Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC tytqVDKsYLxks4d7bS9wxCp S0066-782X2022000200435 abc.20201155 10.36660/abc.20201155 Artigo Original Pterostilbeno Reduz o Estresse Oxidativo no Pulmão e no Ventrículo Direito Induzido por Infarto do Miocárdio Experimental 0000-0002-7184-1072 Tasca Silvio 1 0000-0001-6054-4243 Campos Cristina 1 Lacerda Denise 1 Ortiz Vanessa D. 1 Turck Patrick 1 Bianchi Sara E. 2 Castro Alexandre L. de 1 Belló-Klein Adriane 1 Bassani Valquiria 2 Araújo Alex Sander da Rosa 1 Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia Instituto de Ciências Básicas da Saúde Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre RS Brasil Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS),Porto Alegre, RS - Brasil Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre RS Brasil Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS),Porto Alegre, RS - Brasil Correspondência: Alex Sander da Rosa Araújo • Universidade Federal do Rio Grande do Sul - Sarmento Leite, 500. CEP 90040-060, Porto Alegre, RS – Brasil. E-mail: alex.rosa@ufrgs.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Tasca S, Lacerda D, Castro AL, Araújo ASR; Obtenção de dados: Tasca S, Campos C, Bianchi SE; Análise e interpretação dos dados: Tasca S, Campos C, Lacerda D, Turck P; Análise estatística: Tasca S, Ortiz VD, Turck P; Obtenção de financiamento: Belló-Klein A, Bassani V, Araújo ASR; Redação do manuscrito: Tasca S; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Castro AL, Belló-Klein A, Bassani V, Araújo ASR.

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo

 07 03 2022 02 2022 118 2 435 445 28 10 2020 21 02 2021 24 03 2021 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

O pterostilbeno (PS), um composto polifenólico natural e antioxidante, surge como uma intervenção promissora para minimizar danos do infarto agudo do miocárdio (IAM).

 Objetivo

Este estudo teve como objetivo avaliar o desempenho do PS na promoção da homeostase redox nos pulmões e no ventrículo direito (VD) de animais infartados.

 Métodos

Ratos Wistar machos (60 dias de idade) foram randomizados em três grupos: SHAM, IAM (infarto) e IAM+PS (IAM + pterostilbeno). Sete dias após o procedimento de IAM, os ratos foram tratados com PS (100 mg/kg/dia) por gavagem por oito dias. Os animais foram depois sacrificados e os pulmões e VD foram coletados para análise do balanço redox (diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05).

 Resultados

Nossos resultados mostram que o IAM desencadeia a interrupção redox no VD e nos pulmões, o que pode contribuir para danos induzido pelo IAM nesses órgãos. Consistentemente, o PS mitigou o estresse oxidativo e restaurou as defesas antioxidantes (Glutationa – GSH nos pulmões: SHAM = 0,79 ± 0,07; IAM = 0,67 ± 0,05; IAM + PS = 0,86 ± 0,14; p<0,05), indicando seu papel protetor neste cenário.

 Conclusão

Nosso trabalho evidencia o potencial do uso de PS como abordagem terapêutica adjuvante após IAM para proteção dos tecidos pulmonares e cardíacos direitos.

 Antioxidantes Estresse Oxidativo Óxido Nítrico Sintase Homeostase Hormese Pterostilbeno NADPH Oxidases Infarto do Miocárdio Ratos Introdução

O infarto agudo do miocárdio (IAM), evento agudo que ocorre quando o fluxo sanguíneo coronariano é interrompido, culmina em alterações hemodinâmicas, neuro-humorais e metabólicas que podem impactar negativamente a função pulmonar.1 , 2 A remodelação cardíaca adversa pós-IAM induz modificação da geometria ventricular e deslocamento dos folhetos da válvula mitral, o que prejudica seu processo de fechamento e causa modificações prejudiciais que afetam ambos os ventrículos. Na verdade, o IAM ventricular esquerdo com regurgitação mitral pode levar a alterações hemodinâmicas nos vasos pulmonares, refletindo em última instância no aumento da pressão arterial pulmonar. Todos esses distúrbios podem desencadear hipertensão pulmonar secundária à cardiopatia esquerda.3 Nesse cenário, o aumento da resistência vascular pulmonar (RVP) compromete a câmara cardíaca direita em decorrência da pós-carga elevada do ventrículo direito (VD), levando ao aumento da espessura da parede e diminuição da contratilidade. Essas alterações culminam em resposta adaptative ruim, caracterizada por dilatação, disfunção e falência do ventrículo direito.4 , 5

Importantes mediadores associados ao dano cardiopulmonar induzido pelo infarto são as espécies reativas de oxigênio (ROS), cujas principais fontes são as NADPH oxidases, a xantina oxidase e as mitocôndrias.6 - 8 Nesse sentido, o sistema enzimático antioxidante — constituído principalmente por superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx) — é o mecanismo central de defesa contra o dano celular induzido por ROS.9 Além do sistema enzimático antioxidante, os tecidos também podem recrutar antioxidantes não enzimáticos, como a glutationa reduzida.10 , 11 No entanto, foi relatado que a resposta antioxidante do VD é reduzida após o IAM.12 Nessa situação, a resposta contrarregulatória contra a ruptura da homeostase redox pode ser coordenada pelo fator de transcrição antioxidante, conhecido como fator nuclear eritroide 2 relacionado ao fator 2 (Nrf2).13 De fato, o Nrf2 regula a expressão de várias proteínas redox por meio da indução de elementos de resposta antioxidante (ERA), principalmente em condições de estresse oxidativo,14 e pode ser ativado por antioxidantes naturais, como o pterostilbeno (PS).15

O PS é um composto encontrado em uma grande variedade de frutas vermelhas, como mirtilos ( Vaccinium spp. ) E uvas ( Vitis spp. ). Quimicamente, corresponde ao resveratrol dimetilado (trans-3,5-dimetoxi-4’-hidroxiestilbeno), diferenciando-se dele por sua maior lipofilicidade.15 O mecanismo de ação dos estilbenos tem sido relacionado à redução dos níveis de ROS, como peróxido de hidrogênio e ânions superóxidos, bem como ao aumento da disponibilidade intracelular de antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos.16 Nosso grupo relatou melhora nos parâmetros morfológicos do ventrículo esquerdo (VE) e nos marcadores de estresse oxidativo em ratos infartados tratados com PS (100 mg/kg/dia).15 No entanto, não existem estudos que avaliem se o composto pode causar uma atenuação dos danos induzidos pelo infarto nos pulmões e VD. Diante do exposto, o objetivo deste estudo foi avaliar o impacto do IAM sobre o estresse oxidativo no tecido pulmonar e no VD, e verificar se a administração de PS poderia melhorar a homeostase redox nesses órgãos.

 Métodos Química

O PS foi adquirido da Changsha Organic Herb (Changsha, China). A hidroxipropil--ciclodextrina (HPCD) foi fornecida pela Roquette Frères (Lestrem, França). A preparação e complexação do PS com HPCD para aumentar sua solubilidade em água foi conduzida como descrito previamente.15

 Ética

Ratos Wistar machos (60 dias de idade) foram obtidos no Centro de Reprodução e Experimentação de Animais de Laboratório da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Os animais foram alocados em caixas de polipropileno (340 x 200 x 410 mm) com três/quatro animais por gaiola. Foram mantidos em condições padrão: temperatura de 20-25° C, ciclos claro-escuro de 12 horas e umidade relativa de 70%. Água e rações comerciais foram oferecidas ad libitum . O protocolo experimental foi realizado de acordo com as Diretrizes Internacionais para Uso e Cuidado de Animais de Laboratório e do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal. O protocolo só foi iniciado após aprovação pelo Comitê de Ética para Experimentação Animal da Universidade (#35451).

 Desenho experimental

Primeiramente, os animais foram divididos aleatoriamente em gaiolas e todas as avaliações foram realizadas às cegas.15 A cirurgia de infarto do miocárdio e a administração de PS foram realizadas de acordo com estudos anteriores do nosso grupo.17 A taxa de mortalidade durante o procedimento cirúrgico de infarto foi de 10%. Após a cirurgia, 17 ratos foram alocados nos seguintes grupos: SHAM (n = 6), grupo infartado (IAM) (n = 5) e grupo infartado tratado com PS (IAM + PS) (n = 6). A avaliação do tamanho da área de infarto do miocárdio foi realizada por meio de ecocardiografia (Philips HD7 XE Ultrasound System com transdutor L2-13 MHz), no dia 7 do protocolo experimental. Após essa avaliação, o PS foi administrado (100mg / kg / dia, por gavagem) para o grupo IAM + PS, e uma solução veículo (solução aquosa por gavagem) foi dada aos grupos SHAM e IAM por 8 dias. Após o período de tratamento, os animais foram sacrificados; os pulmões e os VDs foram coletados para análises morfométricas e bioquímicas.

 Avaliação ecocardiográfica

As análises ecocardiográficas (14 dias após o infarto) foram realizadas usando o sistema EnVisor Philips (Andover, MA, EUA) com um transdutor de alta frequência e alta resolução (12-3 MHz) por um operador treinado e com experiência em ecocardiografia de ratos, sem conhecimento do tratamento.18 Os animais foram anestesiados (cetamina 90 mg/kg; xilazina 20 mg/kg, i.p.) e colocados em decúbito lateral para obtenção das imagens. As imagens do ventrículo esquerdo (VE) foram avaliadas em três planos: basal, médio e apical. Os valores de encurtamento fracionário (EF) do VE foram obtidos pela seguinte equação: LVFS = DD – DS / DD × 100 (diâmetro diastólico – DD; diâmetro sistólico – DS). Os volumes sistólico e diastólico final do VE (VSF e VDF) foram medidos conforme descrito anteriormente.18 O débito sistólico (SO) foi calculado como SO = VDF – VSF.19 Em cada plano transversal ecocardiográfico (basal, médio e apical), o arco correspondente aos segmentos com infarto (regiões ou segmentos do miocárdio apresentando uma das seguintes alterações na cinética miocárdica: movimento sistólico acinesia e/ou região de hipocinesia – RHC) foi medido quanto ao perímetro infartado.18 , 19 A avaliação do perímetro infartado foi então usada para estimar o tamanho do infarto do miocárdio (R.B. Teixeira et al. Life Sciences 196 (2018) 93–101).

