Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC YMWRmgpkHxBkjsmsJhY66Qm S0066-782X2021005017204 S0066-782X2021001401106 abc.20200929 10.36660/abc.20200929 Artigo Original Efeitos do Óleo de Copaíba em Marcadores Periféricos de Estresse Oxidativo em um Modelo de Cor Pulmonale em Ratos 0000-0001-6054-4243 Campos Cristina 1 Turck Patrick 1 Tavares Angela Maria Vicente 1 Corssac Giana 1 Lacerda Denise 1 Araujo Alex 1 Llesuy Susana 2 Klein Adriane Bello 1 Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre RS Brasil Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS – Brasil Hospital Italiano de Buenos Aires Buenos Aires Argentina Hospital Italiano de Buenos Aires, Buenos Aires – Argentina Correspondência: Adriane Bello Klein • Universidade Federal do Rio Grande do Sul - Sarmento Leite, 500. CEP 90040-060, Porto Alegre, RS - BrasilE-mail: belklein@ufrgs.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Campos C, Llesuy S, Klein AB; Obtenção de dados e Análise e interpretação dos dados: Campos C, Turck P, Tavares AMV, Corssac G, Lacerda D; Análise estatística: Campos C, Araujo A; Obtenção de financiamento: Klein AB; Redação do manuscrito: Campos C, Klein AB; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Araujo A, Llesuy S, Klein AB.

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo

 08 10 2021 12 2021 117 6 1106 1112 20 08 2020 07 12 2020 27 01 2021 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

Até o presente momento, os efeitos sistêmicos do óleo de copaíba jamais foram documentados no Cor pulmonale induzido por monocrotalina.

 Objetivos

Investigar os efeitos do óleo de copaíba nos marcadores periféricos de stress oxidativo em ratos com Cor pulmonale.

 Métodos

Ratos Wistar machos (170±20g, n=7/grupo) foram divididos em quatro grupos: controle (CO), monocrotalina (MCT), óleo de copaíba (O), e monocrotalina + óleo de copaíba (MCT-O). Foi administrada a MCT (60 mg/kg i.p.) e, depois de uma semana, foi iniciado o tratamento com óleo de copaíba (400 mg/kg/day-gavagem-14 dias). Foi realizado o ecocardiograma e, depois disso, foi coletado sangue do tronco para a realização de avaliações de stress oxidativo. Análise estatística: ANOVA de duas vias com teste Student-Newman-Keuls post hoc. P-valores <0,05 foram considerados significativos.

 Resultados

O óleo de copaíba reduziu a resistência vascular pulmonar e a hipertrofia do ventrículo direito (VD) hipertrofia (Índice de Fulton (mg/mg)): MCT-O= 0,39±0,03; MCT= 0,49±0,01), e função sistólica melhorada (fração de encurtamento do VD, %) no grupo MCT-O (17,8±8,2) em comparação com o grupo de MCT (9,4±3,1; p<0,05). Além disso, no grupo MCT-O, espécies reativas do oxigênio e os níveis de carbonila foram reduzidos, e os parâmetros antioxidantes aumentaram no sangue periférico (p <0,05).

 Conclusões

Os resultados deste estudo sugerem que o óleo de copaíba tem um efeito antioxidante sistêmico interessante, que se reflete na melhoria da função e na morfometria do VD nesse modelo de Cor pulmonale . A atenuação do Cor pulmonale promovida pelo óleo de copaíba coincidiu com uma redução no stress oxidativo sistêmico.

 Doença Cardiopulmonar Monocrotalina Ratos Estresse Oxidativo Fabaceae Fitoterapia Hipertrofia Ventricular Direita Óleo de Copaiba Introdução

A Floresta Amazônica poderia ser considerada um laboratório natural, por tem uma ampla diversidade de plantas com propriedades medicinais. A maioria dessas plantas ainda não foram estudadas, como é o caso da copaíba.1 A copaíba é uma árvore grande que cresce abundantemente na região norte do Brasil. Desde o século XVI, o óleo de copaíba tem sido usado pelos indígenas nativos do país para tratar várias doenças. Esses usos tradicionais motivaram alguns pesquisadores a estudarem esse óleo.2

De acordo com alguns relatos, o óleo de copaíba apresenta propriedades antioxidantes e antilipoperoxidativas.3 , 4 As propriedades antioxidantes do óleo de copaíba poderiam ser muito úteis no tratamento de algumas doenças cardiovasculares associadas ao stress oxidativo. Entretanto, há apenas dois estudos na literatura demonstrando os efeitos benéficos do óleo de copaíba em doenças cardiovasculares, como a hipertensão arterial pulmonar (HAP).5 , 6

A HAP é uma doença crônica e fatal que está associada a aumentos progressivos da pressão e da resistência vascular pulmonar. Essas alterações prejudicam o desempenho do ventrículo direito (VD) e resultam em insuficiência do VD, e, em última instância, em morte.7 Para se estudar os mecanismos fisiopatológicos envolvidos da disfunção do VD e no desenvolvimento da HAP, foi utilizado o modelo de monocrotalina (MCT).8 O metabólito ativo da MCT causa danos ao endotélio pulmonar, levando à HAP.9

O modelo MCT mimetiza aspectos da HAP humana, incluindo o Cor pulmonale, que é um termo usado para descrever a hipertrofia patológica do VD induzida por disfunção pulmonar.10 Na verdade, vários estudos em modelos animais e pacientes implicam o stress oxidativo no desenvolvimento do Cor pulmonale e da HAP.11 - 13 O stress oxidativo pode causar danos às células endoteliais14 além de contribuir para a disfunção e insuficiência do VD.11 Entretanto, nenhum estudo explorou o impacto da HAP nos marcadores de stress oxidativo no sangue periférico, ao analisar os efeitos do óleo de copaíba. Relatou-se que o stress oxidativo medido no sangue de pacientes com doença neurodegenerativa poderia representar um reflexo do dano oxidativo cerebral nesses pacientes.15 Dessa forma, a avaliação dos marcadores periféricos de stress oxidativo poderia ter uma aplicabilidade clínica, já que a obtenção de uma amostra de sangue representa um procedimento minimamente invasivo.16 Essa abordagem poderia ser útil em caso de doenças cardiopulmonares, tais como a HAP, para monitorar o avanço da doença, além da necessidade e da eficácia da terapia antioxidante, como o óleo de copaíba.

Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar se os marcadores periféricos de stress oxidativo refletem as alterações estruturais e funcionais promovidas no VD pela HAP e os efeitos do óleo de copaíba sobre esses marcadores.

 Métodos Animais, indução do Cor pulmonale e grupos:

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal institucional (número de protocolo: 31765). No total, foram estudados 28 ratos Wistar machos (pesando 170±20g) do Centro de Reprodução e Experimentação de Animais de Laboratório (CREAL) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Eles foram mantidos em uma temperatura de 20-22°C, com um fotoperíodo de 12:12h escuro/claro. Todos os animais tinham acesso ad libitum a ração para ratos comum e água, e os experimentos foram realizados de acordo com o Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório) (Departamento de Serviços de Saúde e Humanos, Publicação NIH nº 86-23), e com diretrizes institucionais.

