Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC YWLhk4cCJRmbK6s4qfVbTQp S0066-782X2022005012203 S0066-782X2022001000533 abc.20210682 10.36660/abc.20210682 Artigo Original Perfil de IL-6 e TNF na Formação de Células Espumosas: Um Método Aprimorado Usando a Sonda de Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) 0000-0002-2675-8069 Castro Cynthia Aparecida 1 2 Buzinari Tereza Cristina 3 Lino Rafael Luis Bressani 3 Araújo Heloisa Sobreiro Selistre de 3 Aníbal Fernanda de Freitas 2 Verzola Roberto Mario Machado 3 Bagnato Vanderlei Salvador 1 Inada Natalia Mayumi 1 Rodrigues Gerson Jhonatan 3 Instituto de Física de São Carlos Universidade de São Paulo São Carlos SP Brasil Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, SP – Brasil Departamento de Morfologia e Patologia Universidade Federal de São Carlos São Carlos SP Brasil Departamento de Morfologia e Patologia – Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP – Brasil Departamento de Ciências Fisiológicas Universidade Federal de São Carlos São Carlos SP Brasil Departamento de Ciências Fisiológicas – Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP – Brasil Correspondência: Cynthia Aparecida de Castro • Universidade Federal de São Carlos – Rod. Washington Luís, km 235 – SP-310. CEP 13565-905, São Carlos, SP – Brasil E-mail: cynthiaefi2004@yahoo.com.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Castro CA, Bagnato VS, Inada NM, Aníbal FF, Rodrigues GJ; Obtenção de dados: Castro CA, Buzinari TC, Lino RLB, Selistre-de-Araújo HS, Aníbal FF, Rodrigues GJ; Análise e interpretação dos dados: Castro CA, Buzinari TC, Lino RLB, Rodrigues GJ; Análise estatística: Castro CA, Buzinari TC, Bagnato VS; Obtenção de financiamento: Bagnato VS, Inada NM, Selistre-de-Araújo HS, Rodrigues GJ; Redação do manuscrito: Castro CA, Lino RLB, Bagnato VS, Inada NM, Aníbal FF; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Castro CA, Lino RLB, Bagnato VS, Inada NM, Selistre-de-Araújo HS, Aníbal FF, Rodrigues GJ.

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo.

 05 08 2022 10 2022 119 4 533 541 09 08 2021 07 01 2022 09 03 2022 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

A formação de células espumosas ocorre devido ao aumento em lipoproteína plasmática de baixa densidade (LDL) e desregulação da inflamação, sendo importante para o desenvolvimento da aterosclerose.

 Objetivo

Avaliar o perfil do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e da interleucina-6 (IL-6) no método de formação da célula espumosa existente, otimizando esse protocolo.

 Métodos

A LDL foi isolada, oxidada e marcada com sonda de isotiocianato de fluoresceína (FITC). As células espumosas foram geradas de célula derivada de monócitos humanos THP-1 e incubadas na ausência (controle) ou presença de FITC-ox-LDL (10, 50, 100, 150 ou 200 μg/mL), por 12, 24, 48 ou 72 horas. A FITC-ox-LDL na célula foi quantificada por microscopia. O ensaio de imunoabsorção enzimática foi avaliado para quantificar a IL-6 e o TNF-α, com um p <0,05 considerado significativo.

 Resultados

Todas as concentrações de FITC-ox-LDL testadas apresentaram fluorescência mais alta em comparação com o controle, demonstrando maior acúmulo de lipoproteínas nas células. Quanto mais alta a concentração de FITC-ox-LDL, maior a produção de TNF-α e IL-6. A produção de IL-6 pelas células espumosas foi detectada até o valor de 150 µg/mL da LDL máxima de estímulo. Concentrações acima de 50 μg/mL de LDL estimularam maior liberação de TNF-α comparado ao controle.

 Conclusões

Nosso modelo contribui para o entendimento da liberação de IL-6 e TNF-α em resposta a várias concentrações de ox-LDL usando o método otimizado para a formação de células espumosas.

 Aterosclerose Inflamação Células Espumosas Lipídios Placa Aterosclerótica Fatores de Risco Isotiocianatos Fluoresceina CAPES 001 FAPESP 2018/10588-9 Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado pela FAPESP (CEPID-CEPOF) e CNPq(INCT) e parcialmente financiado pela FAPESP. Introdução

A aterosclerose é uma das causas mais importantes de morbidade e mortalidade em todo o mundo, e é detectada pelo acúmulo de lipídeos em macrófagos que nesse estágio são conhecidos como células espumosas no espaço subendotelial da parede arterial.1 A formação de células espumosas ocorre pelo aumento da lipoproteína plasmática de baixa densidade (LDL), que passa por vários processos fisiológicos mediados por oxidação, acetilação e desnaturação. Essas modificações são estímulos fisiológicos que favorecem a internalização de partículas lipídicas por macrófagos, gerando a célula espumosa.2 Tipos de células alternativas presentes na neoíntima, tais como músculo liso e células endoteliais, também podem internalizar gotículas de lipídeos e se transdiferenciar a um estado semelhante ao das células espumosas de macrófagos, contribuindo para a formação de placa aterosclerótica.3 , 4

Os macrófagos podem contribuir para o desenvolvimento da aterosclerose, exibindo alta heterogeneidade5 devido a seu fenótipo resultante. Esse fenótipo pode ser classificado como M1 ou M2. Macrófagos M1 são caracterizados como pró-inflamatórios e têm alta expressão de proteínas pró-inflamatórias que contribuem para a formação da placa aterosclerótica. Os macrófagos M2 desempenham um papel preventivo, reduzindo o tamanho da placa e melhorando sua estabilidade, já que tem um perfil anti-inflamatório.5 , 6

Estimular o perfil pró-inflamatório é importante no processo de formação das células espumosas, já que mecanismos inflamatórios podem atuar como precursores na formação lipidocêntrica, além de promoverem a aterogênese por meio da absorção de colesterol e da redução do efluxo de colesterol.2 Embora a hiperlipidemia estimule a aterogênese fornecendo mais lipídeos para a formação de células espumosas, alguns mediadores inflamatórios aumentam a oxidação lipídica, tais como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6).7 A IL-6 é uma citocina pleiotrópica que exibe propriedades pró- e anti-inflamatórias, dependendo do tipo de célula-alvo. O aumento da IL-6 na aterosclerose resulta em efeitos em várias células envolvidas no processamento de lipídeos e na formação de placa, tais como a ativação de células endoteliais, a proliferação celular de músculo liso, e o acúmulo de lipídeos de macrófagos.8 Agora existem fortes evidências para o papel do TNF-α derivado de macrófagos no desenvolvimento da aterosclerose e no aumento da inflamação vascular.9 Portanto, é útil investigar a fisiopatologia da formação de células espumosas para o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas para a aterosclerose.10

As técnicas mais comumente usadas para o estudo da formação da célula espumosa são a quantificação de ox-LDL marcado dentro dos macrófagos ou o uso de corantes não específicos, tais como o Oil Red O. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil do TNF-α e da IL-6 no método de formação da célula espumosa existente, otimizando, assim, esse protocolo. A presença desses mediadores inflamatórios age como marcadores da formação das células espumosas pró-inflamatórias, o início da formação da placa aterosclerótica.

 Materiais e métodos Produtos químicos e reagentes

Este estudo utilizou RPMI 1640, soro fetal bovino (SFB) (Vitrocell Embriolife, Campinas, SP, BR), PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil); forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), isotiocianato de fluoresceína (FITC), dicloridrato de 4’, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), benzamidina, cloranfenicol e gentamicina, aprotinina, brometo de tiazolil azul de tetrazolio (MTT), que foram comprados da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA; kit de ensaio de colesterol Amplex Red (Nº de catálogo A12216, Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, OR); IL-6 e TNF-α R&D Systems, 614 McKinley Pl NE, Minneapolis, MN, EUA.

