Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC 3T4KsjHmXXCnyfQ9QvhrbKC S0066-782X2022000200400 abc.20200945 10.36660/abc.20200945 Artigo Original Níveis de Interleucina-35 em Pacientes com Doença Arterial Coronariana Estável Oflar Ersan 1 Sahin Mustafa Hakan 2 Demir Bulent 3 Ertugrul Abdulcelil Sait 1 0000-0003-4108-6405 Oztas Didem Melis 4 Beyaz Metin Onur 5 Ugurlucan Murat 5 Caglar Fatma Nihan Turhan 1 Bakirkoy Dr Sadi Konuk Training and Research Hospital Departamento de Cardiologia Istambul Turquia Bakirkoy Dr Sadi Konuk Training and Research Hospital, Departamento de Cardiologia,Istambul - Turquia Akdeniz Saglik Yasam Vakfi Departamento de Cardiologia Antália Turquia Akdeniz Saglik Yasam Vakfi, Departamento de Cardiologia,Antália - Turquia Turkish Hospital Departamento de Cardiologia Doha Qatar Turkish Hospital, Departamento de Cardiologia,Doha - Qatar Bagcilar Training and Research Hospital Departamento de Cirurgia Cardiovascular Istambul Turquia Bagcilar Training and Research Hospital, Departamento de Cirurgia Cardiovascular,Istambul - Turquia Istanbul Medipol University Faculty of Medicine Departamento de Cirurgia Cardiovascular Istambul Turquia Istanbul Medipol University Faculty of Medicine, Departamento de Cirurgia Cardiovascular,Istambul - Turquia Correspondência: Fatma Nihan Turhan Caglar • Bakirkoy Dr. Sadi Konuk Education and Research Hospital, Bakirkoy, Istambul, Turquia. E-mail: nhnturhan@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Oflar E, Sahin MH, Demir B, Ertugrul AS, Caglar FNT; Obtenção de dados: Oflar E; Análise e interpretação dos dados: Oflar E, Caglar FNT; Redação do manuscrito: Oflar E, Oztas DM, Beyaz MO, Ugurlucan M, Caglar FNT; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Oflar E, Sahin MH, Demir B, Ertugrul AS, Oztas DM, Beyaz MO, Ugurlucan M, Caglar FNT.

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo

 07 03 2022 2 2022 118 2 400 408 10 09 2020 29 01 2021 24 02 2021 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

Foi demonstrado que as subunidades de interleucina-35 (IL-35) estão fortemente expressas nas placas ateroscleróticas em humanos. Assim, considera-se que elas têm um papel na aterosclerose.

 Objetivos

Neste estudo, os níveis de IL-35 foram comparados com o grupo controle em pacientes com doença arterial coronariana (DAC) estável, e a associação entre os níveis de IL-35 e o tipo, gravidade e extensão da lesão foram investigadas com o escore Gensini (GS) e o escore Syntax (SS) no grupo de pacientes

 Métodos

Sessenta pacientes (18 mulheres e 42 homens) com DAC, diagnosticados por meio da angiografia coronária, que apresentaram dor no peito típica e teste de esforço não invasivo positivo, e 46 pacientes (18 mulheres e 28 homens) com luminograma normal, foram incluídos no estudo. Tanto o GS quanto o SS foram calculados para o grupo de pacientes, e esses valores foram comparados com os níveis de IL-35. Variáveis com distribuição não normal foram avaliadas com o teste U de Mann-Whitney, enquanto os parâmetros com distribuição normal foram analisados com o teste t de Student. A diferença entre as variáveis categóricas foi avaliada pelo teste de qui-quadrado ou de Fisher. Os valores de p<0,05 foram considerados como estatisticamente sinificativos.

 Resultados

Não foram observadas diferenças significativas entre pacientes e o grupo controle em termos de características demográficas e achados laboratoriais. Em comparação ao grupo controle, os níveis de IL-35 no grupo com DAC foram consideravalmente menores (36,9±63,9 ng/ml vs. 33,2±13,2 ng/ml, p<0,008). Embora não tenha sido estatisticamente significativo, os níveis de IL-35 foram maiores em pacientes com SS mais baixo do que nos com SS mais alto (33,2±13,7 vs. 31,8±8,9, p=0,51). Os valores de IL-35 em pacientes com GS alto foram significativamente mais baixos do que em pacientes com GS baixo (35±17,4 vs. 30,7±8,6, p=0,043).

 Conclusão

Demonstrou-se que os níveis de IL-35 podem ser um novo biomarcador para a DAC estável, e que a IL-35 está associada à extensão da DAC.

 Aterosclerose Doença da Artéria Coronariana Interleucina-35 Pontuação de Propensão (Escore Gensini, Escore Syntax Introdução

A doença arterial coronariana (DAC) é uma das principais causas de morte pelo mundo, embora a prevalência de mortalidade por DAC tenha recentemente apresentado queda na Europa e nos Estados Unidos.1,2 A DAC é uma disfunção progressiva e sistêmica causada pela aterosclerose.3

Embora a inflamação tenha papel importante no desenvolvimento da aterosclerose, o mecanismo que a causa não está claro até o momento.4 As citocinas anti-inflamatórias, como a interleucina-10 (IL-10), e o fator de crescimento transformante beta tipo 1 (TGF-1) são amplamento avaliados nos ensaios sobre aterosclerose.5-11 Estudos publicados recentemente demonstraram que enquanto os níveis baixos de IL-10 e TGF-1 estão associados à progressão da aterosclerose e ao desenvolvimento da síndrome coronariana aguda, níveis altos de IL-10 e TGF-1 estão correlacionados ao bom prognóstico na DAC.5-11

A interleucina-35 (IL-35), uma citocina anfi-inflamatória recentemente definida, suprime a atividade das células CD4+T, induz a produção de células T regulatórias e reduz a progressão de doenças inflamatórias e autoimunes; por isso, tem um papel importante na aterosclerose.12-15

O objetivo deste estudo foi avaliar os níveis plasmáticos de IL-35 em pacientes com DAC estável e a associação entre IL-35 e a gravidade e extensão da DAC utilizando os escores Syntax (SS) e Gensini (GS).

 Métodos

Este é um estudo transversal e observacional realizado em um centro de referência terciário. Cento e seis pacientes consecutivos, que foram submetidos à angiografia coronária diagnóstica no Bakırköy Dr. Sadi Konuk Research and Training Hospital – Clínica de Cardiologia, entre julho de 2018 e maio de 2019, foram incluídos no estudo. O grupo de pacientes consistia de 60 pacientes (42 homens e 18 mulheres) com DAC estável que apresentaram estenose arterial coronária epicárdica de mais de 50% na angiografia coronária (AGC). O grupo controle consistia de 46 pacientes (28 homens e 18 mulheres) com dor no peito, mas AGC normal. Todos os pacientes tinham sido submetidos à avaliação objetiva da isquemia modificada, e todos tiveram resultados positivos em relação à isquemia. O número necessário de pacientes foi decidido com base em estudos prévios.7 Os pacientes adequados para o estudo de acordo com os critérios de inclusão foram incluídos até atingirmos o número necessário de indivíduos entre julho de 2018 e maio de 2019.

