Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC s4DGcF4J8NPhwXWCWynby3w S0066-782X2022000400778 abc.20210518 10.36660/abc.20210518 Carta Científica Secreção não Clássica: Um Possível Mecanismo para Explicar as Elevações da Troponina Cardíaca na Ausência de Infarto Agudo do Miocárdio 0000-0003-3035-6609 Gonzalez-Rayas Jose Manuel 1 0000-0003-4556-7257 Hernandez-Hernandez Jose Ascencion 1 0000-0002-6200-1397 Lopez-Sanchez Rosa del Carmen 1 0000-0001-7645-9211 Rayas-Gomez Ana Lilia 2 0000-0002-2295-7554 Gonzalez-Yanez Jose Manuel 2 School of Medicine and Health Science Monterrey México Tecnologico de Monterrey, School of Medicine and Health Science, Monterrey – México Hospital San Jose de Queretaro Queretaro México Hospital San Jose de Queretaro, Queretaro – México Correspondência: Jose Manuel Gonzalez-Rayas • Tecnologico de Monterrey, School of Medicine and Health Science, Ignacio Morones Prieto Av. 3000, Sertoma, Monterrey, Nuevo Leon, 64710, México E-mail: contact.jmgr@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Gonzalez-Rayas JM, Rayas-Gomez AL; Obtenção de dados e Análise estatística: Gonzalez-Rayas JM; Análise e interpretação dos dados: Gonzalez-Rayas JM, Hernandez-Hernandez JA, Lopez-Sanchez RC, Rayas-Gomez AL, Gonzalez-Yanez JM; Redação do manuscrito e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Gonzalez-Rayas JM, Hernandez-Hernandez JA, Lopez-Sanchez RC, Rayas-Gomez AL, Gonzalez-Yanez JM.

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo.

 29 04 2022 04 2022 118 4 778 782 15 06 2021 15 09 2021 10 11 2021 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Troponina/uso terapêutico Ensaios Clínicos Controlados/métodos Exossomos Vesiculas Secretórias

“É importante perceber que, se certas áreas da ciência

parecem ser bastante maduras, outras estão em processo de

desenvolvimento e outras ainda estão por nascer.”

Santiago Ramón y Cajal,

Conselho para um jovem investigador

Introdução

Atualmente, os ensaios de troponina cardíaca de alta sensibilidade (hs-cTn) estão disponíveis para uso clínico e fazem parte da definição de infarto agudo do miocárdio (IAM).1 , 2 No entanto, a elevação da troponina não se limita ao IAM, já que outras condições relacionadas ao mismatch da demanda de oxigênio, dano direto ao miocárdio, aumento de strain miocárdico, processos sistêmicos (por ex., sepse), doença neurológica e insuficiência renal também podem resultar em seu aumento.2 A troponina agora também pode ser detectada em cenários atípicos, como em exercícios de resistência extenuante, estimulação atrial rápida e ecocardiografia de estresse com dobutamina, bem como em 50% a 100% dos indivíduos saudáveis.2 , 3

Do ponto de vista fisiológico, a troponina é um complexo proteico que regula a função miofibrilar, formado por três subunidades: I, T e C. No caso da troponina I e da troponina T, existem 3 isoformas tecido-específicas diferentes: troponina esquelética de contração rápida ( fast twitch ), esquelética de contração lenta ( slow twitch ) e cardíaca-específica (fsTn, ssTn e cTn).4 Por outro lado, a TnC tem duas isoformas, uma presente no músculo esquelético de contração rápida (fsTnC) e outra com expressão tanto no músculo esquelético de contração lenta quanto no músculo cardíaco (ssTnC /cTnC).4

Além da necrose celular, vários mecanismos alternativos de liberação têm sido postulados para as isoformas cardíacas da troponina.3 , 4 No entanto, nenhum deles explica de forma concisa porque a troponina é liberada em casos não relacionados ao infarto do miocárdio ou se isso é indicativo de dano reversível ou permanente à célula cardíaca. Considerando a atual falta de conhecimento, nosso principal objetivo foi explorar a viabilidade de um novo mecanismo de liberação de troponina cardíaca utilizando uma abordagem de bioinformática.

 Materiais e métodos Revisão das evidências existentes

Antes de iniciar a análise, foi realizada uma ampla revisão da literatura em busca de artigos relacionados à secreção de troponina. As bases de dados utilizadas foram PubMed, bioRxiv e OpenGrey. Os artigos foram avaliados primeiramente com base em seu título. Se este fazia alusão à troponina e a um processo secretor, o resumo era lido. Os artigos eram selecionados se o resumo se referisse à troponina e a um processo ou via secretora. Artigos puramente clínicos que não investigaram um mecanismo de liberação da troponina foram excluídos. O processo de triagem e revisão foi realizado por todos os autores. As discordâncias foram resolvidas através de consenso durante reuniões regulares.