 Análise morfométrica dos ventrículos esquerdo e direito e pulmões

A eutanásia foi realizada por sobrecarga anestésica (cetamina 90 mg/kg e xilazina 10 mg/kg, por via intraperitonial) e confirmada por luxação cervical. Após a eutanásia, os pulmões, o VE e o VD foram utilizados para medidas morfométricas e bioquímicas. O pulmão esquerdo foi utilizado para determinar a razão pulmão/peso corporal, a fim de avaliar a congestão pulmonar. Para a realização dos índices de hipertrofia dos ventrículos direito e esquerdo, foram calculadas as razões ventrículo/peso corporal e ventrículo/comprimento da tíbia.20

 Preparação de homogenatos de pulmão e ventrículo direito

O pulmão direito foi preparado para as seguintes análises de estresse oxidativo: ROS total, peroxidação lipídica, glutationa total, glutationa reduzida, concentração de tiol, atividades de enzimas antioxidantes e expressão da proteína Nrf2. O VD foi homogeneizado para avaliar as atividades de NADPH oxidase e óxido nítrico-sintase, níveis de sulfidrila e imunoconteúdo de xantina oxidase. A homogeneização do pulmão e do VD foi realizada por 40 segundos com Ultra-Turrax (OMNI Tissue Homogenizer, OMNI International, EUA) na presença de KCl 1,15% (5 mL/g tecido) e fluoreto de fenilmetilsulfonil 100 mmol/L (PMSF). As amostras foram centrifugadas (20 minutos a 10.000 x g a 4° C), e o sobrenadante foi coletado e armazenado a 80° C até a análise.21 As análises bioquímicas foram realizadas por um pesquisador que desconhecia o tratamento.

 Avaliação de estresse oxidativo

No tecido pulmonar, a concentração total de ROS foi determinada pelo método de fluorescência por meio da reação com diacetato de dicloro fluoresceína (DCFH-DA) (Sigma-Aldrich, EUA). Os dados foram expressos em pmol/mg de proteína.22 A peroxidação lipídica foi medida pela reação dos produtos da oxidação com as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e os resultados apresentados em nmol/mg de proteína.23 Os níveis de glutationa total (GSH total) e dissulfeto de glutationa (GSSG) foram determinados pela redução de 5,5-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) pela nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) catalisada pela glutationa redutase. Os dados são expressos como µmol/min/mg de tecido.24

 Atividade NADPH Oxidase

A atividade da enzima NADPH oxidase foi determinada pela avaliação do consumo de NADPH a 340 nm. Os resultados foram expressos em nanomoles de NADPH por minuto por miligrama de proteína (nmol/min/mg de proteína).25

 Determinação de antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos

A atividade da SOD foi determinada por meio da inibição da auto-oxidação do pirogalol, e os resultados foram expressos em unidades de SOD/mg de proteína.26 A avaliação da atividade da CAT foi baseada no consumo de peróxido de hidrogênio, monitorando-se o decaimento da absorbância em 240 nm. Os resultados foram expressos em pmol/min/mg de proteína.27 A atividade da GPx foi estimada a partir da oxidação do NADPH, que foi acoplada à reação de reciclagem de GSSG para GSH, avaliada em 340 nm. Os resultados foram expressos em nmol/mg de proteína.28 A quantidade total de grupos sulfidrila no tecido pulmonar foi determinada pela reação dos grupos tiol com DTNB. A concentração de grupos sulfidrila totais foi expressa em nmol TNB/mg proteína.29 A concentração de proteína foi medida pelo método de Lowry.30

 Atividade de óxido nítrico-sintase

A atividade da enzima óxido nítrico-sintase foi avaliada medindo-se a conversão da oxihemoglobina (HbO2) em metemoglobina, induzida pelo óxido nítrico, conforme descrito anteriormente. Os valores são expressos em nmol NO/min/mg de proteína.31

 Avaliação do conteúdo imunológico de Nrf2 e xantina oxidase

O conteúdo imunológico de Nrf2 e xantina oxidase foram determinados por Western blot, conforme descrito anteriormente.32 Os anticorpos Nrf2 e a xantina oxidase foram usados como anticorpos primários (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). Os anticorpos primários foram detectados por meio de anticorpos secundários conjugados com globulina de coelho anti-rato conjugada com peroxidase de rábano silvestre. As membranas foram desenvolvidas com reagentes de quimioluminescência. As autorradiografias foram escaneadas e as bandas foram medidas por meio de um software densitômetro (Imagemaster VDS CI, Amersham Biosciences Europe, IT). As bandas de pesos moleculares de Nrf2 e xantina oxidase foram determinadas por referência a um marcador de peso molecular padrão (RPN 800 rainbow full range Bio-Rad, CA, EUA). Os resultados foram normalizados pelo método de Ponceau.33

 Análise estatística

O cálculo do tamanho da amostra considerou uma probabilidade de erro = 0,05 e testou o poder estatístico (probabilidade de erro 1-) = 0,90. A distribuição dos dados foi avaliada pelo teste de Shapiro-Wilk. Como os dados apresentaram distribuição normal, os resultados foram analisados por ANOVA one-way com o teste post-hoc de Student-Newman-Keuls para detectar diferenças entre os grupos, e os resultados foram expressos em média ± desvio padrão (DP). As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05. Os dados foram analisados usando o software Sigma Plot (Jandel, Scientific Co, v. 11.0, San Jose, CA, EUA).

 Resultados Resultados morfométricos

Os ratos infartados de ambos os grupos (IAM e IAM + PS) tiveram um perímetro de infarto semelhante. Isso indica que não há diferenças entre os grupos infartados em termos de tamanho da lesão. A congestão pulmonar não diferiu entre os grupos experimentais. Da mesma forma, não houve alteração dos índices de hipertrofia do ventrículo direito, calculados pelas razões ventrículo direito/peso corporal e ventrículo direito/comprimento da tíbia, bem como do peso do ventrículo direito entre os grupos ( Tabela 1 ).

Resultados morfométricos do pulmão e dos ventrículos esquerdo e direito
SHAM (n=5) IAM (n=5) IAM+PS (n=6)
Pulmão/peso corporal (g/g) 4,01±0,99 5,99±0,44a 5,24±1,21
VD (g) 0,17±0,037 0,20±0,02 0,24±0,07
VD/comprimento da tíbia (g/cm) 0,48±0,09 0,57±0,07 0,66±0,19
VD/peso corporal (mg/g) 0,50±0,11 0,60±0,04 0,70±0,23
VE (g) 0,75±0,06 0,75±0,08 0,73±0,07
VE/comprimento da tíbia (g/cm) 2,05±0,19 2,09±0,22 2,00±0,18
VE/peso corporal (mg/g) 2,15±0,24 2,21±0,22 2,11±0,15

Dados apresentados como média ± DP. ANOVA unilateral com o teste post-hoc de Student-Newman-Keuls. ap<0,05 vs SHAM. VD: ventrículo direito; VE: ventrículo esquerdo; SHAM: grupo controle; IAM: infarto do miocárdio; IAM + PS: infarto do miocárdio + pterostilbeno.

Parâmetros ecocardiográficos

Na avaliação dos parâmetros morfológicos do ventrículo esquerdo, tanto o grupo IAM quanto o IAM + PS apresentaram aumento dos volumes sistólico e diastólico final em comparação ao grupo SHAM, indicando dilatação ventricular. Porém, os animais IAM + PS apresentaram aumento do volume sistólico final mais discreto em relação ao IAM. O débito sistólico e a frequência cardíaca não foram diferentes entre os grupos. A fração de encurtamento do ventrículo esquerdo, que indica sua contratilidade, diminuiu nos grupos IAM e IAM + PS em relação aos animais SHAM, indicando piora na função sistólica desta câmara, e a administração de PS não foi eficaz para melhorar esse parâmetro. Em relação ao perímetro infartado, não houve diferença entre os grupos IAM e IAM + PS ( Tabela 2 ).

Avaliação ecocardiográfica do ventrículo esquerdo
SHAM (n=6) IAM (n=5) IAM+PS (n=6)
VSFVE (mL) 0,08±0,05 0,46±0,15 a 0,32±0,06 ab
VDFVE (mL) 0,29±0,09 0,68±0,14 a 0,57±0,06 a
Saída sistólica (mL) 0,21±0,04 0,22±0,03 0,24±0,04
Frequência cardíaca (bpm) 249±16 242±15 237±27
Fração de encurtamento (%) 51,5±5,4 15,8±1,7a 17,0±2,9a
Perímetro infartado (cm) ------------ 1,81±0,45 1,60±0,22

Dados apresentados como média ± DP. ANOVA unilateral com o teste post-hoc de Student-Newman-Keuls. ap <0,05 vs SHAM; bp <0,05 vs IAM. VSFVE: Volume sistólico final do ventrículo esquerdo; VDFVE: Volume diastólico final do ventrículo esquerdo; SHAM: Grupo controle; IAM: grupo infarto do miocárdio; IAM + PS: infarto do miocárdio + pterostilbeno. O perímetro infartado é um parâmetro ecocardiográfico de medição do tamanho do infarto.

Níveis de ROS, peroxidação lipídica e resposta antioxidante no tecido pulmonar

O estresse oxidativo foi medido por meio da produção de dicloro fluoresceína (DCF) (um indicador dos níveis totais de ROS) e TBARS (um indicador de peroxidação lipídica) no tecido pulmonar. Em relação aos ROS totais, o grupo IAM + PS apresentou níveis aumentados em comparação aos grupos SHAM e IAM (p<0,05) ( Figura 1A ). No entanto, nenhuma diferença foi encontrada entre IAM e SHAM. Embora os níveis de espécies reativas tenham aumentado no grupo IAM + PS, a peroxidação lipídica diminuiu no tecido pulmonar desses animais em comparação com o grupo IAM (P<0,05). Além disso, a peroxidação lipídica no grupo IAM + PS não foi diferente em relação ao grupo SHAM, indicando redução do dano oxidativo promovida pela administração de PS ( Figura 1B ).