O diagnóstico prévio de diabetes melitus (DM), o uso de remédios para diabetes ou o nível de glicose em jejum de 126 mg/dl em dois momentos, em pacientes previamente não tratados, foram necessários para diagnosticar a DM. A hipertensão (HT) foi definida com base no uso prévio de medicações para hipertensão, pressão sistólica maior que 140 mmHg, ou pressão diastólica maior que 90 mmHg em pelo menos dois momentos separados. A taxa de filtração glomerular (TFG) foi estimada utilizando a equação da Modificação de Dieta em Doença Renal (MDRD) na internação. O Índice de Massa Corporal (IMC) foi calculado de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS). A hiperlipidemia (HL) foi definida com base no uso prévio de antilipêmicos nos seis meses anteriores, ou altos níveis de lipídios séricos medidos após 8 horas de jejum [lipoproteína de baixa densidade (LDL) >160 mg/dl, colesterol total (CT) >240 mg/dl, ou triglicérides (TG) >160 mg/dl)].

Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento, e este estudo está de acordo com a Declaração de Helsinki. Nossa pesquisa foi aprovada pelo Conselho de Ética Institucional.

Pacientes com DAC diagnosticada, TFG estimada (TFGe) <60ml/min, aqueles com doença valvar, indivíduos com pressão arterial sistólica maior que 140 mmHG e pressão arterial diastólica maior que 90 mmHg apesar do tratamento, insuficiência cardíaca, insuficiência renal, infecção aguda/crônica, febre, dores musculares, dores de cabeça, indivíduos em uso de antibióticos, indivíduos com doença imunoproliferativa, doença reumática, câncer, osteoporose e aqueles com mais de 75 anos foram excluídos.

Avaliação objetiva da isquemia

Todos os pacientes tinham sido submetidos a um teste de esforço não-invasivo para a avaliação da isquemia. Na maior parte dos casos, o protocolo de Bruce modificado foi realizado. Uma depressão de segmento ST de pelo menos 1 mm, horizontal ou decrescente, em derivações ≥2 após 60*80 milissegundos desde o ponto J durante o exercício, foi considerada anormal. O escore de Duke foi usado para a estratificação do risco.11 Uma AGC foi realizada em pacientes que tinham escore de Duke médio ou alto. Uma cintilografia do miocárdio perfusão (CMP) foi realizada para avaliar a isquemia em pacientes internados com bloqueio atrioventricular de primeiro grau ou depressão de ST ≥1mm no eletrocardiograma de repouso (ECG), teste de esforço não diagnóstico, ou com pouca capacidade de esforço. A AGC foi realizada em pacientes que apresentavam nível de isquemia médio ou alto na CMP.

 Medidas de biomarcadores

Todos os dados laboratoriais dos pacientes, como troponina cardíaca T (TnT), creatinina, contagem de leucócitos, proteína C reativa de alta sensibilidade (PCR-as) etc., foram documentados.

Amostras sanguíneas para IL-35 foram coletadas no laboratório de cateterização antes da angiografia coronária em todos os participantes. As amostras foram obtidas por punção venosa com uso de EDTA (ácido etilenodiaminotetracético), em tubos sem aditivos, e imediatamente centrifugadas a 4.000 rpm por 10 minutos. As amostras foram coletadas após a centrifugação e armazenadas a -80ºC até a análise (não mais do que 6 meses).

As amostras foram descongeladas somente uma vez. A técnica do sanduíche, duplo anticorpo à base de biotina, utilizando o kit ELISA, foi usada para a análise de IL-35 (interleucina 35 humana: Yehua Biological Technology; Cat No:YHB1739Hu). A IL-35 foi adicionada a poços pré-revestidos com o anticorpo monoclonal IL-35, e, depois, incubada. Após a incubação, os anticorpos anti-IL-35 identificados com biotina foram adicionados à unidade com estreptavidina-HRP para formar o complexo imune. Após a lavagem, as enzimas não ligadas foram removidas e, depois, adicionadas aos substratos A e B. A solução tornou-se azul e transformou-se em amarelo com o efeito do ácido. Os tons da solução e a concentração de IL-35 estiveram positivamente correlacionados. Os resultados foram expressos em ng/ml. Os coeficientes de variação (CV) intra e entre ensaios da análise foram de <10% e <12%, respectivamente.

 Angiografia coronária

Todos os procedimentos de AGC foram realizados com o técnica de Judkins, por meio de um procedimento de cineangiografia (Axiom Artis, Siemens, Alemanha). Todas as angiografias foram registradas em compact discs (CDs), no formato DICOM, e visualmente examinadas por dois cardiologistas intervencionistas experientes e cegos para o estudo. A gravidade e extensão da DAC foram avaliadas de acordo com os SS e GS. O nível de estreitamento do lúmen, a concentricidade e a excentricidade foram avaliados. De acordo com o GS, 1 ponto é dado para 1-25% de estenose; 2 pontos, de 26-50%; 4 pontos, de 51-75%; 8 pontos, de 76-90%; 16 pontos, de 91-99%; e 32 pontos para 100%. Depois, o número de pontos para cada lesão é multiplicado pelo coeficiente considerado para cada segmento vascular principal, de acordo com a significância funcional do vaso (artéria coronária principal esquerda x 5; segmento proximal da artéria coronária descendente anterior esquerda x 2,5; segmento proximal da artéria circunflexa x 2,5; segmento médio da artéria coronária descendente anterior esquerda x 1,5; artéria coronária direita, segmento distal da artéria coronária descendente anterior esquerda, artéria posterolateral e artéria obtusa marginal x 1; e outros x 0,5), e a soma de todos os pontos constitui a pontuação total.16 O escore foi realizado com dois observadores e o valor médio. GS < 20 foi considerado como DAC leve (grupo 1), e GS ≥ 20 foi considerado como DAC grave (grupo 2). A SS correspondendo à complexidade da lesão foi medida pelas características da árvore coronária, assim como a localização da lesão e suas especificidades.17 O escore é medido por meio de uma calculadora virtual de acesso livre (www.syntaxscore.com). A pontuação foi realizada e a média foi calculada por dois observadores, cegos aos grupos do estudo.

