Arq Bras CardiolabcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCzpmQdMzQJmWm6h4PDcTLKHpS0066-782X2021001401179abc.2020076110.36660/abc.20200761Artigo OriginalA Adiponectina Previne a Reestenose pela Inibição da Proliferação Celular em um Modelo de Enxerto Venoso em RatosZhouYang1DaiChun20000-0002-3261-6913ZhangBing3GeJianjun1Anhui Medical UniversityAnhui Provincial HospitalDepartment of Cardiac SurgeryHefeiAnhuiChinaDepartment of Cardiac Surgery, Anhui Provincial Hospital, Anhui Medical University, Hefei, Anhui - ChinaShandong UniversityCheeloo College of MedicineSchool of MedicineP.R.ChinaSchool of Medicine, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, P.R. – ChinaUniversity of Science and Technology of ChinaHospital of USTCDivision of Life Sciences and MedicineHefeiAnhuiChinaThe First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, Hefei, Anhui - ChinaCorrespondência: Bing Zhang e Jianjun Ge • Department of cardiac surgery, The First Affiliated Hospital of USTC, Lujiang Rd 17, Hefei, Anhui, 230001 - China. E-mail: zkdgjj@ustc.edu.cn
Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa: Zhou Y, Zhang B, Ge J; Obtenção de dados: Zhou Y, Dai C; Análise e interpretação dos dados, Análise estatística e Redação do manuscrito: Zhou Y; Obtenção de financiamento: Ge J; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Zhang B, Ge J.
Potencial conflito de interesse
Não há conflito com o presente artigo
03122021122021117611791188110720201212202027012021This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution LicenseResumoFundamento:
O enxerto de bypass na artéria coronária (CABG) continua a ser eficiente como tratamento para pacientes portadores de doença arterial coronariana; entretanto, o enxerto venoso tende a apresentar reestenose ou oclusão. A adiponectina (ADP) é uma proteína hormonal plasmática com a função de regular a proliferação celular.
Objetivo:
Foram utilizadas duas doses diferentes da proteína ADP em um modelo de enxerto venoso em ratos para estimular a alteração do enxerto venoso. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da ADP sobre a reestenose em enxerto venoso.
Métodos:
Veias jugulares autólogas foram implantadas como enxertos interposicionais de carótida pela técnica de anastomose de manga em ratos Sprague Dawley. A adiponectina (2,5 μg e 7,5 μg) foi entregue ao enxerto venoso por bypass de forma perivascular, suspensa em gel Pluronic-F127 a 30%. O grupo tratado apenas com bypass e o grupo tratado com gel veículo carregado apenas com Pluronic funcionaram como controle. Foram feitas comparações com análise de via única de variância e teste post-hoc, com p <0,05 sendo considerado significativo.
Resultados:
A proliferação celular (índice de PCNA) foi significativamente baixa no grupo tratado com adiponectina em comparação com o grupo de controle e o grupo tratado com o gel veículo na íntima e na adventícia dos enxertos a partir do dia 3 (p <0,01). VCAM-1 e ICAM-1 avaliados por imuno-histoquímica diminuíram significativamente em enxertos venosos tratados com adiponectina na quarta semana (p <0,01). O tratamento de enxertos venosos com gel carregado com adiponectina reduziu a espessura da íntima, da média e da adventícia, em comparação com os enxertos de controle e tratados com gel veículo no dia 28 (p <0,01).
Conclusões:
Este estudo oferece evidências adicionais do possível papel terapêutico da adiponectina na modulação de lesão vascular e seu reparo.
Palavras-chave:AdiponectinaProliferação de CélulasHiperplasiaNational Natural Science Foundation of China81470530O presente estudo foi financiado por National Natural Science Foundation of China (grant numbers NSFC 81470530 to J.G).Introdução
A doença arterial coronariana (DAC) é uma doença mundial com crescente morbidade e mortalidade.1 O enxerto de bypass na artéria coronária (CABG) continua a ser eficiente como tratamento para pacientes em estágio avançado. Enxertos venosos de safena oferecem o duto para bypass mais amplamente utilizado, e representam ~50% dos enxertos utilizados em CABG devido à conveniência de sua retirada, e por não serem facilmente afetados pelo fluxo de sangue coronariano concorrente.2,3 Apesar das vantagens do tratamento, a veia enxertada tem a tendência à reestenose ou oclusão sob a influência da pressão arterial, inflamação persistente e riscos de falha associados, com um índice de patência de 65% - 80% em 5 anos após a operação.4–6 Portanto, a inibição a reestenose nos enxertos venosos ainda representa um desafio.
A hiperplasia da íntima (HI) tem um papel causal na reestenose de veias enxertadas, caracterizada pelo acúmulo excessivo de células musculares lisas vasculares (CMLV) levando a distúrbios oclusivos.6–8 Além disso, há cada vez mais dados que indicam que a adventícia também pode estar relacionada à remodelação das veias enxertadas.9–11 Depois da lesão, os fibroblastos da adventícia se ativam e proliferam, seguidos pela biossíntese da adventícia, e liberam uma variedade de citocinas para promover a proliferação de CMLV. Todo o processo resulta em HI e reestenose.12–15 Comprovou-se que muitas citocinas estão envolvidas na proliferação das CMLV, entre as quais VCAM-1 e ICAM-1, que podem promover a adesão das células e a formação da lesão aterosclerótica.16,17
A adiponectina (ADP), uma proteína hormonal plasmática especificamente biossintetizada por adipócitos, pode exercer seu efeito ligando ao receptor de adiponectina nos fibroblastos.18,19 Além disso a ADP pode ser usada para atenuar a disfunção endotelial.20 Pesquisas recentes demonstram que a ADP desempenha papéis importantes na supressão da proliferação celular após o dano aos vasos, bem como diminui as citocinas que promovem a proliferação celular.21,22
Considerando esses achados, levantou-se a hipótese de que a ADP pode evitar a reestenose do enxerto venoso pela inibição da proliferação celular. A ADP foi aplicada à superfície externa de enxertos venosos com duas concentrações diferentes para investigar o efeito da ADP em reestenoses de enxertos venosos. Os resultados demonstraram que a ADP reduziu significativamente as espessuras de íntima, média e adventícia no enxerto venoso. Enquanto isso, a proliferação celular e a expressão das citocinas (VCAM-1 e ICAM-1) também diminuíram. Esses resultados demonstraram primeiramente o papel da ADP na prevenção da reestenose de enxertos venosos e esclareceram o possível mecanismo.
Métodos
Este estudo recebeu aprovação ética para experimentos com animais do Comitê de uso e cuidado com animais do Primeiro Hospital Afiliado à Universidade de Ciência e Tecnologia da China. Ratos Sprague Dawley (SD) (machos e fêmeas, com idade 10-12 semanas, peso corporal de 275-325 g e N=72) foram comprados do Centro de Pesquisa Animal do Laboratório de Anhui e foram distribuídos aleatoriamente entre grupos de tratamento com ADP (grupos de dose baixa e alta), grupo de tratamento com gel veículo (gel Pluronic-F127) e grupo de controle (apenas o bypass). De acordo com pesquisas anteriores, 72 ratos foram divididos em 4 grupos, que foram posteriormente divididos em 12 grupos em três momentos do estudo diferentes.23 (n = 6 por grupo).
