Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC qczmpjXVc9RkQrm64cf9cwC S0066-782X2022005013402 S0066-782X2022001000574 10.36660/abc.20210681 Artigo Original O Treinamento Físico Resistido Atenua as Disfunções Ventriculares Esquerdas em Modelo de Hipertensão Arterial Pulmonar 0000-0001-6852-1230 Soares Leôncio Lopes 1 0000-0002-3012-1327 Leite Luciano Bernardes 1 0000-0001-6355-2492 Ervilha Luiz Otávio Guimarães 2 0000-0003-1931-626X Silva Bruna Aparecida Fonseca da 1 0000-0001-7520-3097 Freitas Maíra Oliveira de 1 0000-0002-6850-469X Portes Alexandre Martins Oliveira 1 0000-0003-3942-3353 Rezende Leonardo Mateus Teixeira 1 0000-0002-6043-9256 Drummond Filipe Rios 2 0000-0001-5354-7913 Carneiro-Júnior Miguel Araújo 1 0000-0002-7416-3529 Neves Mariana Machado 2 0000-0002-9794-6972 Reis Emily Correna Carlo 3 0000-0002-4927-4024 Natali Antônio José 1 Universidade Federal de Viçosa Departamento de Educação Física Viçosa MG Brasil Universidade Federal de Viçosa , Departamento de Educação Física , Viçosa , MG – Brasil Universidade Federal de Viçosa Departamento de Biologia Geral Viçosa MG Brasil Universidade Federal de Viçosa , Departamento de Biologia Geral , Viçosa , MG – Brasil Universidade Federal de Viçosa Departamento de Medicina Veterinária Viçosa MG Brasil Universidade Federal de Viçosa , Departamento de Medicina Veterinária , Viçosa , MG – Brasil Correspondência: Leôncio Lopes Soares • Av. P. H. Rolfs, s/n. CEP 36570-900, Viçosa, MG – Brasil E-mail: leoncio.lopes@ufv.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Soares LL, Natali AJ; Obtenção de dados: Soares LL, Leite LB, Ervilha LOG, Silva BAF, Freitas MO, Portes AMO, Rezende LMT, Drummond FR, Reis ECC; Análise e interpretação dos dados: Soares LL, Leite LB, Ervilha LOG, Portes AMO, Rezende LMT, Carneiro-Junior MA, Neves MM, Reis ECC, Natali AJ; Análise estatística: Soares LL; Obtenção de financiamento: Natali AJ; Redação do manuscrito: Soares LL, Natali AJ; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Soares LL, Carneiro-Junior MA, Neves MM, Reis ECC, Natali AJ.

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo

 02 09 2022 10 2022 119 4 574 584 10 08 2021 08 02 2022 06 04 2022 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

A hipertrofia e a dilatação do ventrículo direito observadas na hipertensão arterial pulmonar (HAP) prejudicam a dinâmica do ventrículo esquerdo (VE) achatando o septo interventricular.

 Objetivo

Investigar se o treinamento físico resistido (TFR) de intensidade baixa a moderada é benéfico para funções contráteis do VE e de cardiomiócitos em ratos durante o desenvolvimento de HAP induzida por monocrotalina (MCT).

 Métodos

Foram usados ratos Wistar machos (Peso corporal: ~ 200 g). Para avaliar o tempo até o possível surgimento de insuficiência cardíaca (ou seja, ponto de desfecho), os ratos foram divididos em dois grupos, hipertensão com sedentarismo até a insuficiência (HSI, n=6) e hipertensão com treinamento até a insuficiência (HTI, n=6). Para testar os efeitos do TFR, os ratos foram divididos entre grupos de controle sedentários (CS, n=7), hipertensão com sedentarismo (HS, n=7) e hipertensão com treinamento (HT, n=7). A HAP foi induzida por duas injeções de MCT (20 mg/kg, com um intervalo de 7 dias). Os grupos com treinamento foram submetidos a um protocolo de TFR (subir escadas; 55-65% da máxima carga carregada), 5 dias por semana. A significância estatística foi definida em p <0,05.

 Resultados

O TFR prolongou o ponto de desfecho (~25%), melhorou a tolerância ao esforço físico (~55%) e atenuou as disfunções de contratilidade de VE e de cardiomiócitos promovidas pela MCT preservando a fração de ejeção e o encurtamento fracional, a amplitude do encurtamento, e as velocidades de contração e relaxamento nos cardiomiócitos. O TFR também preveniu os aumentos de fibrose e colágeno tipo I no ventrículo esquerdo causados pela MCT, além de manter as dimensões de miócitos e colágeno tipo III reduzidas por MCT.

 Conclusão

O TFR de intensidade baixa a moderada é benéfico para funções contráteis de VE e cardiomiócitos em ratos durante o desenvolvimento de HAP induzida por MCT.

 Insuficiência Cardíaca Hipertensão Pulmonar Ratos Condicionamento Físico Animal/métodos Miócitos Cardíacos Disfunção Ventricular Esquerda Exercício Introdução

Aumentos na resistência da vasculatura pulmonar, causados principalmente pela disfunção endotelial, levam à hipertensão arterial pulmonar (HAP). 1 A resistência da vasculatura pulmonar sobrecarrega o ventrículo direito resultando em remodelação patológica, 2 e disfunção devido a hipertrofia e dilatação. 1 Essa remodelação afeta a dinâmica do ventrículo esquerdo (VE) por causa da interação ventricular direta. Nessa estrutura, a dinâmica do ventrículo esquerdo é prejudicada pelo achatamento do septo interventricular, 3 , 4 pois ela enfrenta enchimento diastólico precoce deficiente, volume diastólico final reduzido e remodelação adversa. 3 , 5 , 6 Portanto, pacientes com HAP apresentaram um volume de acidente vascular cerebral 3 e tolerância a esforço físico reduzidos, o que afeta negativamente sua qualidade de vida e sobrevida. 7

Os tratamentos farmacológicos têm o objetivo de reduzir a pressão arterial pulmonar e a sobrecarga no ventrículo direito, e, assim, manter a função cardíaca. 8 Já se demonstrou que pacientes com HAP podem manter a função cardíaca por meios não farmacológicos, tais como a prática regular de exercícios físicos. 9 , 10 No modelo experimental de HAP grave induzida por monocrotalina (MCT), por exemplo, o exercício aeróbico prévio ou precoce demonstrou promover benefícios cardiovasculares, tais como a atenuação da hipertrofia, a disfunção e a remodelação adversa do ventrículo direito. 11 - 16 Nosso grupo de pesquisa 17 , 18 relatou recentemente que a corrida voluntária (ou seja, treinamento de alta intensidade intermitente) adia o início da insuficiência cardíaca, e alivia a remodelação adversa do ventrículo direito e a disfunção de miócitos (ou seja, a contratilidade de miócitos e a deterioração da ciclagem de Ca 2 intracelular) nesse modelo. Além disso, também demonstramos que o exercício aeróbico contínuo de intensidade moderada previne a remodelação adversa do ventrículo direito, a contratilidade de miócitos e as deficiências da ciclagem de Ca 2 . 19

O uso de treinamento físico resistido (TFR) de intensidade baixa a moderada foi recomendado como parte de programas de treinamentos para promover a saúde e prevenir doenças cardiovasculares 20 , 21 incluindo as relacionadas à disfunção do ventrículo esquerdo. 22 Em relação à HAP, intervenções combinadas de exercícios, incluindo aeróbicos, treinamento de resistência e treinamento muscular inspiratório específico, demonstraram ser seguras para esses pacientes e resultaram em melhorias significativas na potência muscular, na capacidade de exercício e na sobrevida. 23 - 25 Apesar disso, embora o exercício aeróbico tenha demonstrado evitar a disfunção diastólica e sistólica do ventrículo esquerdo nas condições de linha de base e isovolumétrica, 26 na HAP induzida por MCT, o impacto do TFR na disfunção do ventrículo esquerdo nesse modelo é desconhecido.

Embora os modelos animais tenham embasado a descoberta de novas terapias e o entendimento da fisiopatologia da HAP, o modelo de lesão pulmonar do MCT em roedores usando a injeção de 60 mg/kg de massa corporal induz HAP grave em um processo subagudo, que é limitado para simular a HAP crônica humana. 27 Nesse sentido, Whang et al., 28 demonstraram que 40 mg/kg MCT divididos em duas injeções de 20 mg/kg com um intervalo de sete dias são o que melhor imitam HAP crônica com as alterações comuns na estrutura e função das artérias pulmonares e do ventrículo direito observadas em seres humanos. Portanto, no presente estudo, usamos esse modelo em ratos para testar se o TFR de intensidade baixa a moderada é benéfico para o VE e para funções contráteis em miócitos durante o desenvolvimento de HAP induzida por MCT. A hipótese deste estudo é de que o TFR de intensidade baixa a moderada é benéfico para funções contráteis de VE e miócitos em ratos durante o desenvolvimento de HAP induzida por MCT.