O número de animais por grupo foi estimado com base em estudos anteriores de nosso grupo de pequisa,6 , 7 considerando a diferença mínima entre os grupos de dois desvios padrão, uma probabilidade mínima de erro tipo I de 5% (a = 0,05) e uma probabilidade de erro tipo II de 20% (b = 0,2). Esse cálculo foi realizado utilizando-se o software Computer Programs for Epidemiologists (PEPI - Versão 4.04x)

Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais (N=7/grupo): controle (CO), monocrotalina (MCT), óleo de copaíba (O), e monocrotalina + óleo de copaíba (MCT-O). No primeiro dia, a HAP foi induzida por uma injeção única de MCT in bolus (60mg/kg i.p.), conforme descrito em outro local.10 Uma semana depois da indução de HAP, os animais no grupo O e MCT-O receberam óleo de copaíba (400mg/kg) por gavagem, uma vez ao dia, durante 14 dias.5 Essa dose corresponde a um volume de 0,63 mL/kg de óleo de copaíba. Durante esse período, os animais dos grupos CO e MCT receberam o mesmo volume de água por gavagem.

 Análise ecocardiográfica

O fluxo pela artéria pulmonar e a função contrátil do VD foram avaliados por ecocardiografia após o final do tratamento para estimar o efeito do óleo de copaíba na função cardiovascular. Os animais foram anestesiados (cetamina, 90 mg/kg; xilazina, 20 mg/kg, intraperitoneal) e colocados na posição decúbito lateral esquerdo para se obter as imagens cardíacas. Foi utilizado um sistema EnVisor Philips (Andover, MA, EUA), com um transdutor de 12–13MHz, por um operador treinado e com experiência em ecocardiografia de pequenos animais. Foram medidos a fração de encurtamento do VD (FEVD), que estima a função contrátil do VD, e o tempo de aceleração (TA) e o tempo de ejeção (TE) dos traços da velocidade do fluxo da artéria pulmonar, que estimam a resistência vascular pulmonar.17

 Análise morfométrica

Depois do final do tratamento, os ratos foram sacrificados por decapitação. O VD e o VE foram retirados para medição morfométrica, e foi coletado sangue do tronco venoso para análise de stress oxidativo. VD e VE + septo (S) foram pesados para determinar a hipertrofia cardíaca pelo Índice de Fulton (peso do VD/peso de VE+S).18

 Preparação da amostra de sangue:

Defesas antioxidantes sistêmicas e espécies reativas do oxigênio (ERO) totais foram avaliadas nas hemácias e as carbonilas forma medidas no plasma. Amostras de sangue heparinizadas foram lavadas três vezes em uma solução de cloreto de sódio (9g/L) e centrifugadas a 3.000 g por 10 minutos em temperatura ambiente. Eritrócitos lavados foram diluídos na proporção de 1/10 em uma solução de ácido acético (1mmol/L) e sulfato de magnésio (4mmol/L). A solução final foi centrifugada a 4.200 g por 20 minutos. O sobrenadante foi armazenado em freezer a -80 °C para medições de stress oxidativo futuras.15

 Concentração de proteína

A concentração de proteína foi quantificada pelo método estabelecido por Lowry et al.,19 utilizando albumina bovina como solução padrão na concentração de 1mg/mL. Todos os resultados de stress oxidativo foram normalizados pela quantidade de proteína.19

 Determinação dos níveis totais de ERO

A geração de ERO foi medida por emissão de fluorescência DCFH-DA (Sigma-Aldrich, USA). O diacetato de diclorofluoresceína é uma membrana permeável e é rapidamente oxidada para a altamente fluorescente 2’, 7’-diclorofluoresceína (DCF) na presença de ERO. A amostra foi excitada a 488 nm, e a emissão foi coletada com um filtro de passagem longa de 525 nm. As ERO foram expressas como nmol por miligrama de proteína.20

 Ensaio de carbonila

Essa técnica se baseia na reação de proteínas oxidadas com 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH). Em resumo, estas proteínas foram adicionadas a DNPH 10mmol/L em 2,5mol/L solução de HCl, por 1 h, no escuro em temperatura ambiente, com agitação a cada 15 minutos. Em seguida, uma solução de ácido tricloroacético a 20% (p/v) foi adicionada às amostras de plasma, que foram centrifugadas (1.000 por 5 minutos) para coletar precipitados de proteína. Daí em diante, a pelota foi dissolvida com etanol:acetato de etila (1:1) (v/v) e incubada por 10 minutos a 37 °C com 6mol/L de solução de cloreto de guanidina. A absorbância foi medida em um espectrofotômetro a 360nm e os resultados foram expressos em nmol de DNPH derivativos/mg de proteína.21

 Determinação de atividades de enzimas antioxidantes:

A atividade de superóxido dismutase (SOD) foi determinada pela medição da velocidade da formação de pirogalol oxidado, e expressa em unidades por miligrama de proteína, conforme Marklund.22 A atividade de catalase (CAT) foi determinada acompanhando a diminuição na absorção de peróxido de hidrogênio de 240 nm. Ela foi expressa em nmol de peróxido de hidrogênio reduzido por minuto por miligrama de proteína.23

A atividade de glutationa peroxidase (GPx), expressa em nmol de peróxido de hidrogênio por minuto por mg de proteína, foi medida após a oxidação de NADPH a 340 nm em um meio de reação contendo 0,17 mmol/L de glutationa reduzida, 0,2 U/mL de glutationa redutase, e 0,5 mmol/L de hidroperóxido de terc-butil.24

 Níveis totais de glutationa

Os níveis totais de glutationa (GSH) foram determinados conforme descrito por Akerboom e Sies,25 com modificações. O GSH foi medido nos eritrócitos após a precipitação de proteína com 10% de ácido tricloroacético. Uma alíquota da amostra foi adicionada ao tampão de fosfato com 500 μmol/L DTNB. O desenvolvimento de cor, resultante da reação entre DTNB e os tióis, atingiu o máximo em 5 minutos e ficou estável por mais 30 minutos. A absorbância foi medida a 412 nm após 10 minutos. Uma curva padrão de glutationa reduzida foi utilizada para calcular os níveis de GSH nas amostras.25

 Análise estatística

Para a análise estatística, foi usado o software SigmaPlot. Os dados são mostrados como média ± desvio padrão. O teste de normalidade (Shapiro-Wilks) foi conduzido para determinar a distribuição de dados. Como nossos resultados apresentaram distribuição normal, a análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias, seguida do teste Student-Newman-Keuls post hoc. A correlação de Pearson foi utilizada para estudar a associação entre variáveis. P-valores menores que 0,05 foram considerados significativos.

