Arq Bras CardiolabcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCQGTwGSYLhbqYRKhZ4LGTZ3KS0066-782X20230003005040050410.36660/abc.20220313Carta CientíficaDistúrbio Cumulativo da Lipofuscina Miocárdica após Transplante Cardíaco de Longa Evolução: Estudo Baseado em Biópsias Endomiocárdicas0000-0002-5673-165XBenvenutiLuiz AlbertoConcepção e desenho da pesquisaAnálise estatística e Redação do manuscritoObtenção de dadosAnálise e interpretação dos dados e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante10000-0002-2533-5638Marcondes-BragaFabiana G.Obtenção de dadosAnálise e interpretação dos dados e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante1BacalFernandoAnálise e interpretação dos dados e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante1Universidade de São PauloFaculdade de MedicinaHospital das ClínicasSão PauloSPBrasilInstituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP – BrasilCorrespondência: Luiz Alberto Benvenuti • Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo – Av. Dr. Eneas Carvalho Aguiar, 44. CEP 05403-904, São Paulo, SP – Brasil. E-mail: anpluiz@incor.usp.br
Potencial conflito de interesse
Não há conflito com o presente artigo.
0704202320231203e20220313100520222710202214122022This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution LicensePalavras-chaveTransplante de CoraçãoLipofuscinaBiópsia EndomiocárdicaIntrodução
Lipofuscina é um pigmento citoplasmático castanho-amarelado, não degradável, composto por proteínas altamente oxidadas, lípides e metais. A lipofuscina se acumula com o tempo em células pós-mitóticas perenes, como os cardiomiócitos, sendo também chamada “pigmento da idade”.1-4
O transplante cardíaco é tratamento consagrado para pacientes com insuficiência cardíaca grave refratária a outras formas de tratamento.5 Sua maior limitação no longo prazo é o desenvolvimento da doença vascular do enxerto (DVE), de diagnóstico relativamente difícil e para a qual há poucas opções efetivas de tratamento.6,7 Nesse contexto é de se salientar estudo prévio relacionando a quantidade de lipofuscina no miocárdio de pacientes transplantados cardíacos ao desenvolvimento da DVE.8
O objetivo deste trabalho foi avaliar a deposição de lipofuscina no miocárdio após o transplante cardíaco de longa evolução, e investigar a relação entre a quantidade de lipofuscina no miocárdio e a presença e gravidade da DVE.
Métodos
De 2008 a 2014, 176 pacientes adultos foram submetidos a transplante cardíaco em nosso hospital. Os critérios de inclusão para este estudo retrospectivo foram: 1) apresentar seguimento clínico em nosso hospital superior a 4 anos após o transplante; 2) apresentar biópsia endomiocárdica sem rejeição aguda celular significativa (grau ≤ 1R) obtida ao menos 4 anos após o transplante (biópsia tardia), como representativa da condição tardia do coração transplantado; 3) apresentar biópsia endomiocárdica sem rejeição aguda celular significativa (grau ≤ 1R) obtida até o segundo mês após o transplante (biópsia basal), como representativa da condição basal do órgão transplantado (coração normal); e 4) apresentar angiografia coronariana para avaliação de DVE, realizada entre 6 meses antes e 6 meses após a data da coleta da biópsia tardia. Foram selecionados 25/176 (14,2%) pacientes, de acordo com fluxograma representado na Figura 1. Todas as biópsias e angiografias coronarianas foram realizadas no contexto de seguimento clínico rotineiro do paciente transplantado.
Fluxograma para seleção dos pacientes.
A presença e severidade da DVE foi definida de acordo com o consenso de 2010 da Sociedade Internacional de Transplante de Coração e Pulmão (ISHLT),7 e classificada como grau 0 (não significativa), grau 1 (leve), grau 2 (moderada) ou grau 3 (grave), a partir de revisão dos laudos e imagens das angiografias.