 Métodos Desenho do experimento e indução da HAP

Após a definição do tamanho da amostra, 29 trinta e três ratos Wistar machos [Peso corporal: ~200 g] foram obtidos do laboratório de animais da Universidade Federal de Viçosa, MG, Brasil. Os animais foram mantidos em gaiolas de policarbonato transparentes, em uma sala com controle de temperatura (~22 °C) e ~60% de umidade relativa, em ciclos de 12/12 h de luz/escuro, e tiveram acesso livre a água e ração comercial.

Para avaliar o tempo até o possível surgimento de insuficiência cardíaca, 12 animais (~200 g) foram divididos em dois grupos, usando a randomização simples, hipertensão com sedentarismo até a insuficiência (HSI, n=6) e hipertensão com treinamento até a insuficiência (HTI, n=6). Após as injeções de MCT, ratos dos grupos HSI e HTI foram eutanasiados quando apresentaram sinais clínicos externos previamente validados de possível surgimento de insuficiência cardíaca (por exemplo, perda de peso, dispneia, piloereção) e não podiam mais se alimentar adequadamente, subir a escada (grupo HTI) ou mesmo se mover dentro da gaiola, 30 - 37 que foi considerado um ponto de desfecho.

Para testar se os efeitos do TFR eram benéficos durante o desenvolvimento da HAP, 21 animais (~200 g) foram divididos entre grupos usando a randomização bloqueada: de controle sedentários (CS, n=7), hipertensão com sedentarismo (HS, n=7) e hipertensão com treinamento (HT, n=7). Animais dos grupos HS, HT e CS foram eutanasiados no dia do ponto de desfecho mediano (± 1 dia) dos animais do grupo HSI (ou seja, 28 dias). O tempo mediano até o possível surgimento de insuficiência cardíaca representou o momento após o tratamento com MCT em que mais de 50% do grupo chegou ao dia do ponto de desfecho. Os animais nos grupos com treinamento foram submetidos a TFR, e aqueles nos grupos sedentários foram mantidos em suas gaiolas.

Para induzir a HAP, os animais dos grupos HSI, HTI, HS e HT receberam 2 injeções intraperitoneais de MCT (Sigma-Aldrich, USA) de 20 mg/kg, com intervalos de 7 dias para induzir a insuficiência do ventrículo direito. 28 Os animais de controle receberam injeções de solução salina em volume equivalente.

Os experimentos foram conduzidos de acordo com procedimentos internacionais para pesquisa com animais (Scientific Procedures; Act 1986). Todos os protocolos foram analisados e aprovados pelo Comitê de Ética Institucional (número de protocolo 02/2019).

 Treino de resistência e teste de carga máxima

Os animais foram acostumados com o protocolo de TFR (adaptado de Hornberger e Farrar) 38 por uma semana antes da primeira injeção de MCT ou solução salina, sem carga adicional. O TFR consistiu em subir uma escada (1,1 m de altura, inclinação de 80º) com intervalos de repouso de 2 minutos, sendo que a carga foi baseada em um teste de máxima carga carregada. O teste de máxima carga carregada foi realizado antes da injeção de MCT ou solução salina (tempo 0) e no 14º, 21º e 28º dia após as injeções. O teste consistiu em subir escada com carga inicial de 75% do peso corporal, que foi gradualmente aumentado e mais 15% nas subidas subsequentes até que o animal não pudesse mais subir. 39 A carga foi presa à cauda do rato e as subidas foram intercaladas com 2 minutos de intervalos de repouso. A máxima carga carregada foi usada como índice de tolerância de esforço físico.

Os animais exercitados foram submetidos a um programa de TFR, 5 vezes por semana durante o período experimental até o dia anterior ao da eutanásia, totalizando vinte sessões de exercício. A carga do TFR foi de 55-65% da máxima carga carregada seguindo as recomendações para pacientes com doenças cardiovasculares. 20 Cada sessão de treinamento consistiu em 15 subidas intercaladas com intervalos de 60 segundos, sendo que a carga de treinamento foi ajustada após os testes de máxima carga carregada (14º e 21º dia).

 Ecocardiografia e coleta de amostras

As avaliações ecocardiográficas foram realizadas no 28º dia após a primeira injeção com MCT. Os animais foram anestesiados (Isoflurane 1,5% e100% de oxigênio em um fluxo constante de 1L/min; Isoflurane, BioChimico, Brasil) e as imagens foram obtidas enquanto os animais estavam em decúbito lateral. Estudos bidimensionais com uma taxa de amostragem rápida de 120 fps no modo M foram realizados usando o sistema de ultrassom MyLabTM30 (Esaote, Gênova, Itália) e transdutores de frequência nominal de 11 MHz. A ecocardiografia transtorácica bidimensional e modo M foram obtidos numa velocidade de digitalização de 200 mm ajustado de acordo com a frequência cardíaca. 40 Para avaliar a função do VE, os seguintes parâmetros foram avaliados: fração de ejeção (FE) do VE; e encurtamento fracional (EF). Para caracterizar a HAP, a excursão sistólica do plano anular tricúspide (TAPSE) foi determinada.

No dia do desfecho final mediano (± 1 dia) dos animais do grupo HSI, animais dos grupos HS, HT e CS foram eutanasiados. Após a eutanásia, animais dos grupos CS, HS e HT tiveram seus corações, ventrículos e pulmões dissecados, pesados e processados para análises de interesse, conforme descrito abaixo. A tíbia direita foi dissecada, e seu comprimento foi medido.

 Histomorfometria

As análises histológicas do VE foram realizadas conforme descrito anteriormente. 41 , 42 Rapidamente, imediatamente após a coleta, fragmentos do VE foram fixados com o fixador Karnovsky (paraformaldeído a 4% e glutaraldeído a 4% em tampão de fosfato a 0,1 M, pH 7,4) por 24 horas. Em seguida, os fragmentos foram desidratados em etanol, clarificados em xilol e embebidos em parafina. Os blocos foram cortados em seções de 5 μm de espessura, montados em lâminas histológicas e corados com hematoxilina e eosina para medir a área da seção transversal (AST), ou com vermelho Sirius para contar fibras de colágeno e/ou com tricromo de Masson para contagem de fibrose cardíaca. Para evitar as análises repetidas da mesma área histológica, as seções foram avaliadas em semisséries, usando uma em cada 10 seções. As imagens digitais das lâminas coradas com vermelho Sirius foram obtidas usando um microscópio de luz polarizada (Olympus AX-70, Tóquio, Japão) conectado a uma câmera digital (Olympus Q Color-3, Tóquio, Japão) e as imagens das lâminas coradas com hematoxilina e eosina e tricromo de Masson foram obtidas usando um microscópio de luz (Olympus AX-70, Tóquio, Japão) conectado a uma câmera digital (Olympus Q Color-3, Tóquio, Japão). A quantificação dos tipos de colágeno e fibrose cardíaca foi realizada usando-se uma ferramenta de identificação de cores específica usando o software Image-Pro Plus 4.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, EUA). A área de seção transversal do miócito foi medida usando-se uma ferramenta específica (medição manual em software Image Pro-Plus 4.5).

 Isolamento de miócitos no ventrículo esquerdo

O coração foi conectado a um sistema de perfusão retrógrada de Langendorff e miócitos simples do VE isolados conforme descrito anteriormente. 18 Resumidamente, o sistema de perfusão do coração acontece via aorta com solução de Tyrode contendo (em mM; Sigma-Aldrich, EUA): 130 NaCl, 1,43 MgCl2, 5,4 KCl, 0,75 CaCl2, 5,0 Hepes, 10,0 glicose, 20,0 taurina e 10,0 creatina, pH 7,4 por cerca de 5 minutos. A solução de Tyrode foi substituída por uma solução de Tyrode contendo EGTA (0,1 mM) por 6 minutos. Em seguida, foi feita a perfusão do coração com solução de Tyrode contendo 1 mg/ml de colagenase tipo II (Worthington, EUA) e 0,1 mg/ml de protease (Sigma-Aldrich, EUA) por cerca de 12 minutos. Em seguida, o VE do coração digerido foi retirado e cortado em pequenos fragmentos que foram colocados em um frasco cônico contendo a solução enzimática (colagenase e protease). As células foram mecanicamente separadas agitando-se o frasco por 5 minutos. As células dispersadas foram separadas do tecido não dispersado por filtragem por centrifugação. As células isoladas foram armazenadas a 5° C até o uso. Os miócitos isolados foram usados de 2 a 3 horas após o isolamento. As soluções usadas no procedimento de isolamento foram oxigenadas (O 2 100% – White Martins, Brasil) e mantidas a 37° C.

 Função contrátil de miócito simples

A função contrátil de miócitos do VE foi medida usando-se um sistema de detecção de ponta (Ionoptix, Milton, EUA) montado em um microscópio invertido (Nikon Eclipse – TS100, Japão) conforme descrito anteriormente. 19 Os miócitos foram colocados em um banho na mesa de um microscópio invertido e superfusados com uma solução de Tyrode contendo, em mM (Sigma-Aldrich, EUA): 137 NaCl, 5,4 KCl, 0,33 NaH 2 PO 4 , 0,5 MgCl 2 , 5 HEPES, 5,6 glicose 1,8 CaCl 2, pH 7,4 com 5N NaOH, a 37˚ C. Apenas os miócitos que apresentam um padrão de estriação claro e regular (sarcômero), sem contração espontânea na ausência de estimulação externa e respondendo a estimulação de 1Hz com uma única contração foram testados. Os miócitos foram estimulados (Myopacer, Ionoptix, Milton, EUA) para se contrair a uma frequência de estimulação progressiva (1, 3, 5 e 7 Hz) usando eletrodos externos, e o encurtamento de célula resultante medido por análise de uma imagem de vídeo da célula usando-se a câmera e o software Ionoptix (Ionoptix, Milton, MA, EUA). O encurtamento da célula foi expresso como % do comprimento da célula em repouso.