<italic>Estresse oxidativo pulmonar A) Concentração total de espécies reativas de oxigênio; B) Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. Dados expressos como média ± DP. ANOVA unilateral com o teste post-hoc de Student-Newman-Keuls. aP<0,05 vs SHAM; bP<0,05 vs IAM. SHAM: Grupo controle; IAM: grupo infarto do miocárdio; IAM+ PS: infarto do miocárdio + pterostilbeno.</italic>

Em termos de defesas antioxidantes não enzimáticas, nenhuma mudança significativa nos níveis de GSH em ratos com IAM foi observada em comparação com ratos SHAM. Porém, o tratamento com PS teve efeito positivo nos pulmões dos animais IAM + PS, uma vez que os níveis de GSH aumentaram neste grupo quando comparados com SHAM e IAM (p<0,05) ( Tabela 3 ). No entanto, os níveis de GSSG, as relações GSH/Glutationa Total e GSSG/Glutationa Total não apresentaram diferenças entre os grupos.

Parâmetros redox nos pulmões
SHAM (n=6) IAM (n=5) IAM+PS (n=6)
GSH (µmol/min/mg de tecido) 0,79±0,07 0,67±0,05 0,86±0,14b
GSSG (µmol/min/ mg de tecido) 0,24±0,09 0,46±0,20 0,36±0,14
Glutationa total (µmol/min/mg de tecido) 1,27±0,13 1,40±0,22 1,55±0,33
GSH/ Glutationa total 0,63±0,11 0,49±0,12 0,57±0,15
GSSG/ Glutationa total 0,18±0,05 0,29±0,17 0,19±0,08

Os dados são apresentados como média ± DP. ANOVA unilateral com o teste post-hoc de Student-Newman-Keuls bp<0,05 vs IAM. SAHM: Grupo controle; IAM: grupo infarto do miocárdio; IAM + OS: infarto do miocárdio + pterostilbeno; GSH: glutationa reduzida; GSSG: glutationa oxidada (unidade em µmol/min/mg de tecido).

Além da GSH, a administração de PS também parece melhorar as defesas antioxidantes enzimáticas nos pulmões. A atividade SOD foi reduzida no grupo IAM em comparação com o grupo SHAM. No entanto, essa atividade enzimática foi recuperada pelo PS (p<0,05) ( Figura 2A ). A CAT estava aumentada no grupo IAM + PS em relação aos grupos SHAM e IAM (p<0,05) ( Figura 2B ). A atividade da GPx e o SH total, entretanto, não se alteraram entre os grupos ( Figuras 2C e 2D , respectivamente).

<italic>Medições de antioxidantes pulmonares. A) Atividade da superóxido dismutase; B) Atividade da catalase; C) Atividade da glutationa peroxidase; D) Grupos sulfidrila totais. Dados expressos como média ± DP. ANOVA unilateral com o teste post-hoc de Student-Newman-Keuls. aP<0,05 vs SHAM; bP<0,05 vs IAM. SHAM: Grupo controle; IAM: grupo infarto do miocárdio; IAM + PS: infarto do miocárdio + pterostilbeno</italic> .

Expressão da proteína Nrf2 no tecido pulmonar

A expressão de Nrf2 pode estar envolvida nos efeitos antioxidantes do PS. A Nrf2 é uma proteína relacionada com a regulação da transcrição de enzimas antioxidantes e pode ser estimulada por moléculas como os compostos fenólicos. De fato, nossos dados mostraram que o tratamento com PS promoveu um aumento significativo na expressão da proteína Nrf2 no grupo IAM + PS em comparação ao grupo IAM (p<0,05). No entanto, não houve diferença na expressão de Nrf2 entre os grupos SHAM e IAM ( Figura 3 ).

- <italic>Análise Western Blot da expressão de Nrf2 no pulmão. Gráfico representativo mostrando 1 banda para cada grupo experimental. Dados expressos como média ± DP. ANOVA unilateral com o teste post-hoc de Student-Newman-Keuls. bP <0,05 vs IAM. SHAM: Grupo controle; IAM: grupo infarto do miocárdio; IAM + PS: infarto do miocárdio + pterostilbeno</italic> .

Avaliação da Xantina Oxidase e NADPH Oxidase no VD

O infarto do miocárdio estimulou enzimas pró-oxidantes, que foram atenuadas pela administração de PS. Em relação a isso, a expressão da proteína xantina oxidase foi aumentada no VD de animais com IAM em relação aos demais grupos (p<0,05). No entanto, no grupo IAM + PS, os níveis de xantina oxidase não foram diferentes do grupo SHAM, o que indica uma atenuação dessa enzima pró-oxidante em animais infartados tratados com PS. Da mesma forma, houve um aumento na atividade da NADPH oxidase em animais infartados (IAM) em comparação com os do grupo SHAM, o que pareceu reduzido no grupo IAM + PS (p <0,05), comprovando a contribuição do tratamento com PS na redução da produção de radical ânion superóxido no VD ( Figura 4A e 4B ).

<italic>Estresse oxidativo do ventrículo direito. A) Análise Western Blot da expressão da xantina oxidase. Gráfico representativo mostrando 1 banda para cada grupo experimental; B) Atividade de NADPH oxidases. Dados expressos como média ± DP. ANOVA unilateral com o teste post-hoc de Student-Newman-Keuls. aP<0,05 vs SHAM; bP<0,05 vs IAM. SHAM: Grupo controle; IAM: grupo infarto do miocárdio; IAM + PS: infarto do miocárdio + pterostilbeno</italic> .

Concentração de sulfidrila e atividade de NOS no VD

A concentração de sulfidrila (grupos tiol relevantes como antioxidantes não enzimáticos) foi diminuída no grupo IAM em comparação com o SHAM (p<0,05); entretanto, o grupo IAM + PS restabeleceu os níveis de sulfidrila (p<0,05). Além disso, ratos infartados não tratados apresentaram redução da atividade da NOS quando comparados aos animais SHAM, enquanto o tratamento com PS induziu a recuperação dessa atividade enzimática (p<0,05) ( Figura 5A e 5B ).

- <italic>A) Grupos sulfidrila total do ventrículo direito; B) Atividade da óxido nítrico-sintase do ventrículo direito. Dados expressos como média ± DP. ANOVA unilateral com o teste post-hoc de Student-Newman-Keuls. aP<0,05 vs SHAM; bP<0,05 vs IAM. SHAM: Grupo controle; IAM: grupo infarto do miocárdio; IAM + PS: infarto do miocárdio + pterostilbeno</italic> .

Discussão

O principal achado deste estudo foi que o tratamento de ratos infartados com PS promoveu efeitos benéficos nos pulmões e no VD. Ao avaliar a morfologia e função do VE após o infarto, ambos os grupos infartados apresentaram dilatação cardíaca, refletida pelo aumento dos volumes cardíacos, e comprometimento da contratilidade, evidenciado pela diminuição da fração de encurtamento. A administração do PS, entretanto, atenuou o aumento do volume sistólico final, o que parece ser um resultado positivo, uma vez que o aumento do volume sistólico final pode estar relacionado ao desenvolvimento de congestão pulmonar. Na verdade, o tratamento com PS evitou a congestão pulmonar, conforme mostrado pela relação pulmão/peso corporal. O perímetro infartado não foi diferente entre os ratos IAM e IAM + PS, havendo homogeneidade de lesão cardíaca entre esses grupos. Em relação aos parâmetros morfométricos, nem o ventrículo direito nem o esquerdo dos grupos infartados apresentou hipertrofia. O fato de os animais terem sido avaliados apenas 14 dias após o infarto poderia explicar isso. Um estudo anterior ao nosso também não encontrou diferença nesses parâmetros.32

Os pulmões são os órgãos mais afetados pela insuficiência cardíaca, e a disfunção pulmonar é um fator-chave para desfechos clínicos ruins em pacientes infartados.34 No entanto, nosso estudo não encontrou alterações nos níveis totais de ROS nos pulmões de ratos infartados. Por outro lado, os pulmões de animais IAM + PS apresentaram níveis aumentados de ROS, o que está de acordo com o papel relatado dos estilbenos na indução da produção de ROS in vitro.16 O grupo IAM mostrou um aumento na peroxidação lipídica, indicando dano oxidativo nos pulmões. O grupo IAM + PS, entretanto, apresentou redução da lesão pulmonar induzida pela peroxidação lipídica, uma vez que os níveis de TBARS diminuíram. Uma possível hipótese é que esse aumento dos níveis de ROS ocasionado pela administração de PS poderia representar um mecanismo hormonal35 que leva ao aumento das defesas antioxidantes, evitando a peroxidação lipídica. De fato, estudos anteriores com outros compostos naturais que também apresentam efeito pró-oxidante, como o sulforafano, já reportaram esse mecanismo de proteção pela estimulação do sistema antioxidante.36 O tratamento com PS pode induzir uma adaptação contra o aumento dos níveis de ROS por meio de alterações oxidativas celulares na atividade de SOD e CAT, duas enzimas importantes que pertencem à primeira linha de defesa contra o estresse oxidativo9 Em nosso estudo, a redução da atividade da SOD nos pulmões do grupo IAM sugere proteção deficiente contra os radicais superóxido ânion, o que poderia causar um aumento do estresse oxidativo em estágios posteriores do IAM.17 Por outro lado, o tratamento com PS recuperou a atividade SOD no grupo IAM + PS, demonstrando seu efeito protetor na homeostase redox. Nossos resultados mostraram aumento da atividade CAT no tecido pulmonar de animais IAM + PS. Como o peróxido de hidrogênio pode reagir com metais como o ferro e produzir radicais hidroxila,37 esse aumento da atividade CAT no grupo IAM + PS surge como uma importante defesa contra a produção desse radical nos pulmões. Em termos de defesas não enzimáticas, foi encontrado um aumento na concentração de GSH nos pulmões de animais IAM + PS. GSH é o peptídeo antioxidante de baixo peso molecular mais prevalente38 e participa da regulação redox e da homeostase.39 Neste estudo, o aumento da concentração de GSH pode ter contribuído para a redução dos níveis de TBARS no grupo IAM + PS, diminuindo o estresse oxidativo nesses animais. Além da estimulação das defesas enzimáticas e não enzimáticas, o PS também foi capaz de induzir melhorias no perfil antioxidante dos tecidos pulmonares por meio da estimulação de proteínas citoprotetoras, como a Nrf2.40

Nesse contexto, a Nrf2 atua como um fator de transcrição sensível à redox, desempenhando um papel fundamental na resposta antioxidante pulmonar.40 Em situações de equilíbrio redox, a Nrf2 está ancorado na proteína 1, associada à ECH semelhante a Kelch (Keap1). Porém, quando há uma ruptura da homeostase redox, o complexo Nrf2-Keap1 se dissocia e libera Nrf2, que pode se translocar para o núcleo e iniciar a transcrição de moléculas antioxidantes.41 De fato, estudos têm demonstrado que o Nrf2 desempenha um papel importante na síntese de enzimas antioxidantes endógenas. Além disso, segundo Lacerda et al.15 o PS regula positivamente a expressão de Nrf2, o que aumenta o GSH celular e mitiga o dano oxidativo.15 Em nosso estudo, os níveis de imunoconteúdo Nrf2 estavam aumentados nos pulmões de ratos IAM + PS, sugerindo que o PS induz a ativação de Nrf2, o que poderia explicar a melhora nas defesas antioxidantes e redução da peroxidação lipídica. Portanto, o PS mostrou ser protetor para os pulmões após o infarto, pois evitou a congestão pulmonar, aumentou as atividades de SOD e CAT, aumentou os níveis de GSH e evitou a peroxidação lipídica, além de induzir Nrf2, uma proteína citoprotetora.

O cenário pró-oxidativo do infarto do miocárdio afeta significativamente o VD.20 Nossos resultados mostraram que o infarto do miocárdio leva à expressão elevada da xantina oxidase nele. Wang et al.42 mostraram aumento dos níveis de xantina oxidase no coração 12 semanas após o infarto, associado à peroxidação lipídica e disfunção cardíaca.42 Além disso, a atividade da NADPH oxidase, importante fonte de ROS, também foi avaliada em nosso estudo. A atividade da enzima foi elevada em ratos IAM, e a administração de PS foi capaz de prevenir esse aumento. Os níveis elevados de xantina oxidase e a atividade da NADPH oxidase predispõem o VD ao aumento da concentração do ânion superóxido e, consequentemente, à depleção das reservas antioxidantes. Corroborando esses resultados, também encontramos níveis reduzidos de sulfidrila no grupo IAM. O grupo IAM + PS, entretanto, apresentou conteúdo aumentado de grupos tiol. No grupo IAM, a concentração elevada de ânion superóxido produzida por NADPH e xantina oxidase pode interferir desfavoravelmente no equilíbrio de ROS/NO no VD. Na verdade, nossos resultados mostraram atividade reduzida de NOS na câmara direita de animais IAM. A NOS é uma enzima relevante na produção de NO, que desempenha papel fundamental na cardioproteção.43 No presente estudo, a administração de PS evitou a redução da atividade de NOS que ocorreu no grupo IAM. No entanto, considerando o efeito desse composto no embotamento de enzimas pró-oxidantes, como a NADPH oxidase e a xantina oxidase, concomitante à recuperação parcial da atividade da NOS, o PS parece contribuir para a manutenção de um equilíbrio cardioprotetor ROS/NO no VD.

 Conclusões

Em conclusão, a administração de PS promoveu efeitos benéficos nos pulmões de animais infartados, diminuindo a peroxidação lipídica e aumentando as defesas antioxidantes, como SOD, atividade de CAT e níveis de GSH. Também evitou o aumento da atividade da NADPH oxidase e da expressão da xantina oxidase no VD de animais infartados. Esses resultados provavelmente estão relacionados a uma melhora no equilíbrio ROS/NO nesta câmara. Portanto, nossos achados sugerem que o PS efetivamente tem efeitos protetores nos pulmões e no VD após IAM.

<italic>Resumo gráfico</italic> .

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico (CNPq) e pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