 Isolamento de LDL

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana da Universidade Federal de São Carlos - UFSCar (nº 2.243.706) e os participantes forneceram seu consentimento por escrito. Foi realizada a coleta de sangue de 10 voluntários normolipidêmicos (homens e mulheres com idades entre 18 e 45 anos) e o plasma foi obtido após a centrifugação a 1000 g por 15 min na presença de K2EDTA 0,1 mL por 5 mL de sangue. Depois disso, benzamidina (2 mM), gentamicina (0,5%), cloranfenicol (0,25%), PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil) (0,5 mM), e aprotinina (5 µl/mL) foram acrescentados ao plasma (todos adquiridos da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) conforme descrito no relato anterior.11 A densidade do plasma foi elevada a 1,021 g/mL por KBr (o volume de plasma é multiplicado pelo fator 0,3265 e o valor é obtido em gramas de KBr sólido). Em seguida, 2,5 mL de plasma foram acrescentados ao tubo de polipropileno (4 mL) e o tubo foi preenchido com solução de KBr d = 1,006. A LDL foi isolada por ultracentrifugação (337 g por 4 horas a 4 °C) em um rotor de ângulo fixo SW60TI (Beckman Coulter, Beckman). A fração amarelo-laranja da LDL permaneceu no infranadante. A fração da LDL foi coletada por sucção, usando-se uma seringa de 1 mL. A LDL coletada foi dialisada em ambiente escuro a 4 °C em 2 L de PBS, pH 7,4, com quatro trocas de PBS por 24 horas. Após a diálise, a LDL foi filtrada (0,22 μm) e armazenada a 4 °C. A concentração de proteína foi determinada usando-se o método do reagente de fenol de Folin.12

 Modificação oxidativa da LDL

A LDL oxidada (ox-LDL) foi obtida pela incubação da LDL com CuSO4 (5 μmol/mL por mg de proteína LDL/4 h/37 °C). A oxidação foi interrompida acrescentando-se 20 µmol/mL EDTA. O grau de oxidação foi determinado pela medição da oxidação ferrosa do laranja de xilenol.13 Após a oxidação, a ox-LDL foi dialisada em ambiente escuro por 24 h a 4 °C e lavada 4 vezes com 2 L de PBS e EDTA (0,3 mM).

 Marcação fluorescente de LDL

A LDL foi marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC). Todos os procedimentos foram realizados em ambiente escuro. A LDL (1 mg/mL) e o FITC (50 μg ̸mL) foram misturados e incubados a 37 °C por 3 horas. O FITC não ligado foi retirado por diálise em PBS, por 48h a 4 °C com oito trocas de PBS, e filtrado por uma malha de 0,22.14 O FITC-ox-LDL foi armazenado a 4 °C e usado por até dois meses.

 Cultura celular

A linha celular derivada de monócitos humanos THP-1 foi comprada do Banco de Células do Rio de Janeiro, RJ, Brasil, e foi cultivada a 37 °C em uma atmosfera de 5% CO2 com uma densidade de 106 células/mL. O meio de cultura para as células THP-1 foi o meio RPMI 1640 suplementado por soro fetal bovino (SFB) a 10% (Gibco BRL), 50 mg/L de sulfato de gentamicina, e 2 mg/L de anfotericina B. Para os experimentos, foram utilizadas células THP-1 para indução em macrófagos, usando o forbol 12-miristato 13-acetato 100 nM (PMA, Sigma)15 e interferon (IFN)-γ (500 U/mL) para o fenótipo M1 induzido.16 O PMA induz a diferenciação da célula THP-1 pela interação direta com PKCδ que se liga à trombomodulina, ativa ERK1/2, que, por sua vez, ativa a expressão do inibidor de ciclo da célula p21Cip1via sinalização de NF-kB p65. Além disso, ERK1/2 participa da fosforilação de paxilina, cofilina, LIMK1, e PYK2, que mediam a remodelação citoesquelética para promover a diferenciação.17 O interferon γ (IFN-γ), pelo ativador de transcrição 1 (STAT1), favorece a polarização de macrófagos M1, que produzem mediadores pró-inflamatórios, incluindo o TNF-α, IL-6, IL-1.18 Depois dessa indução, as células de macrófagos THP-1 foram incubadas sem FITC-ox-LDL ou com 10, 50, 100, 150, 200 μg/mL, durante tempos diferentes (12, 24, 48 ou 72 horas) dependendo do propósito do experimento.

 Captação celular de colesterol

Para induzir a diferenciação do monócito THP-1 em macrófagos, monócitos THP-1 (104 células/mL) em placas de 96 poços foram tratados com 100 nM de PMA por 48 horas a 37 °C. Para identificar a melhor concentração de ox-LDL para induzir a formação de célula espumosa, foi realizada uma curva de concentração-resposta: por 24 horas a 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL, e 200 μg/mL FITC-ox-LDL + IFN-γ (500 U/mL). Para a análise temporal, células diferenciadas foram incubadas na ausência ou na presença de FITC-ox-LDL (100 μg/mL) + interferon γ (500 U/mL) por 12h, 24h, 48h e 72h. O núcleo celular foi marcado com 1 μg/mL de sonda fluorescente DAPI (Sigma) por 10 minutos e lavado 3 vezes com PBS. Para analisar a imagem de fluorescência, foi usado um sistema de microscópio de fluorescência, ImageXpress Micro (Molecular Devices) com excitação de 495nm e 525 nm de emissão de FITC-ox-LDL, e excitação de 340 nm e 488 nm de emissão de DAPI

 Quantitação de colesterol/éster de colesterol em lisado celular

O teor de éster de colesterol da célula espumosa foi quantificado pelo kit de ensaio de colesterol Amplex Red (Nº de catálogo A12216, Molecular Probes, Eugene, OR), de acordo com o protocolo do fabricante. Para essa análise, as células THP-1 (2x10 células/poço) foram cultivadas em placas de 6 poços, diferenciadas em macrófagos, conforme descrito acima, e incubadas com ou sem ox-LDL. As células espumosas foram fixadas em paraformaldeído a 2% por 15 minutos, lavadas uma vez com PBS e incubadas com 200 μl/poço de álcool absoluto por 30 min a 4 °C para extrair lipídeos celulares. O teor de colesterol foi determinado incubando-se 50 µl de lipídeos extraídos de álcool diluídos em um tampão de reação 1x (0,1 M K2HPO4, pH 7,4, 0,05 M NaCl, 5 mM de ácido cólico, 0,1% Triton X-100) ou solução não diluída com 50 µl da solução de ensaio (colesterol total) ou 50 µl da solução de ensaio sem a esterase do colesterol (colesterol livre), por 30 min a 37 °C em ambiente escuro, e, em seguida, medindo-se a fluorescência (fluorímetro de microplaca HTS-7000; excitação de 530 nm, 590 nm). O valor foi relativizado para o os níveis de proteína celular totais. Para quantificar os níveis de proteína celular totais, as células espumosas extraídas de lipídeos foram incubadas com 0,1% (razão peso/volume [p/v]) SDS/0,2 M NaOH por 30 min em temperatura ambiente para extrair proteína celular. Os níveis de proteína celular foram determinados usando-se o método do reagente de fenol de Folin.12 Os níveis de colesterol total e éster de colesterol foram representados como nanogramas de colesterol total ou éster de colesterol por micrograma de proteína.