Cortes histológicos a 3-μm obtidos dos blocos de parafina das biópsias endomiocárdicas foram corados pelo ácido periódico de Schiff (PAS) após digestão com diastase para remoção do glicogênio, com o intuito de ressaltar os grânulos de lipofuscina. A quantidade de lipofuscina no miocárdio foi calculada pela média da área fracionária do citoplasma ocupada pelo pigmento em 4 campos microscópicos não coincidentes, visualizados ao microscópio (Axioskop 2 plus, Zeiss, Jena, Alemanha) com aumento de 1.000 vezes. Utilizou-se o método da contagem de pontos,9 mediante superposição aos campos microscópicos de grade computadorizada de 525 pontos equidistantes, com o auxílio do software AxioVision (Zeiss, Jena, Alemanha). A avaliação foi feita por um patologista, sem conhecimento prévio se as biópsias mensuradas eram basais ou tardias.
Análise estatística
Dados quantitativos foram expressos como média ± desvio padrão ou mediana (percentil 25-percentil 75). Para avaliar a correlação entre idade e quantidade de lipofuscina nas biópsias foi utilizado o teste de correlação de Pearson. O teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparação da quantidade de lipofuscina nas biópsias basais e tardias considerando-se a mesma idade cardíaca agrupada por décadas e para comparação da quantidade de lipofuscina das biópsias tardias entre pacientes que apresentavam ou não DVE moderada/grave. Nível de significância foi considerado se p≤0,05.
Resultados
Quatorze (56%) dos 25 pacientes incluídos neste estudo eram homens. O tempo decorrido desde o transplante até a obtenção da biópsia tardia variou de 4 a 10,1 anos, com mediana de 6,1 (4,43-7,43) anos. A idade cardíaca na época da coleta da biópsia basal (idade do doador), o tempo decorrido do transplante até a coleta da biópsia tardia, a idade cardíaca na época da coleta da biópsia tardia (idade do doador + anos decorridos até a coleta da biópsia tardia), a quantidade de lipofuscina das biópsias basal e tardia e o grau da DVE estão apresentados na Tabela 1.
Idade cardíaca nos tempos basal e tardio do transplante, tempo decorrido até a coleta da biópsia tardia (Δ T), fração de área (%) ocupada pela lipofuscina nas biópsias basal e tardia e grau da DVE dos pacientes
Idade cardíaca basal (anos)
Δ T (anos)
Idade cardíaca tardia (anos)
Lipofuscina basal (%)
Lipofuscina tardia (%)
Grau da DVE
25
6,8
31,8
1,38
3,01
0
38
4,1
42,1
1,88
1,57
3
33
4,0
37,0
0,89
1,76
0
34
6,3
40,3
1,33
1,72
0
29
4,5
33,5
1,32
2,50
0
27
4,9
31,9
0,81
1,53
0
20
4,3
24,3
0,81
1,43
0
15
4,7
19,7
0,67
1,48
0
40
4,1
44,1
1,43
2,62
1
26
4,7
30,7
1,48
1,62
1
37
4,0
41,0
2,03
3,01
0
18
10,8
28,8
0,48
1,24
1
22
9,1
31,1
0,71
2,48
0
43
10,1
53,1
1,36
3,45
2
44
7,6
51,6
2,01
3,82
0
21
6,9
27,9
0,90
2,67
0
43
8,4
51,4
1,87
2,25
2
33
8,2
41,2
1,52
2,05
2
26
5,6
31,6
1,30
2,57
0
19
5,1
24,1
0,34
1,48
0
26
6,7
32,7
1,39
1,26
0
27
4,2
31,2
0,95
1,62
0
23
7,2
30,2
1,00
2,05
3
43
6,9
49,9
2,16
2,34
0
21
6,1
27,1
1,05
2,87
2
DVE: doença vascular do enxerto.
Imagem representativa de um campo microscópico de biópsia endomiocárdica demonstrando a deposição de lipofuscina no miocárdio (magnificação de 1.000 vezes) está apresentado na Figura 2.
Grânulos de lipofuscina (setas) no citoplasma dos cardiomiócitos corados vermelho-púrpura pelo ácido periódico de Schiff (PAS) após digestão com diastase. Nessa imagem a área fracionária ocupada pela lipofuscina mediu 1,71%.