 Resultados Avaliações ecocardiográfica

Observou-se uma diminuição significativa no TA no grupo MCT, ao mesmo tempo em que houve um aumento no grupo O, em comparação ao CO. Entretanto, o óleo de copaíba recuperou esse parâmetro para controlar os níveis no grupo MCT-O. Por outro lado, não houve diferenças entre os grupos no parâmetro TE. A FEVD, que estima a função sistólica do VD, diminuiu no grupo MCT, e o óleo de copaíba evitou essa alteração nos animais do grupo MCT-O ( Tabela 1 ).

– Resultados ecocardiográficos e morfométricos
CO MCT O MCT-O
TA (s) 0,029±0,005 0,018±0,001a 0,034±0,001a 0,025±0,003b
TE (s) 0,099±0,01 0,106±0,007 0,098±0,01 0,11±0,001
FEVD (%) 21,2±2,4 9,4±3,1a 18,8±2,4 17,8±8,2b
Índice de Fulton (mg/mg) 0,29±0,02 0,49±0,01a 0,29±0,01 0,39±0,03b

Os dados são expressos como média ± DP. a p <0,05 vs. CO; b p <0,05 vs. MCT. CO: controle; O: óleo de copaíba; MCT: monocrotalina; MCT-O: monocrotalina + óleo; TA: tempo de aceleração; TE: tempo de ejeção; VD: ventrículo direito; FEVD: fração de encurtamento do ventrículo direito. Índice de Fulton = peso do VD/peso do VE + septo; N= 7 animais por grupo.

Avaliação morfométrica

O índice de hipertrofia do ventrículo direito (VD/VE + peso de S), mostrado na Tabela 1 , foi significativamente aumentado no grupo MCT em comparação ao grupo CO. Esse parâmetro diminuiu significativamente nos animais do grupo MCT-O.

 Análise de stress oxidativo

Houve um aumento significativo nas ERO e nos níveis de carbonila ( Figura 1A e 1B , respectivamente) no grupo MCT em comparação ao CO. Não houve diferença significativa entre o grupo MCT e o MCT-O, ou entre o MCT-O e o O, em relação aos níveis de ERO. Entretanto, os níveis de carbonila, que aumentaram no grupo MCT, foram reduzidos no grupo MCT-O.

– <italic>Stress oxidativo A) Concentração total de espécies reativas do oxigênio; B) Níveis de carbonila. Os dados são expressos como média ± DP. a p <0,05 vs. CO; b p <0,05 vs. MCT. Grupo de controle: CO; grupo monocrotalina: MCT, grupo óleo de copaíba: O, grupo monocrotalina + óleo de copaíba: MCT-O.</italic>

Análise de antioxidantes

As atividades de enzimas antioxidantes (SOD, CAT e GPx), e concentração de GSH foram significativamente mais baixas no grupo MCT, em comparação com o grupo CO. O tratamento com óleo de copaíba recuperou esses parâmetros significativamente nos animais do grupo MCT-O. ( Figura 2A, 2B, 2C, 2D , respectivamente).

– <italic>Medições de antioxidantes. A) Atividade de superóxido dismutase; B) Atividade de catalase; C) Atividade de glutationa peroxidase; D) Níveis totais de glutationa. Os dados são expressos como média ± DP. a p <0,05 vs. CO; b p <0,05 vs. MCT. Grupo de controle: CO; grupo monocrotalina: MCT, grupo óleo de copaíba: O, grupo monocrotalina + óleo de copaíba: MCT-O</italic>

Correlações

Observou-se uma correlação positiva (R=0,688; p<0,05) entre ERO total e a relação peso de VD/ peso de VE + S ( Figura 3A ), em comparação com uma correlação negativa (R=0,614; p<0,05) entre a concentração de GSH e a relação entre peso de VD/peso de VE + S ( Figura 3B ).

– <italic>Correlações entre peso do VD/peso do VE + S e (A) ERO (P <0,05); e (B) GSH (P<0,05). VD: ventrículo direito, VE: ventrículo esquerdo, ERO: espécies reativas de oxigênio, GSH: níveis totais de glutationa.</italic>

Discussão

Os principais achados do presente estudo foram que o MCT modulado por óleo de copaíba induziu o Cor pulmonale , uma vez que promoveu a redução da resistência arterial pulmonar, além de resultar em disfunção e hipertrofia do VD. Paralelamente a essas alterações, identificou-se que o tratamento com o óleo de copaíba reverteu o stress oxidativo sistêmico aumentado pelo MCT, que foi observado pela melhoria dos níveis de ERO e carbonila, e pela redução das defesas antioxidantes.

De acordo com a literatura, a elevação da resistência pulmonar arterial é acompanhada de hipertrofia do VD, o que caracteriza o Cor pulmonale. 10 Na verdade, neste estudo observou-se uma diminuição do tempo de aceleração pela artéria pulmonar (TA), o que indica um aumento da resistência da artéria pulmonar, e um aumento da hipertrofia do VD em animais do grupo MCT. Por outro lado, o tratamento com óleo de copaíba conseguiu mitigar esses efeitos. A redução da resistência na artéria pulmonar que contribuiu para o aumento na remodelagem do VD poderia contribuir para melhorar a função do VD. Investigações anteriores em pacientes com HAP indicam que uma deficiência na função do VD está relacionada a resultados clínicos adversos e sobrevida reduzida,26 o que destaca a importância de um tratamento, tais como o óleo de copaíba, que ameniza o dano ao VD. Além disso, detectou-se uma diminuição da fração de encurtamento do VD (FEVD) no grupo MCT, o que indica deficiência da função contrátil do VD. Esse resultado está em conformidade com outros,27 , 28 que estudaram essa doença. Em contrapartida, conforme descrito no trabalho anterior, o óleo de copaíba conseguiu aumentar esse parâmetro, o que indica que este óleo poderia melhorar a função do VD.6

Conforme Jim et al.,29 há um aumento na produção de ERO sistêmicas em um modelo de ratos de hipertensão pulmonar. Além disso, Mohammadi30 também observou uma redução nas atividades de CAT, SOD, GPx, e na concentração de GSH medida no sangue em HAP induzida por MCT. Esses dados estimularam a investigação dos efeitos antioxidantes do óleo de copaíba sobre a HAP. Os dados deste estudo mostraram que o óleo de copaíba reverteu os danos oxidativos elevando as defesas antioxidantes sistêmicas e reduzindo a carbonila a níveis próximos dos observados nos ratos do grupo de controle, sugerindo que esse óleo tenha aumentado a reserva de antioxidante.