 Análise de sequência

Para avaliar a secreção não clássica de troponina, foi utilizado o servidor SecretomeP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/).5 Essa ferramenta é aplicada para prever se uma determinada proteína sofre secreção sem sinalização de peptídeo. É um método baseado em sequência que, com a ajuda de redes neurais, detecta características específicas comuns a proteínas extracelulares/secretadas.5

As sequências canônicas das três subunidades de troponina do músculo esquelético de contração rápida, contração lenta e músculo cardíaco foram obtidas do banco de dados UniProtKB (Arquivo Suplementar 1). As proteínas foram primeiramente examinadas com SignalP 5.0 , um método comumente utilizado para o reconhecimento de sinalização de peptídeos com base em redes neurais (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/).6 Esta etapa inicial foi realizada para excluir a via secretora clássica. Em seguida, as sequências foram analisadas com SecretomeP 2.0 . Finalmente, para avaliar a possibilidade de secreção não clássica do tipo IV (utilizada por proteínas transmembranares que se desviam do Complexo de Golgi), as sequências foram avaliadas utilizando o TMHMM 2.0 , um programa projetado para detectar hélices transmembranares (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/).7 Uma representação gráfica do pipeline de bioinformática que foi seguido é mostrada na Figura Suplementar 1.

 Resultados Revisão das evidências existentes

Cerca de 19.900 artigos foram revisados, dos quais 31 foram lidos na íntegra. Após a avaliação do resumo e do texto completo, não foram encontrados artigos relacionados à secreção de troponina. Portanto, que seja de nosso conhecimento, este é o primeiro artigo relatando evidências de secreção não clássica de troponina.

 Análise de sequência

Após analisar as isoformas da troponina, o SecretomeP 2.0 previu que cTnT, fsTnI, ssTnI, fsTnT e fsTnC eram secretadas de forma não clássica. Nos 5 casos, as proteínas alcançaram um escore de rede neural (escore NN) superior a 0,6, que é o limite mínimo para sequências em mamíferos. Além disso, nenhuma das oito isoformas da troponina mostrou conter uma sinalização de peptídeo ou uma hélice transmembranar, de acordo com SignalP 5.0 e TMHMM 2.0 , respectivamente. Os resultados resumidos são apresentados na Tabela 1 . Os resultados completos podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1.

– Resultados resumidos obtidos de <italic> SignalP 5.0, SecretomeP 2.0</italic> e <italic>TMHMM 2.0</italic>
Isoforma da Troponina Identificador de sequências UniProtKB SignalP 5.0 SecretomeP 2.0 TMHMM 2.0
Troponina Cardíaca T – cTnT (TNNT2) P45379-1 Nenhuma sinalização de peptídeo detectada Escore NN = 0.746 Nenhuma hélice transmembranar detectada
Troponina esquelética de contração rápida I – fsTnI (TNNI2 P48788-1 Nenhuma sinalização de peptídeo detectada Escore NN = 0.611 Nenhuma hélice transmembranar detectada
Troponina esquelética de contração lenta I – ssTnI (TNNI1) P19237-1 Nenhuma sinalização de peptídeo detectada Escore NN = 0.727 Nenhuma hélice transmembranar detectada
Troponina esquelética de contração rápida T – fsTnT (TNNT3) P45378-1 Nenhuma sinalização de peptídeo detectada Escore NN = 0.689 Nenhuma hélice transmembranar detectada
Troponina esquelética de contração rápida C – \\\fsTnC (TNNC2) P02585-1 Nenhuma sinalização de peptídeo detectada Escore NN = 0.670 Nenhuma hélice transmembranar detectada

As isoformas de troponina com um escore NN acima do limiar de 0,6 para sequências de mamíferos são mostradas. Escore NN: escore de rede neural.

Discussão Secreção não clássica

A secreção não clássica ou não convencional é uma via de liberação de proteínas. Ao contrário da secreção clássica, ela é independente do retículo endoplasmático (RE)/Complexo de Golgi.8 Consequentemente, ela não necessita de uma sinalização de peptídeo, que é uma sequência curta de aminoácidos que conduz a proteína através do processo secretório clássico (mediado pelo RE/Golgi).9 Em vez disso, as proteínas secretadas de forma não clássica são liberadas através de uma miríade de mecanismos que podem ser classificados em 4 grupos: tipo I (transporte dependente de poros), tipo II (liberação mediada por transportador ABC), tipo III (liberação através de endossomos/autofagossomos) e tipo IV (desvio do Complexo de Golgi por proteínas transmembranares).8 Além disso, outros mecanismos, como exossomos e bolhas, também foram reconhecidos como participantes da secreção não clássica.9 Curiosamente, a maioria dos cenários de secreção não-convencional são desencadeados por estresse celular, como inflamação. Alguns exemplos de proteínas que utilizam a via não clássica são IL-1β/IL-1α, FGF-1, FGF-2 e galectinas.8 , 9