 Análise estatística

A análise estatística foi realizada com o software SPSS, versão 16. A distribuição normal das variáveis contínuas foi analisada por métodos visuais (historama) e analíticos (Kolmogorov-Smirnov). As variáveis contínuas com distribuição normal foram demonstradas como média±desvio padrão (DP). Variáveis contínuas com distribuição não normal foram demonstradas como mediana e intervalo interquartil. As variáveis de distribuição não normal foram avaliadas com o teste U de Mann-Whitney, enquanto os parâmetros de distribuição normal foram analisados pelo test t de Student não pareado. As diferenças entre as variáveis categóricas foram avaliadas pelo teste de qui-quadrado ou de Fisher. A associação entre variáveis de distribuição não normal foi analisada pelo teste de Spearman; por outro lado, o teste de Pearson foi usado para a correlação entre as variáveis de distribuição normal. O teste de qui-quadrado foi usado para a sensibilidade, especificidade, valores preditivos negativos e positivos. A análise de regressão logística foi realizada para demonstrar a IL-35 como um fator de risco independente da DAC entre os fatores de risco tradicionais. A efetividade e a compatibilidade do modelo criado foram verificadas com o teste de Hosmer-Lemeshow. Valores de p <0,05 foram considerados como estatisticamente significativos.

 Resultados

Os aspectos demográficos dos grupos de pacientes e controle estão demonstados na Tabela 1. Da mesma forma, a idade média do grupo de pacientes foi maior do que no grupo controle. Gênero, hábito de fumar, DM, HT, HL e IMC foram semelhantes entre os grupos (Tabela 1). Os achados laboratoriais dos grupos estão demonstrados na Tabela 2. Os níveis de IL-35 foram significativamente menores no grupo de pacientes em relação ao grupo controle (p=0,008) (Figura 1). Além disso, enquanto a contagem de leucócitos, níveis de colesterol total e lipoproteína de baixa densidade (LDL) estavam maiores no grupo de pacientes, a contagem de trombócitos foi mais baixa no grupo de pacientes em comparação ao grupo controle (Tabela 2). A Tabela 3 ilustra os níveis de IL-35 de acordo com os principais aspectos demográficos e laboratoriais no grupo de pacientes. Da mesma forma, os níveis de IL-35 foram significativamente mais baixos em indivíduos com diabetes no grupo de pacientes (p=0,042). Analisamos mais profundamente os níveis de IL-35 em ambos os grupos, em pacientes com e sem diabetes, para demonstrar se os níveis baixos de IL-35 em pacientes com DAC estavam relacionados à diabetes ou não (Tabela 4). Os níveis de IL-35 não estavam associados à presença de diabetes (p=0,18). Embora os níveis de IL-35 tenham sido semelhantes entre os pacientes com DAC com SS baixo (<22) e alto (≥22), foram menores em pacientes com DAC com GS alto (≥20) do que entre aqueles com GS baixo (<20) (p=0,51 e p=0,043, respectivamente) (Tabela 5). A análise de correlação entre IL-35 e outros parâmetros está demonstrada na Tabela 6. Os níveis de IL-35 tinham uma correlação negativa leve com o SS e com os níveis de colesterol total (p=0,036) (Figura 2) (Tabela 6). Por fim, na análise de regressão logística que incluía IL-35, HM, gênero, idade, HT, DM tipo 2 e hábito de fumar, somente a DM tipo 2 (p= 0,049, RR= 3,44, CI: 1,004-11,8), o hábito de fumar (p <0,001, RR= 11,27, IC: 3,45-36,83) e os níveis de IL-35 (p= 0,017, RR= 1,02, GA: 1,005 -1,053) tiveram um efeito independente na presença da DAC (Tabela 7). O ponto de corte para os níveis de IL-35 para detectar a DAC foi a avaliado pela análise ROC (Figura 3) (Tabela 8).

– Aspectos demográficos dos grupos de pacientes e controles
Paciente, n(%) Controle, n(%) Valor de p
Total 60(100) 46(100)
Idade (média±DP) 59±9,1 54,5(8,9) 0,013*
Sexo
Masculino 42(70) 28(60,9) 0,32
Feminino 18(30) 18(39,1)
Fumar 38(63,3) 12(26,1) <0,001
Diabetes 22(36,7) 10(21,7) 0,09
Hipertensão 38(63,3) 21(45,7) 0,07
Hiperlipidemia 16(26,7) 9(19,6) 0,008
IMC (média±DP) 26,3±4,4 28.2±3,8 0,07*

Teste de qui-quadrado, *teste t de Student; IMC: índice de massa corporal.

– Achados laboratoriais nos grupos de pacientes e controles
Grupo de pacientes Grupo controle Valor de p
IL-35 (pg/ml) Mediana: 33,2 Intervalo: 23,39-172,6 Mediana: 36,9 Intervalo: 23,39-238,1 0,008
Creatinina (mg/dl) Mediana: 0,8 Intervalo: 0,35-1,1 Mediana: 0,8 Intervalo: 0,42-1,2 0,43
Colesterol LDL (mg/dl)(média+DP) 149±39,3 116,5±35,9 <0,001*
Colesterol total (mg/dl) (média+DP) 229,5±47,1 190,5±46,3 <0,001*
Colesterol HDL (mg/dl) Mediana: 44 Intervalo: 25-72 Mediana: 45 Intervalo: 27-72 0,98
Triglicérides (mg/dl) (média+DP) 150,5±81 115,5±83,2 0,19*
Contagem de leucócitos (103/mm3) (média+DP) 8250±2670 6550±2030 0,006*
Hematócrito (%) Mediana: 40,8 Intervalo: 29,7-52,1 Mediana: 40,9 Intervalo: 28,6-50,2 0,93
Hemoglobina (g/dl) (média+DP) 13,9±1,7 13,4±1,8 0,37*
Contagem de trombócitos (103/mm3) (média+DP) 248±104 270±64,7 0,015*
Mediana: 2,6 0,09
PCR-as (mg/L) Mediana: 4,1 Intervalo: 0,32-18,2 Intervalo: 0,2-17,8
HbA1C(%) Mediana: 5,9 Intervalo: 4,0-13,2 Mediana: 5,8 Intervalo: 4,5-7,6 0,45

IL-35: Interleucina-35; LDL: lipoproteína de baixa densidade; HDL: lipoproteína de alta densidade; PCR-as: proteína C reativa de alta sensibilidade; HbA1C: Hemoglobina A1C. Teste U de Mann-Whitney, *teste t de Student

<italic><bold>–</bold> Níveis de IL-35 nos grupos de pacientes e controles (Box-plot).</italic>