Em um estudo prévio deste grupo, foi avaliada a composição do óleo de copaíba.5 A análise química desse óleo foi realizada utilizando cromatografia gasosa com espectrometria de massa. Detectou-se que o óleo de copaíba é composto de terpenos com a predominância do β-cariofileno. Esse composto tem atividade antioxidante, levando à redução das ERO devido a seu efeito de sequestro de radicais livres contra ânions superóxidos, ânions hidroxila, e peróxidos lipídicos.31

Portanto, é razoável acreditar que os efeitos antioxidantes observados após o tratamento com óleo de copaíba se devem ao β-cariofileno presente nesse óleo. Por outro lado, os efeitos antioxidantes do óleo de copaíba também podem se dever a uma interação entre seus vários componentes. Conforme relatado em um estudo anterior, o óleo de copaíba é composto de uma grande variedade e outros sesquiterpenos e diterpenos, que também têm propriedades antioxidantes.5

O stress oxidativo está envolvido no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca patológica e em um prognóstico ruim.32 A redução da hipertrofia do VD encontrada pelo presente estudo poderia estar associada ao efeito antioxidante do óleo de copaíba. Na verdade, foi encontrada uma correlação positiva entre os níveis de ERO e a hipertrofia cardíaca neste estudo. Por outro lado, níveis aumentados de GSH, um antioxidante não enzimático endógeno, foram correlacionados a índices mais baixos de hipertrofia cardíaca. Portanto, sugere-se que o óleo de copaíba possa proteger o VD contra a hipertrofia cardíaca por suas propriedades antioxidantes. Esse achado tem enorme importância, pois, de acordo com Rosca et al., a hipertrofia do VD está correlacionada a um risco mais alto de morte súbita cardíaca.33 Como essa era uma associação entre stress oxidativo sistêmico e alteração morfométrica cardíaca, esses marcadores podem ser um reflexo das alterações no VD promovidas pela HAP.

O presente estudo foi o primeiro a testar o efeito sistêmico do óleo de copaíba em um modelo de Cor pulmonale . Alguns marcadores periféricos de stress oxidativo foram avaliados para se detectar mudanças no estado redox sistêmico. Avaliações do sangue periférico são importantes e úteis, pois refletem o estado de saúde geral do organismo. Amostras de sangue são facilmente acessíveis, disponíveis em grande quantidade, e sua coleta é menos invasiva que uma biópsia de tecido, por exemplo. Portanto, a avaliação dos marcadores de stress oxidativo no sangue de pacientes com HAP poderia ser útil para se monitorar o desenvolvimento do Cor pulmonale e o tratamento utilizado, como foi realizado com os animais usados no presente estudo.

 Conclusões

Os resultados obtidos sugerem que o óleo de copaíba tem um efeito antioxidante sistêmico interessante, que se reflete na melhoria da função e na morfometria do VD nesse modelo de Cor pulmonale . Esses resultados destacam a importância do óleo de copaíba como possível tratamento adjuvante da HAP.