O comprimento e a largura do miócito foram obtidos a partir da imagem de vídeo da célula; e o volume da célula foi calculado conforme descrito anteriormente. 43

 Análise estatística

A normalidade dos dados foi testada usando-se o teste de Shapiro-Wilk. Os dados são apresentados como médias ± DP, para variáveis contínuas com distribuição normal, como mediana e faixa interquartil, para variáveis contínuas sem distribuição normal. O ponto de desfecho, os parâmetros de remodelação ventricular e os parâmetros contráteis de cardiomiócitos isolados apresentaram uma distribuição não normal, enquanto os parâmetros de exercício, peso corporal e dos órgãos e área da seção transversal e morfometria da célula isolada apresentaram distribuição normal. O ponto de desfecho foi testado pela curva de análise de Kaplan-Meier pelo teste de Log-rank. A máxima carga carregada, o peso corporal, a função do VE, o peso dos órgãos e os parâmetros de célula simples foram testados pela análise de variância de via única (ANOVA) ou de Kruskal-Wallis seguida de teste post-hoc de Dunn. A máxima carga carregada foi testada por medidas de ANOVA de via única repetidas. As análises ANOVA foram seguidas do teste de correção de Tukey pareado. O teste Qui-quadrado de Pearson (X 2 ) foi usado para avaliar a proporção de animais que apresentaram achatamento do septo interventricular. A significância estatística foi definida em P <0,05. A descrição dos dados, o número de ratos e miócitos são apresentados nas legendas das tabelas e das figuras. Todas as análises foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism, versão 6.01 (San Diego, CA, EUA).

 Resultados Possível surgimento de insuficiência cardíaca e tolerância ao esforço físico

A figura 1A ilustra que os animais do grupo HTI realizaram o protocolo de treinamento de resistência durante o desenvolvimento da HAP até apresentar sinais do possível surgimento de insuficiência cardíaca. A máxima carga carregada aumentou progressivamente até o 21º dia e, depois disso, diminuiu até o nível inicial no 35º dia após a primeira injeção de MCT. Todos os animais dos grupos HSI e HTI apresentaram sinais de possível surgimento de insuficiência cardíaca - ponto de desfecho ( Figura 1B ); entretanto, os animais do grupo HTI tiveram um tempo mediano de ponto de desfecho mais longo (37 dias) do que aqueles no grupo de HSI (28 dias), indicando benefícios do treinamento resistivo.

Efeito do treinamento resistido em possível surgimento de insuficiência cardíaca (ponto de desfecho) e tolerância ao esforço físico. (A) Máxima carga carregada de animais hipertensos até a insuficiência, determinada pela máxima carga carregada ajustada para peso corporal, antes da injeção (dia 0) e no 14º, 21º e 28º e 35º dias após a primeira injeção de monocrotalina. (B) Ponto de desfecho, medido em dias para apresentar sinais de possível surgimento de insuficiência cardíaca, foi significativamente mais curto em ratos em hipertensão com sedentarismo até a insuficiência (HSI, n=6) do que nos ratos em hipertensão com treinamento até a insuficiência (HTI, n=6). **P <0,01, análise da curva de Kaplan-Meier pelo teste de Log-rank. (C) Máxima carga carregada relativa para animais de controle, hipertensos, sedentários e em treinamento, determinada conforme o painel A. Ratos em hipertensão com treinamento (HT, n=7) apresentaram maior ganho em carga carregada do que o grupo de controle sedentário (CS, n=7) e o grupo de hipertensão com sedentarismo (HS, n=7), a partir do 14º dia. Medições de ANOVA repetidas seguidas do teste de correção de Tukey. aP <0,05 vs. HS; bP <0,05, vs. CS; *P <0,05 vs. antes da injeção de MCT.

Ratos hipertensos do grupo de HT melhoraram sua tolerância ao esforço físico ( Figura 1C ) durante o experimento. A máxima carga carregada no grupo HT foi mais alta no 21º e no 28º dias do que no dia 0. Além disso, esses animais tiveram a máxima carga carregada mais alta no 14º, 21º e 28º, comparados aos dos grupos CS e HS.

 Função e morfologia do ventrículo esquerdo

A avaliação ecocardiográfica mostrou o achatamento do septo interventricular chamado de ventrículo esquerdo em forma de “D” em animais dos grupos HS e HT ( Figura 2A ), o que sugere sobrecarga de pressão do ventrículo direito, característica da HAP. Essa alteração morfológica foi maior no grupo HS do que no grupo CS, enquanto o grupo HT apresentou valores intermediários ( Figura 2D ). Em relação à função do ventrículo esquerdo, não se encontrou nenhuma diferença entre os grupos para a fração de ejeção ( Figura 2B ) ou ao encurtamento fracional ( Figura 2C ). Apesar disso, é importante observar que 3 dos 7 animais do grupo HS tiveram fração de ejeção <50% e 3 de 7 tiveram encurtamento fracional <25%, indicativo de insuficiência do ventrículo esquerdo. Por outro lado, nenhum dos animais treinados (HT), no mesmo período, apresentaram fração de ejeção <50% e apenas 1 de 7 teve encurtamento fracional <25%.

Efeito do treinamento físico resistido na função do ventrículo esquerdo avaliado no 28º dia após a primeira injeção de monocrotalina. (A) Imagens ecocardiográficas representativas (B) Fração de ejeção (C) Encurtamento fracional. (D) Ventrículo esquerdo em forma de “D”. Os valores são médias ± DP (n=7 ratos em cada grupo), CS: controle sedentários; HS: hipertensão com sedentarismo; HT: hipertensão com treinamento; VD: ventrículo direito; VE: ventrículo esquerdo. A linha pontilhada indica os limites para a classificação da função prejudicada. Painéis B e C: ANOVA de uma via seguido de teste post hoc de Tukey. Painel D: Teste Qui-quadrado de Pearson (teste x2). *p <0,05.

A presença de HAP em animais do grupo HS foi caracterizada também pelos valores de TAPSE. Animais do grupo HS apresentaram valores de TAPSE mais baixos (1,43 ± 0,23) do que os dos grupos CS (2,06 ± 0,17) e HT (2,13 ± 0,36).

Os animais do grupo HS apresentaram menor peso corporal do que os dos grupos CS e HT ( Tabela 1 ). Apesar de não haver diferença de peso do coração entre os grupos, os animais dos grupos HS e HT tiveram maior peso do ventrículo direito (VD) e proporção entre ventrículo direito e tíbia do que os animais do grupo CS, o que indica a hipertrofia do ventrículo direito. Embora o peso do pulmão e a proporção entre pulmão e tíbia serem maiores nos grupos HS e HT do que no grupo CS, não foi encontrada diferença entre peso de VE e proporção peso de VE e tíbia entre os grupos. Em relação às dimensões dos miócitos do ventrículo esquerdo, o grupo HS apresentou comprimento, largura e volume menores do que o grupo CS. O grupo HT apresentou valores intermediários entre os dos grupos CS e HS. Os animais dos grupos de HS apresentaram AST mais baixa em comparação com os animais dos grupos CS e HT. Por outro lado, não houve diferença na AST dos animais do grupo HT em comparação com os animais do grupo CS, sugerindo um efeito benéfico do programa de treinamento resistido para prevenir a remodelação adversa do ventrículo esquerdo.

Efeito do treinamento físico resistido no corpo e no peso dos órgãos
CS HS HT
Peso corporal final (g) 298,6 ± 19,01 276,3 ± 19,87 * 303,7 ± 20,98 †
Peso do coração (g) 1,23 ± 0,11 1,30 ± 0,18 1,28 ± 0,12
Peso do VD (g) 0,33 ± 0,04 0,42 ± 0,03 * 0,44 ± 0,05 *
Peso do VE (g) 0,74 ± 0,10 0,65 ± 0,07 0,70 ± 0,07
Peso do pulmão (g) 1,65 ± 0,28 2,77 ± 0,41** 2,38 ± 0,33**
Razão entre peso do VD e comprimento da tíbia (g/cm) 0,09 ± 0,01 0,11 ± 0,00* 0,11 ± 0,01*
Razão entre peso do VE e comprimento da tíbia (g/cm) 0,20 ± 0,02 0,17 ± 0,02 0,18 ± 0,02
Razão entre peso do pulmão e comprimento da tíbia (g/cm) 0,45 ± 0,10 0,73 ± 0,11** 0,63 ± 0,09*
Comprimento do miócito (µm) 132,3 ± 19,09 122,5 ± 19,86** 129,2 ± 21,42
Largura do miócito (µm) 46,12 ± 10,08 41,75 ± 9,95* 43,64 ± 9,50
Volume do miócito (pL) 46,24 ± 3,97 38,71 ± 3,18** 42,62 ± 3,61
Seção transversal do miócito (µm 2 ) 462,1 ± 21,86 400,5 ± 43,34* 492,2 ± 66,56 †

Os valores são médias ± DP de 7 ratos e 10 células em cada grupo. CS: controle sedentários; HS: hipertensão com sedentarismo; HT: hipertensão com treinamento; VD: ventrículo direito; VE: ventrículo esquerdo; * p <0,05 vs. CS; ** p <0,01 vs. CS; † p <0,05 vs. HS. ANOVA de uma via seguido de teste post hoc de Tukey.