 Medições de citocina

A quantificação de citocinas inflamatórias em lisado de célula espumosa foi realizada usando-se o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). A concentração de IL-6 e do TNF-α nos sobrenadantes de macrófagos foi medida usando-se o DuoSet kits (R&D Systems, 614 McKinley Pl NE, Minneapolis, MN, EUA). Os macrófagos incubados na ausência de ox-LDL foram definidos como grupo de controle (M).

 Viabilidade celular

A viabilidade celular foi determinada por MTT (brometo de tiazolil azul de tetrazolio) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, EUA) (Mosmann, 1983). Monócitos de THP-1 (104 células/mL) foram inoculados em placas de 96 poços e tratados com 100 nM PMA para diferenciação de macrófagos, por 48 horas, mantidos a 37 °C em uma incubadora umidificada contendo 5% CO2. Após 48 horas, as células foram expostas por 24 horas a 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL e 200 μg/mL de FITC-ox-LDL + interferon γ (500 U/mL). A análise da viabilidade celular ao longo do tempo também foi realizada, sendo as células incubadas na ausência (grupo de controle - M) ou na presença de FITC-ox-LDL (FC) (100 μg/mL) + interferon γ (500 U/mL) por 12h, 24h, 48h e 72h. Posteriormente, foram adicionados 5 mg/mL de MTT, seguido de 4 horas de incubação a 5% CO2, 37 °C. Depois desse tempo, foram adicionados 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) e a placa permaneceu no agitador de placas por 10 minutos. A absorbância foi medida em 540 nm, usando-se um leitor de microplaca SpectraMax GeminiXS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA).

 Análise estatística

Todo o estudo foi realizado pelo menos em triplicata em três experimentos independentes, de acordo com as recomendações para Boas Práticas de Cultura Celular (BPCC).19 , 20 A normalidade dos dados foi verificada pelo teste Kolmogorov-Smirnov; igualdade de variância (teste de Levene). Todos os valores são expressos em média ± desvio padrão (DP). Para se determinar a diferença entre condições, foi aplicado o ANOVA com o teste post hoc de Bonferroni para múltiplas comparações. Para de determinar a diferença entre duas condições, o teste T não pareado de Student foi usado (SigmaStat versão 3.5; Systat). O nível de significância adotado para a análise estatística foi 5%.

 Resultados

Houve um acúmulo maior de ox-LDL marcado com uma sonda de FITC (indicado pela presença de fluorescência verde), não apenas na área perinuclear, mas também distribuído pelo citosol da maioria das células, conforme mostrado na Figura 1B . Como esperado, não foi encontrado acúmulo de LDL em células não tratadas ( Figura 1A ), que apresentou apenas fluorescência azul, que marca o núcleo da célula.

Imagens representativas de captação de FITC-ox-LDL em macrófagos de THP-1. As THP-1 foram incubadas na ausência (grupo de controle - A) ou presença B das concentrações indicadas de FITC-ox-LDL por 24 horas. As células foram então lavadas, fixadas e examinadas usando-se um conjunto de filtro de 546 nm. A captação de FITC-ox-LDL foi mostrada em verde e os núcleos das células foram marcados com DAPI (azul).

Na figura 2B , as imagens de fluorescência microscópica mostram que a FITC-ox-LDL foi absorvida em todas as concentrações, apresentando fluorescência mais alta quando comparada ao controle, usando-se a incubação de 24 horas. Acima de 50 μg/mL, a fluorescência foi mais alta quando comparada a 10 μg/mL, mas não se observou diferenças entre elas ( Figura 2A ).

Medição da concentração de FITC-ox-LDL em células THP-1. A) Captação de colesterol fluorescente dependente da concentração por macrófagos THP-1 em unidades arbitrárias (UA). B) Imagens representativas de captação de FITC-ox-LDL em macrófagos de THP-1. As THP-1 foram incubadas na ausência (grupo de controle: 0) ou na presença das concentrações indicadas de FITC-ox-LDL (10 – 200 μg/mL) por 24 h. A captação de FITC-ox-LDL foi mostrada em verde e núcleos celulares foram marcados usando-se DAPI (azul). As células foram visualizadas em microscópio de fluorescência (20× objetivas). Os valores foram expressos como média ± DP. * P <0,05, comparado a células incubadas com 10 μg/mL; ** P <0,01, comparado a células incubadas na ausência de FITC-ox-LDL.

Os macrófagos THP-1 foram incubados com 100 μg/mL de FITC-ox-LDL por 0, 12, 24, 48 e 72 h ( Figura 3 ). Observou-se que em 12, 24, 48 e 72 horas, a intensidade da fluorescência das células tratadas com FITC-ox-LDL aumentou significativamente do nível inicial (grupo de controle 0), mas somente após 72 horas a fluorescência foi maior do que a de outros períodos ( Figuras 3A e 3B ).

Medição de captação de colesterol aumentada dependente do tempo por macrófagos THP-1. A) Captação de colesterol fluorescente dependente do tempo por macrófagos THP-1 em unidades arbitrárias (UA). B) Imagens representativas de captação de FITC-ox-LDL em macrófagos de THP-1. As THP-1 foram incubadas com 100 ug/mL de FITC-ox-LDL por 0h, 12h, 24h, 48h e 72h. A captação de FITC-ox-LDL foi mostrada em verde e núcleos celulares foram marcados por DAPI (azul). As células foram visualizadas em microscópio de fluorescência (20× objetivas). M, macrófago; FC, células espumosas. Os valores foram expressos como média ± DP. * P <0,05, comparado a células incubadas na ausência de FITC-ox-LDL; y P<0,001, comparado a células incubadas com outras concentrações de FITC-ox-LDL.

A figura 4 mostra o colesterol relativo, outras técnicas para confirmar a presença de colesterol em dentro das células e a sobrevivência das células nessa condição. Quantitativamente, quando as células foram incubadas por 24 horas em concentrações diferentes, apenas com 150 e 200 µg/mL de ox-LDL, houve um aumento na concentração de colesterol em comparação ao controle não incubado com ox-LDL ( Figura 4A ). Essa condição não causou uma alteração maior na sobrevivência das células ( Figura 4C ). A figura 4B mostra que incubações de 100 µg/mL em tempos de exposição diferentes de ox-LDL não apresentaram diferenças nos períodos diferentes, mas todos os períodos mostraram uma concentração mais alta de colesterol comparadas ao momento 0 ( Figura 4B ). A viabilidade dos macrófagos foi reduzida ao longo do tempo (24, 48 e 72 horas) em comparação com o período de 12 horas, mas as células espumosas apresentaram uma redução na viabilidade apenas nos períodos de 24 e 48 horas, e, em 72 horas, essas células tinham uma viabilidade maior em comparação com os macrófagos em 72 horas, que era semelhante à do grupo das células espumosas no período de 12 horas ( Figura 4D ).

Captação de lipídeos em macrófagos THP-1 e viabilidade das células. A) Captação aumentada dependente da concentração de colesterol por macrófagos THP-1 (Colesterol relativo - o valor foi relativizado para os níveis de proteína celular totais); B) Captação aumentada dependente da concentração de colesterol por macrófagos THP-1 dependente do tempo (Colesterol relativo - o valor foi relativizado para os níveis de proteína celular totais). C) Índice de sobrevivência em concentrações diferentes de FITC-ox-LDL. D) Índice de sobrevivência em tempos de exposição a FITC-ox-LDL diferentes. M, ausência de FITC-ox-LDL no macrófago; FC, células espumosas. Os valores são expressos como média ± DP. P <0,05: * M vs. FC por tempo; ** comparado a células incubadas na ausência de FITC-ox-LDL (tempo 0); γ comparado a M com 12h; β comparado a FC com 12h.