Construtos para entrega perivascular de fármacos
A abordagem de entrega de fármacos à adventícia utilizou o gel Pluronic F127 como veículo. Um total de 2,5 μg de adiponectina (Abcam) foi dissolvido em 25 μl de água destilado e ressuspenso em 300 μl de gel Pluronic-F127 a 30% para entrega nos enxertos venosos após a interposição da carótida, no grupo de tratamento com dose baixa (grupo L-ADP), enquanto 7,5 μg de adiponectina foram usados para revestir os enxertos venosos no grupo de tratamento com alta dose de adiponectina (grupo H-ADP). Uma quantidade igual de gel Pluronic-F127 foi aplicada ao grupo com tratamento por gel veículo (grupo VG). O gel Pluronic-F127 só foi retirado do ambiente refrigerado a 4 °C no momento da aplicação, para que mantivesse sua forma líquida.
Modelo de enxerto venoso autólogo em ratos
Ratos SD foram anestesiados com hidrato cloral a 10% (300 mg/kg) e receberam heparina (200 U/kg) via injeção venosa caudal. A veia jugular esquerda foi retirada para utilização como enxerto interposicional de carótida. O bypass foi realizado pelo modelo de anastomose de manga, conforme descrito anteriormente.24 Especificamente, foram cortadas mangas de 2 mm de agulhas arteriais vermelhas 20G (BD Company). A artéria carótida foi isolada até as ramificações. Foram colocadas linhas de tração para sutura e clipes de hemostasia para bloquear o fluxo sanguíneo nas extremidades proximal e distal da artéria antes de serem seccionadas na metade. As duas extremidades das artérias foram puxadas por dentro da manga. Em seguida, as artérias foram evertidas e presas à manga por sutura de seda 6-0. Após a arteriotomia na artéria carótida comum esquerda (ipsilateral), as mangas foram inseridas e presas à artéria com sutura de seda 6-0. A artéria foi seccionada para permitir a extensão longitudinal do enxerto venoso interposicional. Foram aplicados tratamentos à superfície externa do enxerto após a retirada dos clipes. Os dois grupos de tratamento com a adiponectina foram submetidos à aplicação perivascular de 300 μL de gel de ADP, o grupo de tratamento com gel veículo, com 300 μL de gel Pluronic-F127, e o grupo de bypass apenas não recebeu gel. Além disso, o gel foi mantido resfriado até a aplicação perivascular e, em seguida, foi permitido que se solidificasse à temperatura corporal, como descrito anteriormente.25
Coleta de enxertos implantados
Os ratos foram sacrificados no 3°, 14° e 28° dias após o transplante de bypass, 6 ratos por vez. Após a patência dos enxertos venosos ter sido testada por ultrassonografia por Doppler, foram coletados corpos de prova de enxertos venosos, que foram divididos em 2 seções. Um dos segmentos foi imediatamente afixado após a perfusão com solução salina heparinizada, seguida de formaldeído a 4% para hematoxilina e eosina (H&E), coloração de tricrômio de Masson e análise de ensaios imuno-histoquímicos, enquanto o outro foi colocado a −80 °C para realização do ensaio de Western blot. Os animais foram sacrificados por overdose de pentobarbital sódico.
Análise morfométrica
Após a fixação em formaldeído a 4% e o processamento em álcool 70%, os corpos de prova coletados no 3°, 14° e 28° dias foram embebidos em parafina; foram retiradas seções de 3 μm ao longo do enxerto; exceto pelas regiões imediatamente adjacentes às mangas da anastomose. As seções foram coloridas com hematoxilina e com o kit de Masson (Shanghai Gefan Biological, China), e as seções coloridas foram observadas em um microscópio biológico Leica-DM2000 (Leica, Hefei, China). Pelo menos cinco seções dos enxertos de bypass espaçadas simetricamente foram analisadas para cada corpo de prova. Medidas morfométricas padrão foram registradas, incluindo a espessura íntima, a espessura média, e a espessura adventícia. Em seguida, esses dados foram calculados pelo software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA).
Análise imuno-histoquímica
Tecidos embebidos em parafina (enxertos no 3°, 14° e 28° dias) foram processados, e foram retiradas seções de 3 μm ao longo do enxerto; exceto pelas regiões imediatamente adjacentes às mangas da anastomose. Depois da desparafinização, o antígeno foi recuperado com tampão citrato por 20 minutos em temperatura e pressão altas, depois desativado com peroxidase endógena H2O2 a 3% for 20 minutos, e bloqueio de peroxidase endógena com albumina sérica bovina a 5% por 10 minutos. As seções foram tratadas durante a noite a 4°C com anticorpo monoclonal anti-PCNA (D3H8P; Cell Signaling), anticorpo anti-VCAM1 (ab134047; Abcam, diluição 1:500), e anticorpo anti-ICAM1 (ab119871; Abcam, diluição 1:200). Três seções separadas por enxerto foram analisadas em relação a todos os marcadores. Os cortes foram lavados várias vezes. Foram adicionadas aos cortes a solução funcional de anticorpo secundário biotinilado, e de solução funcional de estreptavidina conjugada com horseradish peroxidase. Os cortes foram lavados em PBS (pH 7.2) por 5 minutos. Foi utilizada a diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB) para a visualização, e a hematoxilina foi utilizada para contracoloração. Por último, os cortes foram desidratados, e em seguida foram montadas e seladas. Todas as imagens foram capturadas por aquisição de sinal de imagem e sistema de análise (Leica-DM2000, Hefei, China). O índice de PCNA foi utilizado para descrever o nível de expressão de PCNA (índice de PCNA = número de células com PCNA positivo/número total de células). A densidade ótica média foi utilizada para descrever o padrão de expressões de VCAM-1 e ICAM-1 (densidade ótica média = densidade ótica integral/área).
Análise de expressão de proteína VCAM-1 e PCNA pelo ensaio de Western blot
As proteínas totais foram isoladas das veias enxertadas. Após a eletroforese e a eletrotransferência, as membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5%, e foram incubadas a 4°C com anticorpos primários durante a noite (com anticorpo monoclonal anti-PCNA D3H8P; Cell Signaling, diluição 1:1000; anticorpo anti-VCAM1 ab134047; Abcam, diluição 1:3000; anticorpo anti-β-tubulina GB11017; Servicebio, diluição 1:2000). Depois de serem incubadas com anticorpos secundários (IgG de cabra anti-IgG de camundongo HRP SE131; Solarbio, diluição 1:3000), as membranas foram lavadas com TBST. Em seguida, as membranas foram expostas no filme de PVDF e a solução de reagente ECL (PE0010, Solarbio) foi adicionada. Faixas imunorreativas separadas foram processadas pelo software Odyssey v1.2. Valores cinza foram medidos com base na referência interna da β-Tubulina.