 Remodelação adversa do ventrículo esquerdo

A figura 3 mostra dados sobre as fibras de colágeno e a fibrose do VE. Animais hipertensos (HS e HT) apresentaram uma alta porcentagem de colágeno tipo I em comparação aos animais do grupo de controle (CS) ( Figura 3A ). Entretanto, os animais do grupo HT tiveram uma porcentagem menor de colágeno tipo I em comparação com os animais do grupo HS, mostrando o efeito protetor do TFR no avanço da HAP. Além disso, os animais do grupo TH apresentaram uma porcentagem mais alta de colágeno tipo III do que a dos animais sedentários (CS e HS) ( Figura 3B ). Animais hipertensos (HS e HT) tiveram uma alta porcentagem de colágeno total em comparação aos animais do grupo de controle ( Figura 3C ). Em relação à fibrose do VE ( Figura 3D ), os animais do grupo HS apresentaram uma porcentagem mais alta, em comparação com os animais nos grupos CS e HT. Não houve diferença entre a porcentagem de fibrose nos animais dos grupos HT e CS, demonstrando um efeito benéfico do treinamento resistido na prevenção da remodelação cardíaca patológica.

Efeito do treinamento físico resistido na remodelação do ventrículo esquerdo. (A) Porcentagem de colágeno tipo I. (B) Porcentagem de colágeno tipo III. (C) Porcentagem de colágeno total. (D) Porcentagem de fibrose no VE. (E) Microfotografias representativas do tecido do VE corado com vermelho Sirius; (F) Microfotografias representativas do tecido do VE corado com tricromo de Masson. A seta azul indica colágeno tipo I; A seta branca indica colágeno tipo III; A seta preta indica fibrose cardíaca. Os valores são apresentados como medianas acompanhadas da faixa interquartil de 10 imagens por animal em cada grupo (n=5 ratos em cada grupo). CS: controle sedentários; HS: hipertensão com sedentarismo; HT: hipertensão com treinamento. Kruskal-Wallis, seguido pelo teste post-hoc de Dunn: * p <0,05, e ** p <0,01.

Função contrátil de miócito simples

Sob estimulação elétrica, miócitos dos animais do grupo HS apresentaram uma relação contração-frequência positiva nas frequências 1, 3 e 5 Hz; a uma grandeza menor de encurtamento do que os animais dos grupos CS e HT ( Tabela 2 ). Essa diferença perdeu seu valor estatístico de 5 para 7 Hz, onde a relação contração-frequência se tornou negativa. Além disso, a velocidade de partida (um índice de velocidade de contração) foi mais lenta nas células do grupo HS do que no grupo do CS acima da faixa de 1 a 7 Hz. Entretanto, na comparação com o grupo HT, a velocidade mais baixa foi encontrada apenas em 1, 3 e 7 Hz. Da mesma forma, a velocidade de retorno (um índice da velocidade de relaxamento) foi mais baixa no grupo HS do que no grupo de CS. Na comparação com o grupo HT, a velocidade mais baixa foi encontrada apenas em 1 e 3 Hz.

Efeito do treinamento físico resistido na contração e relaxamento do miócito do ventrículo esquerdo
CS HS HT
Mediana (FIQ 25%-75%) Mediana (FIQ 25%-75%) Mediana (FIQ 25%-75%)
Encurtamento (% c.c.r.)
FE (1 Hz) 7,69 (5,74-9,42) 5,26 (3,23-7,08)* 7,89 (5,80-9,30) †
FE (3 Hz) 8,02 (5,47-10,14) 6,08 (3,73-8,29)* 7,70 (6,59-10,11) †
FE (5 Hz) 8,16 (6,06-10,15) 6,74 (4,83-8,78)* 8,26 (6,25-10,20) †
FE (7 Hz) 7,32 (4,86-9,33) 6,04 (4,37-8,01) 6,95 (5,41-8,90)
Velocidade de partida
FE (1 Hz) 262,9 (191,8-330,3) 189,2 (106,1-266,8)* 250,7 (179,1-307,0) †
FE (3 Hz) 317,7 (222,6-411,2) 250,2 (129,3-332,6)* 288,5 (226,4-416,1) †
FE (5 Hz) 365,8 (246,7-473,2) 303,3 (175,5-417)* 342,4 (254,7-467,3)
FE (7 Hz) 369,8 (284,4-472,9) 322,2 (209,7-367,9)* 344,9 (293,1-469,5) †
Velocidade de retorno
FE (1 Hz) 229,0 (158,2-282,5) 143,6 (76,53-220,7)* 206,5 (148,4-274,1) †
FE (3 Hz) 254,6 (177,2-321,3) 191,9 (97,98-254,2)* 241,3 (159,2-323,8) †
FE (5 Hz) 273,3 (218,4-354,5) 236,1 (126,9-279,6)* 247,6 (178,4-353,6)
FE (7 Hz) 285,2 (226,9-362,6) 234,3 (153,5-293,8)* 260,5 (202,9-356,9)

Os valores são apresentados como medianas acompanhadas da faixa interquartil (FIQ) de 10 células por animal em cada grupo (n=7 ratos em cada grupo). % c.c.r., porcentagem do comprimento da célula em repouso; FE: frequência de estimulação; CS: controle sedentários; HS: hipertensão com sedentarismo; HT: hipertensão com treinamento. * p <0,05 vs. CS; ** p <0,01 vs. CS; † p <0,05 vs. HS. Kruskal-Wallis, seguido de teste post-hoc de Dunn.

 Discussão

O presente estudo examinou se o TFR de intensidade baixa a moderada poderia demonstrar ser benéfico para as funções contráteis de VE e miócitos em ratos durante o desenvolvimento de HAP induzida por MCT. Nossos achados demonstram pela primeira vez que ratos tratados com MCT (duas injeções de MCT de 20 mg/kg, com intervalo de 7 dias) subiram escada durante o desenvolvimento da HAP e aumentaram progressivamente sua tolerância ao esforço físico. O índice de tolerância ao esforço físico do nosso estudo, a máxima carga carregada, foi progressivamente mais alto no grupo HT em comparação com os grupos HS e CS durante o experimento. O modelo de TFR foi eficiente no aumento da força muscular e outro modelo de hipertensão de ratos. 44 O aumento no peso corporal e na máxima carga carregada observado aqui sugere um efeito protetor do TFR contra a perda e disfunção e perda de músculo esquelético. Esse é um achado interessante desde que a sarcopenia, a intolerância ao esforço físico, e a letargia foram relatadas como características desse modelo de HAP. 42 , 45 - 47 A potência muscular demonstrou melhorar em pacientes com HAP em resposta a programas de exercícios combinados (aeróbicos + resistidos). 23 - 25 Além disso, o aumento da força muscular é importante para indivíduos hipertensos, já que alivia a sobrecarga cardiovascular durante suas atividades rotineiras e foi associado à proteção contra mortalidade global. 48

O programa de TFR usado no presente estudo expandiu o tempo até os animais exibirem sinais de possível surgimento de insuficiência cardíaca (ou seja, ponto de desfecho). Embora não haja estudo sobre os efeitos do modelo de TFR em tal ponto de desfecho em ratos com HAP induzida por MCT, o prolongamento do ponto de desfecho em ratos injetados com MCT em resposta à corrida voluntária foi relatado por nosso grupo, 17 , 18 e a sobrevida estendida em resposta a corrida na esteira foi demonstrada por outros, 45 , 49 mais especificamente quando iniciada nos estágios iniciais da doença. A sobrevida melhorada também foi demonstrada em pacientes com HAP submetidos a intervenções de exercícios combinados (aeróbicos + resistidos). 23 - 25

Nosso regime de TFR beneficiou os parâmetros funcionais e estruturais do VE em ratos injetados com MCT. Em relação à função do ventrículo esquerdo, a ecocardiografia demonstrou que 42,86% dos ratos sedentários injetados com MCT (grupo HS) tiveram fração de ejeção abaixo de 50%, e 28,57% apresentaram encurtamento fracional abaixo de 25%, o que indica disfunção do ventrículo esquerdo. Entretanto, os animais treinados (grupo de HT) a presença da disfunção do ventrículo esquerdo foi mais baixa nos ratos sedentários (grupo HS), o que sugere uma função protetora do exercício de resistência. Esses achados estão alinhados com as alterações causadas pelo TFR empregado no tecido do VE. Por exemplo, o TFR aumentou a porcentagem de colágeno tipo III ao mesmo tempo em que reduziu a porcentagem de colágeno tipo I e fibrose nos ratos com HAP induzida por MCT, demonstrando, portanto, o efeito protetor desse regime de exercícios contra a disfunção do ventrículo esquerdo e a remodelação adversa levando à atenuação da progressão da HAP.