Houve correlação positiva entre a idade cardíaca e a quantidade de lipofuscina tanto na condição basal (coração normal) como na tardia do coração transplantado. Entretanto, o coeficiente de correlação na condição basal (p<0,001; r=0,827) foi consideravelmente superior ao da condição tardia (p=0,008; r=0,516). Gráfico de dispersão dos dados está apresentado na Figura 3.
Gráfico de dispersão múltipla relacionando a idade do coração com a fração de área ocupada pela lipofuscina nas biópsias endomiocárdicas basal e tardia.
A quantidade de lipofuscina nas biópsias tardias foi superior à das biópsias basais considerando-se a mesma idade cardíaca, agrupada por décadas. A mediana da fração de área ocupada pela lipofuscina foi 1,03 (0,83-1,37) nas biópsias basais (n=12) e 1,48 (1,34-2,77) nas biópsias tardias (n=5) dos corações com 20-29 anos de idade; 1,52 (1,11-1,96) nas biópsias basais (n=5) e 1,91 (1,60-2,52) nas biópsias tardias (n=10) dos corações com 30-39 anos de idade; e 1,87 (1,40-2,09) nas biópsias basais (n=5) e 2,20 (1,68-2,72) nas biópsias tardias (n=6) dos corações com 40-49 anos de idade. Entretanto, a diferença da quantidade de lipofuscina entre as biópsias basais e tardias foi estatisticamente significante apenas na década de 20-29 anos de idade cardíaca (p=0,015).
A mediana da fração de área ocupada pela lipofuscina nas biópsias tardias dos pacientes que apresentavam DVE moderada/grave (n=6) ou apresentavam DVE não significativa/leve (n=19) foi 2,15 (1,93-3,02) e 1,76 (1,48-2,62) respectivamente, sem diferença estatística entre os grupos. Pacientes que apresentavam DVE moderada/grave apresentavam idade cardíaca mais elevada (média: 40,8 ± 10,7 anos) que os pacientes que apresentavam DVE não significativa/leve (média: 33,9 ± 8,4 anos), sem diferença estatística entre os grupos.
Discussão
O pigmento de lipofuscina se origina do dano oxidativo de organelas citoplasmáticas, particularmente mitocôndrias, que são engolfadas pelos lisossomos no processo de autofagia. Alternativamente o pigmento pode se originar diretamente no citoplasma, por proteínas oxidadas não clivadas pelo proteosoma. Como a lipofuscina não se degrada, o pigmento se acumula no citoplasma de células pós-mitóticas de longa sobrevida, refletindo o desgaste celular característico do envelhecimento.2,3
Exceto pela caquexia, há controvérsia se a taxa de deposição de lipofuscina no miocárdio pode ser alterada por outros fatores que não o envelhecimento. Em estudo prévio a fração de área ocupada pela lipofuscina no miocárdio não diferiu em pacientes com insuficiência cardíaca de origem isquêmica ou hipertrófica quando comparada a pacientes com coração normal, de mesma idade.4 Por outro lado, estudando pacientes jovens com cardiomiopatia dilatada foi descrito que aqueles com melhor fração de ejeção do ventrículo esquerdo apresentaram maiores quantidades de lipofuscina.10 Mais recentemente, há relato de acúmulo de lipofuscina nos cardiomiócitos hipertróficos de paciente de 16 anos de idade com defeito de condução cardíaca associada a mutação do gene da subunidade 5 alfa do canal de sódio voltagem-dependente (SCN5A).11
Até onde sabemos há um único estudo focando a deposição de lipofuscina no miocárdio após o transplante cardíaco.8 Nesse estudo os autores sugeriram que a detecção de lipofuscina em biópsias endomiocárdicas obtidas tardiamente (12 meses) após o transplante cardíaco poderia ser preditiva do desenvolvimento de DVE. Entretanto, a idade dos doadores não foi claramente determinada e a avaliação da lipofuscina nas biópsias foi apenas qualitativa, não quantitativa.