Análise estatística
Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP) e foram processados pelo software SPSS v.21.0 (Chicago, IL, EUA). Como os dados seguiram a distribuição normal verificada pelo teste Kolmogorov–Smirnov, as comparações entre vários grupos foram analisadas por análise de variância de via única (ANOVA). As comparações entre dois grupos foram analisadas pelo teste de diferença mínima significativa de Fisher (LSD). Um p-valor <0.05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
O método de operação descrito anteriormente foi usado para estabelecer o modelo de bypass autólogo em veia jugular em ratos. Após o procedimento, as veias jugulares transplantadas foram totalmente preenchidas, e os vasos sanguíneos tinham bons batimentos. A entrega perivascular local do gel Pluronic-F 127 cobriu uniformemente a superfície do vaso sanguíneo. A incisão foi fechada após a solidificação do adesivo. Os status de atividade e cura da incisão nos ratos foram verificados diariamente após a operação. Foi realizado ultrassom por Doppler no dia da eutanásia, que demonstrou que o sangue da veia jugular transplantada não apresentava uma clara oclusão. No grupo de controle de 28 dias, os enxertos venosos estavam espessados e ligeiramente rígidos, e a adesão dos tecidos adjacentes estava relativamente óbvia. Correspondentemente, no grupo de alta dose de adiponectina, as veias não se expandiram significativamente, e os tecidos adjacentes poderiam ser separados com facilidade (Figura 1).
Fotografias intraoperatórias e pós-operatórias e fotografias do ultrassom por Doppler. (A) a. Fotografias intraoperatórias dos grupos de controle e alta dose de adiponectina; (B) fotografia pós-operatória na quarta semana dos grupos de controle e de alta dose de adiponectina; (C) fotografias do ultrassom por Doppler no dia da eutanásia dos grupos de controle e alta dose adiponectina.
A adiponectina atenua a hiperplasia de íntima, média e adventícia em enxerto venoso
Análises morfométricas de enxertos explantados após o bypass (Figura 2A) apresentaram redução da espessura íntima, média e adventícia após a entrega perivascular da adiponectina. A quantificação da espessura íntima, média e adventícia foi realizada por, pelo menos, cinco seções igualmente espaçadas ao longo da veia não anastomótica em cada enxerto do bypass. Na visualização dos três momentos de análise, dia 3, dia 14 e dia 28, não houve diferença significativa entre a espessura da íntima, da média e da adventícia entre o grupo de controle e o grupo de gel veículo, o que significou que a aplicação do gel Pluronic F-127 como carga de gel não afetou a fisiopatologia dos enxertos venosos. Especificamente, a espessura da íntima do enxerto venoso no grupo H-ADP diminuiu significativamente no dia 14 e no dia 28 em comparação com o grupo de controle e o grupo de gel veículo. De forma semelhante, a espessura da íntima no grupo L-ADP evidentemente reduziu mais, em comparação com o grupo de controle e o grupo de gel veículo no dia 14 e no dia 28 (Figura 2B, Tabela 1).
A entrega perivascular local de adiponectina atenua a hiperplasia de íntima, média e adventícia em enxerto venoso em ratos. (A) Microfotografias de seções de veias enxertadas com coloração de Masson (200× ampliação, barra: 100 <italic>μ</italic>m). (B) Mudança da espessura neoíntima; (C) Mudança da espessura da média; (D) Mudança da espessura da adventícia; (E) relação íntima-média (I/M). Os resultados são apresentados como média + ± DP. *p <0,05 versus grupo de controle, **p <0,01 versus grupo de controle. #p <0,05 versus grupo de gel veículo, ##p <0,01 versus grupo de gel veículo. I: íntima; M: média.
Espessura da íntima, média e adventícia nos grupos de controle, de gel veículo (Pluronic-F127), L-ADP (dose baixa de ADP) e H-ADP (dose alta de ADP).
Grupos
Horário (dia)
ControleN=6
Gel veículoN=6
L-ADPN=6
H-ADPN=6
Análise
Espessura da íntima (μm)
3
25,47±1,02
25,10±1,53
26,55±1,05
26,46±0,71
ANOVA
14
111,69±5,31
106,62±5,57
75,12±4,94**##
75,46±3,59**##
ANOVA
28
196,09±6,78
190,44±7,68
128,30±6,01**##
96,96±5,45**##
ANOVA
Espessura da média (μm)
3
94,00±4,19
95,47±3,38
76,93±5,30**##
69,03±5,94**##
ANOVA
14
107,19±3,66
107,41±5,48
93,86±3,17**##
82,83±4,13**##
ANOVA
28
158,83±8,39
157,75±8,75
109,67±7,16**##
104,02±7,12**##
ANOVA
Espessura da adventícia (μm)
3
56,09±3,42
53,03±4,59
54,51±3,95
59,21±4,28
ANOVA
14
112,03±7,08
111,87±6,35
85,04±6,35**##
86,52±5,20**##
ANOVA
28
152,31±3,55
154,49±6,55
95,70±6,05**##
90,15±4,87**##
ANOVA
Os valores das espessuras são apresentados como média ± DP (=6).
p <0,05 versus grupo de controle,
p <0,01 versus grupo de controle.
p <0,05 versus grupo de gel veículo,
p <0,01 versus grupo de gel veículo.
Comparada à hiperplasia da íntima, a hiperplasia da média nas veias enxertadas ocorreu mais cedo; o espessamento da média no grupo de controle e no grupo de gel veículo, no dia 3 era mais óbvia que nos grupos L-ADP e H-ADP. Similarmente, a espessura do tecido da média diminuiu nos grupos com alta dose de adiponectina comparados aos grupos de controle e de gel veículo no dia 14 e no dia 28. A mesma tendência também existiu no grupo de baixa dose de adiponectina no dia 14 e no dia 28 (Figura 2C, Tabela 1).
As relações íntima-média nos grupos L-ADP e H-ADP foram mais altas em comparação com grupo de controle e o de gel veículo no dia 3. Posteriormente, a relação íntima-média era notavelmente mais baixa no grupo H-ADP no dia 14 e no dia 28 em comparação com o grupo de controle e o grupo de gel veículo. Dados do grupo L-ADP revelaram uma tendência similar no dia 14 e no dia 28 versus o grupo de controle e de gel veículo (Figura 2E).
Além disso, identificou-se que a aplicação de adiponectina também pode inibir a hiperplasia da adventícia de veias enxertadas em ambos os grupos com doses diferentes. A espessura da adventícia foi atenuada pela alta dose de adiponectina comparada aos grupos de controle e de gel veículo no dia 3, no dia 14 e no dia 28. A mesma tendência também existiu no grupo de baixa dose de adiponectina comparada aos grupos de controle e de gel veículo no dia 3, no dia 14 e no dia 28 (Figura 2D, Tabela 1).