Na produção de citocinas inflamatórias, a curva de tempo mostra que tanto a IL-6 e o TNF-α eram mais altos em células espumosas em comparação a macrófagos em todos os períodos de exposição a ox-LDL ( Figura 5A, 5B ), mas apenas a IL-6 foi mais alta nos períodos de 48 e 72 horas em comparação aos períodos de 12 e 24 horas ( Figura 5A ). Considerando a curva de concentração de ox-LDL, a produção de IL-6 foi mais alta em todas as concentrações testadas, em comparação às células sem exposição a ox-LDL (grupo de controle 0) ( Figura 5C ). Além disso, quando exposta a 50, 100, e 150 µg/mL, a produção de IL-6 foi maior quando comparada à concentração de 10 µg/mL, e a concentração de 200 µg/mL também diminuiu a liberação de IL-6, igualando-se aos valores de concentração de 10 µg/mL. A liberação de TNF-α foi mais expressiva apenas nas concentrações de 50 a 200 µg/mL ( Figura 5D ).

Efeito de tempo e concentração de ox-LDL nas citocinas pró-inflamatórias da célula THP-1: A) Interleucina 6 em tempos diferentes com 100 μg/mL ox-LDL; B) Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) em tempos diferentes com 100 μg/mL ox-LDL. C) Interleucina 6 em concentrações diferentes de ox-LDL tratada por 24 horas. D) Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) em concentrações diferentes de ox-LDL tratado por 24 horas. Os valores são expressos como média ± DP. M, macrófago na ausência de FITC-ox-LDL; FC, células espumosas. * P <0,001, M vs. FC por tempo (Teste T de Student); P <0,05: ** comparado a células incubadas na ausência FITC-ox-LDL (tempo 0); γ comparado com células incubadas de 10 μg/mL. + P < 0.01, comparado com 12h e 24h.

Discussão

Nossos experimentos documentam uma otimização do método existente de formação de célula espumosa induzida por LDL oxidada para a formação de célula espumosa in vitro , a partir de macrófagos THP-1 e da incubação com FITC-ox-LDL, além de verificar a resposta de citocinas tais como a IL-6 e o TNF-α. Com 12 horas de incubação, a formação de célula espumosa acontece com o fenótipo pró-inflamatório M1, ou seja, com um aumento nas concentrações de IL-6 e TNF-α. A caracterização do perfil inflamatório dos macrófagos é importante, pois macrófagos M1 pró-inflamatórios ativados de forma clássica estimulam a aterogênese, enquanto macrófagos M2 estabilizam a placa aterosclerótica.6

Outros estudos usaram a técnica de formação de célula espumosa adotando protocolos, como o uso de corante Oil Red O ou LDL marcada com suas próprias sondas, juntamente com LDL oxidada tornada mais complexa com o corante DiL (DiL-ox-LDL). Um estudo conduzido por Xu et al.,21 demonstrou que, após a incubação com DiL-ox-LDL (10 µg/mL) por 4 horas, o resultado foi um aumento significativo de captação de ox-LDL em macrófagos; entretanto, esse estudo não avaliou a inflamação nesses macrófagos.21 Embora o protocolo de indução de célula espumosa usando-se a sonda DiL-ox-LDL seja mais eficiente em comparação com outras técnicas, ele tem um rendimento menor, ou seja, é necessária uma grande quantidade de materiais para realizá-la, aumentando muito o custo. Além dessa técnica, este trabalho indica que a formação de células espumosas usando-se o corante Oil Red O e incubação de ox-LDL (50 μg/mL) por 24 horas não é um protocolo preciso, já que, nesse protocolo, lipídeos neutros (especialmente triglicérides) são coradas com um corante vermelho-alaranjado,22 o que pode levar à baixa especificidade da técnica, já que em células espumosas há mais éster de colesterol e não há lipídeos neutros. Portanto, no presente estudo, os métodos foram otimizados usando-se LDL oxidada marcada com uma sonda fluorescente FITC (FITC-ox-LDL), introduzindo um método prático de coloração para formação de célula espumosa a partir de macrófagos. Usando a marcação de ox-LDL com FITC e a quantificação da inflamação na formação de células, obteve-se um método com a qualidade de sondas fluorescentes de baixo custo, produzindo fotos de alta qualidade.

Para a formação de célula espumosa, a LDL humana foi isolada por ultracentrifugação, oxidada e marcada com sonda de isotiocianato de fluoresceína (FITC). O uso de FITC como sonda fluorescente é amplo, já que o grupo do isotiocianato reage com grupos aminos terminais e primários em proteínas, o que faz dele uma técnica viável e altamente acessível.11 , 14 Células THP-1 aderentes acumulam inúmeras gotículas de lipídeos (coloridas em verde) expostas a uma concentração de 100 μg/mL de LDL oxidada por 24 horas, conforme mostrado na literatura.23 , 24 Além disso, a THP-1 diferenciada por macrófagos assumiu a aparência morfológica de células espumosas com gotículas de lipídeo fluorescente presentes ao longo do citosol e próximo ao núcleo da maioria das células. Os monócitos de THP-1 foram amplamente usados como modelo de macrófagos in vitro , mas pouca atenção foi dedicada à otimização da formação de célula espumosa a partir de macrófagos sem verificar se há inflamação.

A concentração de 100 μg/mL é mais comumente usada na literatura,23 , 24 entretanto, os dados do presente estudo mostram que macrófagos derivados de monócitos THP-1 são bem diferenciados em células espumosas com 50 μg/mL FITC-ox-LDL por apenas 12h. Nessas condições, há um acúmulo de colesterol na célula com produção aumentada de citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-6 e TNF-α, sem alterar a viabilidade dessa célula. O fenótipo pró-inflamatório é de grande importância para a formação de célula espumosa, já que os componentes presentes na ox-LDL podem induzir diversos efeitos biológicos in vitro e in vivo , tais como a diferenciação de monócitos, a ativação de células endoteliais, e a ativação do sistema imune. Além disso, há evidências de que sua ação se deve à ativação de TLR4.25 Portanto, o processo oxidativo parece estar diretamente envolvido no estímulo dessas substâncias.

Além da concentração de LDL no citoplasma do macrófago, é importante monitorar a produção de citocinas inflamatórias, já que os macrófagos podem contribuir para a aterogênese, especialmente após sua interação com a ox-LDL na camada íntima da artéria, produzindo citocinas e mediadores inflamatórios.7 A crescente expressão de marcadores inflamatórios pode ser causada pela ativação de macrófagos durante o processo aterosclerótico, levando a um aumento na captação de ox-LDL.2 Os resultados mostrados neste trabalho demonstraram que a produção de IL-6 e TNF-α aumentou em macrófagos quando o tempo de exposição variou. A IL-6 foi liberada em uma concentração mais alta nas células espumosas em comparação com os controles. Além disso, quanto maior o tempo de exposição à ox-LDL, maior a liberação de IL-6, de forma que os períodos de 48 e 72 horas tiveram uma liberação maior em comparação com os períodos de 12 e 24 horas. Considerando o TNF-α, todos os tempos foram maiores do que seus controles, mas não houve diferenças entre os tempos de exposição. Em um ambiente com alta inflamação, é extremamente importante considerar a viabilidade dessas células, pois, nessas condições experimentais, a exposição a FITC-ox-LDL por 72 horas reduziu a viabilidade das células em comparação com a exposição por 12 horas. Juntos, esses dados podem sugerir que a produção de IL-6 e TNF-α poderiam contribuir para a adaptação da fagocitose de macrófagos. Isso é especialmente importante se, nesse microambiente, os macrófagos (M1) estão em maiores quantidades, promovendo um processo inflamatório, induzindo a cronicidade e promovendo efeitos deletérios nos tecidos.

As células espumosas na placa aterosclerótica produzem citocinas pró-inflamatórias que podem contribuir para a inflamação local. Sua natureza inflamatória foi corroborada por estudos in vitro que mostram macrófagos M2 derivados de monócitos, que normalmente têm um fenótipo anti-inflamatório, consomem altos níveis de ox-LDL e produzem fatores pró-inflamatórios (IL-6, IL-8, MCP-1) seguidos da formação de célula espumosa, assumindo, dessa forma, um fenótipo pró-inflamatório mais próximo ao M1.2 Os macrófagos, in vivo , são uma população de células dinâmicas com características fenotípicas e funcionais que são significativamente diferentes entre si, dependendo de seu ambiente de maturação e da natureza de seus estímulos adicionados.7 Por exemplo, células THP-1 podem ser direcionadas a um fenótipo M1 usando o IFN-γ,16 da forma como usamos em nosso protocolo e que foi confirmada pela alta liberação de citocinas inflamatórias. Outros estudo usam um protocolo de exposição a LDL muito prolongado, com duração de 48 horas ou mais,26 , 27 o que mostramos não ter viabilidade, já que, com 12 horas de incubação, a formação da célula espumosa já foi obtida, garantindo um alto grau de inflamação. Além disso, no período de 48 horas, a viabilidade da célula foi reduzida em aproximadamente 50%, prejudicando possíveis intervenções.

Portanto, a falta de um protocolo uniforme que apresenta componentes inflamatórios afeta grandemente a interpretação dos resultados e a capacidade de comparar estudos. Isso se dá porque o desenho do experimento não representa possíveis diferenças fenotípicas e/ou funcionais nas populações de macrófagos que podem ser atribuídas ao uso de protocolos de maturação diferentes, tempo de exposição e concentração de LDL, sem avaliar o perfil inflamatório.

 Conclusão

Os resultados do presente estudo sugerem um modelo que contribui para o entendimento da liberação de IL-6 e TNF-α em resposta a várias concentrações de ox-LDL usando o método otimizado para a formação de células espumosas. Portanto, o entendimento das relações fenotípicas de macrófagos e mecanismos inflamatórios é importante para o desenvolvimento de pesquisas sobre o combate/atenuação da condição de aterosclerose.

 Agradecimentos

Este estudo foi financiado por verbas da FAPESP (Programa CEPID-CEPOF), bem como do CNPQ (Programa INCT), pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código Financeiro 001, e pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2018/10588-9).

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Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado pela FAPESP (CEPID-CEPOF) e CNPq(INCT) e parcialmente financiado pela FAPESP.

 Original Article Profile of IL-6 and TNF in Foam Cell Formation: An Improved Method Using Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Probe 0000-0002-2675-8069 Castro Cynthia Aparecida 1 2 Buzinari Tereza Cristina 3 Lino Rafael Luis Bressani 3 Araújo Heloisa Sobreiro Selistre de 3 Aníbal Fernanda de Freitas 2 Verzola Roberto Mario Machado 3 Bagnato Vanderlei Salvador 1 Inada Natalia Mayumi 1 Rodrigues Gerson Jhonatan 3 Brasil Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, SP – Brasil Brasil Departamento de Morfologia e Patologia – Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP – Brasil Brasil Departamento de Ciências Fisiológicas – Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP – Brasil Mailing Address: Cynthia Aparecida de Castro • Universidade Federal de São Carlos – Rod. Washington Luís, km 235 – SP-310. Postal code 13565-905, São Carlos, SP – Brazil E-mail: cynthiaefi2004@yahoo.com.br

Author Contributions

Conception and design of the research: Castro CA, Bagnato VS, Inada NM, Aníbal FF, Rodrigues GJ; Acquisition of data: Castro CA, Buzinari TC, Lino RLB, Selistre-de-Araújo HS, Aníbal FF, Rodrigues GJ; Analysis and interpretation of the data: Castro CA, Buzinari TC, Lino RLB, Rodrigues GJ; Statistical analysis: Castro CA, Buzinari TC, Bagnato VS; Obtaining financing: Bagnato VS, Inada NM, Selistre-de-Araújo HS, Rodrigues GJ; Writing of the manuscript: Castro CA, Lino RLB, Bagnato VS, Inada NM, Aníbal FF; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Castro CA, Lino RLB, Bagnato VS, Inada NM, Selistre-de-Araújo HS, Aníbal FF, Rodrigues GJ.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background

The formation of foam cells occurs due to the increase in low-density plasma lipoprotein (LDL) and dysregulation of inflammation, which is important for the development of atherosclerosis.

 Objective

To evaluate the profile of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and Interleukin-6 (IL-6) in the existing foam cell formation method, optimizing this protocol.

 Methods

The LDL was isolated, oxidized, and labeled with a Fluorescein isothiocyanate (FITC) probe. Foam cells were generated from THP-1 human monocyte-derived cells and incubated in the absence (control) or presence of FITC-ox-LDL (10, 50, 100, 150, or 200 μg/mL), for 12, 24, 48, or 72 hours. The accumulated FITC-ox-LDL in the cell was quantified by microscopy. The enzyme-linked immunosorbent assay was evaluated to quantify the IL-6 and TNF-α, with p < 0.05 considered significant.

 Results

All the FITC-ox-LDL concentrations tested showed a higher fluorescence when compared to the control, showing a greater accumulation of lipoprotein in cells. The higher the concentration of FITC-ox-LDL, the greater the production of TNF-α and IL-6. The production of IL-6 by foam cells was detected up to the value of 150 µg/mL of the maximum stimulus for LDL. Concentrations above 50 μg/mL LDL stimulated greater release of TNF-α compared to control.

 Conclusions

Our model contributes to the understanding of the release of IL-6 and TNF-α in response to different concentrations of ox-LDL, using an optimized method for the formation of foam cells.

 Atherosclerosis Inflammation Foam Cells Lipids Plaque, Atherosclerotic Isotiocianatos, Fluoresceina Introduction

Atherosclerosis is one of the most important causes of morbidity and mortality worldwide, and is detected by the accumulation of lipids in macrophages that in this stage are known as foam cells in the sub-endothelial space of the arterial wall.1 Foam cell formation occurs by the increase of plasma low-density lipoprotein (LDL), which undergoes various physiological processes mediated by oxidation, acetylation, and denaturation. These modifications are physiological stimuli that favor the Internalization of lipid particles by macrophages generating the foam cell.2 Alternative cell types present in the neointima, such as smooth muscle and endothelial cells, can also internalize lipid droplets and transdifferentiate to a state similar to foam cells from macrophages, contributing to the formation of atherosclerotic plaque.3 , 4

Macrophages can contribute to the development of atherosclerosis, displaying high heterogeneity5 due to its resulting phenotype. This phenotype can be classified as M1 and M2. M1 macrophages are characterized as pro-inflammatory and have a high expression of pro-inflammatory proteins that contribute to the formation of atherosclerotic plaque. M2 macrophages play a preventive role by reducing the size and improving the stability of the plaque, as it has an anti-inflammatory profile.5 , 6

Stimulating the pro-inflammatory profile is important in the process of foam cell formation, given that inflammatory mechanisms can act both as precursors in the lipid-centric formation as well as promote atherogenesis via cholesterol absorption and a decrease in cholesterol efflux.2 Although hyperlipidemia stimulates atherogenesis by providing more lipids for foam cell formation, some induced inflammatory mediators increase lipid oxidation, such as tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and Interleukin-6 (IL-6).7 IL-6 is a pleiotropic cytokine that exhibits pro and anti-inflammatory properties, depending on the type of target cell. An increase in IL-6 in atherosclerosis results in effects on multiple cells involved in lipid processing and plaque formation, such as the activation of endothelial cells, smooth muscle cell proliferation, and accumulation of macrophage lipids.8 There is now strong evidence for the role of macrophage-derived TNF-α in the development of atherosclerosis and increased vascular inflammation.9 Therefore, investigating the physiopathology of foam cell formation is useful in developing new therapeutic interventions for atherosclerosis.10

The most commonly used techniques for studying foam cell formation are ox-LDL-labeled quantification inside the macrophages or using non-specific stains such as oil. The present study aimed to evaluate the profile of TNF-α and IL-6 in the existing foam cell formation method, thereby optimizing this protocol. The presence of these inflammatory mediators act as markers of the formation of pro-inflammatory foam cells, the beginning of the formation of atherosclerotic plaque.

 Materials and methods Chemicals and reagents

This study used RPMI 1640, Fetal Bovine Serum (FBS) (Vitrocell Embriolife, Campinas, SP, BR), PMSF (phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride), Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), Fluorescein Isothiocyanate (FITC), 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI), benzamidine, gentamicin chloramphenicol, aprotinin, Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT), which were purchased from Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, Amplex Red Cholesterol Assay Kit (Catalog no. A12216, Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, OR); IL-6 and TNF-α R&D Systems, 614 McKinley Pl NE, Minneapolis, MN, USA.

 LDL isolation

The present study was approved by the Human Research Ethics Committee at the Universidade Federal de São Carlos - UFSCar (#2.243.706) and the participants provided their written consent. Blood was collected from 10 normolipidemic volunteers (men and women, aged 18 to 45 years), and plasma was obtained after centrifugation at 1,000 g for 15 min in the presence of K2EDTA 0.1mL for each 5 mL of blood. Next, benzamidine (2 mM), gentamicin (0.5%), chloramphenicol (0.25%), PMSF (phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride) (0.5 mM), and aprotinin (5µl/mL) (all acquired from Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) were added to the plasma pool, as described in previous report.11 The plasma density was raised to 1.021 g/mL by KBr (the plasma volume is multiplied by factor 0.3265, and the amount is then obtained in grams of solid KBr). After, 2.5 mL of plasma was added to the polypropylene tube (4 mL), and the tube was completed with a KBr solution of d = 1.006. The LDL was isolated by ultracentrifugation (337 g for 4h at 4°C) in a SW60TI fixed-angle rotor (Beckman Coulter, Beckman). The yellow-orange LDL fraction remained in the infranatant. The LDL fraction was collected by suction, using a 1 mL syringe. The collected LDL was dialyzed in the dark at 4ºC in 2 L of PBS, pH 7.4, with four PBS exchanges for 24 hours. After dialysis, LDL was filtered (0.22 μm) and stored at 4°C. The protein concentration was determined by using the Folin phenol reagent method.12

 Oxidative modification of LDL

Oxidized LDL (ox-LDL) was obtained by incubating LDL with CuSO4 (5μmol/mL per mg of LDL protein/ 4 h/ 37°C). Oxidation was stopped by adding 20 µmol/mL EDTA. The degree of oxidation was determined by measuring the ferrous oxidation-xylenol orange.13 After oxidation, the ox-LDL was dialyzed in the dark for 24 h at 4°C and washed 4 times with 2 L of PBS and EDTA (0.3 mM).

 Fluorescent labeling of LDL

The oxidized LDL was labeled with Fluorescein isothiocyanate (FITC). All procedures were performed in the dark. LDL (1 mg/mL) and FITC (50 μg ̸mL) were mixed and incubated at 37°C for 3h. Unbound FITC was removed by dialysis against PBS for 48h at 4°C with eight changes of PBS and filtered through a 0.22 μm filter.14 FITC-ox-LDL was then stored at 4°C and used for up to two months.

 Cell culture

The THP-1 human monocyte-derived cell line was purchased from the Rio de Janeiro Cell Bank, Rio de Janeiro, Brazil, and was grown at 37°C in a 5% CO2atmosphere to a density of 106cells/mL. The growth medium for the THP-1 cells was RPMI Medium 1640 supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco BRL), 50 mg/L Gentamicin Sulfate, and 2 mg/L Amphotericin B. The THP-1 cells were used in the experiments for induction in macrophages, using the 100 nM phorbol myristate acetate (PMA, Sigma)15 and interferon (IFN)-γ (500 U/mL) to induce the M1 phenotype.16 PMA induces THP-1 cell differentiation through direct interaction with PKCδ, which binds to Thrombomodulin and activates ERK1/2, which in turn increases cell the cycle inhibitor p21Cip1expression via NF-kB p65 signaling. In addition, ERK1/2 participates in the phosphorylation of paxillin, cofilin, LIMK1, and PYK2, which mediate cytoskeletal remodeling to promote differentiation.17 Interferon γ (IFN-γ), through the activator of transcription 1 (STAT1), favors the polarization of M1 macrophages, which produce pro-inflammatory mediators, including TNF-α, IL-6, and IL-1.18 After this induction, the THP-1 macrophage cells were incubated without FITC-ox-LDL or with 10, 50, 100, 150, or 200 μg/mL, for different times (12, 24, 48 or 72 hours), depending on the experimental purpose.

 Cellular uptake of cholesterol

To induce THP-1 monocyte differentiation in macrophages, THP-1 monocytes (104cells/mL) in 96-well plates were treated with 100 nM PMA for 48 hours at 37°C. To identify the best ox-LDL concentration to induce foam cell formation, a concentration-response curve was performed: for 24 hours at 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL, and 200 μg/mL FITC-ox-LDL + IFN-γ (500 U/mL). For the temporal analysis, differentiated cells were incubated in the absence or presence of FITC-ox-LDL (100 μg/mL) + interferon γ (500 U/mL) for 12h, 24h, 48h, and 72h. The cell nucleus was labeled with 1 μg/mL DAPI fluorescent probe (Sigma) for 10 minutes and washed 3 times with PBS. To analyze the fluorescence image, an automated fluorescence microscope system, ImageXpress Micro (Molecular Devices), with 495nm excitation, 525 nm FITC-ox-LDL emission, 340 nm excitation, and 488 nm emission for DAPI was used.

 Cholesterol/cholesteryl ester quantitation in cell lysate

Foam cell cholesteryl ester content was quantified by the Amplex Red Cholesterol Assay Kit (Catalog no. A12216, Molecular Probes, Eugene, OR), according to the manufacturer’s protocol. For this analysis, the THP-1 cells (2x106cells/well) were cultured in 6-well plates; differentiated into macrophages, as described above; and incubated with or without ox-LDL. Foam cells were fixed in 2% paraformaldehyde for 15 min, washed once with PBS, and incubated with a 200 μl/well of absolute ethanol for 30 min at 4°C to extract cellular lipids. Cholesterol content was determined by incubating 50 µl of ethanol-extracted lipids diluted in 1x reaction buffer (0.1 M K2HPO4, pH 7.4, 0.05 M NaCl, 5 mM Cholic acid, 0.1% Triton X-100) or undiluted solution with 50 µl of assay solution (total cholesterol) or 50 µl of assay solution lacking cholesterol esterase (free cholesterol), for 30 min at 37°C in the dark and then by measuring the fluorescence (HTS-7000 microplate fluorometer; 530-nm excitation, 590-nm). The value was relativized for the total cellular protein levels. To quantify the total cellular protein levels, the lipid-extracted foam cells were incubated with 0.1% (weight/volume ratio [w/v]) SDS/0.2 M NaOH for 30 min at room temperature to extract the cellular protein. Total cellular protein levels were determined by using the Folin phenol reagent method.12 Total cholesterol and cholesteryl ester levels were represented as nanograms of total cholesterol or cholesteryl ester per microgram of protein.

 Cytokine measurements

Quantification of inflammatory cytokines in foam cell lysate was performed using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). IL-6 and TNF-α concentration in the supernatants of macrophages were measured using DuoSet kits (R&D Systems, 614 McKinley Pl NE, Minneapolis, MN, USA). Macrophages that incubated in absence of ox-LDL were defined as the control group (M).

 Cell viability

Cell viability was determined by MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) (Mosmann, 1983). THP-1 monocytes (104cells/mL) were seeded in 96-well plates and treated with 100 nM PMA for macrophage differentiation, for 48 hours, maintained at 37°C in a humidified incubator containing 5% CO2. After 48 hours, cells were exposed for 24 hours to 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL, and 200 μg/mL of FITC-ox-LDL + interferon γ (500 U/mL). The analysis of cell viability over time was also performed, where the cells were incubated in the absence (Control group - M) or presence of FITC-ox-LDL (FC) (100 μg/mL) + interferon γ (500 U/mL) for 12h, 24h, 48h, and 72h. Later, 5 mg/mL of MTT was added, followed by 4 hours of incubation at 5% CO2,37°C. After this time, 100 μL of dimethylsulfoxide (DMSO) was added, and the plate remained on the plate shaker for 10 minutes. The absorbance was measured at 540 nm, using a microplate reader SpectraMax GeminiXS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

 Statistical analysis

The entire study was carried out at least in triplicate, in three independent experiments, according to recommendations for Good Cell Culture Practice (GCCP).19 , 20 Data normality was verified by the Kolmogorov-Smirnov test; equality of variance (Levene’s test). All values were presented as mean ± standard deviation (SD). To determine the difference between conditions, ANOVA was applied with the Bonferroni post hoc test for multiple comparisons. To determine the difference between two conditions, the unpaired Student’s t-test was used (SigmaStat version 3.5; Systat). The significance level adopted in the statistical analysis was 5%.

 Results

There was a greater accumulation of ox-LDL labeled with a FITC probe (indicated by the presence of green fluorescence), not only in the perinuclear area, but also distributed throughout the cytosol of most cells, as shown in Figure 1B . As expected, no accumulation of LDL was found in the untreated cells ( Figure 1A ), which exhibited only blue fluorescence, which labels the cell nucleus.

Representative images of FITC-ox-LDL uptake in THP-1 macrophages. THP-1 were incubated in the absence (Ctrl group - A or presence B) of indicated concentrations of FITC-ox-LDL for 24h. Cells were then washed, fixed, and examined, using a 546 nm filter set. FITC-ox-LDL uptake was shown in green and the cells´ nucleus was labeled using DAPI (blue).

In Figure 2B, the microscopic fluorescence images show that FITC-ox-LDL was absorbed in all concentrations, showing higher fluorescence when compared to the control, using 24h of incubation. Above 50 μg/mL, the fluorescence was higher when compared to 10 μg/mL, but no difference was observed between them ( Figure 2A ).

Measurement of FITC-ox-LDL concentration in THP-1 cells. A) Concentration-dependent fluorescent cholesterol uptake by THP-1 macrophages in arbitrary unit (AU). B) Representative images of FITC-ox-LDL uptake in THP-1 macrophages. THP-1 were incubated in the absence (Control group: 0) or presence of indicated concentrations of FITC-ox-LDL (10 – 200 μg/mL) for 24 h. FITC-ox-LDL uptake was shown in green, and cell nucleus was labeled using DAPI (blue). Cells were viewed under fluorescence microscope (20× objectives). Values are expressed as mean ± SD. * P < 0.05, compared to cells incubated with 10 μg/mL; ** P < 0.01, compared to cells incubated in absence of FITC-ox-LDL.

The THP-1 macrophages were incubated with 100 μg / mL of FITC-ox-LDL for 0, 12, 24, 48, and 72 h ( Figure 3 ). It was observed that within 12, 24, 48, and 72h the fluorescence intensity of the cells treated with FITC-ox-LDL increased significantly from the background level (Control group 0), but only after 72h was the fluorescence greater than other times ( Figure 3A and 3B ).

Measurement of time-dependent increased uptake of cholesterol by THP-1 macrophages. A) Time-dependent fluorescent cholesterol uptake by THP-1 macrophages in arbitrary unit (AU). B) Representative images of FITC-ox-LDL uptake in THP-1 macrophages. THP-1 were incubated which 100 ug/mL of FITC-ox-LDL for 0h, 12h, 24h, 48h, and 72h. FITC-ox-LDL uptake was shown in green, and cell nucleus was labeled by DAPI (blue). Cells were viewed under fluorescence microscope (20× objectives). M, macrophage; FC, foam cells. Values are expressed as mean ± SD. * P < 0.05, compared to cells incubated in absence of FITC-ox-LDL; γ P < 0.001, compared to cells incubated with the other FITC-ox-LDL concentrations.

Figure 4 showed the relative cholesterol, other techniques to confirm the presence of cholesterol in cells, and the survival of the cells in this condition. Quantitatively, when the cell was incubated for 24h in different concentrations, only with 150 and 200 µg/mL of ox-LDL, a greater cholesterol concentration was found when compared to the control that was not incubated with ox-LDL ( Figure 4A ). This condition did not cause a major change in cell survival ( Figure 4C ). In Figure 4B , incubations of 100 µg/mL at different times of exposure of ox-LDL showed no difference between times, but all times showed a greater concentration of cholesterol the compared to time 0 ( Figure 4B ). Macrophages reduced their viability over time (24, 48, and 72h) as compared to the time of 12h; however, foam cells showed a reduction in viability only at times of 24 and 48h. By contrast, in 72h, these cells had a greater viability when compared to macrophages in 72h, which was similar to that found for the group of foam cells at 12h ( Figure 4D ).

Lipid uptake in THP-1 macrophage and cell viability. A) Concentration-dependent increased uptake of cholesterol by THP-1 macrophages (Relative cholesterol - the value was relativized for the total cellular protein levels); B) Time-dependent increased uptake of cholesterol by THP-1 macrophages (Relative cholesterol - the value was relativized for the total cellular protein levels). C) Survival rate in different concentrations of FITC-ox-LDL. D) Survival rate in different exposure time of FITC-ox-LDL. M, macrophage absence of FITC-ox-LDL; FC, foam cells. Values are expressed as mean ± SD. P < 0.05: * M vs FC per Time; ** compared to cells incubated in absence of FITC-ox-LDL (time 0); γ compared to 12h M; β compared to 12h FC.

In the production of inflammatory cytokines, the time curve shows that both IL-6 and TNF-α were higher in foam cells when compared to macrophages at each time of exposure to ox-LDL ( Figure 5A, 5B ), but only IL-6 was higher in times 48h and 72h when compared to 12h and 24h ( Figure 5A ). Considering the ox-LDL concentration curve, IL-6 production was higher in all tested concentrations when compared to cells without exposure to ox-LDL (control group 0) ( Figure 5C ). In addition, when exposed to 50, 100, and 150 µg/mL, the production of IL-6 was greater when compared to the concentration of 10 µg/mL. The concentration of 200 µg/mL also decreased the release of IL-6, matching the values of concentration of 10 µg/mL. The release of TNF-α was only more expressive at concentrations of 50 to 200 µg / mL ( Figure 5D ).

Time and concentration effect of ox-LDL in the proinflammatory cytokines of THP-1 cell: A) Interleukin 6 at different times with 100 μg/mL ox-LDL; B) Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α) at different times with 100 μg/mL ox-LDL. C) Interleukin 6 in different concentrations of ox-LDL, treated for 24 hours. D) Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α) in different concentrations of ox-LDL, treated for 24 hours. Values are expressed as mean ± SD. M, macrophage absence of FITC-ox-LDL; FC, foam cells. * P < 0.001, M vs FC per Time (Test T Student); P < 0.05: ** compared to cells incubated in absence of FITC-ox-LDL (time 0); γ compared to cells incubated with 10 μg/mL. + P < 0.01, compared to 12h and 24h.

Discussion

Our experiments document an optimization of the existing method of oxidized LDL-induced foam cell formation for in vitro foam cell formation, from THP-1 macrophages and incubation with FITC-ox-LDL, in addition to the verification of the response of such cytokines as IL6 and TNF-α. With 12h of incubation, foam cell formation takes place with the M1 pro-inflammatory phenotype, that is, with an increase in the concentrations of Il-6 and TNF-α. The characterization of the inflammatory profile of macrophages is important, considering that classically activated pro-inflammatory M1 macrophages stimulate atherogenesis, while M2 macrophages stabilize the atherosclerotic plaque.6

Other studies have used the foam cell formation technique, adopting such protocols as Oil Red O staining or labeled LDL with their own probes, together with oxidized LDL complexed with DiL dye (DiL-Ox-LDL). A study conducted by Xu et al.,21 showed that incubation with DiL-ox-LDL (10 µg/mL) for 4h resulted in a significant increase in ox-LDL uptake in macrophages; however, they did not evaluate the inflammation of these macrophages.21 Although the foam cell induction protocol using the DiL-ox-LDL probe is more efficient when compared to other techniques, it also has a low yield, that is, a large amount of material is needed to perform it, making it rather costly. In addition to this technique, this work points out that foam cell formation using Oil Red staining and LDL-ox incubation (50 μg/mL) for 24h is not an accurate protocol, since in this protocol neutral lipids (mainly triglycerides) are stained with an orange-red dye,22 which may cause a low specificity in the technique, as in foam cells there is more cholesterol ester and no neutral lipids. Therefore, the present study sought to optimize the methods using oxidized LDL labeled with an FITC fluorescent probe (FITC-ox-LDL), introducing a simple and practical staining method for foam cell formation from macrophages. Using ox-LDL labeling with FITC and the quantification of inflammation in cell formation, a method with the quality of low-cost fluorescent probes was obtained, producing high quality photos.

For foam cell formation, human LDL was isolated by ultracentrifugation, oxidized, and labeled with fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC). The use of FITC as a fluorescent probe is widely used because the isothiocyanate group reacts with terminal and primary amino groups in proteins, making it a viable and highly accessible technique.11 , 14 Adherent THP-1 cells accumulate numerous lipid droplets (stained with green) upon exposure to a 100 μg/mL concentration of oxidized LDL for 24 hours, as shown in the literature.23 , 24 In addition, the macrophage-differentiated THP-1 assumed the morphological appearance of foam cells with fluorescent lipid droplets present along the cytosol and near to the nucleus of most cells. THP-1 monocytes have been extensively used as an in vitro model of macrophages, but little care has been given to optimizing foam cell formation from macrophages without checking for inflammation.

The concentration of 100 μg/mL is most commonly used in the literature;23 , 24 however, the present study’s data show that macrophages derived from THP-1 monocytes are well differentiated in foam cells with 50 μg/mL FITC-ox-LDL for only 12h. Under these conditions, there is an accumulation of cholesterol in the cell with an increased production of pro-inflammatory cytokine drugs, such as IL-6 and TNF-α, without altering the viability of this cell. The pro-inflammatory phenotype is of great importance in foam cell formation, as the components present in ox-LDL can induce diverse biological effects in vitro and in vivo , such as monocyte differentiation, activation of endothelial cells, and activation of the immune system. Moreover, there is evidence that its action is due to the activation of TLR4.25 Therefore, the oxidative process seems to be directly involved in the stimulation of these substances.

In addition to the concentration of LDL in the macrophage cytoplasm, it is important to monitor the production of inflammatory cytokines, as macrophages can contribute to atherogenesis, mainly after its interaction with ox-LDL in the intima layer of the artery, producing cytokines and inflammatory mediators.7 The increasing expression of inflammatory markers can be caused by the activation of macrophages during the atherosclerotic process, leading to an increase in the uptake of ox-LDL.2 The results shown in this work demonstrated that IL-6 and TNF-α production increased in macrophages when exposed to different exposure times. IL-6 was released in a higher concentration in the foam cells when compared to its controls; in addition, the longer the exposure time to the ox-LDL, the greater the release of IL-6, so that 48h and 72h had a greater release when compared to 12h and 24h. Considering TNF-α, all times were greater than their controls, but there was no difference between exposure times. In an environment with high inflammation, it is of utmost importance to consider the viability of these cells, so that under these experimental conditions, the 72-hour exposure to FITC-ox-LDL reduced cell viability when compared to 12 hours of exposure. Together, these data may suggest that the production of IL-6 and TNF-α could contribute to the upregulation of macrophage phagocytosis, especially if in this microenvironment the macrophages (M1) are in greater quantities, thus promoting an inflammatory process, inducing chronicity, and promoting deleterious effects on tissues.

The foam cells in the atherosclerotic plaque produce proinflammatory cytokines that may contribute to local inflammation. Their inflammatory nature has been supported by in vitro studies that show human monocyte-derived M2 macrophages, which normally have an anti-inflammatory phenotype, consume high levels of ox-LDL, and produce proinflammatory factors (IL-6, IL-8, MCP-1), followed by the formation of foam cell, thus taking on a more M1-like proinflammatory phenotype.2 Macrophages, in vivo , are a dynamic cell population with both phenotypic and functional traits that differ significantly one with another, depending on their maturation environment and the nature of the added stimuli.7 For example, THP-1 cells can be directed to an M1 phenotype using the IFN-γ,16 as we used in our protocol and which was confirmed by the high release of inflammatory cytokines. Other studies use a very prolonged LDL exposure protocol lasting 48h or more,26 , 27 which we show has no viability, given that, with 12h of incubation, the foam cell formation is already obtained, ensuring a high degree of inflammation. In addition, at 48h, the cell viability was reduced by approximately 50%, hindering possible interventions.

Thus, the lack of a uniform protocol that presents inflammatory components greatly affects the interpretation of results and the ability to compare studies. This is because the experimental design does not represent possible phenotypic and/or functional differences in the macrophage populations that are attributable to the use of different maturation protocols, exposure time, and LDL concentration, without evaluating the inflammatory profile.

 Conclusion

The present study’s results suggest a model that contributes to the understanding of the release of IL-6 and TNF-α in response to different concentrations of ox-LDL using an optimized method for the formation of foam cells. Therefore, the understanding of the phenotypic relationships of macrophages and inflammatory mechanisms is important for the development of research to fight/attenuate the condition of atherosclerosis.

 Acknowledgments

This work was supported by funding from FAPESP (Program CEPID-CEPOF), as well as from CNPq (Program INCT), the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazil (CAPES) – (Finance Code 001), and the São Paulo Research Foundation (FAPESP 2018/10588-9).

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Sources of Funding: This study was funded by FAPESP (CEPID-CEPOF) and CNPq (INCT) and partially funded by FAPESP.