No presente estudo mostramos forte correlação positiva entre a idade e a quantidade de lipofuscina em corações recém transplantados, presumivelmente normais, representados pelas biópsias endomiocárdicas basais. O coeficiente de correlação nessa situação foi 0,827, bastante similar aos coeficientes obtidos em estudos prévios sobre corações normais.1,4 Entretanto, o coeficiente de correlação entre a quantidade de lipofuscina e a idade cardíaca foi muito menor (0,516) para as amostras obtidas de corações transplantados há longo tempo (biópsias tardias). Além disso, os depósitos de lipofuscina no miocárdio mostraram-se aumentados após transplante de longa duração quando comparados a corações recém transplantados com a mesma idade, agrupados por década. Esses achados apontam para maior turnover de organelas celulares e maior estresse oxidativo dos cardiomiócitos no transplante de longo tempo de evolução, sugerindo envelhecimento precoce do coração transplantado.
A hipótese de envelhecimento prematuro do coração transplantado, e talvez também de outros órgãos sólidos, é interessante pois poderia ajudar a explicar a relativamente curta sobrevida funcional dos órgãos sólidos transplantados comparada aos órgãos nativos. Entretanto, essa teoria necessita ser confirmada por outros estudos envolvendo maior número de pacientes transplantados, diferentes tipos de transplante, e múltiplos métodos de avaliação do envelhecimento.
Apesar de nosso estudo ser limitado pelo pequeno número de biópsias analisadas e de pacientes que desenvolveram DVE moderada ou grave, não encontramos associação entre a quantidade de lipofuscina no miocárdio dos pacientes transplantados de longa data e o desenvolvimento da DVE.
Fontes de financiamento
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Vinculação acadêmica
Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.
Aprovação ética e consentimento informado
Este artigo não contém estudos com humanos ou animais realizados por nenhum dos autores.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao Dr. José Felipe Cardoso Braz e Dr. Ciro Mancilha Murad que reviram os prontuários dos pacientes transplantados entre 2008 a 2014, para a obtenção de dados das coronariografias.
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Dr. Eneas Carvalho Aguiar, 44. Postal Code 05403-904, São Paulo, SP – Brasil. E-mail: anpluiz@incor.usp.br
Potential conflict of interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
Lipofuscin is a yellowish-brown, non-degradable cytoplasmic pigment composed of highly oxidized proteins, lipids, and metals. Lipofuscin accumulates over time in perennial post-mitotic cells such as cardiomyocytes and is also called “age pigment”.1-4
Heart transplantation is an established treatment for patients with severe heart failure refractory to other forms of treatment.5 Its major long-term limitation is the development of cardiac allograft vasculopathy (CAV), which is relatively difficult to diagnose and for which few effective treatment options exist.6,7 In this context, it is worth mentioning a previous study relating the amount of lipofuscin in the myocardium of heart transplant patients to the development of CAV.8
The objective of this study was to evaluate the deposition of lipofuscin in the myocardium after long-term heart transplantation and to investigate the relationship between the amount of lipofuscin in the myocardium and the presence and severity of CAV.
Methods
From 2008 to 2014, 176 adult patients underwent heart transplantation at our hospital. The inclusion criteria for this retrospective study were: 1) clinical follow-up in our hospital for more than 4 years after transplantation; 2) present endomyocardial biopsy without significant acute cellular rejection (grade ≤ 1R) obtained at least 4 years after transplantation (late biopsy), as representative of the late condition of the transplanted heart; 3) present endomyocardial biopsy without significant acute cellular rejection (grade ≤ 1R) obtained up to the second month after transplantation (baseline biopsy), as representative of the baseline condition of the transplanted organ (normal heart); and 4) present coronary angiography for evaluation of CAV, performed between 6 months before and 6 months after the date of collection of the late biopsy. We selected 25/176 (14.2%) patients, according to the flowchart shown in Figure 1. All biopsies and coronary angiographies were performed in the context of routine clinical follow-up of the transplanted patient.
Flowchart for patient selection.
The presence and severity of CAV were defined according to the 2010 consensus of the International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT),7 and classified as grade 0 (not significant), grade 1 (mild), grade 2 (moderate) or grade 3 (severe), based on the review of angiographic reports and images.
Histological 3-μm sections obtained from the paraffin blocks of the endomyocardial biopsies were stained with periodic acid-Schiff (PAS) after digestion with diastase to remove glycogen, to highlight the lipofuscin granules. The amount of lipofuscin in the myocardium was calculated by averaging the fractional area of the cytoplasm occupied by the pigment in 4 non-coincident microscopic fields, visualized under a microscope (Axioskop 2 plus, Zeiss, Jena, Germany) with an X 1,000 magnification. A point counting method was used,9 by superimposing a computerized grid of 525 equidistant points to the microscopic fields, with the aid of the AxioVision software (Zeiss, Jena, Germany). A pathologist performed the evaluation without prior knowledge of whether the measured biopsies were baseline or late.
Statistical analysis
Quantitative data were expressed as mean ± standard deviation or median (25th percentile-75th percentile). Pearson's correlation test was used to evaluate the correlation between age and the amount of lipofuscin in the biopsies. Mann-Whitney rank test was used to compare the amount of lipofuscin in baseline and late biopsies considering the same cardiac age (grouped by decades) and to compare the amount of lipofuscin in late biopsies between patients who had or did not have moderate/severe CAV. The significance level was considered if p≤0.05.
Results
Fourteen (56%) of the 25 patients included in this study were men. The time elapsed from transplantation to collection of the late biopsy ranged from 4 to 10.1 years, with a median of 6.1 (4.43-7.43) years. Cardiac age at baseline biopsy collection (donor age), the time elapsed from transplantation to late biopsy collection, cardiac age at the time of late biopsy collection (donor age + years elapsed until late biopsy collection), the amount of lipofuscin in the baseline and late biopsies and the grade of CAV are presented in Table 1.
Cardiac age at baseline and late transplantation period, time elapsed until late biopsy procedure (Δ T), fractional area (%) occupied by lipofuscin in baseline and late biopsies, and CAV grade of patients
Baseline cardiac age (years)
Δ T (years)
Late cardiac age (years)
Baseline biopsy lipofuscin (%)
Late biopsy lipofuscin (%)
CAV grade
25
6.8
31.8
1.38
3.01
0
38
4.1
42.1
1.88
1.57
3
33
4.0
37.0
0.89
1.76
0
34
6.3
40.3
1.33
1.72
0
29
4.5
33.5
1.32
2.50
0
27
4.9
31.9
0.81
1.53
0
20
4.3
24.3
0.81
1.43
0
15
4.7
19.7
0.67
1.48
0
40
4.1
44.1
1.43
2.62
1
26
4.7
30.7
1.48
1.62
1
37
4.0
41.0
2.03
3.01
0
18
10.8
28.8
0.48
1.24
1
22
9.1
31.1
0.71
2.48
0
43
10.1
53.1
1.36
3.45
2
44
7.6
51.6
2.01
3.82
0
21
6.9
27.9
0.90
2.67
0
43
8.4
51.4
1.87
2.25
2
33
8.2
41.2
1.52
2.05
2
26
5.6
31.6
1.30
2.57
0
19
5.1
24.1
0.34
1.48
0
26
6.7
32.7
1.39
1.26
0
27
4.2
31.2
0.95
1.62
0
23
7.2
30.2
1.00
2.05
3
43
6.9
49.9
2.16
2.34
0
21
6.1
27.1
1.05
2.87
2
CAV: cardiac allograft vasculopathy.
A representative image of a microscopic field of an endomyocardial biopsy demonstrating lipofuscin deposition in the myocardium (magnification: X 1,000) is shown in Figure 2.
Granules of lipofuscin (arrows) in the cytoplasm of cardiomyocytes stained purple-red by periodic acid-Schiff (PAS) after digestion with diastase. In this image, the fractional area occupied by lipofuscin measured 1.71%.
There was a positive correlation between cardiac age and the amount of lipofuscin in both baseline (normal heart) and late condition of the transplanted heart. However, the correlation coefficient in the baseline condition (p<0.001; r=0.827) was considerably higher than in the late condition (p=0.008; r=0.516). The data scatter plot is shown in Figure 3.
Multiple dispersion graph relating the age of the heart with the fractional area occupied by lipofuscin in basal and late endomyocardial biopsies.