 Referências 1. Bax JJ, Di Carli M, Narula J, Delgado V. Multimodality imaging in ischaemic heart failure. Lancet. 2019;393(10175):1056-70. Bax JJ Di Carli M Narula J Delgado V Multimodality imaging in ischaemic heart failure Lancet 2019 393 10175 1056 1070 2. Chien CW, Wang CH, Chao ZH, Huang SK, Chen PE, Tung TH. Different treatments for acute myocardial infarction patients via outpatient clinics and emergency department. Medicine. 2019;98(2):e13883. Chien CW Wang CH Chao ZH Huang SK Chen PE Tung TH Different treatments for acute myocardial infarction patients via outpatient clinics and emergency department Medicine 2019 98 2 e13883 3. Jankowich M, Choudhary G. Endothelin-1 levels and cardiovascular events. Trends Cardiovasc Med 2019;30(1):1-8. Jankowich M Choudhary G Endothelin-1 levels and cardiovascular events Trends Cardiovasc Med 2019 30 1 1 8 4. Greyson CR, Schwartz GG, Lu L, Ye S, Helmke S, Xu Y. Calpain inhibition attenuates right ventricular contractile dysfunction after acute pressure overload. J Mol Cell Cardiol. 2008;44(1):59-68. Greyson CR Schwartz GG Lu L Ye S Helmke S Xu Y Calpain inhibition attenuates right ventricular contractile dysfunction after acute pressure overload J Mol Cell Cardiol 2008 44 1 59 68 5. Mann DL, Bristow MR. Mechanisms and models in heart failure: The biomechanical model and beyond. Circulation. 2005;111(21):2837-49. Mann DL Bristow MR Mechanisms and models in heart failure: The biomechanical model and beyond Circulation 2005 111 21 2837 2849 6. Aydin S, Ugur K, Aydin S, Sahin I, Yardim M. Biomarkers in acute myocardial infarction: Current perspectives. Vasc Health Risk Manag.;31(12) 2019;15:1-10 Aydin S Ugur K Aydin S Sahin I Yardim M Biomarkers in acute myocardial infarction: Current perspectives Vasc Health Risk Manag 31 12 2019 15:1 1510 7. Zemskov E, Lu Q, Wojciech Ornatowski W, Klinger CN, Desai AA, Maltepe E, et al. Biomechanical forces and oxidative stress: Implications for pulmonary vascular disease. Antioxidants & redox signaling. 2019;31(12):doi:10.1089/ars.2018.1720. Zemskov E Lu Q Wojciech Ornatowski W Klinger CN Desai AA Maltepe E et al Biomechanical forces and oxidative stress: Implications for pulmonary vascular disease Antioxidants & redox signaling 2019 31 12 10.1089/ars.2018.1720 8. Wang X, Shults NV, Suzuki YJ. Oxidative profiling of the failing right heart in rats with pulmonary hypertension. PloS one. 2017;12(5):e0176887. Wang X Shults NV Suzuki YJ Oxidative profiling of the failing right heart in rats with pulmonary hypertension PloS one 2017 12 5 e0176887 9. Halliwell B, Gutteridge JM. The definition and measurement of antioxidants in biological systems. Free Radic Biol Med. 1995;18:125-6. doi:10.1016/0891-5849(95)-94457-3. Halliwell B Gutteridge JM The definition and measurement of antioxidants in biological systems Free Radic Biol Med 1995 18 125 126 10.1016/0891-5849(95)-94457-3. 10. Comhair SA, Erzurum SC. Antioxidant responses to oxidant-mediated lung diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002;283(2):L246-255. Comhair SA Erzurum SC Antioxidant responses to oxidant-mediated lung diseases Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2002 283 2 L246 L255 11. Roy J, Galano JM, Durand T, Le Guennec JY, Lee JC. Physiological role of reactive oxygen species as promoters of natural defenses. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 2017;31(9):3729-45. Roy J Galano JM Durand T Le Guennec JY Lee JC Physiological role of reactive oxygen species as promoters of natural defenses FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 2017 31 9 3729 3745 12. Hill MF, Singal PK. Right and left myocardial antioxidant responses during heart failure subsequent to myocardial infarction. Circulation. 1997;96(7):2414-20. Hill MF Singal PK Right and left myocardial antioxidant responses during heart failure subsequent to myocardial infarction Circulation 1997 96 7 2414 2420 13. Shaw P, Chattopadhyay A. Nrf2-are signaling in cellular protection: Mechanism of action and the regulatory mechanisms. J Cell Physiol. 2020;235(4):3119-30. Shaw P Chattopadhyay A Nrf2-are signaling in cellular protection: Mechanism of action and the regulatory mechanisms J Cell Physiol 2020 235 4 3119 3130 14. Walters DM, Cho HY, Kleeberger SR. Oxidative stress and antioxidants in the pathogenesis of pulmonary fibrosis: A potential role for nrf2. Antioxidants & redox signaling. 2008;10(2):321-32. Walters DM Cho HY Kleeberger SR Oxidative stress and antioxidants in the pathogenesis of pulmonary fibrosis: A potential role for nrf2 Antioxidants & redox signaling 2008 10 2 321 332 15. Lacerda D, Ortiz V, Turck P, Campos-Carraro C, Zimmer A, Teixeira R, et al. Stilbenoid pterostilbene complexed with cyclodextrin preserves left ventricular function after myocardial infarction in rats: Possible involvement of thiol proteins and modulation of phosphorylated gsk-3beta. Free Radic Res. 2018;52(9):988-99. Lacerda D Ortiz V Turck P Campos-Carraro C Zimmer A Teixeira R et al Stilbenoid pterostilbene complexed with cyclodextrin preserves left ventricular function after myocardial infarction in rats: Possible involvement of thiol proteins and modulation of phosphorylated gsk-3beta Free Radic Res 2018 52 9 988 999 16. Treml J, Lelakova V, Smejkal K, Paulickova T, Labuda S, Granica S, et al. Antioxidant activity of selected stilbenoid derivatives in a cellular model system. Biomolecules. 2019;9:468. Treml J Lelakova V Smejkal K Paulickova T Labuda S Granica S et al Antioxidant activity of selected stilbenoid derivatives in a cellular model system Biomolecules 2019 9 468 17. Schenkel PC, Tavares AM, Fernandes RO, Diniz GP, Ludke AR, Ribeiro MF, et al. Time course of hydrogen peroxide-thioredoxin balance and its influence on the intracellular signalling in myocardial infarction. Exp Physiol. 2012;97(6):741-9. Schenkel PC Tavares AM Fernandes RO Diniz GP Ludke AR Ribeiro MF et al Time course of hydrogen peroxide-thioredoxin balance and its influence on the intracellular signalling in myocardial infarction Exp Physiol 2012 97 6 741 749 18. de Castro AL, Tavares AV, Campos C, Fernandes RO, Siqueira R, Conzatti A, et al. Cardioprotective effects of thyroid hormones in a rat model of myocardial infarction are associated with oxidative stress reduction. Mol Cell Endocrnol.2014;391(1-2):22-9. Castro AL Tavares AV Campos C Fernandes RO Siqueira R Conzatti A et al Cardioprotective effects of thyroid hormones in a rat model of myocardial infarction are associated with oxidative stress reduction Mol Cell Endocrnol 2014 391 1-2 22 29 19. Nozawa E, Kanashiro RM, Murad N, Carvalho AC, Cravo SL, Campos O, et al. Performance of two-dimensional doppler echocardiography for the assessment of infarct size and left ventricular function in rats. Braz J MedBiol Res. 2006;39(5):687-95. Nozawa E Kanashiro RM Murad N Carvalho AC Cravo SL Campos O et al Performance of two-dimensional doppler echocardiography for the assessment of infarct size and left ventricular function in rats Braz J MedBiol Res 2006 39 5 687 695 20. Corssac GB, de Castro AL, Tavares AV, Campos C, Fernandes RO, Ortiz VD, et al. Thyroid hormones effects on oxidative stress and cardiac remodeling in the right ventricle of infarcted rats. Life Sci. 2016;146:109-16. Corssac GB Castro AL Tavares AV Campos C Fernandes RO Ortiz VD et al Thyroid hormones effects on oxidative stress and cardiac remodeling in the right ventricle of infarcted rats Life Sci 2016 146 109 116 21. Llesuy SF, Milei J, Molina H, Boveris A, Milei S. Comparison of lipid peroxidation and myocardial damage induced by adriamycin and 4’-epiadriamycin in mice. Tumori. 1985;71(3):241-9. Llesuy SF Milei J Molina H Boveris A Milei S Comparison of lipid peroxidation and myocardial damage induced by adriamycin and 4’-epiadriamycin in mice Tumori 1985 71 3 241 249 22. LeBel CP, Ischiropoulos H, Bondy SC. Evaluation of the probe 2’,7’-dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress. Chem Res Toxicol. 1992;5(2): 227-31. LeBel CP Ischiropoulos H Bondy SC Evaluation of the probe 2’,7’-dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress Chem Res Toxicol 1992 5 2 227 231 23. Esterbauer H, Cheeseman KH. Determination of aldehydic lipid peroxidation products: Malonaldehyde and 4-hydroxynonenal. Meth Enzymol .1990;186(2): enzymology. 1990;186(2):407-21. Esterbauer H Cheeseman KH Determination of aldehydic lipid peroxidation products: Malonaldehyde and 4-hydroxynonenal Meth Enzymol 1990 186 2 enzymology 1990;186(2): 407 421 24. Akerboom TP, Sies H. Assay of glutathione, glutathione disulfide, and glutathione mixed disulfides in biological samples. Meth Enzymol. 1981;77:373-82. Akerboom TP Sies H Assay of glutathione, glutathione disulfide, and glutathione mixed disulfides in biological samples Meth Enzymol 1981 77 373 382 25. Wei Y, Sowers JR, Nistala R, Gong H, Uptergrove GM, Clark SE, et al. Angiotensin ii-induced nadph oxidase activation impairs insulin signaling in skeletal muscle cells. J Biol Chem.2006;281(46):35137-46. Wei Y Sowers JR Nistala R Gong H Uptergrove GM Clark SE et al Angiotensin ii-induced nadph oxidase activation impairs insulin signaling in skeletal muscle cells J Biol Chem 2006 281 46 35137 35146 26. Marklund SL. Superoxide dismutase isoenzymes in tissues and plasma from new zealand black mice, nude mice and normal balb/c mice. Mutation Res. 1985;148(1-2):129-34. Marklund SL Superoxide dismutase isoenzymes in tissues and plasma from new zealand black mice, nude mice and normal balb/c mice Mutation Res 1985 148 1-2 129 134 27. Aebi H. Catalase in vitro. Meth Enzymol. 1984;105:121-6. Aebi H Catalase in vitro Meth Enzymol 1984 105 121 126 28. Flohe L, Gunzler WA. Assays of glutathione peroxidase. Meth Enzymol. 1984;105:114-21. Flohe L Gunzler WA Assays of glutathione peroxidase Meth Enzymol 1984 105 114 121 29. Sedlak J, Lindsay RH. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with ellman’s reagent. Anal Biochem. 1968;25(1):192-205. Sedlak J Lindsay RH Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with ellman’s reagent Anal Biochem 1968 25 1 192 205 30. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem; 1951;193(1):265-75. Lowry OH Rosebrough NJ Farr AL Randall RJ Protein measurement with the folin phenol reagent J Biol Chem 1951 193 1 265 275 31. Valdez LB, Zaobornyj T, Boveris A. Functional activity of mitochondrial nitric oxide synthase. Meth Enzymol. 2005;396:444-55. Valdez LB Zaobornyj T Boveris A Functional activity of mitochondrial nitric oxide synthase Meth Enzymol 2005 396 444 455 32. de Castro AL, Fernandes RO, Ortiz VD, Campos C, Bonetto JH, Fernandes TR, et al. Thyroid hormones improve cardiac function and decrease expression of pro-apoptotic proteins in the heart of rats 14 days after infarction. Apoptosis. 2016;21(2):184-94. Castro AL Fernandes RO Ortiz VD Campos C Bonetto JH Fernandes TR et al Thyroid hormones improve cardiac function and decrease expression of pro-apoptotic proteins in the heart of rats 14 days after infarction Apoptosis 2016 21 2 184 194 33. Klein D, Kern RM, Sokol RZ. A method for quantification and correction of proteins after transfer to immobilization membranes. Biochem Mol Biol Int.. 1995;36:(1)59-66. Klein D Kern RM Sokol RZ A method for quantification and correction of proteins after transfer to immobilization membranes Biochem Mol Biol Int 1995 36 1 59 66 34. Yuan G, Han A, Wu J, Lu Y, Zhang D, Sun Y, et al. Bao yuan decoction and tao hong si wu decoction improve lung structural remodeling in a rat model of myocardial infarction: Possible involvement of suppression of inflammation and fibrosis and regulation of the tgf-beta1/smad3 and nf-kappab pathways. BioscTrends. 2018;12(5):491-501. Yuan G Han A Wu J Lu Y Zhang D Sun Y et al Bao yuan decoction and tao hong si wu decoction improve lung structural remodeling in a rat model of myocardial infarction: Possible involvement of suppression of inflammation and fibrosis and regulation of the tgf-beta1/smad3 and nf-kappab pathways BioscTrends 2018 12 5 491 501 35. Mattson MP. Hormesis defined. Ageing Res Rev. 2008;7(1): 1-7. Mattson MP Hormesis defined Ageing Res Rev 2008 7 1 1 7 36. Fernandes RO, De Castro AL, Bonetto JH, Ortiz VD, Muller DD, Campos-Carraro C, et al. Sulforaphane effects on postinfarction cardiac remodeling in rats: Modulation of redox-sensitive prosurvival and proapoptotic proteins. J Nutr Byochem. 2016;34:106-17. Fernandes RO De Castro AL Bonetto JH Ortiz VD Muller DD Campos-Carraro C et al Sulforaphane effects on postinfarction cardiac remodeling in rats: Modulation of redox-sensitive prosurvival and proapoptotic proteins J Nutr Byochem 2016 34 106 117 37. Lee JC, Son YO, Choi KC, Jang YS. Hydrogen peroxide induces apoptosis of bjab cells due to formation of hydroxyl radicals via intracellular iron-mediated fenton chemistry in glucose oxidase-mediated oxidative stress. Mol Cells. 2006;22(1):21-9. Lee JC Son YO Choi KC Jang YS Hydrogen peroxide induces apoptosis of bjab cells due to formation of hydroxyl radicals via intracellular iron-mediated fenton chemistry in glucose oxidase-mediated oxidative stress Mol Cells 2006 22 1 21 29 38. Dincer Y, Alademir Z, Ilkova H, Akcay T. Susceptibility of glutatione and glutathione-related antioxidant activity to hydrogen peroxide in patients with type 2 diabetes: Effect of glycemic control. Clin Biochem.. 2002;35(4):297-301. Dincer Y Alademir Z Ilkova H Akcay T Susceptibility of glutatione and glutathione-related antioxidant activity to hydrogen peroxide in patients with type 2 diabetes: Effect of glycemic control Clin Biochem 2002 35 4 297 301 39. Mieyal JJ, Gallogly MM, Qanungo S, Sabens EA, Shelton MD. Molecular mechanisms and clinical implications of reversible protein s-glutathionylation. Antioxidants & redox signaling. 2008;10(11):1941-88. Mieyal JJ Gallogly MM Qanungo S Sabens EA Shelton MD Molecular mechanisms and clinical implications of reversible protein s-glutathionylation Antioxidants & redox signaling 2008 10 11 1941 1988 40. Trachootham D, Lu W, Ogasawara MA, Nilsa RD, Huang P. Redox regulation of cell survival. Antioxidants & redox signaling. 2008;10(8):1343-74. Trachootham D Lu W Ogasawara MA Nilsa RD Huang P Redox regulation of cell survival Antioxidants & redox signaling 2008 10 8 1343 1374 41. Campos C, de Castro AL, Tavares AM, Fernandes RO, Ortiz VD, Barboza TE, et al. Effect of free and nanoencapsulated copaiba oil on monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. J Cardiovasc Pharmacol. 2017;69(2):79-85 Campos C Castro AL Tavares AM Fernandes RO Ortiz VD Barboza TE et al Effect of free and nanoencapsulated copaiba oil on monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension J Cardiovasc Pharmacol 2017 69 2 79 85 42. Wang Z, Ding J, Luo X, Zhang S, Yang G, Zhu Q, et al. Effect of allopurinol on myocardial energy metabolism in chronic heart failure rats after myocardial infarct. Int Heart J. 2016;57(6):753-9. Wang Z Ding J Luo X Zhang S Yang G Zhu Q et al Effect of allopurinol on myocardial energy metabolism in chronic heart failure rats after myocardial infarct Int Heart J 2016 57 6 753 759 43. de Castro AL, Tavares AV, Fernandes RO, Campos C, Conzatti A, Siqueira R, et al. T3 and t4 decrease ros levels and increase endothelial nitric oxide synthase expression in the myocardium of infarcted rats. Mol Cell Biochem. 2015;408(1-2):235-43. Castro AL Tavares AV Fernandes RO Campos C Conzatti A Siqueira R et al T3 and t4 decrease ros levels and increase endothelial nitric oxide synthase expression in the myocardium of infarcted rats Mol Cell Biochem 2015 408 1-2 235 243

