Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC 8VPm6d5Jqmz3FZd8C8jzVVp S0066-782X2023000100309 00309 10.36660/abc.20220396 Artigo Original Efeitos do Treinamento Intervalado de Alta Intensidade e do Treinamento Contínuo na Capacidade de Exercício, Variabilidade da Frequência Cardíaca e em Corações Isolados em Ratos Diabéticos Souza Eduardo Gomes de Neto 1 Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito 0000-0003-3338-8948 Peixoto João Victor Capelli 1 Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Redação do manuscrito Rank Claucio Filho 1 Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Redação do manuscrito 0000-0001-7735-1077 Petterle Ricardo Rasmussen 2 Análise e interpretação dos dados Análise estatística Fogaça Rosalvo Tadeu Hochmuller 1 Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante Wolska Beata Maria 3 Análise e interpretação dos dados Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante 0000-0003-3951-2604 Dias Fernando Augusto Lavezzo 1 Concepção e desenho da pesquisa Análise e interpretação dos dados Análise estatística Obtenção de financiamento Redação do manuscrito Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante Universidade Federal do Paraná Departamento de Fisiologia Curitiba PR Brasil Universidade Federal do Paraná – Departamento de Fisiologia , Curitiba , PR – Brasil Universidade Federal do Paraná Departamento de Medicina Integrada Curitiba PR Brasil Universidade Federal do Paraná – Departamento de Medicina Integrada , Curitiba , PR – Brasil University of Illinois at Chicago Chicago Illinois EUA University of Illinois at Chicago – Medicine, Physiology and Biophysics, Chicago , Illinois – EUA Correspondência: Fernando Augusto Lavezzo Dias • Universidade Federal do Paraná – Fisiologia – Av. Francisco H. dos Santos, 100. CEP 81531-980, Curitiba, PR – Brasil E-mail: fernandoaldias@gmail.com , faldias@ufpr.br

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo

 09 01 2023 2023 120 1 e20220396 31 08 2021 04 06 2022 21 09 2022 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

O treinamento intervalado de alta intensidade (HIIT) tem sido sugerido como alternativa ao treinamento contínuo (TC) em indivíduos com diabetes mellitus (DM) devido à sua curta duração e potencial para melhorar a adesão ao exercício. No entanto, dados sobre seu impacto sobre a variabilidade da frequência cardíaca (VFC) são escassos.

 Objetivos

Avaliar e comparar os efeitos do HIIT e TC sobre a capacidade no exercício, VFC e corações isolados em ratos diabéticos.

 Métodos

Animais diabéticos (estreptozotocina intravenosa, 45 mg.kg -1 ) e controles (C) realizaram 20 sessões de TC (5 dias/semana, 50 min, por quatro semanas) em esteira (70% da capacidade máxima de exercício) ou HIIT (ciclos de 1:1min a 50% e 90% da capacidade máxima de exercício). A VFC foi avaliada por eletrocardiograma contínuo, e a função cardíaca foi avaliada em corações isolados perfundidos. Para a análise dos dados, utilizamos a matriz do modelo linear generalizado de covariância multivariada ou o teste one-way ANOVA seguido pelo teste de Tukey, considerando um valor de p<0,05 como significativo.

 Resultados

A capacidade de exercício (m/min) foi maior no grupo submetido ao HIIT [DM-HIIT: 36,5 (IIQ 30,0-41,3); C-HIIT: 41,5 (37,8-44,5), ambos n=10) em comparação ao grupo submetido ao TC [DM-TC: 29,0 (23,8-33,0); C-TC: 32,0 (29,5-37,0), ambos n=10) (p<0,001). A frequência cardíaca (bpm) foi mais baixa no grupo DM em comparação aos controles (p<0,001) tanto in vivo (DM-HIIT: 348±51, C-HIIT:441±66, DM-TC:361±70, C-TC:437±38) como nos corações isolados. Não houve diferenças na VFC entre os grupos. Os valores máximos e mínimos de dP/dt foram reduzidos no DM, com exceção da +dP/dt no grupo DM-HIIT vs. C-HIIT (diferença média: 595,5±250,3, p=0,190).

 Conclusão

O HIIT de curto prazo promoveu melhora superior no desempenho no exercício em comparação ao TC, sem causar mudanças significativas na variabilidade da frequência cardíaca.

 Exercício Esforço Físico Diabetes Mellitus Ratos Frequência Cardíaca MSDecit 09/2016 Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado por PPSUS 2015 Fundação Araucária-PR/SESA-PR/CNPq/MSDecit e Chamada Pública 09/2016-PBA - Fundação Araucária-PR. Introdução

Diabetes mellitus (DM) é um fator de risco para doenças cardiovasculares e está associado com mortalidade por todas as causas e mortalidade cardiovascular mais elevadas. 1 Entre as complicações conhecidas do DM encontra-se a neuropatia. 2

A neuropatia autonômica cardíaca (NAC), frequentemente observada em indivíduos com DM, 3 afeta as fibras autonômicas que inervam o coração e os vasos sanguíneos. 4 Um comprometimento da função nervosa causa alterações fisiológicas, tais como aumento da frequência cardíaca (FC) e redução na variabilidade da frequência cardíaca (VFC) em repouso nesses indivíduos. 5 Além dos pacientes com DM, reduções na VFC também são relatadas em doenças relacionadas ao estilo de vida sedentário, tais como hipertensão, 6 obesidade, 7 e infarto do miocárdio. 8 Assim, a prática regular de exercícios físicos tornou-se uma importante ferramenta na promoção da saúde. 9

Animais diabéticos apresentam capacidade física reduzida em comparação a controles. 10 , 11 No coração, essa condição reflete negativamente na função sistólica 10 - 12 e diastólica 10 e está associada à sobrecarga cardíaca. 10 O treinamento físico restaura a capacidade funcional, com melhora na disfunção cardíaca, em animais diabéticos. 10 , 11 , 13 Contudo, a magnitude da melhora depende da intensidade do exercício e pode ser dependente da modalidade do treinamento. 13 , 14

O HIIT (Treino Intervalado de Alta Intensidade, ou high-intensity interval training em inglês) tem sido considerado uma maneira eficaz de aumentar a regularidade na prática de atividade física devido à menor duração 15 e melhores respostas adaptativas em comparação ao treinamento contínuo (TC). Por isso, o HIIT tem sido sugerido para indivíduos diabéticos, 16 - 18 mesmo sem um conhecimento aprofundado acerca das repercussões fisiológica no controle autonômico cardíaco nessa população. 19 Evidência clara da segurança do HIIT, bem como dos efeitos benéficos sobre o sistema, se faz necessária para a recomendação do HIIT a pacientes diabéticos.

Nossa hipótese é a de que, em comparação ao TC, o programa de HIIT melhore a capacidade de exercício, mas exerça efeitos diferentes sobre a VFC e a contratilidade cardíaca em um modelo de DM induzido por estreptozotocina (STZ). Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar, em ratos com DM induzido por STZ, os efeitos de um protocolo de curto prazo de HIIT ou de TC sobre a capacidade de exercício, a VFC avaliada por eletrocardiograma (ECG) e sobre a função cardíaca em coração isolado perfundido.

 Métodos Animais e delineamento experimental

Sessenta ratos Wistar machos, com peso entre 250 e 300 g foram mantidos em gaiolas sob condições controladas de temperatura e ciclo claro-escuro de 12 horas, com livre acesso a alimentos e água, e separados aleatoriamente em grupo controle (C, n=30) e grupo DM (DM, n=30). Esses grupos foram subdivididos em animais controles não treinados (C-NT, n=10), animais diabéticos não treinados (DM-NT, n=10), animais controles em TC (C-TC, n=10), animais diabéticos em TC (DM-TC, n=10), animais controles em HIIT (C-HIIT, n=10) e animais diabéticos em HIIT (DM-HIIT, n=10). Todos os protocolos experimentais usados no estudo foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Setor de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Paraná (CEUA-BIO – UFPR) (número de aprovação: AEEC-866), e conduzidos de acordo com as diretrizes do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).

O tamanho da amostra inicial foi calculado usando o GPower 3.1, com base na porcentagem de aumento da capacidade de exercício observado em estudos anteriores. Foram considerados seis grupos independentes com mesmo número (n) de animais, tamanho do efeito de 0,6, poder de 0,85, e alfa de 0,05, resultando em um tamanho amostral de 48 animais (oito por grupo).

O delineamento experimental está representado na Figura 1 e descrito detalhadamente a seguir.