A adiponectina diminui a proliferação celular após o enxerto venoso
A proliferação celular foi quantificada pelo índice de PCNA da íntima e da adventícia (número total de células com PCNA positivo dividido pelo número total de células nucleadas) em 3 momentos no tempo após o bypass (Figuras 3A, 3B). A proliferação celular entre o grupo de controle e o grupo de gel veículo na íntima e na adventícia foi similar nos três momentos no tempo. Veias tratadas com alta dose de adiponectina demonstraram proliferação mínima na íntima (26%) e na adventícia (10%) três dias após o bypass em relação aos grupos de controle e de gel veículo. Em comparação com os grupos de controle (íntima: 36%; adventícia: 36%) e de gel veículo (íntima: 37%; adventícia: 37%), a proliferação diminuiu no grupo L-ADP na íntima (29%) e na adventícia (19%) no terceiro dia. Além disso, a supressão da proliferação do grupo H-ADP também foi mais evidente na adventícia do que no grupo L-ADP no dia 3. A proliferação foi pronunciada em enxertos venosos no dia 14 (íntima: 48%; adventícia: 46%) e no dia 28 (íntima: 61%; adventícia: 51%) no grupo de controle, mas também no dia 14 (íntima, 47%; adventícia, 46%) e dia 28 (íntima, 59%; adventícia, 50%) no grupo de gel veículo. Aplicação perivascular de adiponectina com alta dose apresentou 34% de proliferação na íntima e 20% na adventícia no dia 14 quando comparado com o grupo de controle e o grupo de gel veículo. A proliferação no grupo L-ADP era visivelmente mais baixa na íntima (43%) e na adventícia (37%) no dia 14 em comparação aos grupos de controle e de gel veículo. As diferenças também podem ser encontradas na íntima e na adventícia entre os dois grupos com doses diferentes no dia 14. A inibição da proliferação também foi evidente no dia 28 no grupo L-ADP, 49% de proliferação da íntima e 43% da adventícia, o que ilustra diferenças significativas em relação aos grupos de controle e de gel veículo. A expressão do PCNA nos grupos de H-ADP apresentou uma tendência similar na íntima (38%) e na adventícia (29%) no dia 28. A comparação entre dois grupos de adiponectina diferentes também demonstrou diferenças notáveis na íntima e na adventícia no dia 28 (Figuras 3C, 3D). A expressão do PCNA determinada pelo teste de Western Blot também demonstrou os mesmos efeitos da adiponectina (Figuras 4A, 4B).
A adiponectina diminui a proliferação celular. (A) Índice de PCNA da íntima determinado por imuno-histoquímica (200×ampliação); (B) índice de PCNA da adventícia determinado por imuno-histoquímica (200×magnificação); (C) índice de PCNA da íntima; (D) índice de PCNA da adventícia. Os dados representam média + ± DP. *p <0,05 versus grupo de controle, **p <0,01 versus grupo de controle. #p <0,05 versus grupo de gel veículo, ##p <0,01 versus grupo de gel veículo.
Inibição da expressão de PCNA e VCAM-1 pela entrega de adiponectina. (A) Expressões de PCNA e VCAM-1 em todos os grupos em três momentos no tempo após a operação; (B) Expressão de PCNA determinada por Western blot; (C) Expressão de VCAM-1 determinada por Western blot. Os dados representam média + ± DP. *p <0,05 versus grupo de controle, **p <0,01 versus grupo de controle. #p <0,05 versus grupo de gel veículo, ##p <0,01 versus grupo de gel veículo.
A adiponectina diminui as expressões de VCAM-1 e ICAM-1 após o enxerto venoso
VCAM-1 foi expressado no estágio inicial, mas não houve diferenças entre os grupos no dia 3. A diferença não foi observada entre os grupos de controle e de gel veículo. A expressão de VCAM-1 no grupo de tratamento com alta dose de adiponectina foi significativamente suprimida em relação aos grupos de controle ou de gel veículo no dia 14 (0,25 versus 0,31, 0,30) e no dia 28 (0,30 versus 0,50, 0,50). A expressão de VCAM-1 no grupo L-ADP também foi inibida em relação aos grupos de controle ou de gel veículo no dia 14 (0,26) e no dia 28 (0,40). Além disso, a diferença entre os grupos H-ADP e L-ADP também foi marcada no dia 28 (Figura 5A, Figura 5C). Os resultados determinados pelo teste Western Blot também ilustraram uma tendência similar (Figura 4A, Figura 4C).
A adiponectina diminui expressões de citocina após o enxerto venoso. (A) Expressão de VCAM-1 determinada por imuno-histoquímica (200×ampliação); (B) Expressão de ICAM-1 determinada por imuno-histoquímica (200×ampliação); (C) Expressão de VCAM-1; (D) Expressão de ICAM-1. Os dados representam média + ± DP. *p <0,05 versus grupo de controle, **p <0,01 versus grupo de controle. #p <0,05 versus grupo de gel veículo, ##p <0,01 versus grupo de gel veículo.
A expressão de ICAM-1 analisada pelo ImageJ raramente foi observada nos estágios iniciais. As expressões de ICAM-1 não mostraram diferença significativa no grupo H-ADP (0,10 versus 0,18 no grupo de controle, 0,19 no grupo de gel veículo) e no grupo L-ADP (0,10 versus grupos de controle e de gel veículo) até o dia 28 (Figura 5B). Nenhuma diferença foi observada entre os dois grupos com doses diferentes de adiponectina nos três momentos no tempo.
Discussão
Apesar dos avanços nas terapias de DAC, o CABG continua sendo o principal tratamento cirúrgico, e, portanto, a reestenose continua a afligir a patência de enxertos venosos.26 Muitos experimentos tentaram entender melhor os mecanismos de falha do enxerto venoso e identificar novas abordagens para reduzir a lesão ao vaso e melhorar a cura.27–29 Este estudo demonstrou que a adiponectina entregue à superfície externa dos enxertos venosos em ratos no momento do implante por gel Pluronic-F não só reduziu a hiperplasia íntima no dia 28 em comparação com o grupo de controle em que só foi realizado o bypass, mas também pode diminuir a hiperplasia da média e da adventícia. Os resultados deste estudo sugerem que a atividade antiproliferativa e a expressão de citocinas (VCAM-1, ICAM-1) na parede do enxerto provavelmente devem estar envolvidas nesse efeito. Esses resultados demonstram o papel da ADP na prevenção da reestenose de enxertos venosos e esclarecem o possível mecanismo.
O processo complexo de remodelação de vasos resulta em reestenose dos enxertos venosos, mas o mecanismo ainda não está claro. Estudos demonstraram que o processo de reestenose de enxertos venosos inclui trombose, hiperplasia da íntima, formação da neoíntima, e aterosclerose.3 Depois do transplante dos vasos, a proliferação e a migração celular do músculo liso vascular foram afetadas pelas alterações na disfunção das células endoteliais, inflamação, hemodinâmica, entre outros fatores.11 Além disso, a adventícia do vaso sanguíneo também é danificada. Os fibroblastos ativados da adventícia se transformam em miofibroblastos, e se proliferam a migram para a média e íntima, onde sintetizam e liberam uma série de citocinas que promovem a proliferação e a migração celular.30–32 Estudos já revelaram que a adiponectina pode ser ligada a receptores de adiponectina expressos em fibroblastos da adventícia e desempenhar uma importante função. Além disso, muitos estudos relataram que a adiponectina tem efeitos anti-inflamatórios e anti-ateroscleróticos no sistema cardiovascular.33 Entretanto, os efeitos da ADP na prevenção da reestenose permanecem amplamente desconhecidos. Neste estudo, primeiramente demonstrou-se a possível eficácia da ADP na inibição de hiperplasia em enxertos venosos.