 Referências 1. Kanis LA, Prophiro JS, Vieira Eda S, Nascimento MP, Zepon KM, Kulkamp-Guerreiro IC, et al. Larvicidal activity of copaifera sp. (leguminosae) oleoresin microcapsules against aedes aegypti (diptera: Culicidae) larvae. Parasitol Res. 2012;110(3):1173-8. Kanis LA Prophiro JS Vieira Eda S Nascimento MP Zepon KM Kulkamp-Guerreiro IC et al Larvicidal activity of copaifera sp. (leguminosae) oleoresin microcapsules against aedes aegypti (diptera: Culicidae) larvae Parasitol Res 2012 110 3 1173 1178 2. Veiga Junior VF, Rosas EC, Carvalho MV, Henriques MG, Pinto AC. Chemical composition and anti-inflammatory activity of copaiba oils from copaifera cearensis huber ex ducke, copaifera reticulata ducke and copaifera multijuga hayne--a comparative study. J Ethnopharmacol. 2007;112(2):248-54. Veiga VF Junior Rosas EC Carvalho MV Henriques MG Pinto AC Chemical composition and anti-inflammatory activity of copaiba oils from copaifera cearensis huber ex ducke, copaifera reticulata ducke and copaifera multijuga hayne--a comparative study J Ethnopharmacol 2007 112 2 248 254 3. Paiva LA, Gurgel LA, Campos AR, Silveira ER, Rao VS. Attenuation of ischemia/reperfusion-induced intestinal injury by oleo-resin from copaifera langsdorffii in rats. Life Sci. 2004;75(16):1979-87. Paiva LA Gurgel LA Campos AR Silveira ER Rao VS Attenuation of ischemia/reperfusion-induced intestinal injury by oleo-resin from copaifera langsdorffii in rats Life Sci 2004 75 16 1979 1987 4. Silva JJ, Pompeu DG, Ximenes NC, Duarte AS, Gramosa NV, Carvalho KM, et al. Effects of kaurenoic acid and arginine on random skin flap oxidative stress, inflammation, and cytokines in rats. Aesthetic Plast Surg. 2015;39(6):971-7. Silva JJ Pompeu DG Ximenes NC Duarte AS Gramosa NV Carvalho KM et al Effects of kaurenoic acid and arginine on random skin flap oxidative stress, inflammation, and cytokines in rats Aesthetic Plast Surg 2015 39 6 971 977 5. Campos C, de Castro AL, Tavares AM, Fernandes RO, Ortiz VD, Barboza TE, et al. Effect of free and nanoencapsulated copaiba oil on monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. J Cardiovasc Pharmacol. 2017;69(2):79-85. Campos C de Castro AL Tavares AM Fernandes RO Ortiz VD Barboza TE et al Effect of free and nanoencapsulated copaiba oil on monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension J Cardiovasc Pharmacol 2017 69 2 79 85 6. Carraro CC, Turck P, Seolin BG, Tavares AM, Lacerda D, Corssac GB, et al. Copaiba oil attenuates right ventricular remodeling by decreasing myocardial apoptotic signaling in monocrotaline-induced rats. J Cardiovasc Pharmacol. 2018;72(5):214-21. Carraro CC Turck P Seolin BG Tavares AM Lacerda D Corssac GB et al Copaiba oil attenuates right ventricular remodeling by decreasing myocardial apoptotic signaling in monocrotaline-induced rats J Cardiovasc Pharmacol 2018 72 5 214 221 7. Chin KM, Rubin LJ. Pulmonary arterial hypertension. J Am Coll Cardiol. 2008;51(16):1527-38. Chin KM Rubin LJ Pulmonary arterial hypertension J Am Coll Cardiol 2008 51 16 1527 1538 8. Hessel MH, Steendijk P, Adel B, Schutte CI, van der Laarse A. Characterization of right ventricular function after monocrotaline-induced pulmonary hypertension in the intact rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2006;291(5):H2424-30. Hessel MH Steendijk P Adel B Schutte CI van der Laarse A Characterization of right ventricular function after monocrotaline-induced pulmonary hypertension in the intact rat Am J Physiol Heart Circ Physiol 2006 291 5 H2424 H2430 9. Maruyama H, Watanabe S, Kimura T, Liang J, Nagasawa T, Onodera M, et al. Granulocyte colony-stimulating factor prevents progression of monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension in rats. Circ J. 2007;71(1):138-43. Maruyama H Watanabe S Kimura T Liang J Nagasawa T Onodera M et al Granulocyte colony-stimulating factor prevents progression of monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension in rats Circ J 2007 71 1 138 143 10. Farahmand F, Hill MF, Singal PK. Antioxidant and oxidative stress changes in experimental cor pulmonale. Mol Cell Biochem. 2004;260(1-2):21-9. Farahmand F Hill MF Singal PK Antioxidant and oxidative stress changes in experimental cor pulmonale Mol Cell Biochem 2004 260 1-2 21 29 11. Lacerda DS, Turck P, Lima-Seolin B, Colombo R, Ortiz V, Bonetto JH, et al. Pterostilbene reduces oxidative stress, prevents hypertrophy and preserves systolic function of right ventricle in cor pulmonale model. Br J Pharmacol. 2017;174(19):3302-14. Lacerda DS Turck P Lima-Seolin B Colombo R Ortiz V Bonetto JH et al Pterostilbene reduces oxidative stress, prevents hypertrophy and preserves systolic function of right ventricle in cor pulmonale model Br J Pharmacol 2017 174 19 3302 3314 12. Fessel JP, West JD. Redox biology in pulmonary arterial hypertension (2013 grover conference series). Pulm Circ. 2015;5(4):599-609. Fessel JP West JD Redox biology in pulmonary arterial hypertension (2013 grover conference series) Pulm Circ 2015 5 4 599 609 13. Tabima DM, Frizzell S, Gladwin MT. Reactive oxygen and nitrogen species in pulmonary hypertension. Free Radic Biol Med. 2012;52(9):1970-86. Tabima DM Frizzell S Gladwin MT Reactive oxygen and nitrogen species in pulmonary hypertension Free Radic Biol Med 2012 52 9 1970 1986 14. Grobe AC, Wells SM, Benavidez E, Oishi P, Azakie A, Fineman JR, et al. Increased oxidative stress in lambs with increased pulmonary blood flow and pulmonary hypertension: Role of nadph oxidase and endothelial no synthase. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2006;290(6):L1069-77. Grobe AC Wells SM Benavidez E Oishi P Azakie A Fineman JR et al Increased oxidative stress in lambs with increased pulmonary blood flow and pulmonary hypertension: Role of nadph oxidase and endothelial no synthase Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2006 290 6 L1069 L1077 15. Repetto MG, Reides CG, Evelson P, Kohan S, de Lustig ES, Llesuy SF. Peripheral markers of oxidative stress in probable alzheimer patients. Eur J Clin Invest. 1999;29(7):643-9. Repetto MG Reides CG Evelson P Kohan S de Lustig ES Llesuy SF Peripheral markers of oxidative stress in probable alzheimer patients Eur J Clin Invest 1999 29 7 643 649 16. Fois AG, Paliogiannis P, Sotgia S, Mangoni AA, Zinellu E, Pirina P, et al. Evaluation of oxidative stress biomarkers in idiopathic pulmonary fibrosis and therapeutic applications: A systematic review. Respir Res. 2018;19(1):51. Fois AG Paliogiannis P Sotgia S Mangoni AA Zinellu E Pirina P et al Evaluation of oxidative stress biomarkers in idiopathic pulmonary fibrosis and therapeutic applications: A systematic review Respir Res 2018 19 1 51 17. Urboniene D, Haber I, Fang YH, Thenappan T, Archer SL. Validation of high-resolution echocardiography and magnetic resonance imaging vs. High-fidelity catheterization in experimental pulmonary hypertension. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010;299(3):L401-12. Urboniene D Haber I Fang YH Thenappan T Archer SL Validation of high-resolution echocardiography and magnetic resonance imaging vs. High-fidelity catheterization in experimental pulmonary hypertension Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2010 299 3 L401 L412 18. Winter RL, Ray Dillon A, Cattley RC, Blagburn BL, Michael Tillson D, Johnson CM, et al. Effect of heartworm disease and heartworm-associated respiratory disease (hard) on the right ventricle of cats. Parasit Vectors. 2017;10(Suppl 2):492. Winter RL Ray Dillon A Cattley RC Blagburn BL Michael Tillson D Johnson CM et al Effect of heartworm disease and heartworm-associated respiratory disease (hard) on the right ventricle of cats Parasit Vectors 2017 10 Suppl 2 492 19. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951;193(1):265-75. Lowry OH Rosebrough NJ Farr AL Randall RJ Protein measurement with the folin phenol reagent J Biol Chem 1951 193 1 265 275 20. LeBel CP, Ischiropoulos H, Bondy SC. Evaluation of the probe 2’,7’-dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress. Chem Res Toxicol. 1992;5(2):227-31. LeBel CP Ischiropoulos H Bondy SC Evaluation of the probe 2’,7’-dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress Chem Res Toxicol 1992 5 2 227 231 21. Reznick AZ, Packer L. Oxidative damage to proteins: Spectrophotometric method for carbonyl assay. Methods Enzymol. 1994;233:357-363. Reznick AZ Packer L Oxidative damage to proteins: Spectrophotometric method for carbonyl assay Methods Enzymol 1994 233 357 363 22. Marklund SL. Superoxide dismutase isoenzymes in tissues and plasma from new zealand black mice, nude mice and normal balb/c mice. Mutat Res. 1985;148(1-2):129-34. Marklund SL Superoxide dismutase isoenzymes in tissues and plasma from new zealand black mice, nude mice and normal balb/c mice Mutat Res 1985 148 1-2 129 134 23. Boveris A, Chance B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem J. 1973;134(3):707-16. Boveris A Chance B The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen Biochem J 1973 134 3 707 716 24. Flohe L, Gunzler WA. Assays of glutathione peroxidase. Methods Enzymol. 1984;105:114-21. Flohe L Gunzler WA Assays of glutathione peroxidase Methods Enzymol 1984 105 114 121 25. Akerboom TP, Sies H. Assay of glutathione, glutathione disulfide, and glutathione mixed disulfides in biological samples. Methods Enzymol. 1981;77:373-82. Akerboom TP Sies H Assay of glutathione, glutathione disulfide, and glutathione mixed disulfides in biological samples Methods Enzymol 1981 77 373 382 26. Vanderpool RR, Pinsky MR, Naeije R, Deible C, Kosaraju V, Bunner C, et al. Rv-pulmonary arterial coupling predicts outcome in patients referred for pulmonary hypertension. Heart. 2015;101(1):37-43. Vanderpool RR Pinsky MR Naeije R Deible C Kosaraju V Bunner C et al Rv-pulmonary arterial coupling predicts outcome in patients referred for pulmonary hypertension Heart 2015 101 1 37 43 27. Turck P, Lacerda DS, Carraro CC, de Lima-Seolin BG, Teixeira RB, Bonetto JH, et al. Trapidil improves hemodynamic, echocardiographic and redox state parameters of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension model. Biomed Pharmacother. 2018;103:182-90. Turck P Lacerda DS Carraro CC de Lima-Seolin BG Teixeira RB Bonetto JH et al Trapidil improves hemodynamic, echocardiographic and redox state parameters of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension model Biomed Pharmacother 2018 103 182 190 28. Ruiter G, de Man FS, Schalij I, Sairras S, Grunberg K, Westerhof N, et al. Reversibility of the monocrotaline pulmonary hypertension rat model. Eur Respir J. 2013;42(2):553-6. Ruiter G de Man FS Schalij I Sairras S Grunberg K Westerhof N et al Reversibility of the monocrotaline pulmonary hypertension rat model Eur Respir J 2013 42 2 553 556 29. Jin H, Liu M, Zhang X, Pan J, Han J, Wang Y, et al. Grape seed procyanidin extract attenuates hypoxic pulmonary hypertension by inhibiting oxidative stress and pulmonary arterial smooth muscle cells proliferation. J Nutr Biochem. 2016;36:81-8. Jin H Liu M Zhang X Pan J Han J Wang Y et al Grape seed procyanidin extract attenuates hypoxic pulmonary hypertension by inhibiting oxidative stress and pulmonary arterial smooth muscle cells proliferation J Nutr Biochem 2016 36 81 88 30. Mohammadi S, Najafi M, Hamzeiy H, Maleki-Dizaji N, Pezeshkian M, Sadeghi-Bazargani H, et al. Protective effects of methylsulfonylmethane on hemodynamics and oxidative stress in monocrotaline-induced pulmonary hypertensive rats. Adv Pharmacol Sci. 2012;2012:507278. Mohammadi S Najafi M Hamzeiy H Maleki-Dizaji N Pezeshkian M Sadeghi-Bazargani H et al Protective effects of methylsulfonylmethane on hemodynamics and oxidative stress in monocrotaline-induced pulmonary hypertensive rats Adv Pharmacol Sci 2012 2012 507278 31. Calleja MA, Vieites JM, Montero-Melendez T, Torres MI, Faus MJ, Gil A, et al. The antioxidant effect of beta-caryophyllene protects rat liver from carbon tetrachloride-induced fibrosis by inhibiting hepatic stellate cell activation. Br J Nutr. 2013;109(3):394-401. Calleja MA Vieites JM Montero-Melendez T Torres MI Faus MJ Gil A et al The antioxidant effect of beta-caryophyllene protects rat liver from carbon tetrachloride-induced fibrosis by inhibiting hepatic stellate cell activation Br J Nutr 2013 109 3 394 401 32. Madamanchi NR, Runge MS. Redox signaling in cardiovascular health and disease. Free Radic Biol Med. 2013;61:473-501. Madamanchi NR Runge MS Redox signaling in cardiovascular health and disease Free Radic Biol Med 2013 61 473 501 33. Rosca M, Calin A, Beladan CC, Enache R, Mateescu AD, Gurzun MM, et al. Right ventricular remodeling, its correlates, and its clinical impact in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Soc Echocardiogr. 2015;28(11):1329-38. Rosca M Calin A Beladan CC Enache R Mateescu AD Gurzun MM et al Right ventricular remodeling, its correlates, and its clinical impact in hypertrophic cardiomyopathy J Am Soc Echocardiogr 2015 28 11 1329 1338