Diagrama do delineamento experimental; ECG: eletrocardiograma; DM: Diabetes mellitus.

Implantação dos eletrodos e indução de DM

Após 14 horas de jejum, os animais foram anestesiados com cetamina (80 mg kg -1 , Ketalex, Dechra, Brasil) e xilazina (10 mg kg -1 , Xilazin, Syntec, Brasil) para o procedimento. Quatro eletrodos (aço inoxidável, 0,5 mm) subcutâneos foram implantados posteriormente aos membros inferiores e superiores, conforme descrito por Marques Neto et al., 20 para o monitoramento por ECG. O DM foi induzido por injeção intravenosa (veia peniana) de STZ (45 mg.kg -1 , Sigma-Aldrich, Alemanha) solubilizada com 0,01M de tampão citrato, pH 4,5. 21 No grupo controle, somente tampão citrato foi injetado. A glicemia capilar (precedida de seis horas de jejum) foi medida a partir de amostra colhida da cauda dos animais, por meio de um glicosímetro digital (Accu-check Performa, Roche Diagnostic, Alemanha). As medidas foram realizadas antes da injeção de STZ, sete dias após a injeção para confirmação do estado hiperglicêmico (glicemia de jejum >250 mg dL -1 ), bem como no início, no 15º dia, e no final do protocolo de treinamento.

 Monitoramento por ECG e cálculo da VFC

Os animais foram mantidos em gaiolas individuais e o ECG foi registrado 24 horas após a confirmação do DM, antes do teste de desempenho (descrito abaixo), e repetido uma vez por semana durante as quatro semanas do protocolo de exercício. As medidas foram realizadas por uma hora, sempre pela manhã, para evitar a influência do ciclo circadiano, 22 sem restrição ou anestesia (cabos foram conectados aos fios implantados, mas os animais eram capazes de se moverem dentro das gaiolas). Os experimentos foram realizados em uma sala reservada e silenciosa, a uma temperatura de 20 o C.

No ECG, imagens do plano frontal foram adquiridas usando o sistema PowerLab, modelo 26T (AD Instrument, Austrália) e analisadas usando o programa Lab Chart versão 7.0 (AD Instrument, Austrália). Para a VFC, os dados obtidos da derivação DII foram processados no LabChart e em seguida transferidos para o Kubius HRV (2.0 MATLAB, MathWorks, Inc., Finlândia) para análises.

A VFC foi medida a partir da aquisição de intervalos R-R em resolução de 1 milissegundo. Os dados foram analisados nos domínios do tempo e da frequência, usando a área de maior estabilidade nos intervalos R-R, correspondendo a 10 minutos de registros. Para os parâmetros do domínio tempo, calculamos o desvio padrão dos intervalos RR normais (SDNN), a raiz quadrada da média dos quadrados das diferenças entre os intervalos RR (RR SDNN), e a FC. Os domínios da frequência foram analisados pela transformada rápida de Fourier após subtrair a tendência linear utilizando-se filtros automáticos. Depois calculamos a baixa frequência (LF) (0,20 a 0,75 Hz), a alta frequência (HF) (0,75 a 3Hz) e a razão LF/HF. Ainda, foi realizada a análise não linear para SD1 (desvio padrão da variabilidade instantânea RR) e SD2 (desvio padrão da variabilidade contínua ou de longo prazo da FC). 23

 Teste de desempenho e protocolo de treinamento

O treinamento do exercício foi realizado em uma esteira motorizada desenhada para roedores (Insight Equipamentos Ltda, Brasil), cuja velocidade é controlada por um computador. Tanto o teste de desempenho como o protocolo de treinamento foram adaptados de Pereira et al. 24

Vinte e quatro horas após a confirmação do DM, os animais começaram a ser adaptados a correrem sobre a esteira. A adaptação foi conduzida em cinco dias consecutivos, 50 minutos por dia, sem inclinação. No primeiro dia, os animais caminharam a 5m/min. A velocidade foi aumentada a 1m/min por dia. No sexto dia, os animais foram submetidos a um protocolo de exaustão, com objetivo de identificar a velocidade máxima de corrida de cada animal. O teste consistiu em exercício graduado (sem inclinação), começando a 5m/min, com incrementos de 1m/min a cada minuto, até a velocidade máxima de corrida alcançada por cada rato (exaustão). Quando o animal não pôde manter a velocidade por um minuto, a velocidade anterior em que os animais conseguiram correr foi considerara como a velocidade máxima atingida.

As sessões de treinamento começaram 48 horas após o teste, e foram realizadas cinco vezes por semana (de segunda-feira a sexta-feira) por quatro semanas, 50 minutos por sessão. Todas as sessões iniciaram com um aquecimento de cinco minutos e terminaram com um resfriamento a 5m/min por cinco minutos. Os grupos de TC correram a 70% da capacidade máxima individual por 40 minutos. Os grupos de HIIT correram a 90% da capacidade máxima individual por um minuto, intercalado por um minuto a 50% por 40 minutos. Os grupos não treinados foram mantidos sobre a esteira por 50 minutos sem se exercitarem. Após 48 horas da última sessão de treinamento, os animais foram novamente submetidos ao teste de desempenho descrito acima.

 Função cardíaca no coração isolado perfundido

A função cardíaca foi avaliada em corações isolados perfundidos como descrito anteriormente. 25 Em resumo, os animais foram pesados, anestesiados com injeção intraperitoneal de cetamina (80 mg kg -1 ) e xilazina (20 mg kg -1 ), e submetidos à eutanásia por exsanguinação. O peito foi aberto, o coração coletado e rapidamente transferido para um sistema de perfusão Langendorff, permitindo perfusão imediata com solução de Krebs-Henseleit. Essa solução apresentava a seguinte composição (em mM): NaCl = 118,5; KCl = 5, CaCl 2 = 1,5; KH 2 PO 4 = 2,0; MgSO 4 = 1,2; NaHCO 3 = 26 e glicose = 10, mantida a pH 7,4, e gaseificada com uma mistura de O 2 (95%) e CO 2 (5%) a 37°C e pressão de perfusão constante de 60 mmHg. Para a medida da pressão ventricular esquerda, uma porção do átrio esquerdo foi removido, e um balão conectado a um transdutor de pressão (WPI-rBPI, USA) foi inserido no ventrículo esquerdo através da valva mitral. O volume do balão foi gradualmente ajustado para obter a pressão máxima desenvolvida em batimentos cardíacos espontâneos. Os dados foram obtidos pelo sistema de aquisição PowerLab 26T e analisados pelo programa Lab Chart versão 7.3.7 (AD Instruments, Austrália).

 Análise estatística

Os resultados foram expressos como média e desvio padrão ou mediana e intervalo interquartil para dados não paramétricos. Para análises dos dados, usamos a matriz do modelo linear generalizado de covariância multivariada 26 por meio do pacote McGLM 27 e correção apropriada para a distribuição dos dados usando o teste Tweedie. Utilizamos o teste de Shapiro-Wilk para avaliar se as variáveis seguiam uma distribuição normal. Para dados do coração isolado, uma vez que possuíamos apenas um ponto de medida, usamos o teste one-way ANOVA e o teste de Tukey para comparações múltiplas.

Para análise e plotagem dos dados, usamos o programa R (the R foundation, https://www.r-project.org/), ou o programa Graph Pad Prism 8 (Graph Pad Software, San Diego, California, USA). O nível de significância adotado foi p < 0,05.

 Resultados Peso corporal e capacidade de exercício

Peso corporal, glicemia e capacidade no exercício antes e após o protocolo de exercício nos animais controles e diabéticos estão apresentados na Tabela 1 . Não foram observadas diferenças de peso corporal entre os grupos (0,877) no basal. O peso diminuiu no grupo DM (estimativa: -19,1; p<0,001) e aumentou no grupo controle (estimativa: 66,57, p<0,001) durante o acompanhamento. O peso corporal foi significativamente mais baixo em animais diabéticos em comparação aos controles após o período de exercício (p<0,001). Não houve efeito da modalidade do exercício sobre a alteração de peso corporal após o período de acompanhamento (p=0,91 ao se comparar as modalidades de exercício).