Neste estudo, a adiponectina foi aplicada ao modelo de enxerto venoso autólogo em ratos para estimular o processo fisiopatológico de enxertos venosos após CABG. Observou-se que a espessura da íntima nos grupos tratados com adiponectina era significativamente mais baixa que nos grupos tratados apenas com bypass e gel veículo, indicando que a adiponectina tem um efeito na inibição da hiperplasia da íntima. Além disso, a dose mais alta de adiponectina foi mais eficiente neste estudo. É interessante notar que o índice de PCNA da íntima e da adventícia também diminuiu nos grupos tratados com adiponectina, demonstrando que a adiponectina pode ter um efeito inibitório na proliferação celular na íntima e na adventícia de veias enxertadas. Este estudo apresenta apenas uma visão limitada dos mecanismos pelos quais a ADP reduziu a íntima do enxerto venoso neste modelo. Entretanto, ao comparar estes dados com os dados obtidos no contexto de estudos anteriores, concluiu-se que a adiponectina conseguia não só inibir a hiperplasia da íntima, mas também inibir a proliferação de miofibroblastos e limitar sua migração para a íntima e a média.34,35
Entretanto, o mecanismo específico de interação entre a adiponectina e os receptores ainda exige estudos posteriores. A farmacocinética de entrega perivascular de adiponectina também precisa ser mais bem definida em estudos futuros. Além disso, pesquisadores demonstraram que a trombose desempenhe um papel central na fase inicial das falhas de enxertos venosos. A veia é submetida a um período de lesão de isquemia e reperfusão, levando a uma redução na sintase endotelial do óxido nítrico (eNOS), expressando danos às células endoteliais e células musculares lisas vasculares (CMLV) e liberação de vários mediadores protrombóticos. Além disso, os processos de remodelação de enxerto venoso se iniciam dias após a coleta e o enxerto, levando à formação da hiperplasia da íntima.25 Considera-se que a ADP possa exercer um efeito nos estágios iniciais e intermediários. Este estudo apresenta informações apenas sobre os efeitos em curto prazo. Pesquisas posteriores precisam ser realizadas para que se entenda o mecanismo específico no curto prazo e para saber como a ADP influencia o resultado no longo prazo.
Depois de o endotélio ser lesionado, um processo fisiopatológico inicial de reestenose, as moléculas de adesão ICAM-1 e VCAM-1 são liberadas, o que pode levar à adesão e à infiltração de monócitos/macrófagos que diferenciam e fagocitam uma grande quantidade de ox-LDL, e, em seguida, formam células espumosas. Nestes experimentos, detectou-se a expressão de VCAM-1 e ICAM-1 por imuno-histoquímica, e identificou-se que os valores de VCAM-1 e ICAM-1 nos grupos tratados por adiponectina eram marcadamente mais baixos do que os do grupo tratado por gel veículo e do grupo tratado apenas por bypass, o que elucidou como a aplicação da adiponectina pode reduzir a expressão de VCAM-1 e ICAM-1 para promover a disfunção do endotélio.
Conclusão
No presente estudo, confirmou-se que a entrega perivascular local de adiponectina atenua a hiperplasia de enxertos venosos em um modelo de bypass de carótida em ratos. O efeito parece ser mediado tanto pela diminuição da proliferação celular quanto pela diminuição da expressão de VCAM-1 e ICAM-1 dentro do enxerto. Embora os efeitos de curto prazo da adiponectina pareçam promissores, os efeitos de longo prazo e a significância clínica da adiponectina no CABG precisa ser estudado no futuro. Espera-se que estes estudos, em algum momento, se traduzam em aplicação clínica na prevenção de reestenose e falha nos enxertos em bypass.
Fontes de financiamento
O presente estudo foi financiado por National Natural Science Foundation of China (grant numbers NSFC 81470530 to J.G).
Vinculação acadêmica
Este artigo é parte de tese de doutorado de Yang Zhou pelo Anhui Medical University.
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Author Contributions
Conception and design of the research: Zhou Y, Zhang B, Ge J; Acquisition of data: Zhou Y, Dai C; Analysis and interpretation of the data, Statistical analysis and Writing of the manuscript: Zhou Y; Obtaining financing: Ge J; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Zhang B, Ge J.
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
AbstractBackground:
Coronary artery bypass grafting (CABG) continues to be an effective therapy for coronary artery disease patients, but the vein graft is prone to restenosis or occlude. Adiponectin (ADP) is a plasma hormone protein with the function of regulating cell proliferation.
Objective:
This study used two different doses of ADP protein in a rat vein graft model to stimulate vein graft change. The aim of our study was to investigate the effect of ADP on vein graft restenosis.
Methods:
Autologous jugular veins were implanted as carotid interposition grafts through the anastomotic cuff technique in Sprague Dawley rats. Adiponectin (2.5 μg and 7.5 μg) was delivered to the vein bypass grafts in a perivascular fashion, suspended in a 30% Pluronic-F127 gel. No treatment (bypass only) and vehicle loaded Pluronic gel served as controls. Comparisons were made with one-way analysis of variance and a post-hoc test, with p < 0.05 considered significant.
Results:
Cell proliferation (PCNA index) was significantly low in adiponectin-treated versus control and vehicle-gel-treated grafts, both in intima and adventitia, as of day 3 (p < 0.01). VCAM-1 and ICAM-1 evaluated by immunohistochemistry significantly down-regulated in the adiponectin-treated vein grafts in the fourth week (p <0.01). Treatment of vein grafts with adiponectin-loaded gels reduced intimal, media, and adventitia thickness when compared with the control and vehicle-gel-treated vein grafts at day 28 (p < 0.01).
Conclusions:
Our studies provide further support for the potential therapeutic role of adiponectin in modulating vascular injury and repair.
Keywords:AdiponectinCell ProliferationHyperplasiaNational Natural Science Foundation of China81470530This study was partially funded by National Natural Science Foundation of China (grant numbers NSFC 81470530 to J.G).Introduction
Coronary artery disease (CAD) is a worldwide disease with an increasing morbidity and mortality.1 Coronary artery bypass grafting (CABG) continues to be an therapy for advanced stage patients. Saphenous vein grafts provide the most widely used bypass conduit, which make up ~50% of grafts used in CABG for its convenience of harvesting and manipulating, its sufficient length, and its character of not easily being affected by competitive coronary blood flow.2,3 Despite the advantages in treatments, the grafted vein is prone to restenosis or occlude under the influence of arterial blood pressure, persistent inflammation and associated risks of failure, with a patency rate of 65% - 80% in 5 years after operation.4–6 Therefore, how to inhibit restenosis in the vein grafts represents a challenge.
Intimal hyperplasia (IH) plays a causal role in grafted vein restenosis, characterized by an excessive accumulation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) leading to occlusive disorders.6–8 In addition, increasing data indicate that the adventitia may also be related to the remodeling of the grafted veins.9–11 After being injured, adventitial fibroblasts activate and proliferate, followed by adventitia biosynthesizing, and release a variety of cytokines to promote the proliferation of VSMCs. The entire process results in IH and restenosis.12–15 Many cytokines have proven to be involved in the proliferation of VSMCs, among which VCAM-1 and ICAM-1 can promote cell adhesion and atherosclerotic lesion formation.16,17
Adiponectin (ADP), a plasma hormone protein specifically biosynthesized by adipocytes, can exert an effect by binding to adiponectin receptors in fibroblasts.18,19 ADP can also be used to attenuate endothelial dysfunction.20 Recent studies have shown that ADP plays important roles in suppressing cell proliferation after damage to the vessel, and decreases cytokines, which also promote cell proliferation.21,22
Considering these findings, we hypothesize that ADP can prevent vein graft restenosis by inhibiting cell proliferation. ADP was delivered to the external surface of the graft veins with two different concentrations in order to investigate the effect of ADP on vein graft restenosis. The results showed that the ADP significantly decreased intimal, medial, and adventitial thickness of the vein graft. Meanwhile, cell proliferation and cytokine expression (VCAM-1, ICAM-1) also decreased. These results primarily demonstrated the role of ADP in preventing vein graft restenosis and highlighted the potential mechanism.