– Níveis de IL-35 de acordo com os principais aspectos demográficos e laboratoriais no grupo de pacientes
Mediana/Intervalo Interquartil Valor de p
Sexo 0,55
Masculino Mediana: 34,7 Intervalo: 23,39-103,9
Feminino Mediana: 34,3 Intervalo: 26,5-172,6
Idade 0,12
<50 Mediana: 38,1 Intervalo: 27,2-172,6
≥50 Mediana: 34,7 Intervalo: 23,9-133,3
Hipertensão (+) Mediana: 34 Intervalo: 23,39-172,6 0,11
(-) Mediana: 35,8 Intervalo: 25,4-80,61
Diabetes (+) Mediana: 30,4 Intervalo: 23,9-172,6 0,042
(-) Mediana: 35,0 Intervalo: 24,16-133,3
Fumar (+) Mediana: 35,0 Intervalo: 27,11-133,3 0,5
(-) Mediana: 34,1 Intervalo: 23,39-172,6
Hiperlipidemia (+) Mediana: 34,6 Intervalo: 25,4-133,3 0,56
(-) Mediana: 34,1 Intervalo: 23,39-172,6
IMC 0,71
IMC<25 Mediana: 34,8 Intervalo: 24,16-56,12
IMC≥25 Mediana: 34,2 Intervalo: 23,9-172,6
IMC 0,13
IMC<30 Mediana: 35 Intervalo: 25,3-172,6
IMC≥30 Mediana: 30,7 Intervalo: 23,9-87,6
PCR-as 0,61
<5mg/L Mediana: 34,6 Intervalo: 24,16-87,51
≥5mg/L Mediana: 33,4 Intervalo: 23,9-172,6

IMC: índice de massa corporal; PCR-as: proteína C reativa de alta sensibilidade.

– Níveis de IL-35 de acordo com o histórico de diabetes em ambos os grupos
Variáveis DAC(+) DAC(-) p
DM(-) IL-35 Mediana: 34,4 Intervalo: 24,16-133,3 Mediana: 40,6 Intervalo: 24,59-238,1 0,021
DM(+) IL-35 Mediana: 29,6 Intervalo: 23,39-172,6 Mediana: 33,4 Intervalo: 25,09-199,1 0,18

DAC: doença arterial coronariana

– Níveis de IL-35 no grupo de pacientes de acordo com os escores Gensini e Syntax
Número de pacientes (%) IL-35(média±DP) Valor de p
Escore Gensin <20 23(38,3) 35±17,4 0,043*
≥20 37(61,7) 30,7±8,6
Escore Syntax <22 52(86,7) 33,2±13,7 0,51¥
≥22 8(13,3) 31,8±8,9

* Teste t de Student, ¥ Teste U de Mann-Whitney.

– Análise de correlação entre a IL-35 e outros parâmetros
Variáveis Rho Valor de p Variáveis Rho Valor de p
IL-35 Colesterol total -0,204 0,036 IL-35 Escore Gensini -0,208 0,11
IL-35 Leucócitos 0,12 0,2 IL-35 Escore Syntax -0,293 0,023
IL-35 PCR-as -0,03 0,75

PCR-as: proteína C reativa de alta sensibilidade; Rho: coeficiente de correlação de teste de Spearman ou ρ de Spearman.

<italic><bold>–</bold> Associação entre níveis de IL-35 e o escore Syntax.</italic>

– Análise de regressão logística dos principais parâmetros para previsão da DAC
Parâmetros RR IC95% Valor de p
Hiperlipidemia 1,22 0,34-4,34 0,75
Sexo 0,9 0,27-2,98 0,87
Idade 0,96 0,91-1,02 0,23
Hipertension 17 0,56-5,15 0,34
Diabetes 3,44 1,004-11,8 0,049
Fumar 11,27 3,45-36,83 <0,001
IL-35 1,02 1,005-1,053 0,017

RR: razão de risco; IC: intervalo de confiança; DAC: doença arterial coronariana.

<italic><bold>–</bold> Poder diagnóstico e pontos de corte de valores de IL-35 e PCR em relação à presença da DAC (análise ROC).</italic>

– Valores da Área sob a Curva (AUC) para IL-35 e pontos de corte substitutos
AUC SE IC95% p
IL-35 0,354 0,056 0,24-0,46 0,011
Ponto de corte=29,1 0,431 0,056 0,32-0,54 0,22
Ponto de corte=33,3 0,446 0,056 0,33-0,55 0,33
Ponto de corte=34,8 0,412 0,056 0,3-0,52 0,14
Ponto de corte=37,5 0,414 0,056 0,3-0,52 0,11

Discussão

Sabe-se que a aterosclerose é multifatorial e está muito relacionada à inflamação.4 O equilíbrio entre as citocinas proinflamatórias e anti-inflamatórias está associado à estabilidade das placas e à progressão da aterosclerose.4,5 Baixos níveis de IL-35 são indicativos tanto da resposta anti-inflamatória insuficiente quanto do nível da inflamação na DAC.18,19 Normalmente, a IL-35 só é induzida com inflamação, e depois detectada no sangue periférico.19 Em um estudo conduzido com ratos, a IL-35 não foi detectada no perfil tecidual de sujeitos saudáveis; porém, estava aumentada em amostras teciduais de ratos com resposta inflamatória formada externamente.20

A expressão de IL-35 e os níveis sanguíneos foram avaliados por muitos pesquisadores em cenários clínicos diferentes.20-23 Kempe et al.,21 demonstraram forte expressão de IL-35 nas células endoteliais, células do músculo liso vascular e macrófagos de pacientes sintomáticos com placas nas carótidas, enquanto não poderiam detectar a expressão de IL-35 na camada íntima da carótida saudável.21

Por outro lado, há uma relação linear entre a gravidade da inflamação e a baixa IL-35 na DAC.21 A resposta anti-inflamatória inadequada na aterosclerose leva à resposta inflamatória excessiva na placa.21 Em outras palavras, quanto mais baixos os níveis de IL-35, mais alta a carga aterosclerótica nas artérias coronárias.22 Da mesma forma, Yanmei et al. demonstraram uma correlação entre níveis decrescentes de IL-35 e a gravidade da doença inflamatória intestinal.22 Esses dados sugerem que, primeiro, a IL-35 aumenta de forma secundária à inflamação, e depois diminui conforme a inflamação se torna mais grave.22