Peso corporal, glicemia, e capacidade no exercício em animais diabéticos e controles antes e após o protocolo de exercício
C-NT (n=10) DM-NT (n=10) C-CT (n=10) DM-CT (n=10) C-HIIT (n=10) DM-HIIT (n=10)
Peso corporal (g)
Antes 266,50 ± 8,41 281,00 ± 22,53 261,00 ± 26,23 250,80 ± 16,71 261,10 ± 22,61 259,80± 19,27
Após 342,60 ± 13,18 a 257,40 ± 33,27 a,b 320,30 ± 31,71 a 247,00 ± 44,22 a,b 325,40 ± 16,31 a 229,90 ± 24,28 a,b
Glicemia(mg/dL)
Antes 94,60 ± 10,33 462,90 ± 61,21 b 102,50 ± 3,69 450,00 ± 143,5 b 106,30 ± 10,33 489,60 ± 72,22 b
Após 94,30 ± 5,48 504,20 ± 66,55 a,b 104,10 ± 7,31 542,00 ± 60,60 a,b 106,00 ± 8,97 521,90 ± 64,08 a,b
Velocidade máxima de corrida (m/min)
Antes 27,00 (25,75-29,25) 25,5 (23,00-27,25) 25,00 (24,50-28,00) 24,50 (23,25-25,00) 25,00 (24,50-31,00) 24,50 (20,75-25,00)
Após 25,00(23,75-25,50) a 21,50 (19,00-25,25) a 32,00 (29,50-37,00) a,c 29,00 (23,75-33,00) a,c 41,50 (37,75-44,50) a,c,d 36,50 (30,00-41,25) acd

Dados expressos em média ± DP ou mediana (intervalo interquartil). a Diferença estatisticamente significativa (p<0,01) em comparação a antes do exercício (basal); b Diferença estatisticamente significativa (p<0,01) em comparação ao controle; c Diferença estatisticamente significativa (p<0,01) em comparação ao grupo não treinado; d Diferença estatisticamente significativa (p<0,01) em comparação ao grupo submetido a treinamento contínuo; C-NT: animais controles não treinados; DM-NT: animais diabéticos não treinados; C-TC animais controles em treinamento contínuo (C-TC, n=10), DM-TC: animais diabéticos em treinamento contínuo; C-HIIT: animais controles em treinamento intervalado de alta intensidade; DM-HIIT: animais diabéticos em treinamento intervalado de alta intensidade

Os valores de glicemia foram mais altos nos animais diabéticos em comparação aos animais controles no basal (estimativa: 366,4g/dL; p<0,001) e no seguimento (estimativa: 421,2mg/dL; p<0,001). A glicemia aumentou ainda mais durante o seguimento no grupo DM mas não no grupo C (p=0,982). Não houve efeito significativo do exercício sobre os níveis glicêmicos ( Tabela 1 ).

A velocidade máxima de corrida não foi diferente entre os grupos no basal. Animais não treinados demonstraram uma redução significativa na velocidade máxima de corrida no seguimento. Embora ambas as modalidades de exercício tenham melhorado a velocidade máxima de corrida, o HIIT promoveu maior desempenho em comparação ao TC. A média da velocidade máxima de corrida aumentou em 27.3% no C-TC e 21,4% no DM-TC. Os animais submetidos ao treino intervalado tiveram sua capacidade aumentada, em média, em 52,9% no grupo C-HIIT e 57,7% no grupo DM-HIIT. Não houve diferença entre DM e controles na variação da velocidade máxima de corrida promovida pelo protocolo de exercício no seguimento (ausência de significância estatística quando a interação tripla foi avaliada).

 Domínios de tempo e frequência, e medidas não lineares da VFC

Parâmetros da FC e da VFC durante o período experimental estão resumidos na Tabela 2 . Não foram observadas diferenças nos parâmetros de VFC relacionadas à variabilidade global ou ao equilíbrio simpático-vagal entre os grupos antes ou após o protocolo de exercício. No entanto, observou-se uma redução na FC entre os animais com DM e animais controles.

Parâmetros de frequência cardíaca e variabilidade da frequência cardíaca em ratos diabéticos e ratos controles antes e após o protocolo do exercício
C-NT DM-NT C-TC DM-TC C-HIIT DM-HIIT
Frequência cardíaca (bpm)
Antes 404,15 ± 49,33 358,15 ± 41,51 b 405,62 ± 42,30 372,06 ± 50,80 b 411,47 ± 32,37 339,50 ± 50,52 b
Após 405,74 ± 36,48 342,69 ± 43,89 b 436,74 ± 38,21 361,18 ± 70,72 b 441,26 ± 66,60 347,80 ± 50,56 b
SDNN (ms)
Antes 7,20 (5,84-10,14) 10,25 (6,26-15,03) 6,37 (4,51-8,08) 8,33 (5,81-13,61) 10,69 (6,44-11,84) 9,11 (6,91-11,22)
Após 6,20 (5,440-9,00) 11,54 (6,59-13,92) 8,30 (5,90-11,83) 10,49 (7,00-13,91) 8,52 (5,86-12,08) 7,94 (6,14-10,03)
RMSSD (ms)
Antes 3,56 (2,37-3,66) 2,57 (2,15-3,64) 3,13 (2,16-4,05) 3,25 (2,29-3,54) 3,01 (2,56-4,20) 3,13 (2,20-5,72)
Após 3,06 (2,26-4,05) 4,21 (2,41-5,20) 2,91 (2,02-4,41) 3,44 (2,59-4,26) 2,80 (1,89-3,765) 2,67 (1,90-3,64)
Potência total (ms 2 )
Antes 36,02 (26,69-59,07) 66,97 (16,97-129,4) 32,99 (14,93-59,02) 38,62 (32,32-103,8) 62,89 (31,87-92,58) 58,05 (22,33-81,79)
Após 33,91 (20,56-64,02) 83,56 (34,71-115,4) 65,14 (25,50-138,9) 79,64 (32,93-143,3) 60,77 (17,32-117,6) 42,32 (27,22-98,79)
LF (ms 2 )
Antes 3,63 (1,42-4,98) 1,93 (1,26-5,32) 2,31 (1,13-8,68) 2,20 (1,90-3,76) 2,45 (1,95-11,4) 3,40 (1,29-12,47)
Após 2,62 (1,51-7,91) 5,88 (1,72-13,86) 2,37 (0,71-15,36) 2,78 (1,84-6,57) 3,09 (1,41-7,37) 3,25 (1,65-5,17)
HF (ms 2 )
Antes 5,43 (3,45-6,33) 2,70 (1,16-7,79) 4,01 (1,44-9,31) 5,36 (2,08-7,59) 4,92 (3,06-9,81) 5,49 (1,44-9,31)
Após 4,02 (1,82-8,02) 6,23 (2,91-10,29) 4,03 (1,57-8,40) 4,12 (2,57-6,91) 4,33 (0,99-7,85) 1,87 (1,20-4,81)
LF/HF
Antes 0,79 (0,56-1,04) 0,78 (0,47-1,41) 0,55 (0,44-1,53) 0,74 (0,47-0,98) 0,66 (0,52-1,13) 0,91 (0,65-1,18)
Após 0,78 (0,57-1,44) 0,95 (0,59-1,46) 0,69 (0,40-1,42) 0,77 (0,43-1,04) 0,70 (0,49-1,00) 1,25 (0,79-1,75)
SD1
Antes 2,52 (1,68-2,59) 1,82 (1,52-2,58) 2,21 (1,53-2,86) 2,30 (1,62-2,50) 2,13 (1,81-2,97) 2,46 (1,56-4,04)
Após 2,16 (1,60-2,86) 2,98 (1,71-3,67) 2,06 (1,43-3,12) 2,44 (1,83-3,02) 1,98 (1,34-2,66) 1,89 (1,33-2,57)
SD2
Antes 9,94 (8,08-13,98) 14,29 (8,70-21,05) 8,49 (6,02-11,04) 11,59 (7,97-19,16) 14,80 (8,81-16,52) 12,17 (9,58-15,57)
Após 8,57 (7,42-12,39) 16,04 (9,24-19,41) 11,68 (8,06-16,43) 14,68 (9,58-19,32) 11,77 (8,07-16,91) 10,90 (8,53-14,06)

Dados apresentados em média DP ou mediana (intervalo interquartil). SDNN: desvio padrão dos intervalos RR normais; RR SDNN: raiz quadrada da média dos quadrados das diferenças entre os intervalos; LF: baixa frequência; HF: alta frequência; SD1: desvio padrão da variabilidade instantânea RR; SD2: desvio padrão da variabilidade contínua ou de longo prazo da frequência cardíaca. b Diferença estatisticamente significativa (p<0,01) em comparação ao controle; N é igual a 10 exceto para os parâmetros de variabilidade da frequência cardíaca no grupo C-TC (n=9). C-NT: animais controles não treinados; DM-NT: animais diabéticos não treinados; C-TC animais controles em treinamento contínuo (C-TC, n=10), DM-TC: animais diabéticos em treinamento contínuo; C-HIIT: animais controles em treinamento intervalado de alta intensidade; DM-HIIT: animais diabéticos em treinamento intervalado de alta intensidade

Coração isolado perfundido

A pressão no ventrículo esquerdo está representada na Figura 2 . Animais controles submetidos ao exercício diferiram-se dos grupos DM-NT, C-HIIT e DM-CT; contudo, não houve diferenças entre animais com DM e controles submetidos às mesmas condições ( i.e ., NT ou tipos diferentes de treinamento; p = 0,086 para animais NT, p = 0,061 para TC e p = 0,824 para HIIT).