Methods
Ethical approval for animal experiments was accepted from the Animal Care and Use Committee of the First Affiliated Hospital to the University of Science and Technology of China. Sprague Dawley (SD) rats (male and female, aged 10-12 weeks, body weight of 275-325 g, and N=72) were purchased from the Anhui Lab Animal Research Center and were randomly assigned to the ADP treatment groups (low and high dose groups), vehicle gel treatment group (pluronic-F127 gel), and control group (bypass only). According to previous research, 72 rats were divided into 4 groups, which were then divided into 12 groups at three different points of time23 (n = 6 per group).
Perivascular drug delivery constructs
The adventitial drug delivery approach used Pluronic F127 gel as a vehicle gel. A total of 2.5μg adiponectin (Abcam) was dissolved in 25 μl of distilled water and resuspended in 300 μl of 30% pluronic-F127 gel for delivery to vein grafts after carotid interposition in a low dose adiponectin treatment group (L-ADP group), while 7.5μg adiponectin was used to coat the graft veins in a high dose adiponectin treatment group (H-ADP group). An equal amount of pluronic-F127 gel was applied to the vehicle gel treatment group (VG group). Only upon application were the pluronic-F 127 gels taken out of a 4°C environment, which seeks to maintain its liquid form.
Rat autologous vein graft model
SD rats were anesthetized with a 10% chloral hydrate (300 mg/kg) and received heparin (200 U/kg) via caudal vein injection. The left jugular vein was harvested for use as a carotid interposition graft. The bypass was performed by applying the anastomotic cuff model, as previously described.24 Specifically, 2-mm cuffs were cut from a 20G red arterial puncture needle (BD Company). The carotid artery was isolated up to the branches. The proximal and distal ends of the artery were then placed under suture traction lines and hemoclips to block blood flow before being cut in middle. Both ends of the arteries were then pulled through the cuff. The arteries were then everted and secured to the cuff with 6–0 silk suture. Following an arteriotomy in the left (ipsilateral) common carotid artery, the cuffs were inserted into and secured to the artery with a 6–0 silk suture. The artery was then divided to enable a longitudinal extension of the vein interposition graft. Treatments were applied to the external surface of the graft after unclamping. Both adiponectin treatment groups underwent a perivascular application of 300 μL of ADP gel, the vehicle gel treatment group with 300 μl of pluronic-F127 gel, and the bypass only group with no gel. Additionally, gels were kept on ice until perivascular application and subsequently allowed to solidify at body temperature, as previously described.25
Harvest of implanted grafts
Rats were euthanized on the 3rd, 14th, and 28th days after bypass transplantation respectively, 6 rats each time. Following vein grafts patency tested by Doppler ultrasonography, vein graft specimens were harvested and cut into 2 sections. One segment was immediately fixed after perfusion with heparinized saline, followed by 4% formaldehyde for hematoxylin and eosin (H&E), Masson staining and immunohistochemistry assay analyses, while the other was placed at -80°C for Western blot analysis. Animals were sacrificed by sodium pentobarbital overdose.
Morphometric analysis
After fixation in 4% formaldehyde and processing in 70% ethanol, specimens harvested on the 3rd, 14th and 28th days were paraffin embedded; 3-μm sections were taken throughout the graft, excluding regions immediately adjacent to the anastomotic cuffs. Sections were stained with hematoxylin and Masson kit (Shanghai Gefan Biological, China.), and staining sections were observed by a Leica-DM2000 biological microscope (Leica, Hefei, China). At least five equally spaced sections of the bypass grafts were analyzed for each specimen. Standard morphometric measurements were recorded, including intimal thickness, medial thickness, and adventitial thickness. These data were then calculated by ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Md).
Immunohistochemistry analysis
Paraffin-embedded tissues (3, 14 and 28-day grafts) were processed, and 3-μm sections were taken throughout the graft, excluding regions immediately adjacent to the anastomotic cuffs. After deparaffinization, the antigen was recovered with a citrate buffer for 20 min at high temperature and pressure, then deactivated with a 3% H2O2 endogenous peroxidase for 20 min and block endogenous peroxidase with 5% bovine serum albumin for 10 min. Sections were treated overnight at 4°C with anti-PCNA monoclonal antibody (D3H8P; Cell Signaling), anti-VCAM1 antibody (ab134047; Abcam, 1:500 dilution), and anti-ICAM1 antibody (ab119871; Abcam, 1:200 dilution). Three separate sections per graft were analyzed for all markers. The slices were washed several times. Biotinylated secondary antibody working solution and horseradish peroxidase conjugated streptavidin working solution were added to the slices, respectively. The slices were washed in PBS (pH 7. 2) for 5 minutes. Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) was used to visualize and hematoxylin to counterstain. Lastly, the slices were dehydrated, and then mounted and sealed. All images were acquired by image signal acquisition and analysis system (Leica-DM2000, Hefei, China). PCNA index was used to describe the level of PCNA expression (PCNA index = the numbers of PCNA positive cells / the numbers of all cells). Average optical density was used to describe the standard of VCAM-1 and ICAM-1 expressions (average optical density = Integral optical density / area).
Western blot assay of PCNA and VCAM-1 protein expression analysis
Total protein was isolated from grafted veins. After electrophoresis and electrotransfer, membranes were blocked with 5% skimmed milk and were incubated at 4°C with primary antibodies overnight (with anti-PCNA monoclonal antibody D3H8P; Cell Signaling, 1:1000 dilution; anti-VCAM1 antibody ab134047; Abcam, 1:3000 dilution; anti-β-Tubulin antibody GB11017; Servicebio, 1:2000 dilution). After being incubated with secondary antibody (goat anti-mouse IgG-HRP SE131; Solarbio, 1:3000 dilution), the membranes were washed with TBST. The membranes were then exposed on the PVDF film and an ECL coloring solution (PE0010, Solarbio) was added. Separated immunoreactive bands were processed by Odyssey v1.2 software. Gray values were measured based on the internal reference of β-Tubulin.
Statistical analysis
Data were presented as mean ± standard deviation (SD) and were processed by SPSS v.21.0 software (Chicago, IL). Because data followed a normal distribution verified by the Kolmogorov–Smirnov test, comparisons among multiple groups were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA). Comparisons between two groups were analyzed by Fisher's least significant difference (LSD) test. A p-value < 0.05 was considered statistically significant.