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de pós-doutorado de Cristina Campos pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Universidade Federal do Rio Grande do Sul sob o número de protocolo 3176. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.

Fontes de financiamento: O presente estudo foi financiado pela bolsa de pesquisa oferecida pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

 Original Article Effects of Copaiba Oil in Peripheral Markers of Oxidative Stress in a Model of Cor Pulmonale in Rats 0000-0001-6054-4243 Campos Cristina 1 Turck Patrick 1 Tavares Angela Maria Vicente 1 Corssac Giana 1 Lacerda Denise 1 Araujo Alex 1 Llesuy Susana 2 Klein Adriane Bello 1 Brazil Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS – Brazil Argentina Hospital Italiano de Buenos Aires, Buenos Aires – Argentina Mailing Address: Adriane Bello Klein • Universidade Federal do Rio Grande do Sul - Sarmento Leite, 500. Postal Code 90040-060, Porto Alegre, RS - Brazil E-mail: belklein@ufrgs.br

Author Contributions

Conception and design of the research: Campos C, Llesuy S, Klein AB; Acquisition of data and Analysis and interpretation of the data: Campos C, Turck P, Tavares AMV, Corssac G, Lacerda D; Statistical analysis: Campos C, Araujo A; Obtaining financing: Klein AB; Writing of the manuscript: Campos C, Klein AB; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Araujo A, Llesuy S, Klein AB.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background

To date, copaiba oil’s systemic effects have never documented in Cor pulmonale induced by monocrotaline.

 Objectives

To investigate copaiba oil’s effects in peripheral markers of oxidative stress in rats with Cor pulmonale.

 Methods

Male Wistar rats (170±20g, n=7/group) were divided into four groups: control (CO), monocrotaline (MCT), copaiba oil (O), and monocrotaline+copaiba oil (MCT-O). MCT (60 mg/kg i.p.) was administered, and after one week, treatment with copaiba oil (400 mg/kg/day-gavage-14 days) was begun. Echocardiography was performed and, later, trunk blood collection was performed for oxidative stress evaluations. Statistical analysis: two-way ANOVA with Student-Newman-Keuls post-hoc test. P values<0.05 were considered significant.

 Results

Copaiba oil reduced pulmonary vascular resistance and right ventricle (RV) hypertrophy (Fulton index (mg/mg): MCT-O=0.39±0.03; MCT=0.49±0.01), and improved RV systolic function (RV shortening fraction, %) in the MCT-O group (17.8±8.2) as compared to the MCT group (9.4±3.1; p<0.05). Moreover, in the MCT-O group, reactive oxygen species and carbonyl levels were reduced, and antioxidant parameters were increased in the peripheral blood (p<0.05). Conclusions: Our results suggest that copaiba oil has an interesting systemic antioxidant effect, which is reflected in the improvements in function and RV morphometry in this Cor pulmonale model. Cor pulmonale attenuation promoted by copaiba oil coincided with a reduction in systemic oxidative stress.

 Cor Pulmonale Monocrotaline,Rats Oxidative Stress Fabaceae Phytotherapy Hypertrophy, Right Ventricular Copaiba Oil Introduction

The Amazon forest could be considered a natural laboratory, since it has a wide diversity of plants with medicinal properties. The great majority of these plants have not yet been fully studied, as it is the case of copaiba.1 Copaiba is a large tree that grows abundantly in the northern region of Brazil. Since the 16th century, copaiba oil has been used by the native indigenous people of the country in the treatment of various diseases. These traditional uses have motivated some researchers to study this oil.2

According to some reports, copaiba oil presents antioxidant and anti-lipoperoxidative properties.3 , 4 The antioxidant properties of copaiba oil could be very useful in the treatment of some cardiovascular diseases associated with oxidative stress. However, only two studies were found in the literature demonstrating the beneficial effects of copaiba oil on cardiovascular diseases, such as pulmonary arterial hypertension (PAH).5 , 6

PAH is a chronic and fatal disease that is associated with progressive increases in pulmonary vascular resistance and pressure. These changes impair the performance of the right ventricle (RV) and result in RV failure, and ultimately death.7 To study the physiopathological mechanisms involved in RV dysfunction and PAH development, a monocrotaline (MCT) model was used.8 The active metabolite of MCT causes damage in the pulmonary endothelium, leading to PAH.9

The MCT model mimics aspects of human PAH, including Cor pulmonale, which is a term used to describe pathological RV hypertrophy induced by lung dysfunction.10 In fact, multiple studies in animal models and patients implicate oxidative stress in the development of Cor pulmonale and PAH.11 - 13 Oxidative stress can cause damage to pulmonary endothelial cells,14 as well as contribute to RV dysfunction and failure.11 However, no study has explored the impact of PAH on oxidative stress markers in peripheral blood by analyzing copaiba oil’s effects. It was reported that oxidative stress measured in the blood of patients with a neurodegenerative disease could represent a reflection of the oxidative brain damage in those patients.15 In this sense, evaluating peripheral markers of oxidative stress could have clinical applicability, since obtaining a blood sample represents a minimally invasive procedure.16 This approach could be useful to cardiopulmonary diseases, such as PAH, in order to monitor the disease’s progression, together with the need and efficacy of antioxidant therapy, such as copaiba oil.

Thus, the aim of this study was to investigate whether peripheral markers of oxidative stress reflect the structural and functional changes promoted in RV by PAH and the effects of copaiba oil under these markers.

 Methods Animals, induction of cor pulmonale, and groups:

All procedures were approved by the institutional Animal Ethics Committee (protocol number: 31765). In total, 28 male Wistar rats (weighing 170±20g) from the Center for Reproduction and Experimentation of Laboratory Animals (CREAL) of Universidade Federal do Rio Grande do Sul were studied. These were kept at 20-22°C and with a 12:12h dark/light photoperiod. All animals had ad libitum access to regular rodent chow and water, and the experiments were conducted in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 86-23) and with institutional guidelines.

The number of animals per group was estimated based on previous studies from our research group,6 , 7 considering the minimum difference between the groups of two standard deviations, a minimum probability of type I error of 5% (a = 0.05), and a probability of type II error of 20% (b = 0.2). This calculation was performed using the Computer Programs for Epidemiologists (PEPI - Version 4.04x) software.

Animals were divided into four experimental groups (N=7/group): control (CO), copaiba oil (O), monocrotaline (MCT), and monocrotaline+copaiba oil (MCT-O). On the first day, PAH was induced by a single in bolus MCT injection (60mg/kg i.p.), as described elsewhere.10 One week after PAH induction, animals in the O and MCT-O groups received copaiba oil (400mg/kg) by gavage, once a day, for 14 days.5 This dose corresponds to a volume of 0.63mL/kg of copaiba oil. During this period, animals from the CO and MCT groups received the same volume of water by gavage.

 Echocardiographic analysis

The flow through the pulmonary artery and RV contractile function were evaluated by echocardiography after the end of treatment to estimate the effect of copaiba oil on the cardiovascular function. Animals were anesthetized (ketamine, 90mg/kg; xylazine, 20mg/kg, intraperitoneal) and placed in the left lateral decubitus position to obtain cardiac images. An EnVisor Philips system (Andover, MA) was used, with a 12–13MHz transducer, by a trained operator with experience in small animal echocardiography. The RV shortening fraction (RVSF), which estimates RV contractile function, as well as the acceleration time (AT) and the ejection time (ET) of pulmonary artery flow velocity tracings were measured, which estimates pulmonary vascular resistance.17

 Morphometric analysis

After the end of treatment, rats were killed by decapitation. RV and left ventricle (LV) were harvested for morphometric measurement, and blood was collected from the venous trunk for oxidative stress analysis. RV and LV+septum (S) were weighed to determine cardiac hypertrophy through the Fulton index (RV weight/LV+S weight).18

 Blood sample preparation:

Systemic antioxidant defenses and total reactive oxygen species (ROS) were evaluated in red blood cells, and carbonyls were measured in plasma. Heparinized blood samples were washed three times in a solution of sodium chloride (9g/L) and centrifuged at 3,000g for 10min. at room temperature. Washed erythrocytes were diluted 1/10 in a solution of acetic acid (1mmol/L) and magnesium sulphate (4mmol/L). The final solution was centrifuged at 4,200g for 20 min. The supernatant was stored in freezers at -80ºC for later oxidative stress measurements.15

 Protein concentration

Protein concentration was quantified by the method established by Lowry et al.,19 using bovine albumin as a standard solution at a concentration of 1mg/mL. All oxidative stress results were normalized by the amount of protein.19

 Determination of total ROS levels

ROS generation was measured by DCFH-DA fluorescence emission (Sigma-Aldrich, USA). Dichlorofluorescein diacetate is a permeable membrane and is rapidly oxidized to the highly fluorescent 2,7-dichlorofluorescein (DCF) in the presence of ROS. The samples were excited at 488 nm and emission was collected with a 525nm long pass filter. ROS was expressed as nmol per milligram of protein.20

 Carbonyl assay

This technique is based on the reaction of oxidized proteins with 2,4-dinitro-phenyl hydrazine (DNPH). Briefly, these proteins were added to a DNPH 10mmol/L in 2.5mol/L HCl solution for 1 h in the dark at room temperature, with shaking every 15 min. A 20% trichloroacetic acid (w/v) solution was then added to the plasma samples, which were centrifuged (1,000g for 5 min) to collect protein precipitates. Thereafter, the pellet was dissolved with ethanol:ethyl acetate (1:1) (v/v) and incubated for 10 min at 37ºC with 6mol/L guanidine hydrochloride solution. The absorbance was measured in a spectrophotometer at 360nm and results were expressed as nmol DNPH derivatives/mg protein.21

 Determination of antioxidant enzyme activities:

Superoxide dismutase (SOD) activity was determined by measuring the velocity of oxidized pyrogalol formation, and expressed as units per milligram of protein, according to Marklund.22 Catalase (CAT) activity was determined by following the decrease in 240nm absorption of hydrogen peroxide. This was expressed as ɳmol of hydrogen peroxide reduced per minute per milligram of protein.23

Glutathione peroxidase (GPx) activity, expressed as nmol of hydroperoxide reduced per min per mg protein, was measured following NADPH oxidation at 340nm in a reaction medium containing 0.17mmol/L reduced glutathione, 0.2U/mL glutathione reductase, and 0.5mmol/L tert-butyl hydroperoxide.24

 Total glutathione levels

Total glutathione (GSH) levels were determined as described by Akerboom and Sies,25 with modifications. GSH was measured in erythrocytes after protein precipitation with 10% trichloroacetic acid. An aliquot of the sample was added to phosphate buffer with 500μmol/L DTNB. Color development, resulting from the reaction between DTNB and the thiols, reached a maximum in 5 min and was stable for more than 30 min. Absorbance was read at 412nm after 10 min. A standard curve of reduced glutathione was used to calculate the GSH levels in the samples.25

 Statistical Analysis

For statistical analysis, the SigmaPlot software was used. Data are shown as mean±standard deviation. The normality test (Shapiro-Wilks) was performed to determine the data distribution. As our results presented normal distribution, statistical analysis was performed using two-way ANOVA, followed by the Student-Newman-Keuls post-hoc test. Pearson correlation was used to study the association between variables. P values less than 0.05 were considered significant.