Frequência cardíaca, pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo, e taxas máximas do aumento e da queda da pressão ventricular nos corações isolados. A: pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (PVE); B: taxa máxima do aumento (+dP/dt) e da queda (–dP/dt) da pressão ventricular; C: Frequência cardíaca (FC). *diferença significativamente estatística (p<0,01) em comparação a DM-NT, # diferença significativamente estatística (p<0,05) em comparação a DM-CT, § diferença significativamente estatística (p<0,05) em comparação a todos os grupos DM; C-NT: animais controles não treinados; DM-NT: animais diabéticos não treinados; C-TC animais controles em treinamento contínuo (C-TC, n=10), DM-TC: animais diabéticos em treinamento contínuo; C-HIIT: animais controles em treinamento intervalado de alta intensidade; DM-HIIT: animais diabéticos em treinamento intervalado de alta intensidade.

Diferenças significativas foram observadas em +dP/dt (mmHg/s) nos grupos DM em comparação aos respectivos controles (C-NT vs. DM-NT, diferença média: 812,8 ± 228,5, p = 0,012; C-CT vs. DM-CT, diferença média: 937,5 ± 207,7, p = 0,0008) exceto para HIIT (C-HIIT vs. DM-HIIT, diferença média: 595,5 ± 250,3, p = 0,190) ( Figura 2B ). Valores mais baixos também foram observados para–dP/dt ( Figura 2B ) em todos os grupos DM em comparação aos controles. FC espontânea ( Figura 2C ) reduziu em todos os grupos DM em comparação aos controles (C-NT vs. DM-NT, diferença média: 31,08 ± 8,48; C-CT vs. DM-CT, diferença média: 34,23 ± 7,71; C-HIIT vs. DM-HIIT, diferença média: 42,58 ± 9,29).

 Discussão

O presente estudo comparou, em ratos com DM induzido por STZ, os efeitos de 20 sessões de HIIT ou TC sobre a capacidade de exercício, função cardíaca e VFC. Nossos achados mostraram que ambos os tipos de treinamento melhoraram o desempenho no exercício, com melhores resultados obtidos com HIIT, em magnitudes comparáveis entre animais com DM e controles. Ainda, não houve diferenças na VFC entre controles e animais diabéticos após os protocolos de exercício.

Animais diabéticos submetidos ao treinamento aumentaram a capacidade de exercício ( Tabela 1 ), em contraste com animais sedentários, cuja velocidade máxima de corrida foi significativamente reduzida. No entanto, animais com DM e animais controles submetidos ao HIIT mostraram melhora superior na velocidade máxima de corrida em comparação aos animais submetidos ao TC, embora os níveis glicêmicos não tenham se alterado. A superioridade do treino intervalado sobre o TC havia sido descrita em um modelo de síndrome metabólica envolvendo ratos, em que o VO 2max foi superior e associado a uma maior redução na pressão arterial, melhor função endotelial, e ação superior da insulina. 14 Em um modelo de diabetes com camundongos, o HIIT reduziu a glicemia de jejum e aumentou a concentração de GLUT4 muscular, contudo, esse protocolo de estudo foi realizado por 10 semanas em comparação a quatro semanas em nosso estudo, o que pode explicar a diferença nos níveis de glicemia. 28 Ainda, em humanos, Driller et al., 29 mostraram melhora na potência, captação máxima de oxigênio, e limiar de lactado em remadores submetidos a HIIT em comparação ao treino convencional. Em pacientes com diabetes tipo 2, uma revisão sistemática recente descreveu um maior aumento no VO 2max no HIIT versus TC, sem diferenças significativas no HbA1c ou valores de pressão arterial entre as intervenções, similar a nossos achados. 30 A maior melhora na capacidade física encontrada em nosso estudo usando um HIIT de curto prazo está de acordo com respostas adaptativas promovidas em protocolos de HIIT previamente relatadas.

A análise da função cardíaca em corações isolados revelou que não houve diferença estatística na pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo em corações com batimentos espontâneos entre os grupos submetidos ao mesmo protocolo de exercício ( Figura 2A ). Contudo, o grupo DM-HIIT mostrou atenuação no distúrbio da razão +dP/dt, o que não foi observado no grupo DM-TC ( Figura 2B ). Não foi observada melhora na função diastólica, representada por -dP/dt, em nenhum dos grupos com DM submetidos aos exercícios ( Figura 2B ). Estudos prévios correlacionaram um aumento na capacidade do exercício com melhora na função sistólica em DM. Sanches et al., 10 usaram um protocolo combinado de exercício aeróbico (esteira) e treinamento resistido (escada) com exercícios de intensidade moderada (40-60% da capacidade máxima) durante oito semanas em ratas ovariectomizadas com diabetes induzido por STZ. Os autores demonstraram que um aumento em 66% na capacidade de corrida, em comparação ao grupo DM não treinado, preveniu a redução na fração de encurtamento e na velocidade do encurtamento da fibra, avaliadas por ecocardiografia. Quinteiro et al., 11 utilizando um protocolo de esteira de intensidade baixa a moderada (40-60% da velocidade máxima de corrida) durante oito semanas em ratas ovariectomizadas com diabetes induzido por STZ, observaram uma melhora de 74% na capacidade do exercício, em comparação ao grupo DM não treinado, o que também foi associado com melhora na fração de encurtamento e na velocidade de encurtamento da fibra. No presente estudo, o DM-HIIT melhorou em 57,7% a capacidade do exercício em comparação ao grupo DM-NT, enquanto essa melhora foi de apenas 21,4% no grupo DM-TC. Tal fato pode explicar a atenuação na função contrátil observada somente no grupo DM-HIIT. Ainda, nossos dados corroboram achados prévios apresentados por Khakdan et al., 13 que usaram a ecocardiografia para comparar a função sistólica em ratos diabéticos submetidos a oito semanas de TC (65% VO 2max ) ou HIIT (90%/40% VO 2max ) em uma esteira motorizada. O grupo HIIT melhorou a fração de ejeção e a fração de encurtamento em comparação aos valores pré-exercício, o que não foi observado no grupo TC. De acordo com o autor, o HIIT promoveu diminuição da expressão de miR-195 e microRNA, envolvidos na cardiopatia diabética.

Os efeitos do exercício sobre a contratilidade poderiam também estar relacionados com a atenuação de anormalidades no manejo do cálcio intracelular, o que se demonstrou deficiente no DM. 31 No coração diabético, redução na expressão e na atividade da SERCA, 32 na saída de Ca 2 através da RyR2, 33 e na expressão e atividade de NCX 34 são comumente relatadas. Todas essas alterações podem levar à sobrecarga de Ca 2 intracelular, 35 e contratilidade diminuída. 36 O treinamento diminui os níveis de diacilglicerol (DAG) no miocárdio, 37 normaliza a atividade de CaMKII, e atenua a fosforilação de RyR2 e vazamento de Ca 2 , atenuando a disfunção cardíaca.