Results
The previously described operation method was used to establish the model of autologous jugular vein bypass in rats. After the procedure, the transplanted jugular veins were fully filled, and the blood vessels beat well. Local perivascular delivery of Pluronic-F 127 gel evenly covered the surface of the blood vessel. The incision was closed after the glue solidified. The incision healing and activity status of rats were checked every day after operation. Doppler ultrasound was performed on the day of euthanasia, which showed that the transplanted jugular vein blood did not clearly occlude. In the 28-day control group, the vein grafts were thickened and were slightly stiff, and the surrounding tissue adhesion was relatively obvious. Correspondingly, veins in the high-dose adiponectin group did not expand significantly, and the surrounding tissues were easy to separate (Fig 1).
Intraoperative and postoperative photographs and Doppler ultrasound photographs. (A) a. Intraoperative photographs of control and high-dose adiponectin groups; (B) postoperative photograph in the fourth week of control and high-dose adiponectin groups; (C) Doppler ultrasound photographs on the day of euthanasia in the control and high-dose adiponectin groups.
Adiponectin attenuates vein graft intimal, medial, and adventitial hyperplasia
Morphometric analysis of grafts explanted after bypass (Figure 2A) showed decreased intimal, medial, and adventitial thickness after perivascular delivery of adiponectin. Quantification of the intimal, medial, and adventitial thickness was performed by at least five equally spaced sections along the nonanastomotic vein for each bypass graft. In view of the three time points of day 3, day 14, and day 28, there was no significant difference in the thickness of the intima, media, and adventitia between the control group and the vehicle gel group, which meant the application of Pluronic F-127 gel as the load gel will not affect the pathophysiology of vein grafts. To be specific, the intimal thickness of the vein graft in the H-ADP group diminished significantly on day 14 and day 28 compared with the control group and the vehicle gel group. Similarly, intimal thickness in the L-ADP group evidently decreased more than that in the control group and the vehicle gel group on day 14 and day 28 (Figure 2B, Table 1).
Local perivascular delivery of adiponectin attenuates vein graft intimal, medial, and adventitial hyperplasia within rat vein grafts. (A) Light micrographs of Masson-stained sections of grafted veins (200× magnification, bar: 100<italic>μ</italic>m). (B) The change of neointimal thickness; (C) The change of medial thickness; (D) The change of adventitial thickness; (E) intima-to-media (I/M) ratio. Results are presented as mean ± SD. *P < 0.05 versus control group, **P < 0.01 versus control group. #P < 0.05 versus vehicle gel group, ##P < 0.01 versus vehicle gel group. I: intima; M: media.
The thickness of intima, media, and adventitia in the control, vehicle gel (pluronic-F127 gel), L-ADP (low-ADP dose), and H-ADP (high-ADP dose) groups
Groups
Time(day)
ControlN=6
Vehicle gelN=6
L-ADPN=6
H-ADPN=6
Analysis
Intima thickness (μm)
3
25.47±1.02
25.10±1.53
26.55±1.05
26.46±0.71
ANOVA
14
111.69±5.31
106.62±5.57
75.12±4.94**##
75.46±3.59**##
ANOVA
28
196.09±6.78
190.44±7.68
128.30±6.01**##
96.96±5.45**##
ANOVA
Media thickness (μm)
3
94.00±4.19
95.47±3.38
76.93±5.30**##
69.03±5.94**##
ANOVA
14
107.19±3.66
107.41±5.48
93.86±3.17**##
82.83±4.13**##
ANOVA
28
158.83±8.39
157.75±8.75
109.67±7.16**##
104.02±7.12**##
ANOVA
Adventitia thickness (μm)
3
56.09±3.42
53.03±4.59
54.51±3.95
59.21±4.28
ANOVA
14
112.03±7.08
111.87±6.35
85.04±6.35**##
86.52±5.20**##
ANOVA
28
152.31±3.55
154.49±6.55
95.70±6.05**##
90.15±4.87**##
ANOVA
The values of thickness are presented as mean ± SD (N=6).
p < 0.05 versus control group,
p < 0.01 versus control group.
p < 0.05 versus vehicle gel group,
p < 0.01 versus vehicle gel group.
Compared with intimal hyperplasia, the average hyperplasia in the grafted veins occurred earlier; the thickening of the average in the control and the vehicle gel group on day 3 was more obvious than that in the L-ADP and H-ADP groups. Similarly, the thickness of the medial tissue decreased in the high-dose adiponectin groups when compared with the control group and the vehicle gel group on day 14 and day 28. The same tendency also existed in the low-dose adiponectin group on day 14 and day 28 (Figure 2C, Table 1).
The intima-to-media ratios in the L-ADP and H-ADP groups were higher when compared to the control and vehicle gel groups on day 3. After, the intima-to-media ratio was notably lower in the H-ADP group on day 14 and day 28 when compared to the control and vehicle gel groups. Data from the L-ADP group showed a similar tendency at day 14 and day 28 when compared to the control and vehicle gel groups (Figure 2E).
In addition, our study found that the application of adiponectin can also inhibit the adventitia hyperplasia of grafted veins in both of the different dose groups. Adventitia thickness was attenuated by high-dose adiponectin when compared to the control and vehicle gel groups on day 3, day 14, and day 28. The same trend occurred in the low-dose adiponectin treatment groups when compared to the control and vehicle gel groups on day 3, day 14, and day 28 (Figure 2D, Table 1).
Adiponectin decreases cell proliferation after vein grafting
Cell proliferation was quantified by the PCNA index of intima and adventitia (total number of PCNA-positive cells divided by the total number of nucleated cells) at 3 time-points after bypass (Figure 3A, 3B). The cell proliferation between the control and the vehicle group in both intima and adventitia was similar at 3 points of time. High-dose adiponectin-treated veins showed minimal proliferation in intima (26%) and adventitia (10%) three days after bypass as compared to the control and vehicle gel groups. Compared to the control (intima: 36%; adventitia: 36%) and vehicle gel (intima: 37%; adventitia: 37%) groups, proliferation diminished in the L-ADP group both in intima (29%) and adventitia (19%) on the third day. Moreover, proliferation suppression of the H-ADP group was also more obvious in adventitia than that of the L-ADP group on day 3. Proliferation was pronounced in vein grafts on day 14 (intima, 48%; adventitia, 46%) and day 28 (intima, 61%; adventitia, 51%) in the control group, but also on day 14 (intima, 47%; adventitia, 46%) and day 28 (intima, 59%; adventitia, 50%) in the vehicle gel group. Perivascular application of high-dose adiponectin exhibited 34% proliferation in intima and 20% in adventitia on day 14 when compared to the control and vehicle gel groups. Proliferation in the L-ADP group was visibly lower in both intima (43%) and adventitia (37%) on day 14 when compared to the control and vehicle gel groups. The differences can also be found in intima and adventitia between two different dose groups on day 14. Proliferation inhibition was also evident on day 28 in the L-ADP group, 49% proliferation of intima and 43% of adventitia, which illustrated significant differences when compared to the control and the vehicle gel groups. The expression of PCNA in the H-ADP group showed a similar trend in intima (38%) and adventitia (29%) on day 28. Comparison between two different adiponectin groups also showed notable differences in intima and adventitia on day 28 (Figure 3C, 3D). The expression of PCNA determined by Western blot also demonstrated the same effects of adiponectin (Figure 4A, 4B).
Adiponectin decreases cell proliferation. (A) PCNA index of intima determined by immunohistochemistry (200×magnification); (B) PCNA index of adventitia determined by immunohistochemistry (200×magnification); (C) PCNA index of intima; (D) PCNA index of adventitia. Data represent mean ± SD. *p < 0.05 versus control group, **p < 0.01 versus control group. #p < 0.05 versus vehicle gel group, ##p < 0.01 versus vehicle gel group.
Inhibition of PCNA and VCAM-1 expressions by delivery of adiponectin. (A) Expressions of PCNA and VCAM-1 in all groups at three points in time after operation; (B) Expression of PCNA determined by Western blot; (C) Expression of VCAM-1 determined by Western blot. Data represent mean ± SD. *p < 0.05 versus control group, **p < 0.01 versus control group. #p < 0.05 versus vehicle gel group, ##p < 0.01 versus vehicle gel group.
Adiponectin decreases VCAM-1 and ICAM-1 expressions after vein grafting
VCAM-1 was expressed in the early stages, but there was no difference in each group on day 3. Difference was not observed between the control and the vehicle gel group. The expression of VCAM-1 in the high-dose adiponectin treatment group was significantly suppressed in relation to the control and vehicle gel groups on day 14 (0.25 versus 0.31, 0.30) and day 28 (0.30 versus 0.50, 0.50). The expression of VCAM-1 in the L-ADP group was also inhibited in relation to the control and vehicle gel groups on day 14 (0.26) and day 28 (0.40). In addition, the difference between the H-ADP and the L-ADP groups was also marked on day 28 (Figure 5A, Figure 5C). Results determined by Western blot also illustrated a similar tendency (Figure 4A, Figure 4C).
Adiponectin decreases cytokine expressions after vein grafting. (A) VCAM-1 expression determined by immunohistochemistry (200×magnification); (B) ICAM-1 expression determined by immunohistochemistry (200×magnification); (C) VCAM-1expression; (D) ICAM-1 expression. Data represent mean ± SD. *p < 0.05 versus control group, **p < 0.01 versus control group. #p < 0.05 versus vehicle gel group, ##p < 0.01 versus vehicle gel group.
ICAM-1 expression analyzed by ImageJ was rarely observed in the early stages. The expressions of ICAM-1 showed no prominent difference in the H-ADP group (0.10 versus 0.18 in control group, 0.19 in vehicle gel group) and the L-ADP group (0.10 versus control and vehicle gel group) until day 28 (Figure 5B). No difference could be observed between the two different dose adiponectin groups at the three point in time.
Discussion
Despite advances in CAD therapies, CABG remains the main surgical treatment, and thus restenosis continues to plague the patency of vein grafts.26 Many experiments have tried to better understand the mechanisms of venous-graft failure and to identify new approaches to reduce vessel injury and to improve healing.27–29 Our study demonstrated that adiponectin delivered to the external surface of rat vein grafts at the time of implantation through Pluronic-F gel not only reduced intimal hyperplasia on day 28 compared with bypass-only controls, but can also decrease medial and adventitial hyperplasia. Our results suggest that reduced anti-proliferative activity and cytokine expression (VCAM-1, ICAM-1) in the graft wall are likely to be involved in this effect. These results demonstrate the role of ADP in preventing the vein graft restenosis and highlight the potential mechanism.
The complicated remodeling process of vessels results in restenosis of the vein grafts, but the specific mechanism is still unclear. Studies have shown that the process of venous-graft restenosis includes thrombosis, intimal hyperplasia, neointimal formation, and atherosclerosis.3 After vessel transplantation, vascular smooth muscle cell proliferation and migration are affected by changes in endothelial cell dysfunction, inflammation, hemodynamics, among other factors.11 In addition, the adventitia of the blood vessel is also damaged. The activated adventitial fibroblasts transform into myofibroblasts, and then proliferate and migrate to the media and intima, where they synthesize and release a variety of cytokines to promote smooth muscle cell proliferation and migration.30–32 Studies have revealed that adiponectin can be bound to adiponectin receptors expressed in adventitial fibroblasts and play a key role. Furthermore, many studies have reported that adiponectin has anti-inflammatory and anti-atherosclerotic effects on the cardiovascular system.33 However, the effects of ADP on preventing restenosis remain largely unknown. The present study primarily demonstrated the potential efficacy of ADP in inhibiting vein graft hyperplasia.
In this study, adiponectin was applied to the rat autologous vein graft model to stimulate the pathophysiological process of vein grafts after CABG. The thickness of intima in the adiponectin groups was found to be significantly lower than that in the bypass-only group and vehicle-gel treatment group, indicating that adiponectin has an effect on inhibiting intima hyperplasia. Moreover, the higher-dose adiponectin was more effective in this study. Interestingly, we found that the PCNA index of intima and adventitia decreased in the adiponectin treated groups as well, demonstrating that adiponectin may well have an inhibitory effect on cell proliferation in the intima and adventitia of grafted veins. This study provides only limited insight into the mechanisms through which ADP reduced vein graft intima in this model. However, comparing our data with that taken in the context of previous studies, it can be concluded that adiponectin was not only able to inhibit intimal hyperplasia, but also to inhibit the proliferation of myofibroblasts and limit its migration to the intima and media.34,35
However, the specific mechanism of the interaction between adiponectin and receptors still needs further study. The pharmacokinetics of perivascular delivery of adiponectin also need to be better defined in future studies. Researchers have also shown that thrombosis plays a key role in the early phase of vein graft failure. The vein is subjected to a period of ischemia-reperfusion injury-leading to a reduction in endothelial nitric oxide synthase (eNOS) expressing, damage to endothelial cells and smooth muscle cells (SMCs), and the release of various prothrombotic mediators. Furthermore, the remodeling processes of the vein graft start within days after harvesting and grafting, leading to the formation of intimal hyperplasia.25 We believe ADP can exert an impact in both the early and intermediate stages. Our study only brings information about the short-term effect. Further research is warranted in order to understand the specific mechanism in the short-term and to know how ADP influences the long-term outcome.
After the endothelium is damaged, an early pathophysiological process of restenosis, the adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1 are released, which lead to adhesion and infiltration of monocytes / macrophages that differentiate and engulf a large amount of ox-LDL, and then form foam cells. In our experiments, we detected the expression of VCAM-1 and ICAM-1 by immunohistochemistry and found that the values of VCAM-1 and ICAM-1 in the adiponectin group were markedly lower than those in the vehicle-gel treatment group and the bypass-only group, which elucidated how the application of adiponectin can downregulate the expression of VCAM-1 and ICAM-1 to promote dysfunction of endothelium.
Conclusion
The present study confirmed that the local perivascular delivery of adiponectin attenuates vein graft hyperplasia in a rat carotid bypass model. This effect appears to be mediated by both decreased cell proliferation and a downregulated expression of VCAM-1 and ICAM-1 within the graft. Although the short-term effects of adiponectin seem promising, the long-term effects and clinical significance of adiponectin in CABG need to be studied in the future. We hope that these studies will eventually be translated into clinical application in the prevention of restenosis and bypass graft failure.
Sources of Funding
This study was partially funded by National Natural Science Foundation of China (grant numbers NSFC 81470530 to J.G).
Study Association
This article is part of the thesis of doctoral submitted by Yang Zhou, from Anhui Medical University.