Implicações clínicas da secreção não clássica da troponina

Clinicamente, a secreção não clássica de cTnT pode ajudar a resolver o debate em torno dos ensaios de hs-cTn. Uma via de secreção estabelecida para cTn potencialmente explica por que as troponinas são detectadas em indivíduos saudáveis. Além disso, a liberação não clássica de cTn pode contribuir para melhor definir a base patológica da “lesão miocárdica”. Esse termo foi incluído na Quarta definição universal de infarto do miocárdio, sendo um valor de troponina acima do limite superior de referência, a condição sine qua non para seu diagnóstico.1 Não é irracional pensar que uma condição de atividade geradora de estresse no célula cardíaca resulta na liberação de troponina através de um processo secretor não clássico ( Figura 1 ). Nesse sentido, as elevações de troponina podem ser o resultado de condições sistêmicas que refletem no coração através de um mecanismo inflamatório ou de estresse celular. Este poderia ser o caso de pacientes com sepse, anemia, câncer, acidente vascular cerebral, convulsões ou após exercício extenuante.1 , 4 Curiosamente, a cTnT, mas não a troponina I, mostrou um padrão circadiano de liberação.2A liberação de cTnT por células tumorais, possivelmente por vesículas extracelulares, também foi relatada recentemente.10

– Ilustração do citosol de um cardiomiócito. A via clássica de secreção é representada pelas vesículas que viajam do retículo endoplasmático para o Complexo de Golgi; as vesículas chegam à membrana plasmática, onde liberam sua carga. A via de secreção não clássica proposta também é mostrada. Inicia-se pela formação de bolhas membranosas como resultado da inflamação e/ou estresse celular que afeta o cardiomiócito. Subsequentemente, a troponina cardíaca citosólica não ligada (cTn) (representando cerca de 2-4% e 6-8% do total de cTnI e cTnT, respectivamente)1 entra nessas bolhas e é liberada como microvesículas. Essas microvesículas entram na corrente sanguínea, onde podem ser detectadas por ensaios de troponina cardíaca de alta sensibilidade. A caixa no canto inferior direito mostra a fisiopatologia de duas condições diferentes em que a troponina se eleva. No primeiro caso, um infarto do miocárdio tipo 1, um evento isquêmico agudo leva à necrose irreversível dos miócitos e à liberação de troponina. No segundo caso, a estimulação atrial rápida induz a liberação de troponina. Se a secreção não clássica participa desse processo permanece uma questão em aberto. Criado com BioRender.com. A estrutura 3D do complexo de troponina foi elaborada com dados do Protein Data Bank ID 1J1E.

Limitações da proposta

A principal limitação de nossa proposta é que tanto a troponina I quanto a troponina T cardíaca estão elevadas na lesão miocárdica.1 Uma possível explicação poderia ser que a troponina T cardíaca, a subunidade estrutural do complexo da troponina, carrega as outras subunidades na forma de um dímero ou trímero durante o processo secretor não clássico; entretanto, esta é uma suposição hipotética e permanece uma questão em aberto, mas intrigante.

 Limitações do SecretomeP 2.0

O SecretomeP 2.0 foi criado em 2004 e, após mais de 15 anos, continua a ser um método popular para a avaliação da secreção não clássica.5 No entanto, e como acontece com todos os métodos computacionais, os resultados obtidos são preditivos. Dessa forma, eles devem ser interpretados em conjunto com o corpo de evidência experimental existente.

 Evidências que suportam a secreção não clássica de cTn

Vale ressaltar que já existe literatura corroborando nossos achados. A formação de bolhas por cardiomiócitos durante a isquemia, bem como a liberação de troponina através de microvesículas em múltiplas linhagens celulares (na forma de proteína e mRNA) já foram demonstradas anteriormente. As evidências disponíveis estão resumidas na Tabela 2 .

– Evidências experimentais que apoiam a secreção não clássica de troponina cardíaca. A <italic>Vesiclepedia</italic> é um compêndio eletrônico de biomoléculas identificadas em vesículas extracelulares
Evidência Experimental Referência
Proteína semelhante à troponina secretada por Meloidogyne incognita , um nematoide comumente encontrado no solo Jaubert S, Laffaire JB, Piotte C, Abad P, Rosso M-N, Ledger TN. Direct identification of stylet secreted proteins from root-knot nematodes by a proteomic approach. Molecular and Biochemical Parasitology 121: 205–211, 2002. doi: 10.1016/S0166-6851(02)00034-8
Os cardiomiócitos humanos formam bolhas membranares desencadeadas por anoxia. A liberação reversível de enzimas citosólicas através de bolhas também foi demonstrada. Hickman PE, Potter JM, Aroney C, Koerbin G, Southcott E, Wu AHB, Roberts MS. Cardiac troponin may be released by ischemia alone, without necrosis. Clinica Chimica Acta 411: 318–323, 2010. doi: 10.1016/j.cca.2009.12.009
Identificação de uma proteína não-caracterizada nos exossomos liberados por cardiomiócitos de ratos sob diferentes estressores (etanol e hipóxia/reoxigenação). A proteína não-caracterizada UniProt ID (E9PTA1) acabou por ser o número de acesso secundário de Tnnc1 (troponina C cardíaca de Rattus norvegicus ). Malik ZA, Kott KS, Poe AJ, Kuo T, Chen L, Ferrara KW, Knowlton AA. Cardiac myocyte exosomes: stability, HSP60, and proteomics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology 304: H954–H965, 2013. doi: 10.1152/ajpheart.00835.2012
Evidências da Vesiclepedia
Troponina I tipo 3 (cardíaca) mRNA e proteína do Homo sapiens identificada em células de câncer colorretal (microvesículas), células T (exossomos) e urina (vesículas extracelulares) PubMed IDs: 19930720, 23463506, 25138791
Troponina C tipo 2 (músculo esquelético de contração rápida) Proteína de Homo sapiens identificada em células de câncer de ovário (exossomos) e urina (vesículas extracelulares) PubMed IDs: 24434149, 25138791
Troponina C tipo 2 (músculo esquelético de contração rápida) Proteína de Mus musculus identificada em células de melanoma (vesículas extracelulares) PubMed ID: 29907695
Troponina C tipo 1 (músculo esquelético de contração lenta) Proteína e mRNA de Homo sapiens identificados em células de câncer cerebral (vesículas extracelulares), células de câncer colorretal (microvesículas e vesículas extracelulares), células de câncer renal (vesículas extracelulares), células de leucemia (vesículas extracelulares), células de câncer de pulmão (vesículas extracelulares), células de melanoma (vesículas extracelulares) e células de câncer de ovário (vesículas extracelulares) PubMed IDs: 27894104, 19930720
Troponina I tipo 2 (músculo esquelético de contração rápida) Proteína de Homo sapiens identificada na urina (exossomos) PubMed ID: 22418980
Troponina T tipo 1 (músculo esquelético de contração lenta) mRNA de Homo sapiens identificado em células de câncer colorretal (microvesículas) e células de glioblastoma (microvesículas) PubMed IDs: 19930720, 19011622
Troponina T tipo 3 (músculo esquelético de contração rápida) Proteína de Homo sapiens identificada em células de câncer cerebral (vesículas extracelulares), células de câncer de mama (vesículas extracelulares), células de câncer colorretal (vesículas extracelulares), células de câncer renal (vesículas extracelulares), células de melanoma (vesículas extracelulares) e células de câncer de ovário (vesículas extracelulares) PubMed ID: 27894104

Mais informações podem ser obtidas aqui: Pathan M, Fonseka P, Chitti SV, et al. Vesiclepedia 2019: a compendium of RNA, proteins, lipids and metabolites in extracellular vesicles. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D516-D519. doi:10.1093/nar/gky1029.

Perspectivas futuras

Pesquisas futuras devem ter como objetivo demonstrar a troponina circulante dentro das microvesículas. Isso pode ser testado em pacientes com infarto agudo do miocárdio (onde a necrose deve ser o principal mecanismo de liberação) versus cenários atípicos apresentando elevação da troponina, como exercício extenuante, sepse e acidente vascular cerebral (onde a secreção não clássica deve conduzir a liberação de troponina). Após o isolamento das microvesículas no plasma, uma possível abordagem para validar a via de secreção não clássica poderia ser o uso de espectrometria de massas seguida por confirmação através de anticorpos específicos.

 Conclusão

Ensaios de alta sensibilidade trouxeram incertezas consideráveis sobre as elevações de cTn. A liberação de troponina devido a causas não relacionadas ao IAM permanece indefinida e seu significado prognóstico exato continua a ser investigado. Como nossa proposta é baseada em evidências in silico , ela deve ser confirmada experimentalmente antes que seu significado clínico exato possa ser determinado. Se outras variantes da troponina também entram na via secretora não clássica permanece uma questão em aberto. No entanto, é justo dizer que a secreção não clássica da troponina é uma linha de pesquisa promissora em cardiologia que aguarda ser explorada.

 Referências 1. Thygesen K, Alpert JS, Jaffe AS, Chaitman BR, Bax JJ, Morrow DA, et al. Fourth universal definition of myocardial infarction. Eur Heart J.2018;40(3):237-69. Doi: 10.1093/eurheartj/ehy462. Thygesen K Alpert JS Jaffe AS Chaitman BR Bax JJ Morrow DA et al Fourth universal definition of myocardial infarction Eur Heart J 2018 40 3 237 269 10.1093/eurheartj/ehy462. 2. Chaulin AM, Duplyakov DV. On the potential effect of circadian rhythms of cardiac troponins on the diagnosis of acute myocardial infarction. Signa Vitae.2021;17(3):79-84. Doi: 10.22514/sv.2021.050. Chaulin AM Duplyakov DV On the potential effect of circadian rhythms of cardiac troponins on the diagnosis of acute myocardial infarction Signa Vitae 2021 17 3 79 84 10.22514/sv.2021.050. 3. Hammarsten O, Mair J, Möckel M, Lindahl B, Jaffe AS. Possible mechanisms behind cardiac troponin elevations. Biomarkers.2018;23(8):725-34. Doi: 10.1080/1354750X.2018.1490969. Hammarsten O Mair J Möckel M Lindahl B Jaffe AS Possible mechanisms behind cardiac troponin elevations Biomarkers 2018 23 8 725 734 10.1080/1354750X.2018.1490969. 4. Park KC, Gaze DC, Collinson PO, Marber MS. Cardiac troponins: from myocardial infarction to chronic disease. Cardiovasc Res.2017;113(14):1708-18. Doi: 10.1093/cvr/cvx183. Park KC Gaze DC Collinson PO Marber MS Cardiac troponins: from myocardial infarction to chronic disease Cardiovasc Res 2017 113 14 1708 1718 10.1093/cvr/cvx183. 5. Bendtsen JD, Jensen LJ, Blom N, von Heijne G, Brunak S. Feature-based prediction of non-classical and leaderless protein secretion. Protein Eng Des Selec. 2004;17(4):349–56. Doi: 10.1093/protein/gzh037. Bendtsen JD Jensen LJ Blom N von Heijne G Brunak S Feature-based prediction of non-classical and leaderless protein secretion Protein Eng Des Selec 2004 17 4 349 356 10.1093/protein/gzh037. 6. Almagro Armenteros JJ, Tsirigos KD, Sønderby CK, Petersen TN, Winther O, Brunak S, et al. SignalP 5.0 improves signal peptide predictions using deep neural networks. Nat Biotechnol .2019;37(4):420–3. Doi: 10.1038/s41587-019-0036-z. Almagro Armenteros JJ Tsirigos KD Sønderby CK Petersen TN Winther O Brunak S et al SignalP 5.0 improves signal peptide predictions using deep neural networks Nat Biotechnol 2019 37 4 420 423 10.1038/s41587-019-0036-z. 7. Sonnhammer ELL, von Heijne G, Krogh A. A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol. 1998;6:175–82. Sonnhammer ELL von Heijne G Krogh A A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol 1998 6 175 182 8. Rabouille C. Pathways of Unconventional Protein Secretion. Trends Cell Biol 2017;27(3):230–40. Doi: 10.1016/j.tcb.2016.11.007. Rabouille C Pathways of Unconventional Protein Secretion Trends Cell Biol 2017 27 3 230 240 10.1016/j.tcb.2016.11.007. 9. Doroudgar S, Glembotski CC. The cardiokine story unfolds: ischemic stress-induced protein secretion in the heart. Trends Mol Med.2011;17(4):207-14. Doi: 10.1016/j.molmed.2010.12.003. Doroudgar S Glembotski CC The cardiokine story unfolds: ischemic stress-induced protein secretion in the heart Trends Mol Med 2011 17 4 207 214 10.1016/j.molmed.2010.12.003. 10. Tsuruda T, Sato Y, Kajihara K, Kawabata T, Kubuki Y, Komaki S, et al. Non-canonical Expression of Cardiac Troponin-T in Neuroendocrine Ethmoid Sinus Carcinoma Following Immune Checkpoint Blockade. Front Cardiovasc Med. 2019;6:124. Doi: 10.3389/fcvm.2019.00124. Tsuruda T Sato Y Kajihara K Kawabata T Kubuki Y Komaki S et al Non-canonical Expression of Cardiac Troponin-T in Neuroendocrine Ethmoid Sinus Carcinoma Following Immune Checkpoint Blockade Front Cardiovasc Med 2019 6 124 10.3389/fcvm.2019.00124.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Aprovação ética e consentimento informado

Este artigo não contém estudos com humanos ou animais realizados por nenhum dos autores.

Fontes de financiamento: O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Material suplementar

Para informação adicional, por favor, clique aqui.

 Research Letter Non-Classical Secretion: A Possible Mechanism to Explain Cardiac Troponin Elevations in the Absence of Acute Myocardial Infarction 0000-0003-3035-6609 Gonzalez-Rayas Jose Manuel 1 0000-0003-4556-7257 Hernandez-Hernandez Jose Ascencion 1 0000-0002-6200-1397 Lopez-Sanchez Rosa del Carmen 1 0000-0001-7645-9211 Rayas-Gomez Ana Lilia 2 0000-0002-2295-7554 Gonzalez-Yanez Jose Manuel 2 Mexico Tecnologico de Monterrey, School of Medicine and Health Science, Monterrey – Mexico Mexico Hospital San Jose de Queretaro, Queretaro – Mexico Mailing Address: Jose Manuel Gonzalez-Rayas • Tecnologico de Monterrey, School of Medicine and Health Science, Ignacio Morones Prieto Av. 3000, Sertoma, Monterrey, Nuevo Leon, 64710, Mexico E-mail: contact.jmgr@gmail.com

Author Contributions

Conception and design of the research: Gonzalez-Rayas JM, Rayas-Gomez AL; Acquisition of data and Statistical analysis: Gonzalez-Rayas JM; Analysis and interpretation of the data and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Gonzalez-Rayas JM, Hernandez-Hernandez JA, Lopez-Sanchez RC, Rayas-Gomez AL, Gonzalez-Yanez JM; Writing of the manuscript: Gonzalez-Rayas JM, Hernandez-Hernandez JA, Lopez-Sanchez RC, Rayas-Gomez AL, Gonzalez-Yanez JM.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Troponin non-classical secretion high-sensitivity cardiac troponin assays exosomes microvesicles

“It is important to realize that if certain areas of science

appear to be quite mature, others are in the process of

development, and yet others remain to be born.”

Santiago Ramón y Cajal,

Advice for a young investigator

Introduction

Nowadays, high-sensitivity cardiac troponin (hs-cTn) assays are available for clinical use and are part of the definition of acute myocardial infarction (AMI).1 , 2 However, troponin elevation is not limited to AMI, since other conditions related to oxygen demand mismatch, direct myocardial damage, increased myocardial strain, systemic processes (i.e. sepsis), neurological disease and renal failure can also result in its increase.2Troponin can now also be detected in atypical scenarios, such as in strenuous endurance exercise, rapid atrial pacing, and dobutamine stress echocardiography, as well as in 50% to 100% of healthy subjects.2 , 3

From a physiological point of view, troponin is a protein complex that regulates myofibrillar function, consisting of three subunits: I, T and C. In the case of troponin I and troponin T, there are three different tissue-specific isoforms: fast-twitch skeletal, slow-twitch skeletal and cardiac specific (fsTn, ssTn and cTn).4Conversely, TnC has two isoforms, one present in fast-twitch skeletal muscle (fsTnC) and one that expresses in both slow-twitch skeletal and cardiac muscle (ssTnC/cTnC).4

Apart from cell necrosis, several alternative release mechanisms have been postulated for the cardiac isoforms of troponin.3 , 4 However, none of them concisely explains why troponin is released in cases unrelated to myocardial infarction or whether this is indicative of reversible or permanent damage to the cardiac cell. In light of the current lack of knowledge, our main objective was to explore the feasibility of a novel mechanism for cardiac troponin release using a bioinformatical approach.

 Materials and Methods Review of the existing evidence

Before starting the analysis, a comprehensive review of the literature was conducted in search of articles related to troponin secretion. The searched databases were PubMed, bioRxiv and OpenGrey. Articles were first assessed based on their title. If it mentioned troponin and a secretory process, the abstract was read. Articles were selected if the abstract mentioned troponin and a secretory process or pathway. Purely clinical articles that did not investigate a mechanism of troponin release were excluded. The screening and review processes were performed by all authors. Disagreements were solved by consensus during regular meetings.

 Sequence analysis

To assess for non-classical secretion of troponin, the SecretomeP 2.0 server was used (http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/).5This tool is applied to predict whether a certain protein undergoes secretion without a signal peptide. It is a sequence-based method that, with the help of neural networks, detects specific features common to extracellular/secreted proteins.5

The canonical sequences from the three subunits of troponin from fast-skeletal, slow-skeletal and cardiac muscle were retrieved from the UniProtKB database (Supplementary File 1). The proteins were first assessed with SignalP 5.0 , a commonly used method for the recognition of signal peptides based on neural networks (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/).6This initial step was performed to rule out the classical secretory pathway. Afterwards, the sequences were analyzed with SecretomeP 2.0 . Finally, to assess the possibility of type IV non-classical secretion (used by transmembrane proteins that bypass the Golgi apparatus), the sequences were evaluated using TMHMM 2.0 , a program designed to detect transmembrane helices (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/).7A graphical representation of the followed bioinformatic pipeline can be found in Supplementary Figure 1 .

– Illustration of the cytosol of a cardiomyocyte. The classical pathway of secretion is depicted by the vesicles traveling from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus; the vesicles arrive at the plasma membrane, where they release their load. The proposed non-classical pathway of secretion is also shown. It starts with the formation of membranous blebs as a result of inflammation and/or cell stress, affecting the cardiomyocyte. Subsequently, unbound cytosolic cardiac troponin (cTn) (representing around 2-4% and 6-8% of the total cTnI and cTnT, respectively)1 enters these blebs and is released as microvesicles. These microvesicles enter the bloodstream, where they can be detected by high-sensitivity cardiac troponin assays. The box on the lower right corner shows the physiopathology of two different conditions where troponin increases. In the first case, a type 1 myocardial infarction case, an acute ischemic event leads to irreversible myocyte necrosis and troponin release. In the second case, rapid atrial pacing induces troponin release. Whether non-classical secretion participates in this process remains an open question. Created with BioRender.com. The 3D structure of the troponin complex was created with data from Protein Data Bank ID 1J1E.

Results Review of the existing evidence

Nearly 19,900 articles were reviewed, of which 31 were read in full. After abstract and full text assessment, no articles were found to be related to troponin secretion. Hence, to the best of our knowledge, this is the first paper reporting evidence of troponin non-classical secretion.

 Sequence analysis

After analyzing the troponin isoforms, SecretomeP 2.0 predicted cTnT, fsTnI, ssTnI, fsTnT and fsTnC to be non-classically secreted. In the 5 cases, the proteins achieved a neural network score (NN-score) greater than 0.6, which is the minimum threshold for mammalian sequences. Additionally, none of the eight troponin isoforms were found to contain a signal peptide or a transmembrane helix, according to SignalP 5.0 and TMHMM 2.0 , respectively. The summarized results are shown in Table 1 . The complete results can be found in Supplementary Table 1 .

– Summarized results obtained with <italic>SignalP 5.0, SecretomeP 2.0</italic> and <italic>TMHMM 2.0</italic>
Troponin isoform UniProtKB sequence identifier SignalP 5.0 SecretomeP 2.0 TMHMM 2.0
Cardiac Troponin T – cTnT (TNNT2) P45379-1 No signal peptide detected NN-score = 0.746 No transmembrane helices detected
Fast-twitch skeletal Troponin I – fsTnI (TNNI2) P48788-1 No signal peptide detected NN-score = 0.611 No transmembrane helices detected
Slow-twitch skeletal Troponin I – ssTnI (TNNI1) P19237-1 No signal peptide detected NN-score = 0.727 No transmembrane helices detected
Fast-twitch skeletal Troponin T – fsTnT (TNNT3) P45378-1 No signal peptide detected NN-score = 0.689 No transmembrane helices detected
Fast-twitch skeletal Troponin C – fsTnC (TNNC2) P02585-1 No signal peptide detected NN-score = 0.670 No transmembrane helices detected

The troponin isoforms with a NN-score above the 0.6 threshold for mammalian sequences are shown. NN-score: neural network score.

Discussion Non-classical secretion

Non-classical or unconventional secretion is a pathway of protein release. Contrary to classical secretion, it is independent of the Endoplasmic Reticulum (ER)/Golgi apparatus.8Consequently, it does not require a signal peptide, which is a short sequence of amino acids that leads the protein through the classical (ER/Golgi-mediated) secretory process.9Instead, non-classically secreted proteins are released through a myriad of mechanisms that can be classified into 4 groups: type I (pore-dependent transport), type II (ABC transporter-mediated release), type III (released from endosomes/autophagosomes) and type IV (Golgi bypass by transmembrane proteins).8Moreover, other mechanisms, such as exosomes and blebs, have also been recognized to take part in non-classical secretion.9Interestingly, most of the scenarios of unconventional secretion are triggered by cell stress, such as inflammation. Some examples of proteins that use the non-classical pathway are IL-1β/IL-1α, FGF-1, FGF-2, and galectins.8 , 9

Clinical implications of troponin non-classical secretion

Clinically, cTnT non-classical secretion could help to solve the debate around hs-cTn assays. An established secretion pathway for cTn potentially explains why troponins are detected in healthy subjects. In addition, cTn non-classical release might contribute to better define the pathological basis of “myocardial injury”. This term was included in the fourth universal definition of myocardial infarction, with a troponin value above the upper reference limit being the required condition for its diagnosis.1It is not unreasonable to think that an activity condition that generates stress in the cardiac cell results in the release of troponin through a non-classical secretory process ( Figure 1 ). In this regard, troponin elevations might be the result of systemic conditions reflecting on the heart through an inflammatory or cell stress mechanism. This could be the case of patients with sepsis, anemia, cancer, stroke, seizures, or after strenuous exercise.1 , 4 Interestingly, cTnT, but not I, has shown a circadian pattern of release.2cTnT release by tumor cells, possibly by extracellular vesicles, has also been recently reported.10

 Proposal limitations

The main limitation of our proposal is that both cardiac troponin I and troponin T are elevated in myocardial injury.1A possible explanation could be that cardiac troponin T, the structural subunit of the troponin complex, carries the other subunits in the form of a dimer or trimer along the non-classical secretory process; however, this is a hypothetical assumption and remains an open but intriguing question.

 SecretomeP 2.0 limitations

SecretomeP 2.0 was created in 2004, and after more than 15 years it remains a popular method for the assessment of non-classical secretion.5However, and as it happens with all computational methods, the results obtained are predictions. Thus, they should be interpreted together with the existing experimental body of evidence.

 Evidence supporting cTn non-classical secretion

It is worth mentioning that there is some literature supporting our findings. Bleb formation by cardiomyocytes during ischemia, as well as troponin release through microvesicles in multiple cell lines (in both protein and mRNA form) have been previously demonstrated. Available evidence is summarized in Table 2 .

– Experimental evidence supporting cardiac troponin non-classical secretion. <italic>Vesiclepedia</italic> is an electronic compendium of biomolecules identified in extracellular vesicles
Experimental evidence Reference
Troponin-like protein secreted by Meloidogyne incognita, a root-knot nematode Jaubert S, Laffaire JB, Piotte C, Abad P, Rosso M-N, Ledger TN. Direct identification of stylet secreted proteins from root-knot nematodes by a proteomic approach. Molecular and Biochemical Parasitology 121: 205–211, 2002. doi: 10.1016/S0166-6851(02)00034-8
Human cardiomyocytes form membranous blebs triggered by anoxia. Reversible cytosolic enzyme release by means of blebs has also been shown. Hickman PE, Potter JM, Aroney C, Koerbin G, Southcott E, Wu AHB, Roberts MS. Cardiac troponin may be released by ischemia alone, without necrosis. Clinica Chimica Acta 411: 318–323, 2010. doi: 10.1016/j.cca.2009.12.009
Identification of an uncharacterized protein in the exosomes released by rat cardiomyocytes under different stressors (ethanol and hypoxia/reoxygenation). The uncharacterized protein UniProt ID (E9PTA1) turned out to be the secondary accession number of Tnnc1 (cardiac troponin C of Rattus norvegicus). Malik ZA, Kott KS, Poe AJ, Kuo T, Chen L, Ferrara KW, Knowlton AA. Cardiac myocyte exosomes: stability, HSP60, and proteomics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology 304: H954–H965, 2013. doi: 10.1152/ajpheart.00835.2012
Evidence from Vesiclepedia
Troponin I type 3 (cardiac) Homo sapiens mRNA and protein identified in colorectal cancer cells (microvesicles), T cells (exosomes) and urine (extracellular vesicles) PubMed IDs: 19930720, 23463506, 25138791
Troponin C type 2 (fast-twitch skeletal muscle) Homo sapiens protein identified in ovarian cancer cells (exosomes) and urine (extracellular vesicles) PubMed IDs: 24434149, 25138791
Troponin C type 2 (fast-twitch skeletal muscle) Mus musculus protein identified in melanoma cells (extracellular vesicles) PubMed ID: 29907695
Troponin C type 1 (slow-twitch skeletal muscle) Homo sapiens protein and mRNA identified in brain cancer cells (extracellular vesicles), colorectal cancer cells (microvesicles and extracellular vesicles), kidney cancer cells (extracellular vesicles), leukemia cells (extracellular vesicles), lung cancer cells (extracellular vesicles), melanoma cells (extracellular vesicles) and ovarian cancer cells (extracellular vesicles) PubMed IDs: 27894104, 19930720
Troponin I type 2 (fast-twitch skeletal muscle) Homo sapiens protein identified in urine (exosomes) PubMed ID: 22418980
Troponin T type 1 (slow-twitch skeletal muscle) Homo sapiens mRNA identified in colorectal cancer cells (microvesicles) and glioblastoma cells (microvesicles) PubMed IDs: 19930720, 19011622
Troponin T type 3 (fast-twitch skeletal muscle) Homo sapiens protein identified in brain cancer cells (extracellular vesicles), breast cancer cells (extracellular vesicles), colorectal cancer cells (extracellular vesicles), kidney cancer cells (extracellular vesicles), melanoma cells (extracellular vesicles) and ovarian cancer cells (extracellular vesicles) PubMed ID: 27894104

More information can be found here: Pathan M, Fonseka P, Chitti SV, et al. Vesiclepedia 2019: a compendium of RNA, proteins, lipids and metabolites in extracellular vesicles. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D516-D519. doi:10.1093/nar/gky1029.

Future perspectives

Further research should aim at demonstrating circulating troponin within microvesicles. This could be tested in patients with acute myocardial infarction (where necrosis should be the leading release mechanism) versus atypical scenarios showing troponin elevation such as strenuous exercise, sepsis and stroke (where non-classical secretion should drive troponin release). After the isolation of plasma microvesicles, a possible approach to validate the non-classical secretion pathway could be the use of mass spectrometry followed by confirmation through specific antibodies.

 Conclusion

High-sensitivity assays have brought considerable uncertainty about cTn elevations. Troponin liberation due to non-AMI related causes remains elusive and its exact prognostic significance continues to be investigated. Since our proposal is based on in silico evidence, it should be experimentally confirmed before its exact clinical significance can be ascertained. Whether other troponin variants also enter the non-classical secretory pathway is also an open question. Nonetheless, it is fair to say that troponin non-classical secretion is a promising research field in cardiology that awaits to be explored.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Ethics approval and consent to participate

This article does not contain any studies with human participants or animals performed by any of the authors.

Sources of Funding: There were no external funding sources for this study.

Supplemental Materials

For additional information, please click here.