Dada a escassez de dados investigando os efeitos de HIIT sobre o controle autonômico na população diabética, nós investigamos o impacto dessa modalidade de exercício sobre a VFC. 38 No entanto, nem o protocolo HIIT de curto prazo nem o TC prejudicou ou promoveu melhoras nos parâmetros de VFC em animais diabéticos durante o período avaliado. Tal fato demonstra que, embora uma maior demanda e uma maior ativação da função cardíaca seja necessária durante o ciclo de alta intensidade no HIIT, não houve um impacto negativo em curto prazo sobre a VFC, uma ferramenta para avaliação do controle autonômico. Dados de um ensaio clínico recente 39 demonstraram que mesmo após 12 semanas de HIIT não supervisionado em indivíduos com DM2, o exercício não afetou a VFC, corroborando nossos achados. Um protocolo de exercício de alta intensidade em uma esteira (treino não intervalado) de 10 semanas foi capaz de atenuar as alterações simpático-vagais relatadas (maior razão LF/HF) em ratos diabéticos sedentários em um modelo de hiperglicemia moderada. 40

Índices deficientes da VFC global, tais como SDNN e potência total foram observados 70 dias 41 e 80 dias 42 após a indução de DM por STZ. No segundo caso, 42 os índices deficientes da VFC global foram associados com uma redução na FC e na razão LF/HF. No entanto, Howarth et al., 43 relataram, em ratos após quatro semanas de tratamento com STZ, redução na FC e aumento na razão LF/HF. Por outro lado, nossos dados não demonstraram reduções na VFC 35 dias após o tratamento com STZ, o que sugere a possibilidade de nosso protocolo ter sido muito curto para induzir NAC.

Observamos, em animais diabéticos treinados, uma redução significativa na FC em comparação a seus respectivos controles no final do protocolo de exercício. Isso também foi observado na FC espontânea de corações isolados perfundidos de todos os grupos DM ( Figura 2C ). Diminuições na FC após a administração de STZ foram são comumente relatadas. 44 Tal fato pode ser, em parte, atribuído a um efeito tóxico da STZ no coração, 45 que pode levar à disfunção do nó sinoatrial. 44 , 46 A corrente funny (I f ), carregada por canais controlados por nucleotídeos cíclicos ativados por hiperpolarização (HCN) exerce função importante no controle da FC. 47 Nas células do nó sinoatrial, a isoforma do HCN mais abundante é o HCN4, seguido de HCN2. 48 Baruscotti et al., 47 mostraram em camundongos knock-out para HCN4 uma redução de 70% na corrente I f, 50% na FC e 60% na FC espontânea. Redução na expressão dos canais HCN e sua proporção pode ser a razão da disfunção na FC basal. No nódulo sinoatrial dos ratos com diabetes induzido por STZ, Huang et al., 44 demonstraram uma diminuição da expressão de 70% de HCN2 e 58% de HCN4, e Kondo et al., 46 relataram uma redução na expressão de HCN4 atribuída a um número reduzido de células no nódulo sinoatrial. Silva et al., 49 usando ivabradina, um bloqueador de HCN4, mostram reduções na FC sem alterações no controle autonômico cardíaco. Tal fato pode explicar a redução na FC sem impacto sobre a VFC durante o período de estudo.

Nosso estudo teve algumas limitações, como a curta duração do protocolo de intervenção e do acompanhamento, o qual não foi longo o suficiente para se detectar mudanças na VFC em animais diabéticos. Assim, estudos futuros são necessários para investigar os efeitos dos mesmos protocolos de exercícios em animais com DM e NAC. Ainda, nós conseguimos avaliar a função cardíaca em corações isolados somente em um momento. Uma avaliação repetida não invasiva, como por ecocardiografia, poderia determinar mudanças progressivas ocasionadas pelo HIIT na função cardíaca.

 Conclusões

HIIT de curto prazo promove maior melhora no desempenho no exercício em comparação ao TC, inclusive no DM, sem alterar de maneira significativa a VFC.

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Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de mestrado de Eduardo Gomes de Sousa Neto pelo Programa de Pós-Graduação em Fisiologia – Universidade Federal do Paraná.

Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado por PPSUS 2015 Fundação Araucária-PR/SESA-PR/CNPq/MSDecit e Chamada Pública 09/2016-PBA - Fundação Araucária-PR.

 Original Article Effects of High-Intensity Interval Training and Continuous Training on Exercise Capacity, Heart Rate Variability and Isolated Hearts in Diabetic Rats Souza Eduardo Gomes de Neto 1 Conception and design of the research Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript 0000-0003-3338-8948 Peixoto João Victor Capelli 1 Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Writing of the manuscript Rank Claucio Filho 1 Acquisition of data Analysis and interpretation of the data Writing of the manuscript 0000-0001-7735-1077 Petterle Ricardo Rasmussen 2 Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Fogaça Rosalvo Tadeu Hochmuller 1 Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for important intellectual content Wolska Beata Maria 3 Analysis and interpretation of the data Critical revision of the manuscript for important intellectual content 0000-0003-3951-2604 Dias Fernando Augusto Lavezzo 1 Conception and design of the research Analysis and interpretation of the data Statistical analysis Obtaining financing Writing of the manuscript Critical revision of the manuscript for important intellectual content Brazil Universidade Federal do Paraná – Departamento de Fisiologia, Curitiba, PR – Brazil Brazil Universidade Federal do Paraná – Departamento de Medicina Integrada, Curitiba, PR – Brazil USA University of Illinois at Chicago – Medicine, Physiology and Biophysics, Chicago, Illinois – USA Mailing Address: Fernando Augusto Lavezzo Dias • Universidade Federal do Paraná – Fisiologia – Av. Francisco H. dos Santos, 100. Postal Code 81531-980, Curitiba, PR – Brazil E-mail: fernandoaldias@gmail.com, faldias@ufpr.br

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background

High-intensity interval training (HIIT) has been suggested as an alternative for continuous training (CT) in people with diabetes mellitus (DM) due to its short duration and potential to improve adherence to exercise. However, data on its impact on heart rate variability (HRV) are scarce.

 Objectives

To assess and compare the effects of HIIT and CT on exercise capacity, HRV and isolated hearts in diabetic rats.

 Methods

DM (intravenous streptozotocin, 45 mg.kg -1 ) and control (C) animals performed 20 sessions (5 days/week, 50 min, for 4 weeks) of CT on a treadmill (70% of maximal exercise capacity) or HIIT (cycles of 1:1min at 50% and 90% of maximal exercise capacity). HRV was assessed by continuous electrocardiogram, and cardiac function assessed in isolated perfused hearts. For data analysis, we used the framework of the multivariate covariance generalized linear model or one-way ANOVA followed by Tukey’s test, considering p<0.05 as significant.

 Results

Higher exercise capacity (m/min) was achieved in HIIT (DM-HIIT: 36.5 [IQR 30.0-41.3]; C-HIIT: 41.5 [37.8-44.5], both n=10) compared to CT (DM-CT: 29.0 [23.8-33.0]; C-CT: 32.0 [29.5-37.0], both n=10) (p<0.001). Heart rate (bpm) was lower in DM compared to controls (p<0.001) both in vivo (DM-HIIT:348±51, C-HIIT:441±66, DM-CT:361±70, C-CT:437±38) and in isolated hearts. There were no differences in HRV between the groups. Maximum and minimal dP/dt were reduced in DM, except +dP/dt in DM-HIIT vs. C-HIIT (mean difference: 595.5±250.3, p=0.190).

 Conclusion

Short-term HIIT promotes greater improvement in exercise performance compared to CT, including in DM, without causing significant changes in HRV.

 Exercise Physical Exertion Diabetes Mellitus Rats Heart Rate Introduction

Diabetes mellitus (DM) is a risk factor for cardiovascular disease and is associated with higher all-cause and cardiovascular mortality. 1 Among the well-known DM complications is neuropathy. 2

Cardiovascular autonomic neuropathy (CAN), frequently observed in people with DM, 3 affects the autonomic fibers that innervate the heart and blood vessels. 4 Impaired nerve function causes physiological changes as increased heart rate (HR) and reduced heart rate variability (HRV) at rest in these individuals. 5 In addition to DM patients, reductions in HRV are also reported in diseases related to sedentary lifestyle such as hypertension, 6 obesity, 7 and myocardial infarction. 8 Therefore, the regular practice of physical exercise has become an important tool in health promotion. 9

Diabetic animals present reduced physical capacity when compared to controls. 10 , 11 In the heart, this condition reflects negatively on systolic 10 - 12 and diastolic function 10 and is also associated with cardiac overload. 10 Physical training restores the functional capacity of diabetic animals which is accompanied by improvement in cardiac dysfunction. 10 , 11 , 13 However, the magnitude of the improvement is dependent on exercise intensity and may depend on the modality of the exercise training. 13 , 14

High-intensity interval training (HIIT) has been considered an effective way to increase regularity in performing physical exercise due to short duration 15 and superior adaptive responses when compared to continuous training (CT). Thus, HIIT has been suggested for people with diabetes, 16 - 18 even without an in-depth knowledge of the physiological repercussions on autonomic cardiac control in this population. 19 Clear evidence of the safety of HIIT, and its beneficial effects on the cardiovascular system is necessary for its recommendation for DM patients.

