTEN gene expression (r=0.1304; data not shown).

Spearman Correlation analysis of the clinical and laboratory findings of <italic>PTEN</italic> gene
T1 CK-MB T2 CK-MB T1 TnT T2 TnT T1 PTEN mRNA T2 PTEN mRNA
T1 CK-MB 1.000
T2 CK-MB 0.411 1.000
T1 TnT 0.395 0.125 1.000
T2 TnT 0.422 0.663 * 0.236 1.000
T1 PTEN mRNA -0.125 0.328 0.230 0.250 1.000
T2 PTEN mRNA -0.038 0.110 -0.023 0.322 0.557 * 1.000

p<0.05

In addition, when correlation analysis was made between PTEN and P-PTEN expression and cross-clamp and total bypass time, while there is a negative statistically insignificant relationship between PTEN and P-PTEN and thr cross clamp, there is a positive statistically insignificant relationship between PTEN and P-PTEN and total bypass time (Data not shown). There is only a positive relationship between PTEN and P-PTEN, and this relationship is statistically significant (r=0.90, p=0.02) (Table 3).

Spearman Correlation for protein expression with cross clamp time and total bypass time (* r= 0.90, p=0.02)
P-PTEN PTEN Cross Clamp Time (min) Total Bypass Time (min)
P-PTEN 1.000
PTEN 0.90* 1.000
Cross Clamp Time (min) -0.53 -0.31 1.000
Total Bypass Time (min) 0.17 0.28 0.21 1.000
Demonstration of median, interquartiles and p values of non-normally distributed continuous variables in the gene expression data in pre- and post-operative tissue and blood samples and control blood samples
PTEN gene expression Significance (Blood Samples)‡
Blood (n=22) Tissue (n=22) Control (n=22) PreOp vs. Control PostOp vs. Control
PreOp 0.89 (0.47, 3.49) 0.83 (0.76, 1.50) 1.03 (0.41, 1.91) 0.814 0.742
PostOp 0.80 (0.20, 2.13) 1.55 (0.97, 2.23)
Sig. (p) † 0.072 0.053 N.A.

Summarized using median (quartiles). N.A.: Not applicable.

PreOp versus Post Op comparisons via Wilcoxon test.

Versus control comparisons for blood samples via Mann-Whitney U test.

 Demonstration of median, interquartiles and p values of continuous variables that non-normally distributed in protein expression data in pre- and post-operative tissue samples
PTEN protein expression
n=8 P-PTEN PTEN
PreOp 0.66 (0.61, 1.14) 0.51 (0.47. 0.84)
PostOp 1.64 (1.23, 2.10) 1.67 (1.58. 2.28)
Sig. (p) 0.018 0.018

Summarized using median (quartiles) and compared via Wilcoxon test.

 Discussion

Cardiovascular diseases (CVD), such as coronary artery disease (CAD), myocardial infarction (MI), and stroke are significant causes of mortality and morbidity in the general population worldwide.2 CAD is the most common cause of death worldwide among cardiovascular diseases. PTEN plays a critical role in cardiomyocyte hypertrophy and survival. Therefore, the present study assessed the gene and protein expressions of PTEN in patients with CAD.

Mocanu et al. stated that the PI3K/AKT signaling pathway is vital in protecting the myocardium against ischemia-reperfusion injury.16 They emphasized that the main factor that provides this activation is the PTEN gene. Additionally, PTEN may be essential in pathological conditions associated with ischemic heart diseases, such as diabetes and obesity.12 Therefore, inactivation of PTEN may play an important role in pathological conditions associated with ischemic heart disease.13

Li et al. investigated PTEN expression to explore the relevance between the expression of PTEN and the development of CHD in myocardial tissue of 16 deceased patients through immunohistochemistry and qRT-PCR. PTEN protein expression in the myocardium was significantly lower in patients with coronary heart disease, as compared to the healthy control group. At the same time, there was no statistical difference in the expression of PTEN mRNA between the experimental and control groups. With these results, they concluded that PTEN might be involved in the occurrence and development of CHD.19 Our study also showed that the PTEN gene and protein expression in myocardial tissue increased after bypass. We thought the results differed because postmortem tissue samples were used in the study mentioned above.

PTEN/PI3K signaling pathways play a crucial role in the pathogenesis of myocardial hypertrophy. In one study, it was found to be involved in myocardial remodeling in 39 patients with congestive heart failure (CHF). PTEN protein expressions in the congestive heart failure groups were lower than in the control group and were negatively correlated with cardiac function levels. Thus, they revealed that PTEN may well play a negative regulatory role in the myocardial remodeling process.20 Cardiac hypertrophy, a general adaptive response of the heart, is a complex process in which many genes work in a coordinated manner. It can be stimulated in several ways, including the IGF-1/PI3K/Akt pathway. In the PI3K signaling pathway, PTEN can be a critical determinant of cardiomyocyte growth. Under certain conditions, it can cause apoptosis, prevent hypertrophy, and block growth factor signaling.14 In our study, both PTEN genes and protein expressions in pre-operative myocardial tissues significantly increased after surgery. This result shows us repeatedly that PTEN plays an important role in repairing and enhancing cell survival, myocardial contractility, and cardiomyocyte viability in tissue damage. Considering all these effects, PTEN will provide an important prognostic marker in patients with CAD. One of the recent studies revealed that PTEN plays a role in the progression of myocardial infarction. It has been observed that serum PTEN levels are increased in patients with acute MI, suggesting that PTEN can be used as a predictive marker in MI.21,22 One of the recent studies is Feng et al.’s study. In 2020, they found that the BPV as a PTEN inhibitor given to the mice improved the function of cardiac vessels after myocardial infarction. They thought that the PTEN inhibitor BPV could be a candidate therapeutic drug.23