Os parâmetros de órgãos demonstraram que ratos sedentários injetados com MCT (grupo HS) apresentou valores do ventrículo direito (ou seja, peso do ventrículo direito, índice de Fulton e proporção entre peso do ventrículo direito e comprimento da tíbia) e pulmão (ou seja, peso do pulmão, proporção entre peso do pulmão e comprimento da tíbia) mais altos do que o grupo de CS. Apesar de não haver nenhuma mudança no peso do VE e na proporção entre VE e comprimento da tíbia, o comprimento, a largura e o volume de miócitos simples diminuíram pela MCT (CS > HS). Entretanto, o TFR evitou esse tipo de redução nas dimensões da célula (HT = CS), o que indica a manutenção da massa do ventrículo esquerdo e sugere o efeito protetor do programa de TFR aplicado contra a remodelação adversa do ventrículo esquerdo.

Juntamente com a redução das dimensões dos miócitos, a MCT induziu a disfunção contrátil de miócitos simples. Miócitos do grupo HS tiveram encurtamento menor e velocidades de contração e relaxamento mais altas do que o grupo CS. Mais importante, o TFR atenuou a disfunção contrátil, já que esses parâmetros celulares do grupo HT foram semelhantes aos do grupo CS, indicando, assim, melhorias na função contrátil dos miócitos do grupo HT em relação aos do grupo HS. As proteínas reguladoras do cálcio (ou seja, receptor de rianodina 2; fosfolambano e a ATPase 2 do retículo sarcoplasmático gerenciam a força e o tempo da contração de cardiomiócitos e são relatadas como reguladas no ventrículo direito de ratos tratados com MCT. 15 , 45 Ainda são necessárias investigações posteriores sobre se o regime de TFR empregado aumenta a expressão e a atividade dessas proteínas, embora esse efeito de exercício tenha sido demonstrado em ratos saudáveis normotensos. 50 , 51

Considerados juntos, nossos resultados demonstram que o TFR empregado durante o desenvolvimento da HAP induzida por MCT foi benéfico à estrutura e à função do ventrículo esquerdo e dos miócitos, o que resultou em melhoria da tolerância ao esforço físico e do tempo até o possível surgimento de insuficiência cardíaca nos animais.

A partir das recomendações de treinamento resistido para pacientes com doenças cardiovasculares, 20 utilizamos a intensidade de baixa a moderada. Considerando que se relata que o exercício de alta intensidade promove os maiores benefícios em pacientes com insuficiência cardíaca 52 e que os ratos injetados com MCT treinaram com carga progressiva até o tempo mediano do ponto de desfecho dos ratos sedentários (28 dias), pode ser possível aumentar experimentalmente a intensidade do treinamento usando-se técnicas de recompensa para aumentar os efeitos do treinamento resistido.

Por fim, este estudo tem limitações. Primeiramente, a velocidade da subida não é controlada neste modelo. Segundo, a duração do período de treinamento está limitada pelos efeitos da MCT. Apesar disso, nossos resultados demonstraram efeitos positivos do programa de treinamento resistido no tempo de possível surgimento de insuficiência cardíaca, tolerância ao esforço físico e disfunção do VE.

 Conclusão

Nossos achados demonstram que junto com o aumento do tempo para possível surgimento de insuficiência cardíaca e na tolerância ao esforço físico, o treinamento resistido de intensidade baixa a moderada atenua o desenvolvimento de disfunções do ventrículo esquerdo no modelo da HAP induzida por MCT. Portanto, o TFR de intensidade baixa a moderada é benéfico para funções contráteis do ventrículo esquerdo e dos miócitos nesse modelo. Esses resultados têm relevância clínica, já que corroboram os benefícios de saúde do treinamento resistido em indivíduos com doença cardiopulmonar, incluindo HAP. Sugerimos que o treinamento resistido de intensidade baixa a moderada seja testado em pacientes com HAP.

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Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de doutorado de Leôncio Lopes Soares pela Universidade Federal de Viçosa.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de Viçosa sob o número de protocolo 02/2019. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.

Fontes de financiamento: O presente estudo foi parcialmente financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes).

 Original Article Resistance Exercise Training Mitigates Left Ventricular Dysfunctions in Pulmonary Artery Hypertension Model 0000-0001-6852-1230 Soares Leôncio Lopes 1 0000-0002-3012-1327 Leite Luciano Bernardes 1 0000-0001-6355-2492 Ervilha Luiz Otávio Guimarães 2 0000-0003-1931-626X Silva Bruna Aparecida Fonseca da 1 0000-0001-7520-3097 Freitas Maíra Oliveira de 1 0000-0002-6850-469X Portes Alexandre Martins Oliveira 1 0000-0003-3942-3353 Rezende Leonardo Mateus Teixeira 1 0000-0002-6043-9256 Drummond Filipe Rios 2 0000-0001-5354-7913 Carneiro-Júnior Miguel Araújo 1 0000-0002-7416-3529 Neves Mariana Machado 2 0000-0002-9794-6972 Reis Emily Correna Carlo 3 0000-0002-4927-4024 Natali Antônio José 1 Brasil Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Educação Física, Viçosa, MG – Brasil Brasil Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Biologia Geral, Viçosa, MG – Brasil Brasil Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Medicina Veterinária, Viçosa, MG – Brasil Mailing Address: Leôncio Lopes Soares • Av. P. H. Rolfs, s/n. Postal code 36570-900, Viçosa, MG – Brazil E-mail: leoncio.lopes@ufv.br

Author Contributions

Conception and design of the research: Soares LL, Natali AJ; Acquisition of data: Soares LL, Leite LB, Ervilha LOG, Silva BAF, Freitas MO, Portes AMO, Rezende LMT, Drummond FR, Reis ECC; Analysis and interpretation of the data: Soares LL, Leite LB, Ervilha LOG, Portes AMO, Rezende LMT, Carneiro-Junior MA, Neves MM, Reis ECC, Natali AJ; Statistical analysis: Soares LL; Obtaining financing: Natali AJ; Writing of the manuscript: Soares LL, Natali AJ; Critical revision of the manuscript for important intellectual content: Soares LL, Carneiro-Junior MA, Neves MM, Reis ECC, Natali AJ.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background

The right ventricular hypertrophy and dilation observed in pulmonary artery hypertension (PAH) damages the left ventricle (LV) dynamics by flattening the interventricular septum.

 Objective

To investigate whether low- to moderate-intensity resistance exercise training (RT) is beneficial to LV and cardiomyocyte contractile functions in rats during the development of monocrotaline (MCT)-induced PAH.

 Methods

Male Wistar rats (Body weight: ~ 200 g) were used. To assess the time to potential heart failure onset (i.e., end point), rats were divided into sedentary hypertension until failure (SHF, n=6) and exercise hypertension until failure (EHF, n=6) groups. To test RT effects, rats were divided into sedentary control (SC, n = 7), sedentary hypertension (SH, n=7), and exercise hypertension (EH, n=7) groups. PAH was induced by two MCT injections (20 mg/kg, with 7 days interval). Exercise groups were submitted to an RT protocol (Ladder climbing; 55-65% of carrying maximal load), 5 times/week. Statistical significance was assumed at P < 0.05.

 Results

RT prolonged the end point (~25 %), enhanced the physical effort tolerance (~ 55%), and mitigated the LV and cardiomyocyte contractility dysfunctions promoted by MCT by preserving the ejection fraction and fractional shortening, the amplitude of shortening, and the velocities of contraction and relaxation in cardiomyocytes. RT also prevented increases in left ventricle fibrosis and type I collagen caused by MCT, and maintained the type III collagen and myocyte dimensions reduced by MCT.

 Conclusion

Low- to moderate-intensity RT benefits LV and cardiomyocyte contractile functions in rats during the development of MCT-induced PAH.