We hypothesized that compared to CT, HIIT program improves exercise capacity but may have a different effect on HRV and cardiac contractility in a model of streptozotocin (STZ)-induced diabetes. Therefore, the objective of this study was to evaluate, in STZ-induced diabetic rats, the effects of short-term protocol of HIIT or CT on exercise capacity, HRV assessed by electrocardiogram (EKG), and on cardiac function in isolated perfused heart.

 Methods Animals and experimental design

Sixty male Wistar rats, weighing 250-300 g were kept in cages under controlled conditions of temperature and a light-dark cycle of 12 h, with free access to food and water and randomly divided in control (C, n=30) and DM groups (DM, n=30). These groups were subdivided in non-trained control (C-NT, n=10), non-trained diabetes (DM-NT, n=10), CT control (C-CT, n=10), DM animals in CT (DM-CT, n=10), interval training control (C-HIIT, n=10) and interval training diabetes (DM-HIIT, n=10). All experimental protocols used in this study were approved by the Ethics Committee Animal Experimentation of the Division of Biological Sciences of the Federal University of Paraná (approval number: AEEC-866) and conducted in accordance with the National Council on Animal Experimentation (CONCEA) guidelines.

Initial sample size was calculated using GPower 3.1 based on percentage increase of exercise capacity observed in previous experiments. Six independent groups of equal number (n), effect size of 0.6, power of 0.85, and alpha of 0.05, were considered, resulting in a sample size of 48 animals (eight per group).

The experimental design is represented in Figure 1 and described in detail below.

Schematic diagram of the experimental design; EKG: electrocardiogram; DM: diabetes mellitus.

Electrode implantation and DM induction

After 14 hours of fasting, all animals were anesthetized with ketamine (80 mg kg -1 , Ketalex, Dechra, Brazil) and xylazine (10 mg kg -1 , Xilazin, Syntec, Brazil) for the procedure. Four electrodes (stainless steel, 0.5mm) were subcutaneously implanted posterior to each limb as described by Marques Neto et al. 20 for EKG monitoring. DM was subsequently induced by an intravenous injection (penile vein) of STZ (45 mg.kg -1 , Sigma-Aldrich, Germany) solubilized in 0.01M of citrate buffer, pH 4.5. 21 In the control group, only citrate buffer was injected. For capillary glycemia (preceded from six-hour fasting) blood samples were collected from the rats’ tail vein and measured using a digital glucometer (Accu-check Performa, Roche Diagnostic, Germany) before the STZ injection, seven days after the injection to confirm the hyperglycemic state (fasting blood glucose >250 mg dL -1 ), and at the beginning, on the 15 th day and at the end of the training protocol.

 EKG monitoring and HRV calculation

Animals were kept in individual cages and EKG was recorded 24 hours after DM confirmation, before the exercise performance test (described below), and repeated once a week during the four weeks of the exercise protocol. Measurements were performed for one hour, always in the morning to avoid the influence of circadian cycle, 22 and without restriction or anesthesia (cables were attached to the implanted wires but animals were able to move inside the cages). Experiments were performed in a silent and reserved room, with a temperature of 20 o C.

Frontal plane EKG was acquired using a PowerLab, model 26T (AD Instrument, Australia) acquisition system and subsequently analyzed using Lab Chart version 7.0 software (AD Instrument, Australia). For HRV, data obtained from DII lead was processed in LabChart and later transferred to Kubius HRV (2.0 MATLAB, MathWorks, Inc., Finland) for analysis.

HRV was measured by acquiring RR intervals within one millisecond resolution. Data were analyzed in the time and frequency domains using the area of greatest stability in RR intervals corresponding to 10 minutes of recordings. For the time domain parameters, we calculated the normal-to-normal intervals (SDNN), the square root of the mean of the squares of successive RR interval differences (rMSSD), and HR. Frequency domains were analyzed by fast Fourier transform after subtracting the linear tendency using automatic filters. We then calculated low frequency (LF) (0.20 to 0.75 Hz), high frequency (HF) (0.75 to 3Hz) and the LF/HF ratio. Furthermore, non-linear analysis for SD1 (standard deviation of the instantaneous RR variability) and SD2 (standard deviation of the continuous or long term variability of the heart rate) was performed. 23

 Exercise performance test and training protocol

Exercise training was performed in a motorized treadmill designed for rodents (Insight Equipamentos Ltda, Brazil) with speed controlled by computer. The exercise performance test and the training protocol were adapted from Pereira et al. 24

Twenty-four hours after DM confirmation, the animals started to be adapted to run on the treadmill. The adaptation was performed on five consecutive days, 50 minutes per day, without inclination. On the first day, the animals walked at 5 m/min. The speed was increased by 1 m/min per day. On the sixth day, the animals were submitted to an exhaustion protocol aiming at identifying the maximum running speed of each animal. The test consisted of graded exercise (no incline) starting at 5 m/min with increments of 1 m/min every one minute, up to the maximal running speed attained by each rat (exhaustion). When the animal could not maintain the speed for a minute, the previous speed they were able to run was considered as the maximum attained speed.

The physical exercise training sessions started 48 hours after the test and were performed five times a week (Monday to Friday) for four weeks, 50 minutes per session. All sessions started with a 5-minute warm-up and ended with a 5-minute cool down at 5 m/min. The CT groups ran at 70% of the individual maximum capacity for 40 minutes. The interval training groups ran at 90% of the individual maximum capacity for one minute interspersed with one minute at 50% for 40 minutes. Non-trained groups remained on the treadmills for 50 minutes without exercising. After 48 hours from the last training session, the animals were resubmitted to the exercise performance test, as described above.

 Cardiac function in isolated perfused heart

Cardiac function was assessed in isolated perfused hearts as described before. 25 Briefly, animals were weighed, anesthetized with an intraperitoneal injection of ketamine (80 mg kg -1 ) and xylazine (20 mg kg -1 ), and euthanized by exsanguination. The chest was opened, the heart collected and quickly transferred to a Langendorff perfusion system, allowing immediate perfusion with Krebs-Henseleit’s solution. This solution had the following composition (in mM): NaCl = 118.5, KCl = 5, CaCl 2 = 1.5, KH 2 PO 4 = 2.0, MgSO 4 = 1.2, NaHCO 3 = 26 and glucose = 10, maintained at pH 7.4 and gassed with carbogen (95% O 2 /5% CO 2 ) at 37°C and constant perfusion pressure of 60 mmHg. For measurement of the left ventricular pressure, a portion of the left atrium was removed, and a plastic balloon connected to a pressure transducer (WPI-rBPI, USA) was inserted into the left ventricle through the mitral valve. The volume of the balloon was gradually adjusted to obtain the maximum developed pressure in spontaneous beating hearts. The data were obtained using an acquisition system PowerLab 26T and analyzed using Lab Chart version 7.3.7 software (AD Instruments, Australia).

 Statistical analysis

Results are expressed as mean values and standard deviation of the mean or median and interquartile range for non-parametric data. For data analysis, we used the framework of the multivariate covariance generalized linear model 26 through McGLM package 27 with appropriate correction for sample distribution using Tweedie test (using logarithmic link function for the linear predictor). We used the Shapiro-Wilk test to assess whether the variables followed a normal distribution. For data of isolated heart, since we only have one time-point, we used a one-way ANOVA and Tukey’s test for multiple comparisons.

For data analysis and plotting we used R software (The R foundation, https://www.r-project.org/), or plotting using Graph Pad Prism 8 (Graph Pad Software, San Diego, California, USA). The accepted level of significance was p < 0.05.

 Results Body weight, glycemia and exercise capacity

Body weight, glucose levels, and exercise capacity before and after the exercise protocol in control and diabetic animals are represented in Table 1 . No differences were observed for weight between the groups (p=0.877) at baseline. Weight decreased in DM animals (estimate: -19.1, p<0.001) and increased in controls (estimate: 66.57, p<0.001) during the follow-up. Body weight was significantly lower in diabetic animals compared to controls after the exercise protocol period (p<0.001). There was no effect of exercise modality on body weight change after the follow-up period (p=0.91 comparing exercise modalities).