No grupo de pacientes, os níveis de IL-35 foram significativamente mais baixos em pacientes com GS alto em comparação àqueles com GS baixo (35±17,4 vs. 30,7±8,6, p=0,043). Por outro lado, os níveis de IL-35 foram semelhantes entre pacientes com CAD com SS baixo e alto (31,8±8,9 vs. 33,2±13,7, p=0,51); porém, em nossa opinião, o número de pacientes com SS alto foi muito pequeno para uma análise significativa. Um motivo para incluirmos poucos pacientes com SS alto pode ser o fato de termos consideraedo somente pacientes com DAC estável, e não indivíduos com síndrome coronária aguda nem aqueles com histórico de DAC. Nossos achados são únicos porque, até onde sabemos, este estudo é o primeiro que revelou uma correlação entre a gravidade da DAC e os níveis de IL-35. Recentemente, Lin et al.,18 demonstraram níveis mais baixos de IL-35 em pacientes com DAC estável e infarto agudo do miocárdio (IAM) em comparação ao grupo controle; porém, não avaliaram o efeito da extensão e gravidade da DAC.18 Os níveis mais baixos de IL-35 estão no grupo IAM do estudo de Lin.18 Assim, especulou-se que a IL-35 pode ser usada como preditor do desfecho clínico para aterosclerose.19

Como o teste PCR-as é um marcador inflamatório conhecido para aterosclerose, é considerado como preditor independente da DAC.23 Embora os níveis de PCR-as sejam mais altos no grupo de pacientes do que no controle, não foram estatisticamente significativos em nosso estudo. Além disso, não houve correlação entre a PCR-as e a IL-35. Este achado pode parecer incompatível com a literatura, porém, em nossa opinião, isso pode se dever ao fato de que a PCR-as está mais relacionada à instabilidade da placa e associada a eventos cardiovasculares, e não à extensão da aterosclerose. Assim, a IL-35 pode pode ser um marcador melhor do que a PCR-as para DAC estável.

Além disso, Wang et al.,19 conduziram um estudo in vitro com animais e fez com que as células T regulatórias de ratos secretassem IL-35 para tratar a doença inflamatória intestinal e artrite induzida pelo colágeno, conhecidas por estarem relacionadas à inflamação crônica.19 Assim, a regulação celular da expressão de IL-35 pode ser um novo tratamento para DAC.

A principal limitação do nosso estudo foi seu desenho em centro único e o número relativamente baixo de participantes. Em segundo lugar, só avaliamos a DAC por meio da AGC; porém, outros métodos, como o ultrassom intravascular e a tomografia de coerência óptica, que são capazes de determinar a morfologia da placa, aumentariam o poder deste estudo. Por fim, o estudo seria mais completo se pudéssemos medir outras citocinas inflamatórias, como fator de crescimento tumoral beta e interleucina-10; porém, tínhamos um orçamento limitado.

 Conclusão

A IL-35 é uma nova citocina que tem efeitos imunossupressores e anti-inflamatórios.24 Os principais achados deste estudo são os níveis baixos de IL-35 em pacientes com DAC estável, principalmente com GS alto, e a correlação negativa entre IL-35 e SS. Esses achados sugerem que os níveis baixos de IL-35 estão associados à extensão e à gravidade de DAC. Além disso, a secreção de IL-35 externamente induzida pode ser usada para o tratamento de aterosclerose. Mais estudos devem ser realizados em populações maiores.

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Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de doutorado de Ersan Oflar pelo Bakirkoy Dr Sadi Konuk Training and Research Hospital.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Bakirkoy Dr Sadi Konuk Training and Research Hospital sob o número de protocolo 2014/03. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.

Fontes de financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

 Original Article Interleukin-35 Levels in Patients with Stable Coronary Artery Disease Oflar Ersan 1 Sahin Mustafa Hakan 2 Demir Bulent 3 Ertugrul Abdulcelil Sait 1 0000-0003-4108-6405 Oztas Didem Melis 4 Beyaz Metin Onur 5 Ugurlucan Murat 5 Caglar Fatma Nihan Turhan 1 Turkey Bakirkoy Dr Sadi Konuk Training and Research Hospital, Department of Cardiology, Istambul - Turkey Turkey Akdeniz Saglik Yasam Vakfi, Department of Cardiology, Antalya - Turkey Qatar Turkish Hospital, Department of Cardiology, Doha - Qatar Turkey Bagcilar Training and Research Hospital, Department of Cardiovascular Surgery, Istambul - Turkey Turkey Istanbul Medipol University Faculty of Medicine, Department of Cardiovascular Surgery, Istambul - Turkey Mailing Address: Fatma Nihan Turhan Caglar • Bakirkoy Dr. Sadi Konuk Education and Research Hospital, Bakirkoy, Istambul, Turkey. E-mail: nhnturhan@gmail.com

Author Contributions

Conception and design of the research: Oflar E, Sahin MH, Demir B, Ertugrul AS, Caglar FNT; Acquisition of data: Oflar E; Analysis and interpretation of the data: Oflar E, Caglar FNT; Writing of the manuscript: Oflar E, Oztas DM, Beyaz MO, Ugurlucan M, Caglar FNT; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Oflar E, Sahin MH, Demir B, Ertugrul AS, Oztas DM, Beyaz MO, Ugurlucan M, Caglar FNT.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background

It has been shown that interleukin-35 (IL-35) subunits are strongly expressed in atherosclerotic plaques in humans. Therefore, it is considered to play a role in atherosclerosis.

 Objectives

In this study, IL-35 levels were compared with the control group in patients with stable coronary artery disease (CAD), and the association between IL-35 levels and the lesion type, lesion severity and extension was investigated with the Gensini score (GS) and the Syntax score (SS) in the patient group.

 Methods

Sixty patients (18 female and 42 male) with CAD diagnosed by coronary angiography, who presented with typical chest pain and positive noninvasive cardiac stress test, and 46 patients (18 female and 28 male) with normal coronary lumenogram, were included in this study. Gensini and Syntax scores were calculated in the patient group, and these values were compared with IL-35 levels. Non-normally distributed variables were analyzed by the Mann-Whitney U test, whereas normally distributed parameters were assessed by Student’s t-test. The difference between categorical variables were evaluated by the Chi-square or Fisher test. P-values<0.05 were considered as statistically significant.

 Results

No significant differences were observed between patients and the control group in terms of demographic characteristics and laboratory findings. Compared to the control group, IL-35 levels of the CAD group were considerably lower (36.9±63.9 ng/ml vs. 33.2±13.2 ng/ml, p<0.008). Although not statistically significant, IL-35 levels were higher in patients with low SS than among those with high SS (33.2±13.7 vs. 31.8±8.9, p=0.51). The IL-35 values of the patients with high GS were significantly lower than in patients with low GS (35±17.4 vs. 30.7±8.6, p=0.043).

 Conclusion

It has been shown that IL-35 levels can be a new biomarker for stable CAD, and IL-35 is associated with the extension of CAD.