 Heart Failure Pulmonary Hypertension Rats Physical Conditioning, Animal/methods Myocytes, Cardiac Ventricular Dysfunction, Left Exercise Introduction

Increases in the pulmonary vasculature resistance, mainly caused by endothelial dysfunction, leads to pulmonary arterial hypertension (PAH).1 The chronic pulmonary vasculature resistance overloads the right ventricle (RV), resulting in pathological remodeling,2 and dysfunction because of hypertrophy and dilation.1 Such remodeling affects the left ventricle (LV) dynamics because of the direct ventricular interaction. In this framework, the left ventricle dynamics are damaged by the interventricular septum flattening,3 , 4 as it faces impaired early diastolic filling, reduced end-diastolic volume, and adverse remodeling.3 , 5 , 6 Therefore, PAH patients exhibit reduced stroke volume3 and physical effort tolerance, which negatively impacts their quality of life and survival.7

Pharmacological therapies aim to reduce pulmonary artery pressure and the overload to the RV, thereby maintaining the cardiac function.8 It has been demonstrated that patients with PAH may maintain the cardiac function by non-pharmacological means, such as practicing regular physical exercise.9 , 10 In the experimental model of monocrotaline (MCT)-induced severe PAH, for example, previous and early aerobic exercise have been shown to promote cardiovascular benefits, such as mitigation of right ventricular hypertrophy, dysfunction, and adverse remodeling.11 - 16 Our research group17 , 18 recently reported that voluntary running (i.e. intermittent high-intensity exercise) postpones the onset of heart failure, and lightens RV e adverse remodeling and myocyte dysfunction (i.e. myocyte contractility and intracellular Ca2cycling deterioration) in this model. Furthermore, our study also demonstrated that moderate-intensity continuous aerobic exercise prevents right ventricle adverse remodeling and myocyte contractility and Ca2cycling impairments.19

The use of low- to moderate-intensity resistance exercise training (RT) has been recommended to compose exercise programs to promote health and prevent cardiovascular diseases,20 , 21 including those related to left ventricular dysfunction.22 Regarding PAH, combined exercise interventions, including aerobic, resistance, and specific inspiratory muscle training proved safe for these patients and yielded significant improvements in muscle power, exercise capacity, and survival.23 - 25 Nevertheless, while aerobic exercise has been demonstrated to prevent left ventricular systolic and diastolic dysfunction in both baseline and isovolumic conditions26 in MCT-induced PAH, the impact of RT in the left ventricular dysfunction in this model is unknown.

While the animal models have supported the discovery of new therapies and the understanding of PAH pathophysiology, the model of MCT lung injury in rodents using the injection of 60 mg/kg body mass induces severe PAH in a subacute process, which is limited in order to simulate human chronic PAH.27 In this sense, Whang et al.28 demonstrated that 40 mg/kg MCT divided into two injections of 20 mg/kg with an interval of seven days better mimics chronic PAH with those common changes in the structure and function of pulmonary arteries and RV observed in humans. Therefore, the present study applied this model in rats to test whether low- to moderate-intensity RT might prove beneficial to LV and myocyte contractile functions during the development of MCT-induced PAH. The hypothesis of this study is that low- to moderate-intensity RT is beneficial to LV and myocyte contractile functions in rats during the development of MCT-induced PAH.

 Methods Experimental design and PAH induction

After the definition of the sample size,29 thirty-three male Wistar rats [Body weight: ~200 g] were obtained from the animal laboratory at the Federal University of Viçosa, MG, Brazil. The animals were housed in transparent polycarbonate cages, kept in a room with a controlled temperature (~22 °C) and ~60% relative humidity, under a 12/12 h light/dark cycles, and had free access to water and commercial chow.

To assess the time to the onset of potential heart failure, 12 animals (~200 g) were divided into two groups, by using simple randomization: sedentary hypertension until failure (SHF, n = 6) and exercise hypertension until failure (EHF, n = 6). After the MCT injections, rats from the SHF and EHF groups were euthanized when they showed previously validated external clinical signs of potential heart failure onset (e.g., weight loss, dyspnea, piloerection) and could no longer feed properly, climb the ladder (EHF group), or even move in the cage,30 - 37 which was considered the end point.

To test whether RT is beneficial during the development of PAH, 21 animals (~200 g) were divided into groups using blocked randomization: sedentary control (SC, n = 7), sedentary hypertension (SH, n = 7), and exercise hypertension (EH, n = 7). Animals from the SH, EH, and SC groups were euthanized at the median end point day (± 1 day) of the SHF animals (i.e., 28 days). The median time to the onset of potential heart failure represented the moment after MCT treatment when more than 50% of the group reached the end point day. The animals in the exercise groups were submitted to RT while those in sedentary groups were maintained in their cages.

To induce PAH, animals from the SHF, EHF, SH, and EH groups received 2 intraperitonial MCT (Sigma-Aldrich, USA) injections of 20 mg/kg, at a 7-day interval, to induce right ventricular failure.28 Control animals received equivalent volume injections of saline.

Experiments were conducted in accordance with international procedures for animal research (Scientific Procedures; Act 1986). All protocols were reviewed and approved by the Institutional Ethics Committee (protocol number 02/2019).

 Resistance training and maximal load test

The animals were familiarized to the RT protocol (adapted from Hornberger and Farrar38 ) for one week before the first MCT or saline injection, with no additional load. RT consisted of climbing a ladder (1.1 m high; 80º inclination) with 2 min resting intervals, with the load based on a maximal carrying load test. The maximal carrying load test was performed before MCT or saline injection (time 0) and on the 14th, 21st, and 28thday after injections. The test consisted of ladder climbing with an initial load of 75% of body weight, which was progressively increased by an additional 15% in the subsequent climbs until the animal could no longer climb.39 The load was fixed on the rat’s tail, and climbs were interspersed with 2 min resting intervals. The maximal carrying load was used as the physical effort tolerance index.

Exercised animals were submitted to a RT program, 5 times/week during the experimental period until the day before euthanasia, totaling twenty exercise sessions. RT load was 55-65% of the maximal carrying load, following the recommendations for patients with cardiovascular diseases.20 Each training session consisted of 15 climbs, interspersed with 60-second intervals, with the training load adjusted after the maximal carrying load tests (14thand 21stday).

 Echocardiography and sample collection

The echocardiographic evaluations were performed on the 28thday after the first MCT injection. The animals were anesthetized (Isoflurane 1.5% and 100% oxygen in a constant flow of 1L/min; Isoflurane, BioChimico, Brazil), and the images were obtained while the animals remained in the lateral decubitus position. Two-dimensional studies with a fast-sampling rate of 120 fps in M-mode were performed using the MyLabTM30 ultrasound system (Esaote, Genoa, Italia) and 11 MHz nominal frequency transducers. The two-dimensional transthoracic echocardiography and M-mode was obtained at a scanning speed of 200 mm adjusted according to the heart rate.40 To evaluate LV function, the following parameters were assessed: LV ejection fraction (EF) and fractional shortening (FS). To characterize the PAH, the tricuspid annular plane systolic excursion (TAPSE) was determined.

At the median end point day (± 1 day) of the SHF animals, animals from SH, EH, and SC groups were euthanized. After euthanasia, animals from SC, SH, and EH groups had the heart, ventricles, and lungs dissected, weighed, and processed for analyses of interest, as described below. The right tibia was dissected, and its length was measured.

 Histomorphometry

The histological analyses of the LV were performed as previously described.41 , 42 Briefly, immediately after collection, fragments of the LV were fixed on the Karnovsky fixator (paraformaldehyde 4% and glutaraldehyde 4% in 0.1M phosphate buffer, pH 7.4) for 24 hours. The fragments were then dehydrated in ethanol, clarified in xylol, and embedded in paraffin. Blocks were cut into 5 μm-thick sections, mounted on histological slides, and stained with Hematoxylin & Eosin to measure the cross-sectional area (CSA), or with Sirius Red to count collagen fibers and/or with Masson’s trichrome for cardiac fibrosis count. To avoid repeated analyses of the same histological area, the sections were evaluated in semi-series, using one in every 10 sections. Digital images from Sirius Red stained slides were obtained using a polarized light microscope (Olympus AX-70, Tokyo, Japan) connected to a digital camera (Olympus Q Color-3, Tokyo, Japan), and images of slides stained with Hematoxylin & Eosin and Masson’s trichrome were obtained using a light microscope (Olympus AX-70, Tokyo, Japan) connected to a digital camera (Olympus Q Color-3, Tokyo, Japan). The quantification of collagen types and cardiac fibrosis was performed using a specific color identification tool using the Image-pro Plus 4.5 software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA). Myocyte CSA was measured using a specific tool (manual measurement in software image pro-plus 4.5).

 Isolation of left ventricle myocytes

The heart was attached to a Langendorff-retrograde perfusion system, and single LV myocytes were isolated as previously described.18 Briefly, the heart perfused system via aorta with Tyrode solution containing (in mM; Sigma-Aldrich, USA): 130 NaCl, 1.43 MgCl2, 5.4 KCl, 0.75 CaCl2, 5.0 Hepes, 10.0 glucose, 20.0 taurine, and 10.0 creatine, pH 7.4 until for about 5 min. The Tyrode solution was exchanged to Tyrode solution containing EGTA (0.1 mM) for 6 min. The heart was then perfused with Tyrode solution containing 1 mg/ml collagenase type II (Worthington, USA) and 0.1 mg/ml protease (Sigma-Aldrich, USA) for about 12 min. Next, the LV of the digested heart was removed and cut into small fragments, which were placed into a conical flask containing the enzymatic solution (collagenase and protease). The cells were mechanically separated by shaking the flask for 5 min. The dispersed cells were separated from the non-dispersed tissue by filtration through centrifugation. The isolated cells were stored at 5°C until use. Isolated myocytes were used within 2 to 3 hours after isolation. The solutions used in the isolation procedure were oxygenated (O2100% - White Martins, Brazil) and maintained at 37ºC.