Body weight, glycemia and exercise capacity in control and diabetic animals before and after the exercise protocol
C-NT (n=10) DM-NT (n=10) C-CT (n=10) DM-CT (n=10) C-HIIT (n=10) DM-HIIT (n=10)
Body weight (g)
Before 266.50 ± 8.41 281.00 ± 22.53 261.00 ± 26.23 250.80 ± 16.71 261.10 ± 22.61 259.80± 19.27
After 342.60 ± 13.18 a 257.40 ± 33.27 a b 320.30 ± 31.71 a 247.00 ± 44.22 a b 325.40 ± 16.31 a 229.90 ± 24.28 a b
Blood glucose (mg/dL -1 )
Before 94.60 ± 10.33 462.90 ± 61.21 b 102.50 ± 3.69 450.00 ± 143.5 b 106.30 ± 10.33 489.60 ± 72.22 b
After 94.30 ± 5.48 504.20 ± 66.55 a b 104.10 ± 7.31 542.00 ± 60.60 a b 106.00 ± 8.97 521.90 ± 64.08 a b
Maximum running speed (m/min)
Before 27.00 (25.75-29.25) 25.5 (23.00-27.25) 25.00 (24.50-28.00) 24.50 (23.25-25.00) 25.00 (24.50-31.00) 24.50 (20.75-25.00)
After 25.00(23.75-25.50) a 21.50 (19.00-25.25) a 32.00 (29.50-37.00) ac 29.00 (23.75-33.00) ac 41.50 (37.75-44.50) acd 36.50 (30.00-41.25) acd

Data are expressed as mean ± SD or median (interquartile range). a Statistically significantly different (p<0.001) when compared to before (baseline); b statistically significantly different (p<0.001) when compared to controls; c statistically significantly different (p<0.001) when compared with NT; d statistically significantly different (p<0.001) when compared to CT; C-NT: non-trained controls, DM-NT: non-trained diabetes; controls in continuous training; DM-CT: diabetic animals in continuous training; C-HIIT: control animals in high-intensity interval training; DM-HIIT : diabetic animals in high-intensity interval training

Glucose levels were higher in DM compared to controls at baseline (estimate: 366.4mg/dL, p<0.001) and at follow-up (estimate: 421.2mg/dL, p<0.001). The follow-up glucose levels further increased in DM animals but not in controls (p=0.982). There was no significant effect of exercise on blood glucose levels ( Table 1 ).

Maximum running speed was not different between the groups at baseline. Non-trained animals demonstrated a significant decrease in maximum running speed at follow-up. Although both exercise modalities improved maximum exercise speed, HIIT promoted higher exercise performance as compared to CT. Mean maximum running speed was increased by 27.3% in C-CT and 21.4% for DM-CT. Animals submitted to interval training had their exercise capacity increased by an average 52.9% for C-HIIT and 57.7% for DM-HIIT. There was no difference between DM and controls in the variation in maximum running speed promoted by the exercise protocol at follow-up (no statistical significance when triple interaction was assessed).

 Time and frequency domains, and nonlinear measures of HRV

Parameters of HR and HRV during the experimental period are summarized in Table 2 . There were no differences in HRV parameters related to global variability or sympathovagal balance between the groups before or after the exercise protocol. However, a reduction in heart rate between DM animals and controls was observed.

Heart rate and heart rate variability parameter in control and diabetic rats before and after the exercise protocol
C-NT DM-NT C-CT DM-CT C-HIIT DM-HIIT
Heart rate (bpm)
Before 404.15 ± 49.33 358.15 ± 41.51 b 405.62 ± 42.30 372.06 ± 50.80 b 411.47 ± 32.37 339.50 ± 50.52 b
After 405.74 ± 36.48 342.69 ± 43.89 b 436.74 ± 38.21 361.18 ± 70.72 b 441.26 ± 66.60 347.80 ± 50.56 b
SDNN (ms)
Before 7.20 (5.84-10.14) 10.25 (6.26-15.03) 6.37 (4.51-8.08) 8.33 (5.81-13.61) 10.69 (6.44-11.84) 9.11 (6.91-11.22)
After 6.20 (5.440-9.00) 11.54 (6.59-13.92) 8.30 (5.90-11.83) 10.49 (7.00-13.91) 8.52 (5.86-12.08) 7.94 (6.14-10.03)
RMSSD (ms)
Before 3.56 (2.37-3.66) 2.57 (2.15-3.64) 3.13 (2.16-4.05) 3.25 (2.29-3.54) 3.01 (2.56-4.20) 3.13 (2.20-5.72)
After 3.06 (2.26-4.05) 4.21 (2.41-5.20) 2.91 (2.02-4.41) 3.44 (2.59-4.26) 2.80 (1.89-3.765) 2.67 (1.90-3.64)
Total power (ms 2 )
Before 36.02 (26.69-59.07) 66.97 (16.97-129.4) 32.99 (14.93-59.02) 38.62 (32.32-103.8) 62.89 (31.87-92.58) 58.05 (22.33-81.79)
After 33.91 (20.56-64.02) 83.56 (34.71-115.4) 65.14 (25.50-138.9) 79.64 (32.93-143.3) 60.77 (17.32-117.6) 42.32 (27.22-98.79)
LF (ms 2 )
Before 3.63 (1.42-4.98) 1.93 (1.26-5.32) 2.31 (1.13-8.68) 2.20 (1.90-3.76) 2.45 (1.95-11.4) 3.40 (1.29-12.47)
After 2.62 (1.51-7.91) 5.88 (1.72-13.86) 2.37 (0.71-15.36) 2.78 (1.84-6.57) 3.09 (1.41-7.37) 3.25 (1.65-5.17)
HF (ms 2 )
Before 5.43 (3.45-6.33) 2.70 (1.16-7.79) 4.01 (1.44-9.31) 5.36 (2.08-7.59) 4.92 (3.06-9.81) 5.49 (1.44-9.31)
After 4.02 (1.82-8.02) 6.23 (2.91-10.29) 4.03 (1.57-8.40) 4.12 (2.57-6.91) 4.33 (0.99-7.85) 1.87 (1.20-4.81)
LF/HF
Before 0.79 (0.56-1.04) 0.78 (0.47-1.41) 0.55 (0.44-1.53) 0.74 (0.47-0.98) 0.66 (0.52-1.13) 0.91 (0.65-1.18)
After 0.78 (0.57-1.44) 0.95 (0.59-1.46) 0.69 (0.40-1.42) 0.77 (0.43-1.04) 0.70 (0.49-1.00) 1.25 (0.79-1.75)
SD1
Before 2.52 (1.68-2.59) 1.82 (1.52-2.58) 2.21 (1.53-2.86) 2.30 (1.62-2.50) 2.13 (1.81-2.97) 2.46 (1.56-4.04)
After 2.16 (1.60-2.86) 2.98 (1.71-3.67) 2.06 (1.43-3.12) 2.44 (1.83-3.02) 1.98 (1.34-2.66) 1.89 (1.33-2.57)
SD2
Before 9.94 (8.08-13.98) 14.29 (8.70-21.05) 8.49 (6.02-11.04) 11.59 (7.97-19.16) 14.80 (8.81-16.52) 12.17 (9.58-15.57)
After 8.57 (7.42-12.39) 16.04 (9.24-19.41) 11.68 (8.06-16.43) 14.68 (9.58-19.32) 11.77 (8.07-16.91) 10.90 (8.53-14.06)

Data are present as mean ± SD or median (interquartile range). SDNN: Standard deviation of all R-R intervals. RMSSD: Square root of the mean of the squares of successive R-R interval differences. LF: low frequency. HF: high frequency. SD1: standard deviation of the instantaneous RR variability. SD2 standard deviation of the continuous or long-term variability of the heart rate. b Represents statistical difference when DM is compared to Control. N is equal 10 except for HRV parameter in C-CT (n=9); C-NT: non-trained controls, DM-NT: non-trained diabetes; controls in continuous training; DM-CT: diabetic animals in continuous training; C-HIIT: control animals in high-intensity interval training; DM-HIIT: diabetic animals in high-intensity interval training.

Isolated perfused heart

Left ventricular developed pressure (LVDP) is represented in Figure 2 . Control animals submitted to exercise differed from the DM-NT, C-HIIT, and DM-CT groups; however, there was no differences between DM and C submitted to same conditions (i.e., NT or different types of training; p = 0.086 for NT animals, p = 0.061 for CT and p = 0.824 for HIIT).

Heart rate, left ventricular developed pressure, and maximum rate of left ventricular pressure rise and pressure fall in isolated perfused hearts. A: Left ventricular developed pressure (LVDP). B: Maximum rate of left ventricular pressure rise (+dP/dt) and fall (–dP/dt). C: Heart rate (HR). *Statistically significant difference (p<0.01) compared to DM-NT, # statistically significant (p<0.05) compared to DM-CT, § statistically significant (p<0.05) compared to all DM groups.

Significant differences were observed in +dP/dt (mmHg/s) in DM groups compared with respective controls (C-NT vs. DM-NT, mean difference: 812.8 ± 228.5, p = 0.012; C-CT vs. DM-CT, mean difference: 937.5 ± 207.7, p = 0.0008) except for HIIT (C-HIIT vs. DM-HIIT, mean difference: 595.5 ± 250.3, p = 0.190) ( Figure 2B ). Lower values were also observed for –dP/dt ( Figure 2B ) in all DM groups compared with controls. Spontaneous HR ( Figure 2C ) was reduced in all DM groups compared with controls (C-NT vs. DM-NT, mean difference: 31.08 ± 8.48; C-CT vs. DM-CT, mean difference: 34.23 ± 7.71; C-HIIT vs. DM-HIIT, mean difference: 42.58 ± 9.29).

 Discussion

This study compared, in STZ-induced diabetic rats, the effects of 20 sessions of HIIT or CT on exercise capacity, cardiac function and HRV. Our results demonstrated that both types of training improved exercise performance, with better results with HIIT, and comparable magnitudes between DM and controls animals. Furthermore, there were no differences in HRV between controls and DM after the exercise protocols. HIIT attenuated the impairment in +dP/dt, but not –dP/dt in isolated hearts from DM.

Diabetic animals submitted to training increased their exercise performance ( Table 1 ), as opposed to sedentary animals whose maximum running speed was significantly reduced. Nevertheless, DM and control animals submitted to HIIT showed greater improvement in maximum running speed when compared with animals submitted to CT, even though glucose levels did not change. The superiority of interval training over CT had been previously described in a rat model of metabolic syndrome, where VO 2max was superior and associated with a greater reduction in blood pressure, better endothelial function, and superior insulin action. 14 In a mouse model of diabetes, HIIT did reduce fasting glucose and increased muscle GLUT4 content; however, this study protocol was performed for 10 weeks compared to four weeks in our study, which may explain the difference in glucose levels. 28 Furthermore, in humans, Driller et al. 29 showed improvement in power, maximum oxygen uptake, and lactate threshold in rowers submitted to HIIT as compared to traditional training. In type 2 diabetic patients, a recent systematic review described a higher increase in VO 2max in HIIT versus CT, without significant differences in HbA1c or blood pressure values between interventions, similar to our findings. 30 The greater improvement in physical capacity found in our study using a short-term HIIT is in accordance with adaptive responses promoted by HIIT protocols previously reported.

Cardiac function analysis in isolated hearts revealed no statistical differences in left ventricular developed pressure in spontaneously beating hearts between groups submitted to the same exercise protocol ( Figure 2A ). However, DM-HIIT showed attenuation in +dP/dt impairment, which was not observed in DM-CT ( Figure 2B ). No improvement was observed in diastolic function, represented by –dP/dt, in any of DM exercised groups ( Figure 2B ). Previous reports correlated increased exercise capacity with improved systolic function in DM. Sanches et al. 10 used a combined protocol of aerobic (treadmill) and resistance training (ladder) with low to moderate intensity (40-60% of maximal capacity) during eight weeks in ovariectomized STZ-induced diabetic rats. The authors demonstrated that an improvement of 66% in running capacity, compared to non-trained DM group, prevented reduction in fractional shortening and velocity of fiber shortening, assessed by echocardiography. Quinteiro et al., 11 using a low to moderate (40-60% of maximal running speed) treadmill protocol during eight weeks in ovariectomized STZ-induced rats observed an improvement of 74% in the exercise capacity, when compared to non-trained DM group that was also associated with improvement in fractional shortening and fiber shortening velocity. In the present study, DM-HIIT showed a 57.7% improvement in exercise capacity when compared to DM-NT while the DM-CT showed an improvement of only 21.4%. This may explain the attenuation in contractile function observed only in the DM-HIIT group. Also, our data corroborates with previous findings by Khakdan et al., 13 that used echocardiography to compare the systolic function in DM rats submitted to eight weeks of continuous training (65% VO 2max ) or HIIT (90%/40% VO 2max ) in a motorized treadmill. HIIT group improved ejection fraction and fractional shortening when compared to pre-exercise values, which was not observed in the CT group. According to the author, HIIT decreased the expression of miR-195, microRNA involved in diabetic cardiopathy.

The effects of exercise training on contractility could also be related to attenuation in abnormalities of intracellular Ca 2 handling, that has been shown to be impaired in DM. 31 In diabetic heart, reduced expression and activity of SERCA2, 32 Ca 2 leak thru RyR2 33 and decreased NCX expression and activity 34 are commonly reported. All these changes may lead to intracellular Ca 2 overload, 35 and decreased contractility. 36 Exercise training decreases myocardial diacylglycerol (DAG) levels, 37 normalizes CaMKII activity and attenuates RyR2 phosphorylation and Ca 2 leakage, attenuating cardiac dysfunction.

Due to the scarcity of data investigating the effects of HIIT on autonomic control in the diabetic population we investigated the impact of this exercise modality on HRV. 38 The high physical effort during peak exercise in HIIT could be thought of as a stressor for the already challenged cardiovascular autonomic control in the diabetic. However, neither short-term protocol of HIIT or CT impaired or caused improvements in HRV parameters in DM animals during the period assessed. This demonstrates that, even though higher cardiac demand and activation is required during high-intensity cycle in HIIT training, there was no short-term negative impact on HRV, a tool for autonomic control assessment. Data from a recent clinical trial 39 demonstrated that even after 12 weeks of unsupervised HIIT in DM2 subjects, there were no effects of exercise on HRV, corroborating our findings. A high-intensity exercise protocol in a treadmill (not interval training) of 10 weeks was able to attenuate the sympathovagal changes (higher LF/HF ratio) in sedentary DM rats in a model of moderate hyperglycemia. 40

Impaired indexes of global HRV such as SDNN and total power have been previously observed 70 days 41 and 80 days 42 after STZ-induced DM. In the latter case 42 impaired indexes of global HRV were associated with decrements in HF and LF/HF ratio. However, Howarth et al. 43 reported in rats after four weeks of STZ-treatment, decrements in HF and increments in the LF/HF ratio. On the other hand, our data did not show any decrements in HRV after 35 days from STZ-treatment, which may suggest that our protocol was too short to induce CAN.

We observed in DM-trained animals a significant decrement in HR compared to their respective controls at the end of the exercise protocol. This was also observed in spontaneous HR of isolated perfused hearts for all DM groups ( Figure 2C ). HR decrements after STZ administration are commonly reported. 44 This may be in part attributed to a toxic effect of STZ in the heart 45 that may lead to sinoatrial node dysfunction. 44 , 46 The pacemaker current (I f ) carried by the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels plays an important role in HR control. 47 In the sinoatrial node cells, the most abundant HCN isoform is HCN4 followed by HCN2. 48 Baruscotti et al. 47 showed in HCN4 knock-out mice a decrement of 70% in I f current, 50% in HR and 60% in spontaneous HR. Reduction in the expression of HCN channels and their proportion may be the reason for the impaired basal HR. In sinoatrial node of STZ-induced diabetic rats, Huang et al. 44 demonstrated a decrease in the expression of 70% in HCN2 and 58% in HCN4 and Kondo et al. 46 reported a decrease in HCN4 expression attributed to reduced number of sinoatrial node cells. Silva et al., 49 using ivabradine, an HCN4 blocker, demonstrated decrements in HR without changes in cardiac autonomic control. This may be the reason why we observed reduced HR without impact on HRV during the observed period.

Our study had some limitations, such as the short duration of the intervention protocol and follow-up that was not long enough to detect changes in HRV in DM animals. Therefore, future studies are warranted to investigate the same exercise protocols in DM animals with established CAN. In addition, we were only able to assess cardiac function in one time-point using isolated hearts. A repetitive and non-invasive assessment, such as echocardiography, could determine progressive changes induced by HIIT in cardiac function.

 Conclusions

Short-term HIIT promotes greater improvement in exercise performance compared to CT, including in DM, without causing significant changes in HRV.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Eduardo Gomes de Sousa Neto, from Programa de Pós-Graduação em Fisiologia - Universidade Federal do Paraná.

Sources of Funding : This study was funded by PPSUS 2015 Fundação Araucária-PR/SESA-PR/CNPq/MSDecit and Chamada Pública 09/2016-PBA - Fundação Araucária-PR.