 Coronary artery disease Atherosclerosis Interleukin-35 Gensini score Syntax score Introduction

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of death worldwide, although the prevalence of CAD mortality has recently decreased in Europe and in the United States.1,2 CAD is a progressive and systemic disorder mainly caused by atherosclerosis.3

Although inflammation plays a major role in the development of atherosclerosis, the precise underlying mechanism is still not clear.4 Anti-inflammatory cytokines such as interleukin-10 (IL-10) and transforming growth factor-1 (TGF-1) are widely evaluated in atherosclerosis trials.5-11 Recently published studies have demonstrated that while low IL-10 and TGF-1 levels are associated with the progression of atherosclerosis and the development of acute coronary syndrome, high IL-10 and TGF-1 levels are correlated with good prognosis in CAD.5-11

Interleukin-35 (IL-35), a recently defined anti-inflammatory cytokine, supresses the CD4+T cell activity, induces the production of regulatory T cells, and reduces the progression of inflammatory and autoimmune diseases; hence, it also plays a role in atherosclerosis.12-15

The aim of this study was to evaluate IL-35 plasma levels in patients with stable CAD, and the association between IL-35 and CAD severity and extension using the Syntax (SS) and Gensini (GS).

 Methods

This is a cross-sectional, observational study carried out in a tertiary referral center. One hundred and six consecutive patients who underwent diagnostic coronary angiography in Bakırköy Dr. Sadi Konuk Research and Training Hospital Cardiology Clinic between July 2018 and May 2019 were included in the study. The patient group consisted of 60 patients (42 male, 18 female) with stable CAD who presented with epicardial coronary artery stenosis of more than 50% in the coronary angiogram (CAG). The control group consisted of 46 patients (28 male, 18 female) who had chest pain, but normal CAG. All of the patients had undergone modified objective ischemia assessment, and they all had positive test results in terms of ischemia. The required number of patients was decided based on previous studies.7 The patients who were appropriate for the study according to inclusion criteria were included until we reached the necessary number of patients between July 2018 and May 2019.

A previous diagnosis of diabetes mellitus (DM), use of anti-diabetic medicines, or a fasting glucose level of 126 mg/dl on two occasions in previously untreated patients were required to diagnose DM. Hypertension (HT) was defined based on the previous use of antihypertensive medications, systolic pressure higher than 140 mmHg, or diastolic pressure higher than 90mm Hg in at least two separate measurements. The glomerular filtration rate (GFR) was estimated by using the Modification of Diet in Renal Disease (MDRD) equation at admission. Body mass index (BMI) was calculated according to the World Health Organization (WHO) criteria. Hyperlipidemia (HL) was defined based on the previous use of antilipidemics in the 6 previous months, or high serum levels of lipids measured after 8 hours of fasting [low-density lipoprotein (LDL) >160 mg/dl, total cholesterol (TC) >240 mg/dl, or triglycerides (TG) >160 mg/dl)].

All patients signed an informed consent and this study is in accordance with the Declaration of Helsinki. Our study was approved by the local Institutional Review Board and Ethics Commitee.

Patients with known CAD, estimated glomerular filtration rate (eGFR) <60ml/min, those with valvular disease, individuals with systolic blood pressure higher than 140 mmHg and diastolic blood pressure higher than 90 mmHg despite the treatment, heart failure, liver failure, acute/chronic infection, fever, muscle aches, headache, the ones receiving antibiotic therapy, individuals with immunoproliferative disease, rheumatic disease, cancer, osteoporosis and the ones who were older than 75 years were excluded.

Objective ischemia assessment

All of the patients had undergone a non-invasive stress test for ischemia assessment. Mostly, the modified Bruce exercise test was performed. At least 1 mm horizontal or downsloping ST segment depression in ≥2 derivations after 60*80 msec from the J point during exercise was considered as an abnormal test. The Duke treadmill score was used for risk stratification.11 CAG was performed in patients who had medium or high Duke treadmill score. Myocardial perfussion scintigraphy (MPS) was used to evaluate ischemia in inpatients who had left the bundle branch block or ≥1mm ST depression in the at rest electrocardiogram (ECG), nondiagnostic exercise test, or wth poor exercise capacity. CAG was performed in patients who had medium or high ischemia level on MPS.

 Biomarker measurements

All of the patients’ laboratory data, such as cardiac troponin-T (cTr-T), creatinine, white blood cell count (WBC), high sensitive C-reactive protein (hsCRP) etc, were documented.

Blood samples for IL-35 were drawn in the catheterization laboratory before coronary angiography in all of the participants. Blood samples were obtained by venipuncture in ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) blood collection tubes without additives, and immediately centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes. The sample was collected aftercentrifugation and stored at -80 ºC until analysis (no longer than 6months). The samples were thawed only once. The biotin-based double antibody sandwich technique using the enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA) kit was used for the analysis of IL-35 (Human Interleukin 35: Yehua Biological Technology; Cat No:YHB1739Hu). IL-35 was added to wells that were precoated with IL-35 monoclonal antibody and, then, incubated. After incubation, anti-IL-35 antibodies labeled with biotin were added to the unit with streptavidin-HRP to form the immune complex. After washing, unbound enzymes were removed, then added to substrates A and B. The solution turned blue and changed to yellow with the effect of acid. The shades of the solution and the concentration of IL-35 were positively correlated. Results were expressed as ng/ml. Intra-assay and inter-assay coefficients of variation (CV) of the analysis were <10% and <12%, respectively.

 Coronary angiogram

All CAG procedures were performed using the standard Judkins method with a cineangiography device (Axiom Artis, Siemens, Germany). All of the angiograms were recorded in compact discs, in DICOM format, and visually examined by two experienced interventional cardiologists blinded to the study. The severity and extent of CAD were evaluated according to the SS and GS. The degree of lumen narrowing, concentricity and eccentricity of the plaques were evaluated. According to the Gensini Score system, 1 point is given for 1–25% stenosis; 2 points for 26–50%; 4 points for 51–75%; 8 points for 76–90%; 16 points for 91–99%; and 32 points for 100% stenosis. Then, the number of points for each lesion is multiplied by the coefficient which is given for each main vascular segment according to the functional significance of the vessel (left main coronary artery × 5; proximal segment of the left anterior descending coronary artery (LAD) × 2.5; proximal segment of the circumflex artery × 2.5; mid-segment of LAD × 1.5; right coronary artery, distal segment of LAD, posterolateral artery and the obtuse marginal artery × 1; and others × 0.5), and the sum of all points constitutes the total score.16 Scoring was performed together with two observers and the average value. GS < 20 was considered as mild CAD (group 1), and GS ≥ 20 was accepted as severe CAD (group 2). The SS corresponding to the lesion complexity was measured by the coronary tree characteristics, as well as the lesion locations and specifics.17 The score is measured using the openly accessible web based score calculator (www.syntaxscore.com). Scorings were performed and averaged by two observers who were blinded to the study groups.