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de mestrado de Alex Sander da Rosa Araujo pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Fontes de financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

 Original Article Pterostilbene Reduces Experimental Myocardial Infarction-Induced Oxidative Stress in Lung and Right Ventricle 0000-0002-7184-1072 Tasca Silvio 1 0000-0001-6054-4243 Campos Cristina 1 Lacerda Denise 1 Ortiz Vanessa D. 1 Turck Patrick 1 Bianchi Sara E. 2 Castro Alexandre L. de 1 Belló-Klein Adriane 1 Bassani Valquiria 2 Araújo Alex Sander da Rosa 1 Brasil Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS - Brasil Brazil Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS - Brazil Mailing Address: Alex Sander da Rosa Araújo • Universidade Federal do Rio Grande do Sul - Sarmento Leite, 500. Postal Code 90040-060, Porto Alegre, RS – Brazil. E-mail: alex.rosa@ufrgs.br

Author Contributions

Conception and design of the research: Tasca S, Lacerda D, Castro AL, Araújo ASR; Acquisition of data: Tasca S, Campos C, Bianchi SE; Analysis and interpretation of the data: Tasca S, Campos C, Lacerda D, Turck P; Statistical analysis: Tasca S, Ortiz VD, Turck P; Obtaining financing: Belló-Klein A, Bassani V, Araújo ASR; Writing of the manuscript: Tasca S; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Castro AL, Belló-Klein A, Bassani V, Araújo ASR.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background

Pterostilbene (PS), a natural and antioxidant polyphenolic compound emerges as a promising intervention in improving the myocardial infarction (MI) damages.

 Objetives

This study aimed to evaluate PS actions in promoting redox homeostasis in lungs and right ventricle (RV) of infarcted animals.

 Methods

Male Wistar rats (60 day-old) were randomized into three groups: SHAM, MI (infarcted), and MI+PS (MI+pterostilbene). Seven days after MI procedure, rats were treated with PS (100 mg/kg/day) via gavage for eight days. Animals were euthanized and the lungs and RV were harvested for analyses of redox balance (Differences were considered significant when p<0.05).

 Results

Our results show that MI triggers a redox disruption scenario in RV and lungs, which can contribute to MI-induced damage on these organs. Consistently, PS mitigated oxidative stress and restored antioxidant defenses (GSH in lungs: SHAM= 0.79±0.07; MI=0.67±0.05; MI+PS=0.86±0.14; p<0.05), indicating its protective role in this scenario.

 Conclusions

Our work evidences the PS potential use as an adjuvant therapeutic approach after MI focusing on protecting pulmonary and right-sided heart tissues.

 Antioxidants Oxidative Stress, Nitric Oxidase Synthase Homeostasis Hormesis Pterostilbene NADPH Oxidases Myocardial Infarction Rats Introduction

Myocardial infarction (MI), an acute event that occurs when coronary blood flow is interrupted, culminates in hemodynamic, neuro-humoral, and metabolic alterations, which can negatively impact pulmonary function.1 , 2 The adverse post-MI cardiac remodeling induces modification of ventricular geometry and shifting of mitral valve leaflets which impairs its closing process, causing detrimental modifications that affect both ventricles. In fact, left ventricular MI with mitral regurgitation can lead to hemodynamic changes in the pulmonary vessels, ultimately reflecting in increased pulmonary arterial pressure. All these disturbances can trigger pulmonary hypertension secondary to left heart disease.3 In this scenario, the increased pulmonary vascular resistance (PVR) compromises the right heart, as a result of elevated right ventricle (RV) afterload, leading to increased wall thickness and decreased contractility of this chamber. These changes culminate in poor adaptive response, characterized by right ventricular dilation, dysfunction and failure.4 , 5

Important mediators associated with the infarction-induced cardiopulmonary damage are the reactive oxygen species (ROS), whose main sources are NADPH oxidases, xanthine oxidase, and mitochondria.6 - 8 In this sense, the antioxidant enzymatic system, constituted mainly by superoxide dismutase (SOD),catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GPx), represents the pivotal mechanism of defense against ROS-induced cellular damage.9 In addition to antioxidant enzymatic system, tissues can also recruit non-enzymatic antioxidants, such as reduced glutathione.10 , 11 However, antioxidant response of RV has been reported to be reduced after MI.12 In this situation, the counter regulatory response against redox homeostasis disruption may be coordinated by the antioxidant transcription factor known as nuclear factor 2 related to erythroid factor (Nrf2).13 Indeed, Nrf2 regulates the expression of several redox proteins through induction of the antioxidant response elements (ARE), mainly in oxidative stress conditions14 and can be activated by natural antioxidants, such as pterostilbene (PS).15

PS is a compound found in a wide variety of berries, such as blueberries ( Vacciniumspp ) and grapes ( Vitisspp ). Chemically it corresponds to dimethylated resveratrol (trans-3,5-dimethoxy-4’-hydroxy-stilbene), differing from it in terms of its higher lipophilicity.15 The mechanism of action of stilbenes has been related to the reduction of ROS levels, such as hydrogen peroxide and superoxide anions, as well as the increase in intracellular availability of enzymatic and non-enzymatic antioxidants.16 Our group has reported improvement in left ventricle morphological parameters, as well as in oxidative stress markers, in infarcted rats treated with PS (100 mg kg/day).15 However, there are no studies evaluating whether this compound could cause an attenuation of infarction-induced damage in the lungs and RV. In view of that, the objective of this study was to evaluate the impact of myocardial infarction on oxidative stress in the lung tissue and RV and explore whether PS administration could improve redox homeostasis in these organs.

 Methods Chemicals

PS was purchased from Changsha Organic Herb (Changsha, China). Hydroxypropyl--cyclodextrin (HPCD) was supplied by Roquette Frères (Lestrem, France). PS preparation and complexation with HPCDin order to enhance its water solubility was conducted as previously described.15

 Ethical

Wistar male rats (60 day-old) were obtained from the Center for Reproduction and Experimentation of Laboratory Animals of the Federal University of Rio Grande do Sul. The animals were allocated in polypropylene boxes (340 x 200 x 410 mm) with three/four animals per cage. Animals were kept under standard conditions: temperature (20–25°C), light–dark cycles of 12 hours and relative humidity of 70%. Water and commercial feed were offeredad libitum . The experimental protocol was carried out in accordance with the International Guidelines for Use and Care of Laboratory Animals and National Council for Control of Animal Experimentation. The protocol only started after the University’s Ethical Committee for Animal Experimentation had approved it (#35451).

 Experimental design

In the beginning of the experimental protocol, the animals were randomly divided and all assessments were performed blindly.15 Myocardial infarction surgery and PS administration were performed according to previous studies from our group.17 The rate of mortality during the infarction surgery procedure was 10%. After the surgery, 17 rats were allocated into the following groups: Sham (n=6), infarcted group (MI) (n=5), and infarcted group treated with PS (MI+PS) (n=6). The evaluation of myocardial infarction area size was performed using echocardiography (Philips HD7 XE Ultrasound System with an L2-13 MHz transducer), at the day 7 of the experimental protocol. After this evaluation, PS (100mg/kg/day, via gavage) for MI+PS group, and vehicle (aqueous solution via gavage) administrations for SHAM and MI groups, were started for 8 days. After the treatment period, animals were submitted to euthanasia; the lungs and right ventricles (RVs) were collected for morphometric and biochemistry analyses.

 Echocardiographic evaluation

The echocardiographic analyses (14 days after infarction) were performed using the EnVisor Philips system (Andover, MA, USA) with a high-frequency and high-resolution transducer (12-3 MHz), and conducted by a trained operator with experience in rat’s echocardiography and unaware of treatment.18 The animals were anesthetized (ketamine 90 mg/kg; xylazine 20 mg/kg, i.p.) and placed in lateral decubitus to obtain the images. Left ventricle (LV) images were assessed in three planes: basal, middle and apical. LV fractional shortening (FS) values were obtained by using the following equation: LVFS = DD − SD/DD × 100 (diastolic diameter — DD; systolic diameter — SD). LV end-systolic (ESV) and end-diastolic volumes (EDV) were measured as previously described.18 Systolic output (SO) was calculated as SO = EDV – ESV.19 On each echocardiographic transverse plane (basal, middle and apical) the arch corresponding to the segments with infarction (regions or segments of the myocardium showing one of the following changes in myocardial kinetics: systolic movement akinesis and/or hypokinesis region — AHR) were measured to indicate infarcted perimeter.18 , 19 The evaluation of infarcted perimeter was used to estimate myocardial infarction size.

 Morphometric analysis of left and right ventricles and lungs

Euthanasia was performed through anesthetic overload (ketamine 90 mg/kg and xylazine 10 mg/ kg, intraperitonially) and confirmed by cervical dislocation. After euthanasia, the lungs, left and right ventricle were used for morphometric and biochemical measurements. The left lung was used for the determination of the lung/body weight ratio, in order to evaluate lung congestion. In order to perform the hypertrophy indexes of the right and left ventricles, the ventricle/body weight and ventricle/tibia length ratios were calculated.20

 Preparation of lung and right ventricle homogenates

The right lung was prepared for the following oxidative stress analyses: total ROS, lipid peroxidation, total glutathione, reduced glutathione, thiol concentration, antioxidant enzyme activities, and Nrf2 protein expression. The RVwas homogenized to assay NADPH oxidases and nitric oxide synthase activities, sulfhydryl levels, and xanthine oxidase immunocontent. Lung and RV homogenization was performed for 40 seconds with Ultra-Turrax (OMNI Tissue Homogeneizer, OMNI International, USA) in the presence of 1.15% KCl (5 mL/g tissue) and 100 mmol/L phenyl methyl sulfonyl fluoride. Samples were centrifuged (20 minutes at 10000 x g at 4°C), and the supernatant was collected and stored at 80°C until the analyses.21 The biochemistry analyses were performed by researcher unaware of treatment.

 Oxidative stress evaluation

In pulmonary tissue, total ROS concentration was determined by the fluorescence method through reaction with dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) (Sigma-Aldrich, USA). Data were expressed as pmol/mg protein.22 Lipid peroxidation was measured by the reaction of oxidation products with the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and the results were represented as nmol/ mg protein.23 Total glutathione (GSH Total) and glutathione disulfide (GSSG) levels were determined by the reduction of 5,5-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) by nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) catalyzed by glutathione reductase. Data were expressed as µmol/min/mg tissue.24

 NADPH Oxidase Activity

The activity of the NADPH oxidase enzyme was determined through the evaluation of NADPH consumption at 340 nm. The results were expressed as nanomoles of NADPH per minute per milligram of protein (nmol / min / mg protein).25

 Determination of enzymatic and non-enzymatic antioxidants

Superoxide dismutase (SOD) activity was determined through inhibition of pyrogallol auto-oxidation, and the results were expressed as units SOD/mg protein.26 Catalase (CAT) activity evaluation was based on the hydrogen peroxide consumption monitoring the absorbance decay at 240 nm Results were expressed as pmol/min/mg protein.27 Glutathione peroxidase (GPx) activity was estimated from the NADPH oxidation, which was coupled to recycling reaction from GSSG to GSH, evaluated at 340 nm. Results were expressed as nmol/mg protein.28 The total amount of sulfhydryl (SH) groups, in the lung tissue, was determined through thiol groups reaction with DTNB. The concentration of total sulfhydryl groups was expressed as nmol TNB/ mg protein.29 The protein concentration was measured by the method of Lowry.30

 Nitric oxide synthase enzyme activity

The activity of the nitric oxide synthase enzyme was evaluated by measuring the conversion of oxyhemoglobin (HbO2) to methemoglobin, induced by the presence of nitric oxide, as previously described. The values were expressed as nmol NO/min/mg protein.31

 Evaluation of Nrf2 and Xanthine oxidase immunocontent

The Nrf2 and xanthine oxidase immunocontents were determined by Western blot as previously described.32 Nrf2 and xanthine oxidase antibodies were used as primary antibodies (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Primary antibodies were detected using anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugate secondary antibodies. The membranes were developed using chemiluminescence reagents. The autoradiographs generated were scanned and bands were measured using a densitometer software (Imagemaster VDS CI, Amersham Biosciences Europe, IT). The Nrf2 and xanthine oxidase molecular weights bands were determined by reference to a standard molecular weight marker (RPN 800 rainbow full range Bio-Rad, CA, USA). The results were normalized by Ponceau red method.33

 Statistical analysis

The calculation of sample size were considered probability of error = 0.05 and test the statistical power (1- error probability) = 0.90. The distribution of data was evaluated by the Shapiro–Wilk test. Since the data presented normal distribution, the results were analyzed using one-way ANOVA with the Student-Newman-Keuls post-hoc test to detect differences between groups, and results were expressed as mean ± standard deviation (SD). Differences were considered significant when p<0.05. Data were analyzed using the Sigma Plot software (Jandel, Scientific Co, v. 11.0, San Jose, CA, USA).

 Results Morphometric results

The infarcted rats of both groups (MI and MI+PS) presented a similar infarction perimeter. This result indicates that there were no differences between the infarcted groups in terms of infarction size. Lung congestion had no difference among the experimental groups. In the same way, there was no change in the right ventricle hypertrophy indexes, calculated by right ventricle/body weight and right ventricle/tibia length ratios, as well as right ventricle weight among the groups ( Table 1 ).

Morphometric results of lung and left and right ventricles
SHAM (n=5) MI (n=5) MI+PS (n=6)
Lung/body weight (g/g) 4.01±0.99 5.99±0.44a 5.24±1.21
RV (g) 0.17±0.037 0.20±0.02 0.24±0.07
RV/tibia length (g/cm) 0.48±0.09 0.57±0.07 0.66±0.19
RV/body weight (mg/g) 0.50±0.11 0.60±0.04 0.70±0.23
LV (g) 0.75±0.06 0.75±0.08 0.73±0.07
LV/tibia length (g/cm) 2.05±0.19 2.09±0.22 2.00±0.18
LV/body weight (mg/g) 2.15±0.24 2.21±0.22 2.11±0.15

Data are shown as mean ± SD. One-way ANOVA with the Student-Newman-Keuls post-hoc test. aP<0.05 vs SHAM. RV: Right ventricle; LV: Left ventricle; SHAM: Control group; MI: myocardial infarction group; MI + PS: myocardial infarction + pterostilbene.

Echocardiographic parameters

Evaluating morphologic parameters of the left ventricle, both MI and MI+PS groups presented an increase in end-systolic and end-diastolic volumes in comparison with SHAM animals, indicating ventricular dilatation. However, MI+PS animals presented a lower increase in end-systolic volume in relation to MI. Systolic output and heart rate were not different among the groups. Left ventricle fractional shortening, which indicates its contractility, was decreased in both MI and MI+PS groups in relation to SHAM animals, indicating a worsening in the systolic function of this chamber, and PS administration was not effective in improving this parameter. In relation to infarcted perimeter, there was no difference between MI and MI+PS groups ( Table 2 ).

Echocardiographic evaluation of left ventricle
SHAM (n=6) MI (n=5) MI+PS (n=6)
LVESV (mL) 0.08±0.05 0.46±0.15 a 0.32±0.06 ab
LVEDV (mL) 0.29±0.09 0.68±0.14 a 0.57±0.06 a
Systolic output (mL) 0.21±0.04 0.22±0.03 0.24±0.04
Heart rate (bpm) 249±16 242±15 237±27
Shortening Fraction (%) 51.5±5.4 15.8±1.7a 17.0±2.9a
Infarcted perimeter (cm) ------------ 1.81±0.45 1.60±0.22

Data are shown as mean ± SD. One-way ANOVA with the Student-Newman-Keuls post-hoc test. aP<0.05 vs SHAM; bP<0.05 vs MI. LVESV: Left ventricle end-systolic volume; LVEDV: Left ventricle end-diastolic volume; RV: Right ventricle; LV: Left ventricle; SHAM: Control group; MI: myocardial infarction group; MI + PS:

ROS levels, lipid peroxidation, and antioxidant response in lung tissue

Oxidative stress was measured via dichlorofluorescein (DCF) production (an indicator of total ROS levels) and TBARS (an indicator of lipid peroxidation) in the lung tissue. Regarding total ROS, MI+PS group showed increased levels as compared to both SHAM and MI (p<0.05) ( Figure 1A ). However, it was not observed any difference between MI and SHAM groups. Although reactive species levels were increased in MI+PS group, lipid peroxidation was decreased in the lung tissue of these animals compared to MI group (p<0.05). Besides that, lipid peroxidation in MI+PS group was not different compared to SHAM group, indicating a reduction of oxidative damage promoted by PS administration ( Figure 1B ).

<italic>Lung oxidative stress A) Total reactive oxygen species concentration; B) Thiobarbituric acid reactive substances. Data are expressed as mean ± SD. One-way ANOVA with the Student-Newman-Keuls post-hoc test. a P<0.05 vs SHAM; b P<0.05 vs MI. SHAM: Control group; MI: myocardial infarction group; MI + PS: myocardial infarction + pterostilbene.</italic>

In terms of non-enzymatic antioxidant defenses, there were no significant changes in GSH levels in MI rats compared to SHAM. However, in relation to this parameter, PS treatment demonstrated a positive effect in the lungs of MI+PS animals, since GSH levels were increased in this group when compared to SHAM and MI (p< 0.05) ( Table 3 ). Nevertheless, GSSG levels, GSH/Total glutathione and GSSG/Total glutathione ratios did not present differences among the groups.

Redox parameters in the lungs
SHAM (n=6) MI (n=5) MI+PS (n=6)
GSH (µmol/min/mg tissue) 0.79±0.07 0.67±0.05 0.86±0.14b
GSSG (µmol/min/ mg tissue) 0.24±0.09 0.46±0.20 0.36±0.14
Total glutathione (µmol/min/mg tissue) 1.27±0.13 1.40±0.22 1.55±0.33
GSH/ Total glutathione 0.63±0.11 0.49±0.12 0.57±0.15
GSSG/ Total glutathione 0.18±0.05 0.29±0.17 0.19±0.08

Data are shown as mean ± SD. One-way ANOVA with the Student-Newman-Keuls post-hoc test b P<0.05 vs MI. Control group = SHAM; myocardial infarction group = MI, myocardial infarction + pterostilbene = MI+PS. GSH = reduced glutathione; GSSG = oxidized glutathione (unit in µmol/min/mg tissue).