 Single myocyte contractile function

The contractile function of LV myocytes was measured using an edge detection system (Ionoptix, Milton, USA) mounted on an inverted microscope (Nikon Eclipse - TS100, Japan) as previously described.19 Myocytes were placed in a bath on the stage of an inverted microscope and superfused with Tyrode’s solution containing, in mM (Sigma-Aldrich, USA): 137 NaCl, 5.4 KCl, 0.33 NaH2PO4, 0.5 MgCl2, 5 HEPES, 5.6 glucose 1.8 CaCl2,pH 7.4 with 5N NaOH, at 37˚C. Only myocytes exhibiting a clear, regular striation (sarcomere) pattern, with no spontaneous contraction in the absence of external stimulation, and responding to 1Hz stimulation with a single twitch were tested. Myocytes were stimulated (Myopacer, Ionoptix, Milton, USA) to contract at a progressive stimulation frequency (1, 3, 5 and 7 Hz) using external electrodes, and the resultant cell shortening was measured by analyzing a video image of the cell using Ionoptix camera and software (Ionoptix, Milton, MA, USA). Cell shortening was expressed as % of resting cell length.

The myocyte length and width were obtained from the video image of the cell; and the cell volume was calculated as previously described.43

 Statistical analysis

The normality of the data was tested using the Shapiro-Wilk test. Data are presented as mean ± SD for continuous variables with normal distribution and median accompanied by the interquartile range for continuous variables without normal distribution. The end point, ventricular remodeling parameters, and contractile parameters of isolated cardiomyocytes showed a non-normal distribution, while exercise parameters, body and organ weight, and cross-sectional area and isolated cell morphometry presented normal distribution. The end point was tested by the Kaplan-Meier curve analysis through the Log-rank test. Maximum carrying load, body weight, LV function, organ weight, and single cell parameters were tested by one-way analysis of variance (ANOVA) or Kruskal-Wallis followed by the Dunn’s post hoc test. Maximum carrying load was tested by one-way repeated measures ANOVA. ANOVAs were followed by the pairwise Tukey correction test. Person’s Chi-squared test (X2) was used to assess the proportion of animals that presented intraventricular septum flattening. Statistical significance was assumed at P < 0.05. Data description, numbers of rats and myocytes are given in the table and figure legends. All analyses were performed using GraphPad Prism, version 6.01 (San Diego, CA, USA).

 Results Onset of potential heart failure and physical effort tolerance

Figure 1A illustrates that animals from the EHF group performed the resistance exercise protocol during the development of PAH until presenting signs of the onset of potential heart failure. The maximal carrying load increased progressively until day 21, and afterwards it decreased to the initial level on the 35thday after the first MCT injection. All animals from both SHF and EHF groups presented signs of the onset of potential heart failure - end point ( Figure 1B ); however, animals in the EHF group had a longer median end point time (37 days) than did those in SHF group (28 days), indicating benefits of resistance exercise.

Effect of resistance training on the onset of potential heart failure (end point) and physical effort tolerance. (A) Relative maximal carrying load of hypertensive animals until failure, determined by the maximal carrying load normalized to body weight, at pre-injection (day 0) and on the 14th, 21st, 28th, and 35th day after the first monocrotaline injection. (B) End point, measured in days to present signs of the onset of potential heart failure, was significantly shorter in sedentary hypertension until failure (SHF, n = 6) than in exercise hypertension until failure (EHF, n = 6) rats. **P < 0.01, Kaplan-Meier curve analysis by the Log-rank test. (C) Relative maximal carrying load of control, hypertensive sedentary and exercise animals, determined as in panel A. Exercise hypertension (EH, n=7) rats exhibited higher carrying load gain than sedentary control (SC, n=7) and sedentary hypertension (SH, n=7) from the 14th day on. Repeated measures ANOVA followed by Tukey correction test. aP < 0.05 vs. SH; bP < 0.05, vs. SC; *P < 0.05 vs. Before MCT injection.

Hypertensive rats from the EH group improved their tolerance to physical effort ( Figure 1C ) throughout the experiment. The maximum carrying load in the EH group was higher on days 21 and 28 than on day 0. Moreover, these animals had a higher maximum carrying load on the 14th, 21stand 28thday, when compared to those in the SC and SH groups.

 Left ventricular function and morphology

The echocardiographic evaluation showed a flattening of the interventricular septum, called the D-shaped left ventricle, in animals from the SH and EH groups ( Figure 2A ), which suggests RV pressure overload, characteristic in PAH. Such a morphological change was greater in the SH than in the SC group, while EH presented intermediate values ( Figure 2D ). Regarding the left ventricle function, no difference between the groups for ejection fraction ( Figure2B ) and fractional shortening ( Figure 2C ) was found. Despite that, it is important to note that 3 out of 7 animals in the SH group presented an ejection fraction < 50%, and 3 out of 7 presented fractional shortening < 25%, indicative of left ventricular failure. By contrast, none of the exercised animals (EH), in the same period, showed an ejection fraction < 50%, and only 1 out of 7 presented fractional shortening < 25%.

Effect of resistance exercise training on left ventricular function assessed on the 28th day after the first monocrotaline injection. (A) Representative echocardiograph images. (B) Ejection fraction. (C) Fractional shortening. (D) D-shaped left ventricle. Values are means ± SD (n = 7 rats in each group). SC: sedentary control; SH: sedentary hypertension; EH: exercise hypertension; RV: right ventricle; LV: left ventricle. Dotted line indicates limits for the classification of impaired function. Panel B and C: One-Way ANOVA followed by the Tukey’s post hoc test. Panel D: Pearson’ s Chi-squared test (x2 test). *p < 0.05.

The presence of PAH in animals from the SH group was also characterized by the TAPSE values. Animals from the SH group exhibited lower TAPSE values (1.43 ± 0.23) than did those from the SC (2.06 ± 0.17) and EH (2.13 ± 0.36) groups.

Animals from the SH group presented lower body weight than did those from the SC and EH groups ( Table 1 ). Despite no difference between group for heart weight, animals from the SH and EH groups had higher RV weight and right ventricle-to-tibia ratio than did animals in the SC group, which indicates RV hypertrophy. While lung weight and lung weight-to-tibia ratio were higher in the SH and EH groups than in the SC group, no difference between groups for LV weight and LV weight-to-tibia ratio was found. Regarding left ventricle myocyte dimensions, the SH group presented a lower length, width, and volume than did the SC group. The EH group presented intermediate values between the SC and SH groups. Animals of the SH groups exhibited lower CSA when compared to animals in the SC and EH groups. By contrast, there was no difference in the CSA of animals in the EH group when compared to animals in the SC group, suggesting a beneficial effect of the resistance exercise program in preventing adverse left ventricle remodeling.

Effect of resistance exercise training on body and organ weights
SC SH EH
Final BW (g) 298.6 ± 19.01 276.3 ± 19.87* 303.7 ± 20.98†
Heart weight (g) 1.23 ± 0.11 1.30 ± 0.18 1.28 ± 0.12
RV weight (g) 0.33 ± 0.04 0.42 ± 0.03* 0.44 ± 0.05*
LV weight (g) 0.74 ± 0.10 0.65 ± 0.07 0.70 ± 0.07
Lung weight (g) 1.65 ± 0.28 2.77 ± 0.41** 2.38 ± 0.33**
Ratio of RV weight to tibia length (g/cm) 0.09 ± 0.01 0.11 ± 0.00* 0.11 ± 0.01*
Ratio of LV weight to tibia length (g/cm) 0.20 ± 0.02 0.17 ± 0.02 0.18 ± 0.02
Ratio of lung weight to tibia length (g/cm) 0.45 ± 0.10 0.73 ± 0.11** 0.63 ± 0.09*
Myocyte length (µm) 132.3 ± 19.09 122.5 ± 19.86** 129.2 ± 21.42
Myocyte width (µm) 46.12 ± 10.08 41.75 ± 9.95* 43.64 ± 9.50
Myocyte volume (pL) 46.24 ± 3.97 38.71 ± 3.18** 42.62 ± 3.61
Myocyte CSA (µm2) 462.1 ± 21.86 400.5 ± 43.34* 492.2 ± 66.56†

Data are mean ± SD of 7 rats and 10 cells in each group; SC: sedentary control; SH: sedentary hypertension; EH: exercise hypertension; BW: body weight; RV: right ventricle; LV: left ventricle; *p < 0.05 vs. SC; **p < 0.01 vs. SC; †p < 0.05 vs. SH. One-way ANOVA followed by the Tukey post hoc test.

 Left ventricular adverse remodeling

Figure 3 shows data on LV collagen fibers and fibrosis. Hypertensive animals (SH and EH) presented a higher percentage of type I collagen compared to animals in the control group (SC) ( Figure 3A ). However, animals in the EH group had a lower percentage of type I collagen when compared to animals in the SH group, showing the protective effect of RT on the progression of PAH. In addition, animals in the EH group exhibited a higher percentage of type III collagen than those in the sedentary animals (SC and SH) ( Figure 3B ). Hypertensive animals (SH and EH) had a higher percentage of total collagen, compared to animals in the control group ( Figure 3C ). Concerning LV fibrosis ( Figure 3D ), animals in the SH group presented a higher percentage, compared to the those in the SC and EH groups. There was no difference between the percentage of fibrosis in animals from the EH and SC groups, showing a beneficial effect of resistance exercise on the prevention of pathological cardiac remodeling.