 Statistical Analysis

Statistical analysis was performed using the software SPSS, version 16. The normal distribution of continuous variables was analyzed by visual (histogram) and analitic methods (Kolmogorov-Smirnov). Continuous variables with normal distribution were shown as mean±standard deviation (SD). Continuous variables with non-normal distribution were demonstrated as median and interquartile range. Non-normally distributed variables were analyzed by the Mann-Whitney U test, whereas normally distributed parameters were assessed by the unpaired Student’s t-test. The differences between categorical variables were evaluated by Chi-square or Fisher test. The association between non-normally distributed variables were analyzed by the Spearman test; on the other hand, the Pearson test was used for the correlation between normally distributed variables. The chi-square test was used for sensitivity, specificity, negative, and positive predictive values. The logistic regression analysis was performed to demonstrate IL-35 as an independent CAD risk factor among traditional CAD risk factors. The effectiveness and compatibility of the created model was tested by the Hosmer-Lemeshow test. P-values <0.05 were considered as statistically significant.

 Results

The demographic features of the patient and control groups are shown in Table 1. Accordingly, the mean age of the patient group was higher than that in the control group. Gender, smoking, DM, HT, HL, and BMI were similar between groups (Table 1). Laboratory findings of the groups are demonstrated in Table 2. IL-35 levels were significantly lower in the patient group than in the control group (p=0.008) (Figure 1). Besides, while leucocyte count, total cholesterol, and low density lipoprotein (LDL) levels were higher in the patient group, thrombocyte count was lower in the patient group compared to the control group (Table 2). Table 3 illustrates IL-35 levels according to main demographic and laboratory features in the patient group. Likewise, IL-35 levels were significantly lower in individuals with diabetes in the patient group (p=0.042). We further analyzed IL-35 levels in both groups, in patients with and without diabetes, in order to demonstrate if the low IL-35 levels in patients with CAD were owed to diabetes or not (Table 4). IL-35 levels were not associated with the presence of diabetes (p=0.18). Although IL-35 levels were similar among CAD patients with low (<22) and high SS (≥22), it was lower in CAD patients with high (≥20) than among those with low (<20) GS (p=0.51 and p=0.043, respectively) (Table 5). The correlation analysis between IL-35 and other parameters is shown in Table 6. IL-35 levels had a mild negative correlation with the SS and total cholesterol levels (p= 0.036) (Figure 2) (Table 6). Finally, in the logistic regression analysis that included IL-35, HM, gender, age, HT, type 2 DM, and smoking, only type 2 DM (p= 0.049, RR= 3.44, CI: 1.004-11.8), smoking (p <0.001, RR= 11.27, CI: 3.45-36.83) and IL-35 levels (p= 0.017, RR= 1.02, GA: 1.005 -1.053) were found to have an independent effect on the presence of CAD (Table 7). The cut-off point for IL-35 levels for detecting CAD was evaluated by the ROC analysis (Figure 3) (Table 8).

– Demographic features of the patient and control groups
Patient, n(%) Control, n(%) p-value
Total 60(100) 46(100)
Age (mean±SD) 59±9.1 54.5(8.9) 0.013*
Sex
Male 42(70) 28(60.9) 0.32
Female 18(30) 18(39.1)
Smoking 38(63.3) 12(26.1) <0.001
Diabetes 22(36.7) 10(21.7) 0.09
Hypertension 38(63.3) 21(45.7) 0.07
Hyperlipidemia 16(26.7) 9(19.6) 0.008
BMI (mean±SD) 26.3±4.4 28.2±3.8 0.07*

Chi-square test, *Student’s t- test; BMI:body mass index.

– Laboratory findings of the patient and control groups
Patient group Control group p-value
IL-35 (pg/ml) Median: 33.2 Range: 23.39-172.6 Median: 36.9 Range: 23.39-238.1 0.008
Creatinine (mg/dl) Median: 0.8 Range: 0.35-1.1 Median: 0.8 Range: 0.42-1.2 0.43
LDL cholesterol (mg/dl)(mean+SD) 149±39.3 116.5±35.9 <0.001*
Total cholesterol (mg/dl) (mean+SD) 229.5±47.1 190.5±46.3 <0.001*
HDL cholesterol (mg/dl) Median: 44 Range: 25-72 Median: 45 Range: 27-72 0.98
Triglyceride (mg/dl) (mean+SD) 150.5±81 115.5±83.2 0.19*
Leucocyte count (103/mm3) (mean+SD) 8250±2670 6550±2030 0.006*
Hematocrit (%) Median: 40.8 Range: 29.7-52.1 Median: 40.9 Range: 28.6-50.2 0.93
Hemoglobin (g/dl) (mean+SD) 13.9±1.7 13.4±1.8 0.37*
Thrombocyte count(103/mm3) (mean+SD) 248±104 270±64.7 0.015*
hs-CRP (mg/L) Median: 4.1 Range: 0.32-18.2 Median: 2.6 Range: 0.2-17.8 0.09
HbA1C(%) Median: 5.9 Range: 4.0-13.2 Median: 5.8 Range: 4.5-7.6 0.45

IL-35: Interleukin 35; LDL:low density lipoprotein; HDL:high density lipoprotein; hs-CRP: high sensitive C-reactive protein; HbA1C:Hemoglobin A1C. Mann-Whitney U-test, *Student’s t-test.

– <italic>IL-35 levels in the patient and control groups (Box-plot).</italic>

– IL-35 levels according to the main demographic and laboratory features in the patient group
Median/Interquartile Range p-value
Sex 0.55
Male Median: 34.7 Range: 23.39-103.9
Female Median: 34.3 Range: 26.5-172.6
Age 0.12
<50 Median: 38.1 Range: 27.2-172.6
≥50 Median: 34.7 Range: 23.9-133.3
Hypertension (+) Median: 34 Range: 23.39-172.6 0.11
(-) Median: 35.8 Range: 25.4-80.61
Diabetes (+) Median: 30.4 Range: 23.9-172.6 0.042
(-) Median: 35.0 Range: 24.16-133.3
Smoking (+) Median: 35.0 Range: 27.11-133.3 0.5
(-) Median: 34.1 Range: 23.39-172.6
Hyperlipidemia (+) Median: 34.6 Range: 25.4-133.3 0.56
(-) Median: 34.1 Range: 23.39-172.6
BMI 0.71
BMI<25 Median: 34.8 Range: 24.16-56.12
BMI≥25 Median: 34.2 Range: 23.9-172.6
BMI 0.13
BMI<30 Median: 35 Range: 25.3-172.6
BMI≥30 Median: 30.7 Range: 23.9-87.6
hs-CRP 0.61
<5mg/L Median: 34.6 Range: 24.16-87.51
≥5mg/L Median: 33.4 Range: 23.9-172.6

BMI: body mass index; hs-CRP: high sensitive C-reactive protein.

