Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC bR3LC3DHQSqgynbFt4t8jJS S0066-782X2022005001214 S0066-782X2022000400669 abc.20201371 10.36660/abc.20201371 Artigo Original Rastreamento para Hipercolesterolemia Familiar em Pequenos Municípios: A Experiência do Programa HipercolBrasil em 11 Municípios Brasileiros 0000-0002-8791-642X Jannes Cinthia Elim 1 Silvino Júnea Paolucci Paiva 2 0000-0002-3602-603X Silva Pãmela Rodrigues de Souza 3 Lima Isabella Ramos 1 Tada Mauricio Teruo 1 Oliveira Theo Gremen Mimary 4 Santos Raul D. 5 Krieger José Eduardo 1 Pereira Alexandre da Costa 1 Universidade de São Paulo Instituto do Coração Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular São Paulo SP Brasil Universidade de São Paulo Instituto do Coração - Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular, São Paulo, SP – Brasil Universidade Federal de Minas Gerais Faculdade de Medicina Belo Horizonte MG Brasil Universidade Federal de Minas Gerais - Faculdade de Medicina, Belo Horizonte, MG - Brasil Universidade Federal de Mato Grosso Faculdade de Farmácia Cuiabá MS Brasil Universidade Federal de Mato Grosso - Faculdade de Farmácia, Cuiabá, MS - Brasil Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina Instituto do Coração São Paulo SP Brasil Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina - Instituto do Coração, São Paulo, SP – Brasil Hospital Israelita Albert Einstein Ringgold São Paulo SP Brasil Hospital Israelita Albert Einstein Ringgold, São Paulo, SP – Brasil Correspondência: Cinthia Elim Jannes • Universidade de São Paulo Instituto do Coração - Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular – Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 44. CEP 05403-000, São Paulo, SP – Brasil E-mail: cejannes@hotmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Jannes CE, Pereira AC; Obtenção de dados: Jannes CE, Silvino JPP, Lima IR, Tada MT; Análise e interpretação dos dados: Jannes CE, Silvino JPP, Pereira AC; Análise estatística: Silva PRS, Pereira AC; Obtenção de financiamento: Jannes CE, Krieger JE, Pereira AC; Redação do manuscrito: Jannes CE, Oliveira TGM, Santos RD, Pereira AC; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Silvino JPP, Santos RD, Krieger JE, Pereira AC.

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo

 07 02 2022 04 2022 118 4 669 677 28 12 2020 07 05 2021 12 05 2021 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

A hipercolesterolemia familiar (HF) é uma doença genética dominante que se caracteriza por níveis sanguíneos elevados de colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), e está associada à ocorrência de doença cardiovascular precoce. No Brasil, o HipercolBrasil, que é atualmente o maior programa de rastreamento em cascata para HF, já identificou mais de 2.000 indivíduos com variantes genéticas causadoras de HF. A abordagem padrão baseia-se no rastreamento em cascata de casos índices referidos, indivíduos com hipercolesterolemia e suspeita clínica de HF.

 Objetivos

Realizar rastreamento direcionado de 11 pequenos municípios brasileiros com suspeita de alta prevalência de indivíduos com HF.

 Métodos

A seleção dos municípios ocorreu de 3 maneiras: 1) municípios em que houve suspeita de efeito fundador (4 municípios); 2) municípios em uma região com altas taxas de infarto do miocárdio precoce, conforme descrito pelo banco de dados do Sistema Único de Saúde (2 municípios); e 3) municípios geograficamente próximos a outros municípios com alta prevalência de indivíduos com HF (5 municípios). A significância estatística foi considerada como valor p < 0,05.

 Resultados

Foram incluídos 105 casos índices e 409 familiares de primeiro grau. O rendimento dessa abordagem foi de 4,67 familiares por caso índice, o qual é significativamente melhor (p < 0,0001) do que a taxa geral do HipercolBrasil (1,59). Identificamos 36 CIs com variante patogênica ou provavelmente patogênica para HF e 240 familiares de primeiro grau afetados. Conclusão: Nossos dados sugerem que, uma vez detectadas, regiões geográficas específicas justificam uma abordagem direcionada para a identificação de aglomerações de indivíduos com HF.

 Hipercolesterolemia Familiar Testes Genéticos Doenças Cardiovasculares Amgen Biotechnology 682/2016 Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado por Amgen Biotechnology (grant number 682/2016) Introdução

Hipercolesterolemia familiar (HF) é uma doença autossômica dominante que se caracteriza clinicamente por níveis sanguíneos elevados de colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), e está associada à ocorrência de doença cardiovascular aterosclerótica (DCVA) precoce.1,2

A prevalência da HF no mundo é estimada em aproximadamente 1:250 na forma heterozigótica e 1:600.000 na forma homozigótica.3 Um estudo realizado pela coorte ELSA-Brasil estimou que a prevalência de indivíduos com os critérios clínicos para a HF no Brasil seria de 1:263. Considerando essas estimativas, haveria aproximadamente 760.000 pessoas com HF no Brasil.4

Porém, embora seja relativamente frequente, a forma heterozigótica ainda é uma doença subdiagnosticada.5 Para auxiliar na identificação de indivíduos com essa doença, tem sido utilizado o rastreamento genético em cascata em vários países, como a Holanda,6 o Reino Unido7 e a Espanha.8 Este método já foi reconhecido como sendo de custo efetivo para a identificação e a prevenção de DCVA precoce em indivíduos com a HF.9,10

No Brasil, o HipercolBrasil, que é atualmente o maior programa de rastreamento genético em cascata, existe desde 201211 e já identificou mais de 2.000 indivíduos com variantes genéticas causadoras de HF. O programa atualmente realiza testes genéticos em qualquer indivíduo com LDL-C ≥ 230 mg/dL (caso índice [CI])12 e nos familiares de primeiro grau daquelas com variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas.

Entre julho de 2017 e julho de 2019, testamos uma nova metodologia para identificar novos indivíduos com mutações genéticas para HF, direcionada a pequenos municípios com prevalência potencialmente alta de HF.

O presente estudo descreve os primeiros resultados de triagem direcionada em 11 pequenos municípios brasileiros (até 60.000 habitantes) com suspeita de alta prevalência de pessoas com HF.

 Métodos

O estudo foi realizado no Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular do Instituto do Coração (InCor) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, Brasil. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional (CAPPesq protocolo l00594212.0.1001.0068).