Besides GSH, PS administration also seems to improve the enzymatic antioxidant defenses in the lungs. SOD activity was reduced in MI group compared to SHAM. However, such enzymatic activity was recovered by PS (p<0.05) ( Figure 2A ). In addition, catalase presented an increased activity in MI+PS group in relation to both SHAM and MI groups (p<0.05) ( Figure 2B ). Both GPx activity and total –SH, however, did not change among the groups ( Figures 2C and 2D , respectively).

<italic>Lung antioxidant measurements. A) Superoxide dismutase activity; B) Catalase activity; C) Glutathione peroxidase activity; D) Total sulfhydryl groups. Data are expressed as mean ± SD. One-way ANOVA with the Student-Newman-Keuls post-hoc test. a P<0.05 vs SHAM; b P<0.05 vs MI. SHAM: Control group; MI: myocardial infarction group; MI + PS: myocardial infarction + pterostilbene</italic> .

Nrf2 protein expression in the lung tissue

Nrf2 expression may be involved with the antioxidant effects of PS. Nrf2 is a protein related with the regulation of antioxidant enzymes transcription and can be stimulated by molecules such as phenolic compounds. Indeed, our data showed that PS treatment promoted a significantly increase in Nrf2 protein expression in the MI+PS group compared to MI group (p<0.05). There was no difference in Nrf2 expression between SHAM and MI groups ( Figure 3 ).

<italic>Lung’s western blot analysis of Nrf2 expression. A representative gel showing 1 band for each experimental group is provided. Data are expressed as mean ± SD. One-way ANOVA with the Student-Newman-Keuls post-hoc test. b P<0.05 vs MI. SHAM: Control group; MI: myocardial infarction group; MI + PS: myocardial infarction + pterostilbene</italic> .

Evaluation of xanthine oxidase and NADPH oxidase in the RV

Myocardial infarction stimulated pro-oxidant enzymes, which were attenuated by PS administration. In relation to this, xanthine oxidase protein expression was augmented in the RV of MI group in comparison to the other groups (p<0.05). However, in MI+PS group, xanthine oxidase levels were not different from SHAM group, indicating an attenuation of this pro-oxidant enzyme in the infarcted animals treated with PS. In the same way, there was an increase in NADPH oxidase activity in MI group compared to SHAM, which seemed reduced in MI+PS group (p<0.05), showing the contribution of PS treatment to reduce the superoxide anion radical production in RV ( Figure 4A and 4B ).

<italic>Right ventricle oxidative stress. A) Western blot analysis of xanthine oxidase expression. A representative gel showing 1 band for each experimental group is provided; B) NADPH oxidases activity. Data are expressed as mean ± SD. One-way ANOVA with the Student-Newman-Keuls post-hoc test. a P<0.05 vs SHAM; b P<0.05 vs MI. SHAM: Control group; MI: myocardial infarction group; MI + PS: myocardial infarction + pterostilbene</italic> .

Sulfhydryl concentration and NOS activity in RV

Sulfhydryl concentration (thiol groups relevant as non-enzymatic antioxidants) was decreased in MI group compared to SHAM (p<0.05); however, MI+PS group reestablished the sulfhydryl levels (p<0.05). Besides that, infarcted non-treated rats showed reduced NOS activity when compared to SHAM animals, while treatment with PS recovered this enzyme activity (p<0.05) ( Figure 5A and 5B ).

<italic>A) Right ventricle total sulfhydryl groups; B) Right ventricle nitric oxide synthase activity. Data are expressed as mean ± SD. One-way ANOVA with the Student-Newman-Keuls post-hoc test. a P<0.05 vs SHAM; b P<0.05 vs MI. SHAM: Control group; MI: myocardial infarction group; MI + PS: myocardial infarction + pterostilbene</italic> .

Discussion

The main finding of this study was to demonstrate that treatment of infarcted rats with PS promoted beneficial effects in the lungs and in the RV. Evaluating the left ventricle morphology and function after infarction, both infarcted groups showed cardiac dilatation, as demonstrated by the increase in cardiac volumes, and contractility impairment, as shown by the decrease in fractional shortening. PS administration, however, attenuated the increase in end-systolic volume, which seems to be a positive result, since the increase in end-systolic volume can be related to the development of lung congestion. In fact, PS treatment prevented lung congestion, evaluated by lung/ body weight ratio. The infarcted perimeter was not different between MI and MI+PS rats, demonstrating the homogeneity of the cardiac injury between these groups. In terms of morphometric parameters, neither the right nor the left ventricle of the infarcted groups presented hypertrophy. These results could be related with the fact that the animals were evaluated only 14 days after infarction. In this time point, a previous study from our group also did not find any difference in these parameters.32

The lungs are the organs most affected by heart failure, and pulmonary dysfunction are a key factor for poor clinical outcomes in infarcted patients.34 Nevertheless, our study found no changes in total ROS levels in the lungs of infarcted rats. On the other hand, the lungs of MI+PS group showed increased ROS levels, which is in accordance with the reported role of stilbenes in inducing ROS production in vitro .16 MI group showed an increased in the lipid peroxidation, indicating oxidative damage in the lungs. MI+PS group, however, showed a reduction in lipid peroxidation-induced pulmonary injury, since there was a decrease in TBARS levels. In view of that, a possible hypothesis is that this increase in ROS levels caused by PS administration could represent a hormetic mechanism,35 which leads to an increase in the antioxidant defenses, preventing lipid peroxidation. In fact, previous studies with other natural compounds that also present a pro-oxidant effect, such as sulforaphane, have already described this protective mechanism caused by antioxidant system stimulation.36 Indeed, PS treatment may provoke an adaptation against increased ROS levels through cellular oxidative changes in SOD and CAT, which are two important enzymes that belong to the first line of defense against oxidative stress.9 In our study, reduced SOD activity in the lungs of MI group suggests a deficient protection against anion superoxide radical, which could cause an increase in oxidative stress in later stages of MI.17 On the other hand, PS treatment recovered SOD activity in MI+PS group, demonstrating its protective effect in redox homeostasis. Our results showed increased CAT activity in the pulmonary tissue of MI+PS group. Since hydrogen peroxide may react with metals, such as iron, and produce hydroxyl radical,37 this increased CAT activity in MI+PS groups arises as an important defense against the production of this radical in the lungs. In terms of non-enzymatic defenses, it was found an increase in GSH concentration in the lungs of MI+PS group. GSH is the most prevalent low-molecular-weight antioxidant peptide38 and participates in redox regulation and homeostasis.39 In the present study, increased GSH concentration could have contributed to reduced TBARS levels in MI+PS group, decreasing oxidative stress in these animals. Besides enzymatic and non-enzymatic defenses stimulation, PS could also induce improvement in antioxidant profile in the pulmonary tissue through stimulation of cytoprotective proteins, such as Nrf2.40

In this context, Nrf2 acts as a redox sensitive transcription factor, playing a key role in pulmonary antioxidant response. In situations of redox balance, Nrf2 is anchored to Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1). However, when there is a redox homeostasis disruption, Nrf2-Keap1 complex dissociates and release Nrf2, which can translocate into the nucleus, and initiate the transcription of antioxidant molecules.40 Indeed, studies in the literature have demonstrated that Nrf2 plays an important role in the synthesis of endogenous antioxidant enzymes.41 Moreover, according to Lacerda et al.15 PS up-regulates the expression of Nrf2, which increases cellular GSH and mitigates oxidative damage.15 In our study, Nrf2 immunocontent levels was increased in the lungs of MI+PS rats, suggesting that PS induces Nrf2 activation, which could be an explanation for the improvement in the antioxidant defenses and the reduction in lipid peroxidation. In view of these data, PS showed to be protective to the lungs after infarction, since prevented pulmonary congestion, increased SOD and CAT activities, increased GSH levels and prevented lipid peroxidation, as well as induced Nrf2, which is a cytoprotective protein.

Regarding the RV, the pro-oxidative scenario of myocardial infarction affects significantly this chamber.20 Our results showed that myocardial infarction leads to elevated xanthine oxidase expression in the RV. Wang et al.,42 showed increased xanthine oxidase levels in the heart 12 weeks post-infarction, associated with lipid peroxidation and cardiac dysfunction.42 Besides that, NADPH oxidase activity, which is an important source of ROS, was also evaluated in our study. This enzyme activity was elevated in MI rats, and PS administration was capable of prevent this increase. The elevated xanthine oxidase levels and NADPH oxidases activities observed predispose the RV to increased superoxide anion concentration, and consequently antioxidant reserve depletion. Corroborating these results, we also found reduced sulfhydryl levels in MI group. MI+PS group, however, showed increased thiol groups content. In the MI group, the elevated superoxide anion concentration, produced by NADPH oxidases and xanthine oxidase, may interfere unfavorably in the ROS/NO balance in the RV. In fact, our results showed reduced NOS activity in the right chamber of MI group. NOS is a relevant enzyme in NO production, which plays critical role in cardioprotection.43 In the present study, PS administration prevented NOS activity reduction, which occurred in MI group. Nevertheless, considering the effect of this compound in blunting pro-oxidant enzymes, such as NADPH oxidase and xanthine oxidase, concomitant with partial NOS activity retrieval, PS seems to contribute in the maintenance of a cardioprotective ROS/NO balance in the RV.

 Conclusions

In conclusion, PS administration promoted beneficial effects in the lungs of infarcted animals, decreasing lipid peroxidation and increasing antioxidant defenses, such as SOD and catalase activities and GSH levels. Besides that, this compound prevented the increase in NADPH oxidase activity and in xanthine oxidase expression in the RV of infarcted animals. These results were probably related with an improvement in ROS/NO balance in this chamber. In view of that, our findings suggest that PS effectively presents protective effects in the lungs and RV after myocardial infarction.

<italic>Graphical abstract</italic> .

Acknowledgements

This work was funded by the Brazilian National Council for Scientific Development (CNPq) and Brazilian Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES).

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Alex Sander da Rosa Araujo, from Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.