– IL-35 levels according to history of diabetes in both groups
Variables CAD(+) CAD(-) p
DM(-) IL35 Median: 34.4 Range: 24.16-133.3 Median: 40.6 Range: 24.59-238.1 0.021
DM(+) IL35 Median: 29.6 Range: 23.39-172.6 Median: 33.4 Range: 25.09-199.1 0.18

CAD: Coronary Artery Disease

– IL-35 levels in the patient group according to the Gensini and Syntax scores
Patient number (%) IL-35(mean±SD) p-value
Gensini score <20 23(38.3) 35±17.4 0.043*
≥20 37(61.7) 30.7±8.6
Syntax score <22 52(86.7) 33.2±13.7 0.51¥
≥22 8(13.3) 31.8±8.9

* Student’s t-test, ¥ Mann Whitney U-test.

– Correlation analysis between IL-35 and other parameters
Variables Rho p- value Variables Rho p- value
IL35 Total cholesterol -0.204 0.036 IL35 Gensini score -0.208 0.11
IL35 Leucocyte 0.12 0.2 IL35 Syntax score -0.293 0.023
IL35 hs-CRP -0.03 0.75

hs-CRP: high sensitive C-reactive protein; Rho: Spearman’s rank correlation coefficient or Spearman’s ρ.

– <italic>The association between IL-35 levels and Syntax score.</italic>

– Logistic regression analysis of main parameters in CAD prediction
Parameters RR %95CI p-value
Hyperlipidemia 1.22 0.34-4.34 0.75
Sex 0.9 0.27-2.98 0.87
Age 0.96 0.91-1.02 0.23
Hypertension 17 0.56-5.15 0.34
Diabetes 3.44 1.004-11.8 0.049
Smoking 11.27 3.45-36.83 <0.001
IL-35 1.02 1.005-1.053 0.017

RR: risk ratio; CI: confidence interval; CAD: Coronary Artery Disease.

– D<italic>iagnostic power and potential cut-off values of IL-35 and CRP values in terms of the presence of CAD (ROC analysis).</italic>

– Area Under Curve (AUC) values for IL-35 and surrogate cut-off values
AUC SE 95%CI p
IL35 0.354 0.056 0.24-0.46 0.011
Cut-off value=29.1 0.431 0.056 0.32-0.54 0.22
Cut-off value=33.3 0.446 0.056 0.33-0.55 0.33
Cut-off value=34.8 0.412 0.056 0.3-0.52 0.14
Cut-off value=37.5 0.414 0.056 0.3-0.52 0.11

Discussion

It is well-known that atherosclerosis is multifactorial and closely related with inflammation.4 The balance between proinflammatory and antiinflammatory cytokines is associated with plaque stabilisation and atherosclerosis progression.4,5 Low IL-35 levels are indicators of both insufficient antiinflammatory response and the amount of inflammation in CAD.18,19 Normally, IL-35 is only induced with inflammation, and then detected in peripheral blood.19 In a study conducted with mice, IL-35 was not detected in the tissue profile of healthy subjects; however, it was increased in tissue samples of mice with externally formed inflammatory response.20

IL-35 expression and blood levels have been evaluated by many researchers in different clinical scenarios.20-23 Kempe et al.21 demonstrated strong expression of IL-35 in endothelial cells, vascular smooth muscle cells, and macrophages of symptomatic patients with carotid plaques, whereas they could not detect IL-35 expression in healthy carotid intima.21

On the other hand, there is a linear relationship between the severity of inflammation and low IL-35 in CAD.21 Inadequate antiinflammatory response in atherosclerosis leads to excessive inflammatory response in the plaque.21 In other words, the lower the IL-35 levels, the higher the atherosclerotic burden in the coronary arteries.22 Similarly, Yanmei et al. demonstrated a correlation between decreasing IL-35 levels and the severity of inflammatory bowel disease.22 These data suggest that, first, IL-35 rises secondary to the inflammation, and then declines as the inflammation gets severe.22

In the patient group, IL-35 levels were significantly lower in patients with high GS in comparison with those with low GS (35±17.4 vs . 30.7±8.6 , p= 0.043). Conversely, IL-35 levels were similar among CAD patients with low and high SS (31.8±8.9 vs. 33.2±13.7, p=0.51); however, in our opinion, the number of patients with high SS was too low for a powerful analysis. A reason for having few patients with high SS might be because we only enrolled patients with stable CAD, and not individuals with acute coronary syndrome nor those with a history of known CAD. Our findings are unique because, to our knowledge, this study is the first that revealed a correlation between CAD severity and IL-35 levels. Recently, Lin et al.18 showed lower IL-35 levels in patients with stable CAD and acute myocardial infarction (AMI) in comparison to the control group; however, they did not evaluate the effect of CAD extent and severity.18 The lowest IL-35 levels were in the AMI group in Li’s study.18 Hence, it it has been speculated that IL-35 may be used as a clinical outcome predictor in atherosclerosis.19

An hs-CRP test is a well-known inflammatory marker in atherosclerosis, and is considered as an independent predictor of CAD.23 Although hs-CRP levels were higher in the patient group than among controls, it was not statistically significant in our study. Furthermore, there was no correlation between hs-CRP and IL-35. This finding may seem incompatible with the literature, however, in our opinion, it may be because hs-CRP is more related with plaque instability and its associated cardiovascular events, rather than the extent of atherosclerosis. Therefore, IL-35 might be a better marker than hs-CRP in stable CAD.

Moreover, Wang et al.19 conducted an in vitro animal study, and made regulatory T cells’ of mice secrete IL-35 to treat inflammatory bowel disease and collagen-induced arthritis, which are known to be related with chronic inflammation.19 Thus, the cellular regulation of IL-35 expression may be a new treatment target in CAD.

The main limitation of our study was its single-center design and relatively low number of participants. Secondly, we only evaluated CAD by CAG; however, other methods, such as intravascular ultrasound and optical coherence tomography, which are capable of determining plaque morphology, would increase the power of this study. Lastly, the study would be more thorough if we could measure other inflammatory cytokines, like tumor growth factor beta and interleukin-10; yet, we had a limited budget.

 Conclusion

IL-35 is a new cytokine which has immunosuppressive and strong antiinflammatory effects.24 The main findings of this study are low IL-35 levels in patients with stable CAD, especially with high GS, and the negative correlation between IL-35 and SS. These findings suggest that low IL-35 levels are associated with the extent and severity of CAD. Additionally, externally induced IL-35 secretion might be used in atherosclerosis treatment. Further studies conducted in larger populations are required.

Study Association

This article is part of the thesis of doctoral submitted by Ersan Oflar, from Bakirkoy Dr Sadi Konuk Training and Research Hospital.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Bakirkoy Dr Sadi Konuk Training and Research Hospital under the protocol number 2014/03. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.