The amount of lipofuscin in late biopsies was higher than in baseline biopsies, considering the same cardiac age grouped by decades. The median of the fractional area occupied by lipofuscin was 1.03 (0.83-1.37) in baseline biopsies (n=12) and 1.48 (1.34-2.77) in late biopsies (n=5) of hearts aged 20-29 years; 1.52 (1.11-1.96) in baseline biopsies (n=5) and 1.91 (1.60-2.52) in late biopsies (n=10) of hearts aged 30–39-year; and 1.87 (1.40-2.09) in baseline biopsies (n=5) and 2.20 (1.68-2.72) in late biopsies (n=6) of hearts aged 40-49 years. However, the difference in the amount of lipofuscin between baseline and late biopsies was statistically significant only in the decade of 20-29 years of cardiac age (p=0.015).
The median of the fractional area occupied by lipofuscin in late biopsies of patients with moderate/severe CAV (n=6) or with non-significant/mild CAV (n=19) was 2.15 (1.93-3.02) and 1.76 (1.48-2.62) respectively, with no statistical difference between the groups. Patients with moderate/severe CAV had a higher cardiac age (mean: 40.8 ± 10.7 years) than those with non-significant/mild CAV (mean: 33.9 ± 8.4 years), with no statistical difference between the groups.
Discussion
The lipofuscin pigment originates from the oxidative damage of cytoplasmic organelles, particularly mitochondria, which are engulfed by lysosomes in the process of autophagy. Alternatively, the pigment may originate directly in the cytoplasm by oxidized proteins not cleaved by the proteasome. Lipofuscin is not degradable, so the pigment accumulates in the cytoplasm of long-lived post-mitotic cells, reflecting the characteristic cellular wear and tear of aging.2,3
Except for cachexia, there is controversy as to whether the rate of lipofuscin deposition in the myocardium can be altered by factors other than age. In a previous study, the fractional area occupied by lipofuscin in the myocardium did not differ in patients with heart failure of ischemic or hypertrophic origin when compared to patients with normal hearts of the same age.4 On the other hand, studying young patients with dilated cardiomyopathy, it was described that those with better left ventricular ejection fraction had higher amounts of lipofuscin.10 More recently, there is a report of lipofuscin accumulation in the hypertrophic cardiomyocytes of a 16-year-old patient with cardiac conduction defect associated with mutation of the sodium voltage-gated channel alpha subunit 5 gene (SCN5A).11
To the best of our knowledge, only one study focuses on lipofuscin deposition in the myocardium after heart transplantation.8 In that study, the authors suggested that the detection of lipofuscin in endomyocardial biopsies obtained late (12 months) after heart transplantation could be predictive of the development of CAV. However, the age of the donors was not clearly determined, and the evaluation of lipofuscin in the biopsies was only qualitative, not quantitative.
In the present study, we showed a strong positive correlation between age and the amount of lipofuscin in newly transplanted hearts, presumably normal, represented by baseline endomyocardial biopsies. The correlation coefficient in this situation was 0.827, quite similar to the coefficients obtained in previous studies on normal hearts.1,4 However, the correlation coefficient between the amount of lipofuscin and cardiac age was much lower (0.516) for the samples obtained from hearts transplanted a long time ago (late biopsies). In addition, lipofuscin deposits in the myocardium were shown to be increased after long-term transplantation when compared to newly transplanted hearts of the same age, grouped by decade. These findings point to a higher turnover of cell organelles and greater oxidative stress of cardiomyocytes in long-term transplants, suggesting early aging of the transplanted heart.
The hypothesis of premature aging of the transplanted heart, and perhaps also of other solid organs, is interesting as it could help to explain the relatively short functional survival of transplanted solid organs compared to native organs. However, this theory needs to be confirmed by other studies involving a greater number of transplanted patients, different types of transplants, and multiple methods of assessing aging.
Although our study was limited by the small number of biopsies analyzed and the number of patients who developed moderate or severe CAV, we found no association between the amount of lipofuscin in the myocardium of long-term transplant patients and the development of CAV.
Sources of funding
There were no external funding sources for this study.
Study association
This study is not associated with any thesis or dissertation work.
Ethics approval and consent to participate
This article does not contain any studies with human participants or animals performed by any of the authors.
Acknowledgments
We want to thank Dr. José Felipe Cardoso Braz and Dr. Ciro Mancilha Murad, who reviewed the medical records of transplanted patients between 2008 and 2014 to obtain data from coronary angiographies.