Effect of resistance exercise training on left ventricle remodeling. (A) Percentage of type I collagen. (B) Percentage of type III collagen. (C) Percentage of total collagen. (D) Percentage of fibrosis in the LV. (E) Representative photomicrographs of LV tissue stained with Sirius Red; (F) Representative photomicrographs of LV tissue stained with Masson’s trichrome. Blue arrow indicates type I collagen; White arrow indicates type III collagen; Black arrow indicates cardiac fibrosis. Values are presented as median accompanied by the interquartile range of 10 images per animal in each group (n = 5 rats in each group). SC: sedentary control; SH: sedentary hypertension; EH: exercise hypertension. Kruskal-Wallis, followed by the Dunn’s post hoc test: * P < 0.05, and ** p < 0.01.

Single myocyte contractile function

Under electrical stimulation, myocytes from SH animals showed a positive contraction-frequency relationship at the frequencies of 1, 3, and 5 Hz and a lower magnitude of shortening than those from the SC and EH groups ( Table 2 ). Such a difference lost its statistical difference from 5 to 7Hz, where the contraction-frequency relationship became negative. In addition, the departure velocity (an index of contraction velocity) was slower in cells from the SH group than in those from the SC group over the range of 1-7 Hz. However, when compared to the EH, the lower speed was found only at 1, 3, and 7 Hz. Likewise, the return velocity (an index of relaxation velocity) was slower in the SH group than in the SC group. When compared to the EH, the slower speed was found only at 1 and 3 Hz.

Effect of resistance exercise training on left ventricular myocyte contraction and relaxation
SC SH EH
Median (IQR 25%-75%) Median (IQR 25%-75%) Median (IQR 25%-75%)
Shortening (% r.c.l.)
S.F. (1 Hz) 7.69 (5.74-9.42) 5.26 (3.23-7.08)* 7.89 (5.80-9.30)†
S.F. (3 Hz) 8.02 (5.47-10.14) 6.08 (3.73-8.29)* 7.70 (6.59-10.11)†
S.F. (5 Hz) 8.16 (6.06-10.15) 6.74 (4.83-8.78)* 8.26 (6.25-10.20)†
S.F. (7 Hz) 7.32 (4.86-9.33) 6.04 (4.37-8.01) 6.95 (5.41-8.90)
Departure velocity
S.F. (1 Hz) 262.9 (191.8-330.3) 189.2 (106.1-266.8)* 250.7 (179.1-307.0)†
S.F. (3 Hz) 317.7 (222.6-411.2) 250.2 (129.3-332.6)* 288.5 (226.4-416.1)†
S.F. (5 Hz) 365.8 (246.7-473.2) 303.3 (175.5-417)* 342.4 (254.7-467.3)
S.F. (7 Hz) 369.8 (284.4-472.9) 322.2 (209.7-367.9)* 344.9 (293.1-469.5)†
Return velocity
S.F. (1 Hz) 229.0 (158.2-282.5) 143.6 (76.53-220.7)* 206.5 (148.4-274.1)†
S.F. (3 Hz) 254.6 (177.2-321.3) 191.9 (97.98-254.2)* 241.3 (159.2-323.8)†
S.F. (5 Hz) 273.3 (218.4-354.5) 236.1 (126.9-279.6)* 247.6 (178.4-353.6)
S.F. (7 Hz) 285.2 (226.9-362.6) 234.3 (153.5-293.8)* 260.5 (202.9-356.9)

Data are presented as median accompanied by the interquartile range (IQR) of 10 cells per animal in each group (n = 7 rats in each group). % r.c.l., percentage of resting cell length; SF: stimulation frequency; SC: sedentary control; SH: sedentary hypertension; EH: exercise hypertension. *p < 0.05 vs. SC; **p < 0.01 vs. SC; †p < 0.05 vs. SH. Kruskal-Wallis, followed by the Dunn’s post hoc test.

 Discussion

The present study examined whether low- to moderate-intensity RT might prove beneficial to LV and myocyte contractile functions in rats during the development of MCT-induced PAH. Our findings demonstrate for the first time that rats treated with MCT (Two MCT injections of 20 mg/kg, at a 7-day interval) climbed the ladder during the development of PAH and progressively increased their tolerance to physical effort. Our study’s index of physical effort tolerance, the maximal carrying load, was progressively higher in the EH group compared to the SH and SC groups throughout the experiment. This model of RT was efficient in increasing muscle strength in another rat model of hypertension.44 The increase in body weight and maximal carrying load observed here suggests a protective effect of RT against skeletal muscle loss and dysfunction. This is an interesting finding since sarcopenia, intolerance to physical effort, and lethargy are reported characteristics of this PAH model.42 , 45 - 47 Muscle power has proven to be improved in PAH patients in response to combined exercise (Aerobic + Resistance) programs.23 - 25 Moreover, the increase in muscle strength is important for hypertensive individuals, as it lightens the cardiovascular overload during their daily life activities and has been associated with protection against all-cause mortality.48

The RT program used in the present study expanded the time until the animals exhibited the signs of the onset of potential heart failure (i.e., end point). Although there is no study on the effects of the RT model on such an end point in rats with MCT-induced PAH, prolonged end point in rats injected with MCT in response to voluntary running has been reported by our group,17 , 18 and extended survival in response to treadmill running has been demonstrated by others,45 , 49 more markedly when started at the early stages of the disease. Enhanced survival has also been demonstrated in PAH patients submitted to combined exercise (Aerobic + Resistance) interventions.23 - 25

Our RT regime benefited the LV functional and structural parameters in MCT-injected rats. Regarding left ventricular function, echocardiography showed that 42.86% of sedentary rats injected with MCT (SH group) had an ejection fraction below 50%, and 28.57% presented fractional shortening below 25%, which indicates left ventricular dysfunction. Nevertheless, in exercised animals (EH group) the presence of left ventricular disfunction was lower than in sedentary rats (SH group), thus suggesting a protective role of resistance exercise. These findings run in line with changes caused by the employed RT in the LV tissue. For instance, RT increased the percentage of type III collagen while it reduced the percentage of type I collagen and fibrosis in rats with MCT-induced PAH, thus showing the protective effect of this exercise regime against left ventricular dysfunction and adverse remodeling leading to mitigation of the PAH progression.

The organ parameters showed that MCT-injected sedentary rats (SH group) exhibited higher RV (i.e. RV weight, Fulton’s index, and RV weight/tibia length ratio) and lung (i.e. Lung weight, lung weight/tibia length ratio) values than did the control group (SC). Despite no change in whole LV weight and LV to tibia length ratio, single myocyte length, width, and volume were decreased by MCT (SC > SH). However, RT prevented this type of cell dimension reduction (EH = SC), which indicates the maintenance of the left ventricular mass and suggests the protective effect of the applied RT program against the left ventricular adverse remodeling.

Along with reduction in myocyte dimensions, MCT induced single myocyte contractile dysfunction. Myocytes from the SH group had lower shortening and longer contraction and relaxation velocities than did those in the SC group. More importantly, RT mitigated the contractile dysfunction as these cell parameters in the EH group were similar to those in the SC group, thus indicating improvements in the contractile function in myocytes from the EH group relative to those from the SH group. The calcium regulatory proteins (i.e., Ryanodine receptor 2, Phospholamban, and Sarcoplasmic reticulum ATPase 2a) manage the force and time course of cardiomyocyte contraction and are reported to be downregulated in the RV of MCT-treated rats.15 , 45 Whether the employed RT regime increases the expression and activity of these proteins warrants further investigations, though such an exercise effect has been demonstrated in normotensive healthy rats.50 , 51

Taken together, the present study’s results demonstrate that the RT employed during the development of MCT-induced PAH was beneficial to left ventricle and myocyte contractile structure and function, which resulted in enhanced tolerance to physical effort and time to the onset of potential heart failure in the animals.

Considering resistance exercise recommendations for patients with cardiovascular diseases,20 the present used low- to moderate-intensity. Considering that high-intensity exercise is reported to promote the highest benefits in patients with heart failure,52 and that MCT-injected rats exercised with a progressive load until the median end point time of the sedentary rats (28 days), it might be possible to experimentally increase exercise intensity using reward techniques to expand the resistance exercise effects.

Finally, this study has limitations. First, the speed of climbing is not controlled in this model. Second, the duration of the training period is limited by the effects of MCT. Despite that, our results showed positive effects of the resistance exercise program on both the time to the onset of potential heart failure, physical effort tolerance, and LV dysfunction.

 Conclusion

Our findings demonstrate that along with the increase in the time to the onset of potential heart failure and in the physical effort tolerance, low- to moderate-intensity resistance exercise mitigates the development of left ventricular dysfunctions in the MCT-induced PAH model. Therefore, low- to moderate-intensity RT is beneficial to left ventricular and myocyte contractile functions in this model. These results are of clinical relevance, as they support the health benefits of resistance exercise to individuals with cardiopulmonary disease, including PAH. We suggest that low- to moderate-intensity resistance exercise should be tested in PAH patients.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Leôncio Lopes Soares, from Universidade Federal de Viçosa.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Universidade Federal de Viçosa under the protocol number 02/2019. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013.

Sources of Funding: This study was partially funded by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes).