As arritmias são consideradas um problema sério de saúde pública e são uma importante causa de morbidade e mortalidade no mundo.¹ Entre as principais, batimentos ventriculares prematuros (BVP), taquicardia ventricular sustentada, e fibrilação ventricular são comuns em pacientes com miocardiopatia isquêmica ou não isquêmica.¹ No entanto, os tratamentos com drogas antiarrítmicas geralmente causam respostas pró-arrítmicas adversas ou ausência de melhora na qualidade de vida de indivíduos com arritmias.²

Desde 1970, quando Vaughan-Williams classificou as drogas antiarrítmicas com base em seus mecanismos farmacológicos para bloquear canais iônicos ou receptores específicos, pesquisadores investiram muito tempo e esforço para descobrir novas terapias com um risco mais baixo de efeitos adversos para o paciente.^3–5

Entre as novas terapias, compostos de origem natural têm demonstrado sua capacidade de inibir arritmias cardíacas ventriculares, gerando interesse na comunidade científica. Os terpenos mostraram-se como os principais compostos com atividade antiarrítmica comprovada.^6–9 Entre eles, a carvona (p-mentha-6,8-dien-2-one) é de particular interesse, dadas suas propriedades já estabelecidas. A carvona é uma cetona pertencente ao grupo dos monoterpenos, e conhecida por sua atividade antioxidante, antimicrobiana, e antifúngica.^10,11 Parece atuar também sobre canais de sódio dependentes de voltagem nos neurônios, levando a um efeito anticonvulsionante.^12,13 Ainda, a carvona demonstrou um efeito antiespasmódico pela inibição dos canais de cálcio dependentes de voltagem, e uma ação anticâncer sinergística com a doxorrubicina sobre células MCF7, reduzindo sua cardiotoxicidade.¹⁴ Como já foi decrito na literatura, a carvona bloqueia canais de sódio e cálcio, e medicamentos dessa classe têm propriedades antiarrítmicas e cardioprotetoras. Assim, decidimos estudar os efeitos da carvona sobre a regulação do cálcio na célula e sua possível ação antiarrítmica nos corações de ratos.⁹

Embora existam vários estudos sobre a (-)-carvona na literatura científica, em nosso conhecimento, não existem explicações ou hipóteses sobre o mecanismo de ação desse monoterpeno no músculo cardíaco. Portanto, nosso objetivo foi avaliar os possíveis efeitos cardíacos da (-)-carvona, e apresentar uma melhor explicação científica de suas ações no tecido cardíaco que possa servir como base para o desenvolvimento de novos medicamentos de origem natural para o tratamento de arritmias.

A (-)-carvona (0,003 a 4 mM) reduziu a força atrial de maneira concentração-dependente. A Figura 1A mostra traçados de curvas da concentração atrial isolada em situação controle, com (-) carvona 0,3, 2 e 4 mM, e no washout. Como pode ser visto, 4mM de (-)-carvona reduziram a contratilidade do miocárdio em aproximadamente 96%, e a reversibilidade após o washout foi de aproximadamente 65%. A Figura 1B mostra uma curva de concentração-resposta do efeito inotrópico negativo da (-)-carvona que apresentou um EC₅₀ de 0,44 ± 0,11 mM (n = 5). A nifedipina, usada como controle positivo, apresentou valores de EC₅₀ de 0,0034 ± 0,0011 mM (n = 5). O DMSO a 0,5%, usado como diluente, não apresentou efeito sobre a força atrial (dados não apresentados).

Uma vez que a (-)-carvona provocou um efeito inotrópico negativo, decidimos investigar se o canal de cálcio está envolvido em seu mecanismo de ação. Os resultados revelaram que a (-)carvona (1mM) deslocou a curva de concentração-resposta para a direita, aumentando o EC50 do CaCl₂ de 1,46 ± 0,14 mM (controle) para 3,17 ± 0,22 mM (CaCl2 + carvona) (Figura 1C, n = 5, p < 0,05). Um dado interessante foi a inibição do inotropismo induzido pelo (±)-BAY K8644, um agonista do canal de cálcio do tipo L (Figura 1 D).

Nos corações isolados, 0,5mM de (-)-carvona também induziu uma redução na PVE, como pode ser observado nos traçados da Figura 2A (n=5). Uma redução de 73% na PVE foi observada após 15 minutos de perfusão do coração com 0,5mM de (-)-carvona (Figura 2B). A (-)-carvona não alterou o tempo para o pico (Figura 2C), mas reduziu significativamente o tempo de relaxamento (24%) após 15 minutos de perfusão com (-)-carvona (Figura 2D).

A Figura 3A apresenta traçados ecocardiográficos representativos da situação controle após 15 minutos de perfusão com 0,5mM de (-)-carvona e washout. Como pode ser observado, a (-)-carvona diminuiu a frequência cardíaca (n=5, Figura 3B) e aumentou tanto o PRi como o QTi (n=5, Figura 3C e D), sem mudar a duração do complexo QRS (Figura 3E).

A Figura 4A apresenta registros da contratilidade celular na situação controle (painel superior) e após perfusão com 0,5mM de (-)-carvona (painel inferior), mostrando a redução na fração de encurtamento nos cardiomiócitos. As médias dos resultados mostraram redução da fração de encurtamento após incubação com (-)-carvona (n=5, Figura 4B). Ainda, a (-)-carvona reduziu tanto o tempo para o pico como o tempo de relaxamento em 50% (Figuras 4C e D).

Considerando o papel principal dos canais de Ca⁺² do tipo L no controle da contração cardíaca, usamos o teste de grampeamento de voltagem (técnica de patch-clamp) para testar se a (-)-carvona afetaria a I_Ca,L nos cardiomiócitos dos ventrículos. A Figura 5A mostra registros de I_Ca,L das fases de despolarização (300ms) de -40 a 0mV na situação controle e com 0,5mM de (-)-carvona. A Figura 5B ilustra a progressão da I_Ca,L ao longo do tempo, mostrando redução da I_Ca,L após incubação com (-)-carvona. A média de redução do pico de I_Ca,L induzida pela (-)-carvona foi de 79% (n=4, 10 células, Figura 5C). O efeito de 0,3mM de (-)-carvona sobre a I_Ca,L também foi avaliado, e se observou uma redução de 43% na I_Ca,L (dados não apresentados). Concluímos que a (-)-carvona inibe os canais de Ca⁺² do tipo L, e que esse efeito pode contribuir para seu efeito inotrópico negativo evidenciado nos tecidos dos átrios e ventrículos.

Com base nesses resultados, buscamos avaliar o transiente de cálcio intracelular em cardiomiócitos ventriculares imersos com FUO4-AM. A Figura 5D (esquerda) mostra as imagens obtidas usando microscopia confocal do transiente de cálcio intracelular no controle e após pré-incubação com 0,5mM de (-)-carvona. Observou-se que a fluorescência do cálcio, mostrada em verde, foi reduzida com (-)-carvona. A Figura 5D (à direita) mostra traçados representativos do transiente de cálcio intracelular no controle e com (-)-carvona. A Figura 5E apresenta a fluorescência do cálcio como razão F/F₀, a qual foi reduzida após incubação com (-)-carvona (n=5). O pré-tratamento dos cardiomiócitos com (-)-carvona acelerou o tempo de decaimento em 50% (Figura 5G), enquanto que o tempo para pico do transiente de Ca⁺² (Figura 5F) não foi alterado.

Uma vez que os bloqueadores de canais de cálcio apresentam efeitos antiarrítmicos, decidimos investigar se a (-)carvona apresentaria essa propriedade. O efeito antiarrítmico da (-)-carvona foi avaliado em um modelo de arritmia induzido pela sobrecarga de cálcio. Três tipos de arritmias foram observados nos corações perfundidos com alta concentração de cálcio: BVP, TC e FV (Figura 6A). Como observado na Figura 6B, a (-)-carvona reduziu significativamente o escore de arritmia (n=5). Além disso, nossos resultados mostraram que nos corações submetidos à cálcio elevado e perfusão simultânea com (-)-carvona, a gravidade das arritmias foi menor, uma vez que a ocorrência de FV diminuiu de 34% (cálcio elevado) para 8%. Ainda, os corações perfundidos com (-)-carvona apresentaram principalmente BVP, considerada uma arritmia de menor gravidade.

Nossos resultados mostraram a capacidade do monoterpeno (-)-carvona em reduzir a força atrial de corações de ratos de maneira concentração-dependente, o que foi parcialmente reversível após a lavagem. A (-)-carvona mostrou baixa potência em comparação à nifedipina, um clássico bloqueador de canal de C⁺² tipo L. Sabe-se que a força contrátil é dependente da concentração de Ca⁺² citoplasmático livre, e que a entrada de Ca⁺² através de canais de Ca⁺² do tipo L é essencial para estimular a liberação de cálcio induzida pelo cálcio do retículo sarcoplasmático (RS). Esse mecanismo é muito importante por regular a força do miocárdio.

Assim, decidimos investigar se havia uma correlação entre a redução da força atrial e uma diminuição na entrada de Ca⁺² no mecanismo de ação da (-)-carvona. Nossos resultados mostraram que a (-)-carvona reduziu a entrada de Ca⁺² ao prejudicar a resposta inotrópica positiva tanto para Ca⁺² como para Bay K 8644, um agonista dos canais de Ca⁺² do tipo L. O bloqueio do canal de Ca⁺² promovido pela (-)-carvona foi provavelmente o responsável pela diminuição da força atrial observada em nossos experimentos. Em músculos lisos, a carvona apresenta efeito antiespasmódico; ela reduziu a contração induzida por alta concentração de K⁺ e foi quase 100 vezes mais potente que o verapamil, um bloqueador de canal de cálcio.^13,20

A capacidade dos terpenos em bloquear o canal de Ca⁺² foi observada tanto no músculo liso como no músculo cardíaco.²¹ Os monoterpenos podem modular a função dos canais iônicos dependentes de voltagem e dependentes de ligantes.^22,23 Assim, esses compostos são úteis em prevenir doenças cardiovasculares, tais como arritmia e hipertensão. Em relação ao sistema cardiovascular, monoterpenos tais como rotundifolona,²⁴ terpineol,²⁵ timol,²³ e carvacrol²³ atuam como bloqueadores de canal de cálcio. Também foi demonstrado que em cardiomiócito isolado, R(+)-pulegona,¹⁶ geraniol,⁶ nerol,⁷ farnesol⁹ e (-)-mentol²⁶ bloquearam o canal de Ca⁺² do tipo L.

O bloqueio dos canais de Ca⁺² pode induzir alterações eletrofisiológicas importantes, como uma diminuição da condução elétrica no coração e da frequência cardíaca. Assim, nós investigamos se a (-)-carvona poderia induzir alterações fisiológicas no coração. Realizamos experimentos com corações isolados para registrar simultaneamente a PVD e perfis eletrocardiográficos. A (-)-carvona promoveu uma diminuição na PVD, o que corrobora nossos resultados obtidos no átrio esquerdo isolado, discutido anteriormente, bem como uma redução na frequência cardíaca. Como se sabe, a frequência cardíaca é usualmente controlada pelo marcapasso primário do coração, o nó sinusal. As células do nó sinusal têm a propriedade de automaticidade como resultado de despolarização gradual durante a diástole elétrica (despolarização diastólica lenta). Uma lenta despolarização diastólica e a fase da despolarização do potencial de ação do marcapasso são processos fundamentais para a formação de impulso elétrico do nó sinusal. Esses fenômenos estão ligados à entrada de Ca⁺² pelo sarcolema; uma redução no influxo pode induzir a dissociação eletromecânica do miocárdio e bradicardia.²⁷ A corrente iônica provavelmente afetada, e responsável pela diminuição da frequência cardíaca, é a I_Ca,L. O efeito da (-)-carvona sobre o influxo de cálcio promoveu uma redução na frequência cardíaca e um aumento na duração do intervalo PRi, indicativo de bloqueio atrioventricular de primeiro grau. Nesse bloqueio, há um atraso na transmissão de impulso elétrico dos átrios para os ventrículos, aumentando o período refratário do miocárdio. Outras substâncias que promovem esse bloqueio são betabloqueadores, glicosídeos cardíacos, e drogas que aumentam a atividade colinérgica.²⁸

Também foi observado que a (-)-carvona aumentou o intervalo QTc, que reflete o período necessário para a despolarização e a repolarização ventricular ocorrer, i.e., um parâmetro indireto para estimar a duração do potencial de ação ventricular. O prolongamento do QTc pode ocorrer devido ao bloqueio dos canais de potássio.^6,9 Agentes antiarrítmicos da classe III são bloqueadores de canais de potássio que prolongam a duração do potencial de ação aumentando o período refratário dos tecidos atrial, nodal e ventricular. Um aumento no período refratário das células atriais é de grande importância no tratamento de taquiarritmia atrial.²⁹ A amiodarona, um bloqueador de múltiplos canais, é considerada uma das drogas antiarrítmicas mais efetivas, sendo amplamente prescrita. Contudo, o uso desses medicamentos em longo prazo tem sido associado à ocorrência de torsades de pointes³⁰ e de efeitos adversos.²⁹

Em cardiomiócitos ventriculares isolados, 0,5mM de (-)-carvona reduziu a fração de encurtamento e acelerou o tempo de relaxamento, conforme foi também observado no coração isolado. Sabe-se que a força contrátil do músculo cardíaco depende da concentração de Ca⁺² livre no citoplasma, e a entrada de Ca⁺² através de canais de Ca⁺² do tipo L é essencial para a liberação de cálcio dependente de cálcio do RS. Assim, o teste de grampeamento de voltagem foi realizado para testar se a (-)-carvona afeta a I_Ca,L. Os resultados mostraram que a (-)-carvona reduziu significativamente a I_Ca,L no cardiomiócito ventricular. Uma vez que a (-)-carvona reduz a I_Ca,L, é razoável pensar que esse monoterpeno afetaria profundamente a liberação de Ca⁺² do RS. Nossos resultados mostraram que a (-)-carvona também afetou a amplitude do transiente de Ca⁺² e acelerou o tempo de decaimento de 50%. Sabe-se que o relaxamento do músculo cardíaco é amplamente determinado pela recaptação de Ca⁺² pelo retículo sarco(endo)plasmático Ca²⁺-ATPase (SERCA2a) e por outra proteína de transporte tais como os trocadores de Na+/Ca²⁺ (NCX) e membrana plasmática Ca²⁺ ATPase (PMCA).¹⁷ Assim, a diminuição do Ca⁺² citosólico pode estar associada com a ativação de algumas dessas vias.

A nifedipina (10 µM), um bloqueador de canal de cálcio do tipo L, reduziu a amplitude do Ca⁺² transiente em 79% em miócitos do ventrículo de rato neonatos.²⁴ O bloqueio produzido pela nifedipina (1 µM) foi totalmente reversível após o washout com solução padrão.³¹ Nossos resultados indicam que a (-)-carvona é um bloqueador de canal de Ca⁺², similar à nifedipina, mas o efeito sobre a I_Ca,L foi irreversível na presença de (-)-carvona (500 μM). Segundo Vaughan-Williams (1970), os bloqueadores de canal de cálcio pertencem à classe IV de antiarrítmicos, e são amplamente utilizados na prática clínica.^32,33

Uma vez que a (-)-carvona reduz a entrada de cálcio sarcolemal, nós investigamos sua possível atividade antiarrítmica e observamos uma drástica redução ao longo do tempo em eventos como FV em um modelo ex vivo de sobrecarga de cálcio. De fato, nossos resultados mostraram que a (-)-carvona apresentou um bom efeito antiarrítmico, confirmado por uma redução nos escores de arritmia e redução na ocorrência de fibrilação atrial, considerada um tipo mais grave de arritmia. Sabe-se que as substâncias ativas oriundas de plantas podem apresentar propriedades antiarrítmicas importantes,³⁴ com grande potencial para serem usadas como agentes antiarrítmicos em estudos clínicos e pré-clínicos. Podemos citar, por exemplo, os terpenos geraniol, nerol, D-limoneno e farnesol que inibiram canais de Ca⁺² do tipo L e apresentaram atividade antiarrítmica.^6–9 Embora muitos estudos experimentais mostraram que os terpenos exercem efeitos antiarrítmicos, esses compostos não são ainda usados na clínica. Além do efeito antiarrítmico, a (-)-carvona também mostrou um efeito cardioprotetor contra a cardiotoxicidade induzida por doxorrubicina in vivo e potencializou sua toxicidade anticâncer in vitro.¹⁴ Esses efeitos cardioprotetores fazem a carvona uma molécula promissora na prática clínica.

Podemos concluir que a (-)-carvona diminuiu a corrente de cálcio do tipo L e o transiente de cálcio intracelular no miocárdio, promovendo uma redução na contratilidade atrial e ventricular. Em corações de ratos isolados, a (-)-carvona causou uma diminuição nas taxas cardíacas e aumento em intervalos PR, característica de bloqueadores de canais de cálcio. Ainda, observou-se uma redução significativa da gravidade das arritmias, como fibrilação ventricular em corações submetidos à perfusão com carvona. A (-)-carvona é, portanto, uma substância natural altamente promissora em relação ao desenvolvimento de novas drogas antiarrítmicas.