Amostra do estudo

A Figura 1 mostra os critérios de inclusão e o desenho do estudo. Cadastramos indivíduos de 11 municípios selecionados com até 60.000 habitantes em todo o território brasileiro. A seleção dos municípios ocorreu de 3 maneiras: 1) municípios em que houve suspeita de efeito fundador, ou seja, ocorrência de indivíduos homozigotos, mas sem histórico de qualquer grau de parentesco entre os pais (Major Vieira, Papanduva, Lagoa do Mato e Passagem Franca); 2) municípios em uma região com altas taxas de dislipidemia, conforme relatado por médicos locais (Bom Despacho e Moema);13 e 3) municípios geograficamente próximos a outros municípios com alta prevalência de indivíduos com HF (Bambuí, Pimenta, Luz, Colinas e Buriti Bravo).

– <italic>Metodologia para selecionar municípios, identificar CIs e familiares e treinar profissionais de saúde para continuar o rastreamento genético em cascata.</italic>

Registro de casos índices e familiares

Em todos os municípios, foi feito um contato inicial com a secretaria saúde local de para explicar o projeto e estabelecer um acordo sobre a parceria. Foi feito contato por telefone antes de visitar cada município e realizado um acordo entre ambas as partes por e-mail. Já no município, a equipe foi atendida por um agente de saúde indicado pela secretaria de saúde. Nos municípios onde havia evidências de efeito fundador e naquelas onde havia relato de alta incidência de dislipidemia, a coleta de amostras começou com familiares de CIs previamente selecionados. Nesses municípios, também ocorreu uma busca ativa para novos CIs a partir de prontuários e exames de colesterol realizados nos laboratórios de análise clínica das unidades de saúde locais. Indivíduos foram considerados CIs quando apresentavam colesterol total > 300 mg/dL e/ou LDL-C ≥ 210 mg/dL com triglicerídeos < 300 mg/dL. Nestes casos, foi coletada uma amostra de sangue para realização de uma segunda dosagem do colesterol em nosso laboratório. Aqueles com LDL-C confirmado ≥ 210 mg/dL na segunda dosagem foram selecionados para o sequenciamento genético, enquanto os indivíduos que não atingiram este valor receberam laudo com os valores de colesterol total e as frações e foram excluídos do estudo.

 Sequenciamento genético e rastreamento em cascata

Foram coletadas as amostras de sangue (10 ml de sangue periférico em tubos de EDTA) e enviadas ao Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular do InCor/HCFMUSP para análise genética. Foi extraído o DNA genômico usando QIAamp DNA MiniKit (QIAGEN), seguindo as instruções do fabricante. Os CIs foram sequenciados por sequenciamento de próxima geração em um painel de genes incluindo os seguintes genes relacionados à dislipidemia: LDLR, APOB, PCSK9, LDLRAP1, STAP1, LIPA, APOE, ABCG5 e ABCG8. Foram realizadas as análises bioinformáticas em Varstation e CLC Genomic Workbench 9.0 (QIAGEN). A amplificação multiplex de sondas dependente de ligação (MLPA) em LDLR foi usada para rastrear variantes de número de cópias dos CIs sem qualquer tipo de variantes do tipo missense, nonsense ou frameshift identificadas no sequenciamento de próxima geração. Foi realizado o rastreamento de familiares com sequenciamento Sanger (para mutações pontuais ou pequenos indels) ou MLPA (para variantes de número de cópias). As variantes foram classificadas de acordo com as recomendações do American College of Medical Genetics and Genomics.14

 Análise de dados

A análise visual da distribuição das variáveis foi realizada por meio de histogramas e foi verificada a normalidade dos dados. Para variáveis contínuas com distribuição normal, foram calculados a média e o desvio padrão. As variáveis categóricas são mostradas como frequências. As diferenças entre as frequências foram comparadas pelo teste de qui-quadrado. Foram comparadas as diferenças entre as médias com o teste t de Student não pareado ou ANOVA unilateral, se necessário. As variáveis testadas apresentaram distribuição normal e optamos pelo teste paramétrico. A significância estatística foi considerada como valor p < 0,05. As análises estatísticas foram realizadas com SPSS v19.0 (IBM).

 Resultados

Inicialmente, coletamos 230 CIs com pelo menos uma medida de colesterol que atendia aos critérios propostos (veja os Métodos). Porém, 125 deles apresentaram valores de LDL-C abaixo do ponto de corte após a segunda medição e não foi realizado sequenciamento posterior. No total, foram incluídos 105 ICs e 490 familiares na análise. A Tabela 1 mostra as características dos 11 municípios visitados, estado da federação brasileira, número de habitantes e data de cada visita. O município com o menor número de habitantes totais foi Moema com 7.028 e a maior foi Bom Despacho com 45.624, ambas no estado de Minas Gerais. Os primeiros municípios a serem visitados foram Major Vieira e Papanduva (setembro de 2017) e as últimas foram Buriti Bravo e Colinas (fevereiro de 2019).

– Características gerais dos municípios da amostra
Município Estado do Brasil Habitantes totais (Censo do IBGE) Data da visita Número de casos esperados (1:263)4 Número de casos positivos identificados
Bambuí Minas Gerais 22.709 Dez 2018 86 2
Bom Despacho Minas Gerais 45.624 Ago 2018 173 45
Buriti Bravo Maranhão 23.827 Fev 2019 91 0
Colinas Maranhão 42.196 Fev 2019 160 4
Lagoa do Mato Maranhão 10.955 Abr 2018 42 32
Luz Minas Gerais 17.492 Dez 2018 67 6
Major Vieira Santa Catarina 8.103 Set 2017 31 47
Moema Minas Gerais 7.028 Ago 2018 27 36
Papanduva Santa Catarina 18.013 Set 2017 68 48
Passagem Franca Maranhão 17.296 Abr 2018 66 50
Pimenta Minas Gerais 8.236 Dez 2018 31 6

IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística.

A Tabela 2 mostra o número de CIs e familiares sequenciados por região e seu genótipo em relação à presença de variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas (positivos), sem variantes patogênicas (negativos) ou presença de uma variante de significado incerto (VSI), bem como o número de novos casos derivados de cada CI incluído.

– CIs e familiares incluídos por região e seus genótipos para a presença de variantes genéticas de HF
Origem CIs Familiares Número de familiares por CIs identificados Número de indivíduos genotipados por município
Negativo Positivo VSI Negativo Positivo VSI
Bambuí 0 1 0 0 1 0 1 2
Bom Despacho 15 11 2 34 31 3 2,4 96
Buriti Bravo 4 0 0 0 0 0 0 4
Colinas 6 1 1 1 3 0 0,5 12
Lagoa do Mato 3 2 0 25 30 0 11 60
Luz 21 4 1 0 2 0 0,08 28
Major Vieira 1 3 0 48 44 0 23 96
Moema 1 4 0 36 32 0 13,6 73
Papanduva 4 2 1 50 46 0 13,7 103
Passagem Franca 3 5 0 55 45 0 12,5 108
Pimenta 6 2 1 0 4 0 0,4 13
Total 64 35 6 249 238 3 4,7 595

CI: caso índice; VSI: variante de significado incerto; HF: Hipercolesterolemia familiar.

A Tabela 3 mostra os três grupos de CIs (negativo, positivo ou VSI) e seus dados clínicos e bioquímicos. No total, foram sequenciados 105 CIs, sendo encontradas variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas em 36 (37,8%) indivíduos e VSI em 5 (5,25%). A maioria dos CIs era do sexo feminino (67,6%) e quando as características clínicas e bioquímicas foram avaliadas entre os três grupos, houve, como esperado, uma diferença estatisticamente significativa em relação ao colesterol total e LDL-C basais (não tratados), com o grupo positivo apresentando os maiores valores de colesterol total e LDL-C, 382 ± 150 mg/dL e 287 ± 148 mg/dL, respectivamente. A Tabela 4 mostra as características clínicas e bioquímicas dos familiares.

– Características clínicas e bioquímicas de CIs negativos, positivos e alterados por VSI
CI negativo (64) CI positivo (36) CI com VSI (5) valor p
Mulheres % 45 (70,3) 64 21 (58,3) 36 5 (100) 5 0,134
Homens % 19 (29,7) 64 15 (41,7) 36 - 5
Idade (anos) 54±15 64 44±19 36 56±16 5 0,015
Uso de drogas hipolipemiantes 32 (50,0) 64 24 (66,7) 36 3 (60,0) 5 0,261
DAC precoce 2 (3,1) 64 4 (11,1) 36 - 5 0,297
Xantomas 3 (4,7) 64 3 (8,3) 36 1 (20,0) 5 0,365
Xantelasmas 4 (6,3) 64 1 (2,8) 36 - 5 0,696
Arco córneo 2 (3,1) 64 3 (8,3) 36 - 5 0,345
CT atual 279±65 62 316±107 36 302±28 5 0,102
LDL-C atual 195±56 64 234±104 36 207±35 5 0,051
CT basal 322±33 60 382±150 32 305±43 5 0,008
LDL-C basal 233±24 59 287±148 34 229±20 4 0,022

CI: caso índice; CT: colesterol total; DAC: doença arterial coronariana; LDL-C: colesterol de lipoproteína de baixa densidade; VSI: variante de significado incerto. DAC precoce definido como evento de doença cardiovascular aterosclerótica < 55 e 60 anos de idade em homens e mulheres, respectivamente; lipídios em mg/dL; lipídios basais = não tratados.

– Características clínicas e bioquímicas dos familiares positivos e negativos
Familiares negativos N (249) Familiares positivos N (240) valor p
Mulheres % 136 (54,6) 249 135 (56,3) 240 0,504
Homens % 113 (45,4) 249 105 (43,8) 240
Idade (anos) 40±21 249 38±21 240 0,710
Uso de drogas hipolipemiantes 31 (12,4) 249 93 (38,8) 240 0,001
DAC precoce 2 (0,8) 249 9 (3,8) 240 0,034
Xantomas 6 (2,4) 249 17 (7,1) 240 0,013
Xantelasmas 11 (4,4) 249 34 (14,2) 240 0,001
Arco córneo 1 (0,4) 249 9 (3,8) 240 0,009
CT atual 198±51 114 309±86 127 0,001
LDL-C atual 124±42 192 233±75 198 0,001
CT basal 220±191 97 318±97 130 0,001
LDL-C basal 126±41 169 243±82 178 0,001

DAC: doença arterial coronariana; LDL-C: colesterol de lipoproteína de baixa densidade; CT: colesterol total. DAC precoce definido como evento de doença cardiovascular aterosclerótica < 55 e 60 anos de idade em homens e mulheres, respectivamente; lipídios em mg/dL; lipídios basais = não tratados.

A Figura 2 mostra a distribuição geográfica dos 11 municípios localizados em 3 estados da federação brasileira, o número de casos registrados, o número de indivíduos genotipados e o número de indivíduos com uma variante patogênica.

– <italic>Distribuição geográfica dos casos, número de indivíduos genotipados e número de indivíduos com variante patogênica identificada (positivos).</italic>

Estados brasileiros, de cima para baixo: Maranhão, Minas Gerais e Santa Catarina

A Tabela 5 mostra todas as variantes encontradas e o local onde foram identificadas. No total, foram identificadas 21 variantes diferentes, com 3 variantes aparecendo com mais frequência. As frequências observadas para essas 3 variantes sugerem que elas têm efeitos fundadores nessas localidades. Foram encontrados 6 pacientes homozigotos e 1 heterozigoto composto em trans.

– Variantes patogênicas, provavelmente patogênica e VSI de HF encontradas por município
Gene Variante Classificação da variantes Bambuí Bom Despacho Luz Pimenta Moema Buriti Bravo Colinas Lagoa do Mato Passagem Franca Major Vieira Papanduva Total
LDLR Duplicação do exon 4 para 8 (b) Patogênica 0 0 0 0 0 0 0 0 0 45b 41 86
LDLR Duplicação do promoter para o exon 6 Patogênica 0 0 0 0 0 1 4 29 49a 0 0 83
LDLR p.Asp224Asn Patogênica 0 39 4 0 34 0 0 0 0 0 0 77
LDLR p.Cys222* Patogênica 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 5
LDLR c.1359-1G >C Patogênica 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 5
LDLR p.Gly592Glu Patogênica 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 2
LDLR p.Ala771Val Patogênica 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1
LDLR p.Pro699Leu Patogênica 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1
LDLR p.Asp601His Provavelmente patogênica 2 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 4
LDLR p.Cys34Arg Provavelmente patogênica 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
LDLR p.Arg257Trp Provavelmente patogênica 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1
LDLR p.Ser854Gly Provavelmente patogênica 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2
LDLR c.-228G>C VSI 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1
LDLR p.Ala30Gly VSI 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
APOB p.Ala2790Thr VSI 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1
APOB p.Met499Val VSI 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
PCSK9 p.Arg237Trp VSI 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4
PCSK9 p.Arg357Cys VSI 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1
STAP1 p.Pro176Ser VSI 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
LDLR p.Cys222* Patogênica 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1c 1c
LDLR Duplicação do exon 4 para 8 Patogênica
PCSK9 p.Arg215Cys Provavelmente patogênica 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1c
APOB p.Asp2213Asn VSI
APOB p.Val3290Ile VSI
PCSK9 p.Arg215Cys Provavelmente patogênica 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1c
APOB p.Val3293lle VSI
PCSK9 p.Arg215Cys Provavelmente patogênica 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1c
APOB p.Asp2213Asn VSI

2 homozigotas (b) 4 homozigotas (c) heterozigota composta em trans. VSI: variante de significado incerto; HF: Hipercolesterolemia familiar.

Discussão

O presente estudo descreve os resultados da implementação de um sistema de rastreamento em cascata para HF em 11 pequenos municípios brasileiros.

Apesar dos benefícios de custo conhecidos do rastreamento em cascata para HF, a implementação mundial tem sido abaixo do ideal. Diversas barreiras locais e obstáculos à implementação devem ser identificados e superados. A implementação do rastreamento em cascata em pequenas localidades, por exemplo, tem sido maiormente desconsiderado. Esse desafio é maior em países de dimensões continentais, como o Brasil, onde, além das enormes distâncias geográficas, existem desigualdades no acesso aos serviços de saúde. Descrevemos a experiência do HipercolBrasil que realizou rastreamento em cascata abrangente em pequenos municípios brasileiros. Neste novo modelo, o rastreamento genético em cascata foi realizado em municípios que apresentavam evidências de maior prevalência de HF devido ao achado prévio de indivíduos com o fenótipo homozigoto no mesmo município, ou porque essas regiões relataram elevada frequência de infarto do miocárdio.

Os municípios que apresentaram evidências de efeito fundador foram os que apresentaram maior identificação de indivíduos afetados por cada CI analisado (em ordem decrescente Major Vieira, Papanduva, Lagoa do Mato e Passagem Franca). Nestas cidades, começamos com indivíduos homozigotos cujos pais não tinham parentesco e nasceram em regiões geográficas diferentes. Obviamente, sempre que essa situação for sinalizada por um programa de rastreamento em cascata, ela merece a implantação de uma abordagem que abranja todo o município, pois os custos-benefícios deste cenário são os mais vantajosos. A implementação da cascata genética em municípios de pequeno porte mostrou-se mais eficiente quando comparada à cascata genética realizada pelo HipercolBrasil11 considerando que as taxas de familiares por CI foram de 4,7 e 1,6, respectivamente (p < 0,0001).

É importante notar que a taxa de familiares testados por CI também foi maior em municípios com suspeita de efeito fundador. Isso provavelmente ocorreu porque esses municípios possuíam um número pequeno de habitantes e a maioria dos familiares tinha algum grau de relação familiar. Isso não ocorreu em Bom Despacho, que é um município consideravelmente maior que os demais (45.624 habitantes) e, embora o número de familiares coletados tenha sido semelhante ao de outras cidades, houve maior número de CIs coletados (28), diminuindo a taxa de parentes/CI para 2,4. Essa situação exemplifica o equilíbrio tênue entre o tamanho do município e o sucesso da abordagem descrita.

Os municípios visitados que eram geograficamente próximos a municípios com suspeita de efeito fundador (Bambuí, Buriti Bravo, Colinas, Pimenta e Luz) apresentaram baixa captação de CIs e, consequentemente, baixo número de familiares identificados. Isso sugere que a concentração de esforços no município selecionado, ao invés de estender a abordagem para cidades próximas, deve ser priorizada e a captura de casos potenciais próximos deve ser deixada para o mecanismo usual de rastreamento em cascata.

 Conclusão

Rastreamento em cascata em pequenos municípios (menos de 60.000 habitantes) com efeito fundador mostrou-se eficaz. Porém, alguns pontos podem ser de grande importância para que o rastreamento em cascata seja eficaz, podendo ser considerados os seguintes antes de decidir quais cidades rastrear: estabelecimento de uma parceria formal e interesse explícito por parte do departamento de saúde local em receber o programa e realizar o rastreamento em cascata; disponibilidade de conjuntos de dados laboratoriais de análises clínicas para a realização de levantamento retrospectivo dos testes de colesterol; e divulgação via rádios e redes sociais sobre a doença e o programa para maior adesão dos moradores.

O presente estudo é limitado pelo número relativo de municípios avaliados considerando o tamanho continental do Brasil. No entanto, sugere que a abordagem desenhada pode ser útil para detectar indivíduos com HF. Em conclusão, nossos dados sugerem que, uma vez detectadas, regiões geográficas específicas justificam uma abordagem direcionada para a identificação de aglomerações de indivíduos com HF.

 Referências 1. Goldberg AC, Hopkins PN, Toth PP, Ballantyne CM, Rader DJ, Robinson JG, et al. Familial Hypercholesterolemia: Screening, Diagnosis and Management of Pediatric and Adult Patients: Clinical Guidance from the National Lipid Association Expert Panel on Familial Hypercholesterolemia. J Clin Lipidol. 2011;5(3 Suppl):1-8. doi: 10.1016/j.jacl.2011.04.003. Goldberg AC Hopkins PN Toth PP Ballantyne CM Rader DJ Robinson JG et al Familial Hypercholesterolemia: Screening, Diagnosis and Management of Pediatric and Adult Patients: Clinical Guidance from the National Lipid Association Expert Panel on Familial Hypercholesterolemia J Clin Lipidol 2011 5 3 Suppl 1 8 10.1016/j.jacl.2011.04.003. 2. van der Graaf A, Kastelein JJP, Wiegman A. Heterozygous Familial Hypercholesterolaemia in Childhood: Cardiovascular Risk Prevention. J Inherit Metab Dis. 2009;32(6):699. doi: 10.1007/s10545-009-1165-1. van der Graaf A Kastelein JJP Wiegman A Heterozygous Familial Hypercholesterolaemia in Childhood: Cardiovascular Risk Prevention J Inherit Metab Dis 2009 32 6 699 10.1007/s10545-009-1165-1. 3. Hopkins PN, Toth PP, Ballantyne CM, Rader DJ; National Lipid Association Expert Panel on Familial Hypercholesterolemia. Familial Hypercholesterolemias: Prevalence, Genetics, Diagnosis and Screening Recommendations from the National Lipid Association Expert Panel on Familial Hypercholesterolemia. J Clin Lipidol. 2011;5(3 Suppl):9-17. doi: 10.1016/j.jacl.2011.03.452. Hopkins PN Toth PP Ballantyne CM Rader DJ National Lipid Association Expert Panel on Familial Hypercholesterolemia Familial Hypercholesterolemias: Prevalence, Genetics, Diagnosis and Screening Recommendations from the National Lipid Association Expert Panel on Familial Hypercholesterolemia J Clin Lipidol 2011 5 3 Suppl 9 17 10.1016/j.jacl.2011.03.452. 4. Harada PH, Miname MH, Benseñor IM, Santos RD, Lotufo PA. Familial Hypercholesterolemia Prevalence in an Admixed Racial Society: Sex and RACE MATter. The ELSA-Brasil. Atherosclerosis. 2018;277:273-7. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2018.08.021. Harada PH Miname MH Benseñor IM Santos RD Lotufo PA Familial Hypercholesterolemia Prevalence in an Admixed Racial Society: Sex and RACE MATter. The ELSA-Brasil Atherosclerosis 2018 277 273 277 10.1016/j.atherosclerosis.2018.08.021. 5. Nordestgaard BG, Chapman MJ, Humphries SE, Ginsberg HN, Masana L, Descamps OS, et al. Familial Hypercholesterolaemia is Underdiagnosed and Undertreated in the General Population: Guidance for Clinicians to Prevent Coronary Heart Disease: Consensus Statement of the European Atherosclerosis Society. Eur Heart J. 2013;34(45):3478-90. doi: 10.1093/eurheartj/eht273. Nordestgaard BG Chapman MJ Humphries SE Ginsberg HN Masana L Descamps OS et al Familial Hypercholesterolaemia is Underdiagnosed and Undertreated in the General Population: Guidance for Clinicians to Prevent Coronary Heart Disease: Consensus Statement of the European Atherosclerosis Society Eur Heart J 2013 34 45 3478 3490 10.1093/eurheartj/eht273. 6. Umans-Eckenhausen MA, Defesche JC, Sijbrands EJ, Scheerder RL, Kastelein JJ. Review of First 5 Years of Screening for Familial Hypercholesterolaemia in the Netherlands. Lancet. 2001;357(9251):165-8. doi: 10.1016/S0140-6736(00)03587-X. Umans-Eckenhausen MA Defesche JC Sijbrands EJ Scheerder RL Kastelein JJ Review of First 5 Years of Screening for Familial Hypercholesterolaemia in the Netherlands Lancet 2001 357 9251 165 168 10.1016/S0140-6736(00)03587-X. 7. Hadfield SG, Horara S, Starr BJ, Yazdgerdi S, Marks D, Bhatnagar D, et al. Family Tracing to Identify Patients with Familial Hypercholesterolaemia: The Second Audit of the Department of Health Familial Hypercholesterolaemia Cascade Testing Project. Ann Clin Biochem. 2009;46(Pt 1):24-32. doi: 10.1258/acb.2008.008094. Hadfield SG Horara S Starr BJ Yazdgerdi S Marks D Bhatnagar D et al Family Tracing to Identify Patients with Familial Hypercholesterolaemia: The Second Audit of the Department of Health Familial Hypercholesterolaemia Cascade Testing Project Ann Clin Biochem 2009 46 Pt 1 24 32 10.1258/acb.2008.008094. 8. Mozas P, Castillo S, Tejedor D, Reyes G, Alonso R, Franco M, et al. Molecular Characterization of Familial Hypercholesterolemia in Spain: Identification of 39 Novel and 77 Recurrent Mutations in LDLR. Hum Mutat. 2004;24(2):187. doi: 10.1002/humu.9264. Mozas P Castillo S Tejedor D Reyes G Alonso R Franco M et al Molecular Characterization of Familial Hypercholesterolemia in Spain: Identification of 39 Novel and 77 Recurrent Mutations in LDLR Hum Mutat 2004 24 2 187 10.1002/humu.9264. 9. Sperlongano S, Gragnano F, Natale F, D’Erasmo L, Concilio C, Cesaro A, et al. Lomitapide in Homozygous Familial Hypercholesterolemia: Cardiology Perspective From a Single-Center Experience. J Cardiovasc Med. 2018;19(3):83-90. doi: 10.2459/JCM.0000000000000620. Sperlongano S Gragnano F Natale F D’Erasmo L Concilio C Cesaro A et al Lomitapide in Homozygous Familial Hypercholesterolemia: Cardiology Perspective From a Single-Center Experience J Cardiovasc Med 2018 19 3 83 90 10.2459/JCM.0000000000000620. 10. Lázaro P, Isla LP, Watts GF, Alonso R, Norman R, Muñiz O, et al. Cost-Effectiveness of a Cascade Screening Program for the Early Detection of Familial Hypercholesterolemia. J Clin Lipidol. 2017;11(1):260-71. doi: 10.1016/j.jacl.2017.01.002. Lázaro P Isla LP Watts GF Alonso R Norman R Muñiz O et al Cost-Effectiveness of a Cascade Screening Program for the Early Detection of Familial Hypercholesterolemia J Clin Lipidol 2017 11 1 260 271 10.1016/j.jacl.2017.01.002. 11. Jannes CE, Santos RD, Silva PRS, Turolla L, Gagliardi ACM, Marsiglia JDC, et al. Familial Hypercholesterolemia in Brazil: Cascade Screening Program, Clinical and Genetic Aspects. Atherosclerosis. 2015;238(1):101-7. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2014.11.009 Jannes CE Santos RD Silva PRS Turolla L Gagliardi ACM Marsiglia JDC et al Familial Hypercholesterolemia in Brazil: Cascade Screening Program, Clinical and Genetic Aspects Atherosclerosis 2015 238 1 101 107 10.1016/j.atherosclerosis.2014.11.009 12. Santos RD, Bourbon M, Alonso R, Cuevas A, Vasques-Cardenas NA, Pereira AC, et al. Clinical and Molecular Aspects of Familial Hypercholesterolemia in Ibero-American Countries. J Clin Lipidol. 2017;11(1):160-6. doi: 10.1016/j.jacl.2016.11.004. Santos RD Bourbon M Alonso R Cuevas A Vasques-Cardenas NA Pereira AC et al Clinical and Molecular Aspects of Familial Hypercholesterolemia in Ibero-American Countries J Clin Lipidol 2017 11 1 160 166 10.1016/j.jacl.2016.11.004. 13. Silvino JPP, Jannes CE, Tada MT, Lima IR, Silva IFO, Pereira AC, et al. Cascade Screening and Genetic Diagnosis of Familial Hypercholesterolemia in Clusters of the Southeastern Region from Brazil. Mol Biol Rep. 2020;47(12):9279-88. doi: 10.1007/s11033-020-06014-0. Silvino JPP Jannes CE Tada MT Lima IR Silva IFO Pereira AC et al Cascade Screening and Genetic Diagnosis of Familial Hypercholesterolemia in Clusters of the Southeastern Region from Brazil Mol Biol Rep 2020 47 12 9279 9288 10.1007/s11033-020-06014-0. 14. Richards S, Aziz N, Bale S, Bick D, Das S, Gastier-Foster J, et al. Standards and Guidelines for the Interpretation of Sequence Variants: A Joint Consensus Recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17(5):405-24. doi: 10.1038/gim.2015.30. Richards S Aziz N Bale S Bick D Das S Gastier-Foster J et al Standards and Guidelines for the Interpretation of Sequence Variants: A Joint Consensus Recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology Genet Med 2015 17 5 405 424 10.1038/gim.2015.30.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado por Amgen Biotechnology (grant number 682/2016)

 Original Article Screening for Familial Hypercholesterolemia in Small Towns: Experience from 11 Brazilian Towns in the Hipercolbrasil Program 0000-0002-8791-642X Jannes Cinthia Elim 1 Silvino Júnea Paolucci Paiva 2 0000-0002-3602-603X Silva Pãmela Rodrigues de Souza 3 Lima Isabella Ramos 1 Tada Mauricio Teruo 1 Oliveira Theo Gremen Mimary 4 Santos Raul D. 5 Krieger José Eduardo 1 Pereira Alexandre da Costa 1 Brasil Universidade de São Paulo Instituto do Coração - Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular, São Paulo, SP – Brasil Brazil Universidade Federal de Minas Gerais - Faculdade de Medicina, Belo Horizonte, MG – Brazil Brazil Universidade Federal de Mato Grosso - Faculdade de Farmácia, Cuiabá, MS – Brazil Brazil Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina - Instituto do Coração, São Paulo, SP –– Brazil Brazil Hospital Israelita Albert Einstein Ringgold, São Paulo, SP – Brazil Mailing Address: Cinthia Elim Jannes • Universidade de São Paulo Instituto do Coração - Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular – Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 44. Postal Code 05403-000, São Paulo, SP – Brazil E-mail: cejannes@hotmail.com

Author Contributions

Conception and design of the research: Jannes CE, Pereira AC; Acquisition of data: Jannes CE, Silvino JPP, Lima IR, Tada MT; Analysis and interpretation of the data: Jannes CE, Silvino JPP, Pereira AC; Statistical analysis: Silva PRS, Pereira AC; Obtaining financing: Jannes CE, Krieger JE, Pereira AC; Writing of the manuscript: Jannes CE, Oliveira TGM, Santos RD, Pereira AC; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Silvino JPP, Santos RD, Krieger JE, Pereira AC.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background

Familial hypercholesterolemia (FH) is a genetic disease characterized by elevated serum levels of low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and it is associated with the occurrence of early cardiovascular disease. In Brazil, HipercolBrasil, which is currently the largest FH cascade screening program, has already identified more than 2000 individuals with causal genetic variants for FH. The standard approach is based on cascade screening of referred index cases, individuals with hypercholesterolemia and clinical suspicion of FH.

 Objectives

To perform targeted screening of 11 small Brazilian cities with a suspected high prevalence of people with FH.

 Methods

The selection of cities occurred in 3 ways: 1) cities in which a founder effect was suspected (4 cities); 2) cities in a region with high rates of early myocardial infarction as described by the National Health System database (2 cities); and 3) cities that are geographically close to other cities with a high prevalence of individuals with FH (5 cities). Statistical significance was considered as p value < 0.05.

 Results

One hundred and five index cases and 409 first-degree relatives were enrolled. The yield of such approach of 4.67 relatives per index case was significantly better (p < 0.0001) than the general HipercolBrasil rate (1.59). We identified 36 IC with a pathogenic or likely pathogenic variant for FH and 240 affected first-degree relatives.

 Conclusion

Our data suggest that, once detected, specific geographical regions warrant a target approach for identification of clusters of individuals with FH.

 Familial hypercholesterolemia Genetic Testing Cardiovascular Disease Introduction

Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disease that is clinically characterized by elevated blood levels of low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and it is associated with the occurrence of early atherosclerotic cardiovascular disease (ASCVD).1,2

The prevalence of FH in the world is estimated to be approximately 1:250 in the heterozygous form and 1:600,000 in the homozygous form..A study conducted by the ELSA-Brasil cohort estimated that the prevalence of individuals with clinical criteria for FH in Brazil is 1:263. Considering these estimates, there would be approximately 760,000 people with FH in Brazil.4

However, although relatively frequent, the heterozygous form is still an underdiagnosed disease.5 To assist in the identification of individuals with this disease, cascade genetic screening has been used in several countries, such as the Netherlands,6 the United Kingdom,7 and Spain.8 This method has already been recognized as cost-effective for identification as well as prevention of early ASCVD in individuals with FH.9,10

In Brazil, HipercolBrasil, which is currently the largest cascade screening program, has existed since 2012,11 and it has already identified more than 2000 individuals with causal genetic variants for FH. The program currently performs genetic testing on any individual with LDL-C ≥ 230mg/dL (index-case [IC])12 and in first-degree relatives of those with pathogenic or likely pathogenic variants.

Between July 2017 and July 2019 we tested a new methodology for identifying new individuals with genetic alterations for FH based on the targeting of small municipalities with potentially high FH prevalence.

Here we describe the first results of targeted screening in 11 small Brazilian cities (up to 60,000 inhabitants) with a suspected high prevalence of people with FH.

 Methods

The study was conducted at the Genetics and Molecular Cardiology Laboratory of the Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School, São Paulo, Brazil. The protocol received approval from the Institutional Ethics Committee (CAPPesq protocol l00594212.0.1001.0068).

Study sample

Figure 1 shows inclusion criteria and study design. We enrolled individuals from 11 selected cities with up to 60,000 inhabitants throughout the Brazilian territory. The selection of cities occurred in 3 ways: 1) cities in which a founder effect was suspected, i.e. occurrence of homozygous individuals, but with no history of any degree of relation between parents (Major Vieira, Papanduva, Lagoa do Mato, and Passagem Franca); 2) cities in a region with high rates of dyslipidemia as reported by local physicians (Bom Despacho and Moema);13 and 3) cities that are geographically close to other cities with a high prevalence of individuals with FH (Bambuí, Pimenta, Luz, Colinas, and Buriti Bravo).

– Methodology for selecting cities, capturing ICs and relatives and training health care professionals to continue cascade genetic screening.

Enrolment of index cases and relatives

In all cities, initial contact was made with the local secretary of health to explain the project and establish an agreement on the partnership. Contact was made via telephone before visiting each city, and an agreement was established by both parties via e-mail. Once in the city, the team was assisted by a health agent appointed by the health secretary. In the cities where there was evidence of a founder effect and in the ones where there were reports of high incidence of dyslipidemia, the sample collection started from family members of previously selected ICs. In these cities, there was also an active search for new ICs from medical records and cholesterol tests carried out in the clinical analysis laboratories of the local healthcare units. Individuals were considered as ICs when they had total cholesterol > 300 mg/dL and/or LDL-C ≥ 210 mg/dL with triglycerides < 300 mg/dL. In these cases, a blood sample was collected to perform a second cholesterol measurement in our laboratory. Those with a confirmed LDL-C ≥ 210 mg/dl in the second measurement were selected for genetic sequencing, while individuals who did not reach this value received a report with the values of total cholesterol and fractions and were excluded from the study.

 Genetic sequencing and cascade screening

Blood samples were collected (10 ml of peripheral blood in EDTA tubes) and sent to the Genetics and Molecular Cardiology Laboratory at InCor/HCFMUSP for genetic analysis. Genomic DNA was extracted using QIAamp DNA MiniKit (QIAGEN), following the manufacturer’s instructions. IC were sequenced by next generation sequencing in a gene panel comprising the following dyslipidemia-related genes: LDLR, APOB, PCSK9, LDLRAP1, STAP1, LIPA, APOE, ABCG5, and ABCG8. Bioinformatics analyses were performed in Varstation and CLC Genomic Workbench 9.0 (QIAGEN). Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) in LDLR was used to screen for copy-number variants in ICs without any missense, nonsense or frameshift variants identified in next generation sequencing. The screening of relatives was performed with Sanger sequencing (for point mutations or small indels) or MLPA (for copy-number variants). Variants were classified following the recommendations of the American College of Medical Genetics and Genomics.14

 Data analysis

The visual analysis of variable distribution was performed using histograms, and the normality of the data was verified. For continuous variables with normal distribution, the mean and standard deviation were calculated. Categorical variables are shown as frequencies. The differences between frequencies were compared using the chi-square test. The differences between means were compared with unpaired Student’s t test or one-way ANOVA, if necessary. The tested variables were normally distributed, and we opted for a parametric test. Statistical significance was considered as p value < 0.05. Statistical analyses were performed with SPSS v19.0 (IBM).

 Results

Initially, we collected 230 ICs with at least one cholesterol measure that met the proposed criteria (see Methods). However, 125 of them presented LDL-C values below the threshold after the second measurement and were not further sequenced. In total, 105 ICs and 490 relatives were included in the analysis. Table 1 shows characteristics of the 11 visited cities, Brazilian state, number of inhabitants, and date of each visit. The city with the lowest number of total inhabitants was Moema with 7,028, and the largest was Bom Despacho with 45,624 inhabitants, both in the state of Minas Gerais. The first cities to be visited were Major Vieira and Papanduva (September 2017) and the last were Buriti Bravo and Colinas (February 2019).

– Overall characteristics of sampled municipalities
City Brazilian state Total inhabitants (IBGE Census) Visit date N of expected cases (1:263)4 N of positive cases identified
Bambuí Minas Gerais 22,709 Dec 2018 86 2
Bom Despacho Minas Gerais 45,624 Aug 2018 173 45
Buriti Bravo Maranhão 23,827 Feb 2019 91 0
Colinas Maranhão 42,196 Feb 2019 160 4
Lagoa do Mato Maranhão 10,955 Apr 2018 42 32
Luz Minas Gerais 17,492 Dec 2018 67 6
Major Vieira Santa Catarina 8,103 Sep 2017 31 47
Moema Minas Gerais 7,028 Aug 2018 27 36
Papanduva Santa Catarina 18,013 Sep 2017 68 48
Passagem Franca Maranhão 17,296 Apr 2018 66 50
Pimenta Minas Gerais 8,236 Dec 2018 31 6

IBGE: Brazilian Institute of Geography and Statistics.

Table 2 shows the number of sequenced ICs and relatives per region and their genotype regarding the presence of pathogenic or likely pathogenic variants (positive), no pathogenic variants (negative) or presence of a variant of uncertain significance (VUS), as well as the number of new cases derived from each enrolled IC.

– ICs and relatives collected per region and their genotypes for the presence of FH genetic variants
Origin ICs Relatives Number of relatives per identified ICs Number of genotyped individuals per city
Negative Positive VUS Negative Positive VUS
Bambuí 0 1 0 0 1 0 1 2
Bom Despacho 15 11 2 34 31 3 2.4 96
Buriti Bravo 4 0 0 0 0 0 0 4
Colinas 6 1 1 1 3 0 0.5 12
Lagoa do Mato 3 2 0 25 30 0 11 60
Luz 21 4 1 0 2 0 0.08 28
Major Vieira 1 3 0 48 44 0 23 96
Moema 1 4 0 36 32 0 13.6 73
Papanduva 4 2 1 50 46 0 13.7 103
Passagem Franca 3 5 0 55 45 0 12.5 108
Pimenta 6 2 1 0 4 0 0.4 13
Total 64 35 6 249 238 3 4.7 595

IC: index case; VUS: variant of uncertain significance; FH: Familial hypercholesterolemia.

Table 3 shows the three IC groups (negative, positive, or VUS) and their clinical and biochemical data. In total, 105 ICs were sequenced, and pathogenic or likely pathogenic variants were found in 36 (37.8%) individuals, and VUS in 5 (5.25%). Most ICs were female (67.6%), and when the clinical and biochemical characteristics were evaluated among the three groups, there was, as expected, a statistically significant difference regarding baseline (untreated) total cholesterol and LDL-C, with the positive group presenting the highest values of total cholesterol and LDL-C, 382 ± 150 mg/dL and 287 ± 148 mg/dL, respectively. Table 4 shows the clinical and biochemical characteristics of relatives.

– Clinical and biochemical characteristics of negative, positive, and VUS-altered ICs
Negative IC (64) Positive IC (36) IC VUS (5) p value
Females % 45 (70.3) 64 21 (58.3) 36 5 (100) 5 0.134
Males % 19 (29.7) 64 15 (41.7) 36 - 5
Age (years) 54±15 64 44±19 36 56±16 5 0.015
Use of lipid lowering drugs 32 (50.0) 64 24 (66.7) 36 3 (60.0) 5 0.261
Early CAD 2 (3.1) 64 4 (11.1) 36 - 5 0.297
Xanthomas 3 (4.7) 64 3 (8.3) 36 1 (20.0) 5 0.365
Xanthelasmas 4 (6.3) 64 1 (2.8) 36 - 5 0.696
Corneal arcus 2 (3.1) 64 3 (8.3) 36 - 5 0.345
Current TC 279±65 62 316±107 36 302±28 5 0.102
Current LDL-C 195±56 64 234±104 36 207±35 5 0.051
Baseline TC 322±33 60 382±150 32 305±43 5 0.008
Baseline LDL-C 233±24 59 287±148 34 229±20 4 0.022

CAD: coronary artery disease; IC: index case; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol; TC: total cholesterol; VUS: variant of uncertain significance. Early CAD defined as atherosclerotic cardiovascular disease event < 55 and 60 years of age in males and females, respectively; lipids in mg/dL; baseline lipids = untreated.

– Clinical and biochemical characteristics of negative and positive relatives
Negative relatives N (249) Positive relatives N (240) p value
Females % 136 (54.6) 249 135 (56.3) 240 0.504
Males % 113 (45.4) 249 105 (43.8) 240
Age (years) 40±21 249 38±21 240 0.710
In use of lipid lowering drugs 31 (12.4) 249 93 (38.8) 240 0.001
Early CAD 2 (0.8) 249 9 (3.8) 240 0.034
Xanthomas 6 (2.4) 249 17 (7.1) 240 0.013
Xanthelasmas 11 (4.4) 249 34 (14.2) 240 0.001
Corneal arcus 1 (0.4) 249 9 (3.8) 240 0.009
Current TC 198±51 114 309±86 127 0.001
Current LDL-C 124±42 192 233±75 198 0.001
Baseline TC 220±191 97 318±97 130 0.001
Baseline LDL-C 126±41 169 243±82 178 0.001

CAD: coronary artery disease; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol; TC: total cholesterol. Early CAD defined as atherosclerotic cardiovascular disease event < 55 and 60 years of age in males and females, respectively; lipids in mg/dL; baseline lipids = untreated.

Figure 2 shows the geographic distribution of the 11 cities located in 3 Brazilian states, the number of registered cases, the number of individuals genotyped, and the number of individuals with a pathogenic variant.

– Geographical distribution of cases, number of genotyped individuals, and number of individuals with an identified pathogenic variant (positive).

Brazilian states, from top to bottom: Maranhão, Minas Gerais, and Santa Catarina

Table 5 shows all the encountered variants and the location where they were identified. In total, 21 different variants were identified with 3 variants appearing more frequently. Observed frequencies for these 3 variants suggest that they have founder effects in these localities. Six homozygous patients and one compound heterozygous in trans were found.

– FH pathogenic variants, likely pathogenic variants and VUS found per city
Gene Variant Variant Classification Bambuí Bom Despacho Luz Pimenta Moema Buriti Bravo Colinas Lagoa do Mato Passagem Franca Major Vieira Papanduva Total
LDLR Duplication from exon 4 to 8 (b) Pathogenic 0 0 0 0 0 0 0 0 0 45b 41 86
LDLR Duplication from promoter to exon 6 Pathogenic 0 0 0 0 0 1 4 29 49a 0 0 83
LDLR p.Asp224Asn Pathogenic 0 39 4 0 34 0 0 0 0 0 0 77
LDLR p.Cys222* Pathogenic 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 5
LDLR c.1359-1G >C Pathogenic 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 5
LDLR p.Gly592Glu Pathogenic 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 2
LDLR p.Ala771Val Pathogenic 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1
LDLR p.Pro699Leu Pathogenic 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1
LDLR p.Asp601His Likely Pathogenic 2 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 4
LDLR p.Cys34Arg Likely Pathogenic 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
LDLR p.Arg257Trp Likely Pathogenic 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1
LDLR p.Ser854Gly Likely Pathogenic 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2
LDLR c.-228G>C VUS 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1
LDLR p.Ala30Gly VUS 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
APOB p.Ala2790Thr VUS 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1
APOB p.Met499Val VUS 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
PCSK9 p.Arg237Trp VUS 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4
PCSK9 p.Arg357Cys VUS 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1
STAP1 p.Pro176Ser VUS 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
LDLR p.Cys222* Pathogenic 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1c 1c
LDLR Duplication from exon 4 to 8 Pathogenic
PCSK9 p.Arg215Cys Likely Pathogenic 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1c
APOB p.Asp2213Asn VUS
APOB p.Val3290Ile VUS
PCSK9 p.Arg215Cys Likely Pathogenic 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1c
APOB p.Val3293lle VUS
PCSK9 p.Arg215Cys Likely Pathogenic 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1c
APOB p.Asp2213Asn VUS

2 homozygotes (b) 4 homozygotes (c) compound heterozygous in trans. VUS: variant of uncertain significance ; FH: Familial hypercholesterolemia.

Discussion

This study describes the results of the implementation of a cascade screening system for FH in 11 small Brazilian cities.

Despite the known cost benefits of cascade screening for FH, worldwide implementation has been suboptimal. Different local barriers and implementation hurdles have to be identified and overcome. How to implement cascade screening in small localities, for example, has been mainly overlooked. This challenge is greater in a continent-sized country like Brazil, where, in addition to the enormous geographic distances, there is inequality in access to health services. We have described the experience of HipercolBrasil in conducting comprehensive cascade screening in small towns in Brazil. In this new model, cascade genetic screening was carried out in cities that showed evidence of a higher prevalence of FH due to previous finding of individuals with the homozygous phenotype from the same city, or because those regions had reported elevated frequency of myocardial infarction.

Cities that had evidence of a founder effect were the ones that presented a higher identification of individuals affected per each IC analyzed (in descending order Major Vieira, Papanduva, Lagoa do Mato, and Passagem Franca). In these cities, we started from homozygous individuals whose parents were non-related and were born in different geographic regions. Clearly, whenever this situation is flagged by a cascade screening program, it deserves the deployment of a city-wide approach, because the costs-benefits of this scenario are the most advantageous. Implementing the genetic cascade in small towns proved to be more efficient when compared to the genetic cascade performed by Hipercol Brasil11 considering that the rates of family members per IC were 4.7 and 1.6, respectively (p < 0.0001).

It is important that the rate of tested family members per IC was also higher in cities with suspected founder effects. This probably occurred because these cities had a small number of inhabitants, and most relatives had some degree of familial relation. This did not occur in Bom Despacho, a city considerably larger than the others (45,624 inhabitants), and, although the number of family members collected was similar to that of other cities, there was a higher number of ICs collected (28) decreasing the rate of relatives/IC to 2,4. This situation exemplifies the tenuous equilibrium between city size and the success of the described approach.

Visited cities that were geographically close to cities with suspected founder effects (Bambuí, Buriti Bravo, Colinas, Pimenta, and Luz) had a low uptake of ICs and, consequently, a low number of identified relatives. This suggests that concentrating efforts in the selected municipality, as opposed to extending the approach to nearby towns, should be prioritized, and the capture of nearby potential cases should be left to the usual cascade screening mechanism.

 Conclusion

Cascade screening in small cities (fewer than 60,000 inhabitants) with a founder effect proved to be effective. However, some points might be of great importance in order for the cascade screening to be effective, and the following might be considered before deciding which cities to track: establishment of a formal partnership and explicit interest on the part of the local health department in receiving the program and performing the cascade screening; availability of clinical analysis laboratory datasets to carry out a retrospective survey of cholesterol tests; and dissemination via radio stations and social media regarding the disease and the program for greater adherence by the inhabitants.

This study is limited by the relative number of cities evaluated considering the continental size of Brazil. However, it suggests that the designed approach may be useful for detecting individuals with FH. In conclusion, our data suggest that, once detected, specific geographical regions warrant a targeted approach for the identification of clusters of FH individuals.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Sources of Funding: This study was partially funded by Amgen Biotechnology (grant number 682/2016).