The activity of PTEN can be reduced in two ways: one is achieved by enzymatic inactivation through phosphorylation or oxidation, and another by changing the balance between PTEN synthesis and degradation. The change in PTEN activity is important in maintaining balance in many cell types. It also plays a vital role in regulating the balance between survival and death in cardiomyocytes.16 PTEN function is regulated by different post-translational modifications, such as phosphorylation, acetylation, ubiquitination, and oxidation. PTEN participates in the modulation and stability of its tumor suppressor functions. It also has six phosphorylation sites involved in subcellular compartmentalization.8,24 The C-terminal region of PTEN is composed of 218 amino acids. It plays a role in regulating the stability and half-life of the molecule. This region is rich in phosphorylation sites, and phosphorylation of the PTEN C terminal has been reported to affect PTEN protein stability and function. Remarkably, the casein kinase 2 (CK2) phosphorylation sites in PTEN are conserved in species.25 Our study also supports this idea. We showed that PTEN had increased phosphorylation from the point of S380 in the C tail. Phosphorylation of S380 residue inhibits PTEN’s catalytic activity and stabilizes the protein by blocking the productive association of the PTEN catalytic domain with membrane-localized PI(3,4,5)P3.25

We demonstrated a significant difference in the PTEN expression of myocardial tissues during the surgery. In our study, obtaining blood and tissue specimens at different surgery times was difficult, but it made our work different from others. Without the use of healthy controls, first, we compared the tissue and blood samples within the group by eliminating the individual differences and made it possible to show differences in expression levels on the same occasion. We then enrolled the control group to compare the expression levels of PTEN in the blood. The gene expression of PTEN in the blood may be reduced by epigenetics and other mechanisms. Epigenetic effects can alter the activity of PTEN. Some miRNAs can bind to the 3 ‘UTR of PTEN (such as miR-21), alter the proliferation of vascular endothelial cells via PI3K-Akt, and affect CAD.26 Some previous studies27 have suggested that PTEN is upregulated in peripheral blood mononuclear cells of CAD patients. This is consistent with the findings of Zhang et al.’s study on peripheral blood leukocytes,28 and these study results support our study. Our results differed from the aforementioned study’s blood levels compared to the healthy controls. The same levels were detected in the control and the patients for PTEN in the blood.

TnI and TnT as protein markers of myocardial infarction were first proposed more than 20 years ago. Immunochemical measurement of TnI or TnT concentrations in the patient’s blood sidelined the traditional methods of diagnostics of myocardial infarction.29 Troponin and CK-MB levels refer to necrosis and ischemia in cardiomyocytes. Cardiac-specific troponin T (cTnT) is elevated in the blood following cardiac injury.30 The increase in clinical data is also related to the degree of ischemia. According to the literature, our study found that both CK-MB and troponin levels increased significantly after surgery. We also determined a correlation between CK-MB and TnT levels. Based on these findings, it would be helpful to determine the cause of the difference in troponin and CK-MB by planning more extensive and different studies to reveal the structural damage in myocardial tissue. Apart from the known functions of troponin, it has been reported to have a role in cell proliferation.31 As mentioned above, the elevated levels of clinical biomarkers of the myocardium, both gene and protein expression of PTEN, were higher after the surgery. An increase in PTEN as a tumor suppressor due to the increase in TnT level may also be responsible for suppressing the proliferation of damaged cells.

As in many systems, miRNAs play an essential role in the cardiovascular system. In addition to controlling the functions of cells, such as cardiomyocytes, smooth muscle cells, fibroblasts, and endothelial cells, it is also crucial in the pathophysiology of diseases, such as myocardial infarction, hypertrophy, fibrosis, heart failure, arrhythmia, inflammation, and atherosclerosis. Therefore, investigating the miRNAs associated with PTEN will also benefit from expanding our study and acquiring new data. In this respect, our study is the first of its kind in the literature. However, when considering the unknowns regarding the PTEN pathway, planning new investigations in this area would be appropriate.

PTEN functions as a critical regulator of cardiomyocyte hypertrophy and survival. From this point of view, we investigated the PTEN gene and protein expressions in the blood and tissue samples. Studies using blood and myocardial tissues are rare in the literature, and it is challenging to conduct such studies. When we compared the PTEN gene expression in the blood, there was no difference between the PTEN expression before and after the surgery. No difference was found when the patients were compared with the control group. We observed increased protein and gene expression in tissue after surgery compared to before. The increase in PTEN expression in myocardial tissue after surgery compared to the preoperative sample repeatedly shows that PTEN plays a vital role in repairing tissue damage, healing, and increasing cell survival, myocardial contractility, and cardiomyocyte viability. Considering all these effects, the PTEN gene will enable us to take a critical prognostic measure in coronary artery disease in the following years. Molecular studies in this area are scarce, and we believe our findings about PTEN can lead to future studies. The limitation of this study is the small number of patients. In addition, our results can be supported by investigating the relationship between broader clinical parameters and PTEN levels.

 Conclusion

PTEN functions as a critical regulator of cardiomyocyte hypertrophy and survival. According to the results obtained from this study, it can suggested that the PTEN gene may be a marker in this disease group by expanding the number of patients for further investigations. However, when considering the unknowns regarding the PTEN pathway, planning new investigations in this area would be appropriate. Innovative studies may be planned with larger samples to conclude the real effect of PTEN activity on myocardium and accept it as a prognostic marker.

Sources of funding

This study was partially funded by Research Fund of Erciyes University (Project Number: TYL-2017-7188).

Study association

This article is part of the thesis of master submitted by Reyhan Tahtasakal, from Erciyes University.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Erciyes University under the protocol number 2016/577. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.

 Acknowledgment

This study was supported by the Research Fund of Erciyes University (Project Number: TYL-2017-7188).