 Results Echocardiographic evaluations

A significant decrease was observed in the AT in the MCT group, while it was increased in the O group, as compared to CO. However, copaiba oil recovered this parameter to control levels in the MCT-O group. By contrast, no difference was found among groups in the ET parameter. RVSF, which estimates RV systolic function, decreased in the MCT group, and copaiba oil prevented this change in the MCT-O animals ( Table 1 ).

– Echocardiographic and morphometric results
CO MCT O MCT-O
AT (s) 0.029±0.005 0.018±0.001a 0.034±0.001a 0.025±0.003b
ET (s) 0.099±0.01 0.106±0.007 0.098±0.01 0.11±0.001
RVSF (%) 21.2±2.4 9.4±3.1a 18.8±2.4 17.8±8.2b
Fulton index (mg/mg) 0.29±0.02 0.49±0.01a 0.29±0.01 0.39±0.03b

Data are expressed as mean±SD. a P<0.05 vs CO; b P<0.05 vs MCT. CO:control; O: Copaiba oil; MCT: Monocrotaline; MCT-O: Monocrotaline+Oil; AT: acceleration time; ET: ejection time; RV: right ventricle; RVSF: right ventricle shortening fraction. Fulton index: RV weight/LV+Septum weight; N: 7 animals per group.

Morphometric evaluation

The right ventricular hypertrophy index (RV/LV+S weight), shown in Table 1 , was significantly increased in the MCT group in comparison to the CO group. This parameter decreased significantly in the animals from the MCT-O group.

 Oxidative stress analysis

There was a significant increase in the ROS and carbonyl levels ( Figure 1A and 1B , respectively) in the MCT group in comparison with CO. No significant difference was found between the MCT group and the MCT-O, or between the MCT-O and the O group in ROS levels. However, carbonyl levels, which increased in the MCT group, were reduced in MCT-O.

– <italic>Oxidative stress A) Total reactive oxygen species concentration; B) Carbonyl levels. Data are expressed as mean±SD. a P<0.05 vs CO; b P<0.05 vs MCT. Control group: CO; Monocrotaline group: MCT, Copaiba oil group: O, Monocrotaline+Copaiba oil group: MCT-O.</italic>

Antioxidant analysis

Antioxidant enzyme activities (SOD, CAT, and GPx), and GSH concentration were significantly lower in the MCT group, when compared to the CO group. Treatment with copaiba oil significantly recovered these parameters in the animals from the MCT-O group ( Figure 2A, 2B, 2C, 2D , respectively).

– <italic>Antioxidant measurements. A) Superoxide dismutase activity; B) Catalase activity; C) Glutathione peroxidase activity; D) Total glutathione levels. Data are expressed as mean±SD. a P<0.05 vs CO; b P<0.05 vs MCT. Control group: CO; Monocrotaline group: MCT; Copaiba oil group: O; Monocrotaline+Copaiba oil group: MCT-O.</italic>

Correlations

A positive correlation (R=0.688; p<0.05) was observed between total ROS and the RV weight/LV+S weight ratio ( Figure 3A ), as compared to a negative correlation (R=0.614; p<0.05) between GSH concentration and the RV weight/LV+S weight ratio ( Figure 3B ).

– <italic>Correlations between RV weight/LV+S weight and (A) ROS (p < 0.05); and (B) GSH (p<0.05). RV: right ventricle; LV: left ventricle; ROS: reactive oxygen species; GSH:Total glutathione levels.</italic>

Discussion

The main findings of the present study where that copaiba oil modulated MCT-induced Cor pulmonale , since it promoted reduction in the pulmonary artery resistance, as well as in RV hypertrophy and dysfunction. In parallel with these changes, it was found that: copaiba oil treatment reversed the systemic oxidative stress increased by MCT, which was observed by enhanced ROS and carbonyl levels, and a reduction in antioxidant defenses.

According to the literature, the elevation in the pulmonary artery resistance is accompanied by RV hypertrophy, which characterizes Cor pulmonale. 10 In fact, in this study, a decrease in the acceleration time through pulmonary artery (AT) was observed, which indicates an increase in pulmonary artery resistance and an increase in RV hypertrophy in animals from the MCT group. On the other hand, copaiba oil treatment was able to mitigate these effects. The reduction of resistance in the pulmonary artery, which contributed to an improvement in RV remodeling, could contribute to improving the RV function. Previous investigations in patients with PAH indicate that a RV function impairment is related to adverse clinical outcomes and reduced survival,26 which highlights the importance of a treatment, such as copaiba oil, which softens this harmful damage in the RV. Moreover, a decrease was found in the RV shortening fraction (RVSF) in the MCT group, which indicates impairment of the RV contractile function. This result is in accordance with others27 , 28 that have studied this disease. Conversely, as described in a previous work, copaiba oil was able to increase this parameter, which indicates that this oil could improve the RV function.6

According to Jim et al.,29 there is an increase in systemic ROS production in a rat model of pulmonary hypertension. Moreover, Mohammadi30 also observed a decrease in the CAT, SOD, GPx activities, and GSH concentration measured in the blood in an MCT-induced PAH. Those data encouraged us to investigate the antioxidant effects of copaiba oil on PAH. Our data have shown that copaiba oil reversed oxidative damage by elevating the systemic antioxidant defenses and reducing carbonyl to levels close to that observed in control rats, suggesting that this oil has enlarged the antioxidant reserve.

In a previous study from our group, copaiba oil composition was evaluated.5 Chemical analysis of this oil was carried out using gas chromatography – mass spectroscopy. It was found that copaiba oil is composed of terpenes with the predominance of β-caryophyllene. This compound has antioxidant activity, leading to a reduction in ROS due to its free radical-scavenging effect against superoxide anions, hydroxyl anions, and lipid peroxides.31

Thus, it is reasonable to believe that the antioxidant effects observed after treatment with copaiba oil are due to the β-caryophyllene present in this oil. On the other hand, the antioxidant effects of copaiba oil may also be due to an interaction between its various components. As reported in a previous study, copaiba oil is composed of a large variety of other sesquiterpenes and diterpenes, which also have antioxidant properties.5

Oxidative stress is involved in the development of pathologic cardiac hypertrophy and in a bad prognosis.32 The reduction in RV hypertrophy found in the present study could be associated with the copaiba oil antioxidant effect. In fact, a positive correlation was found between ROS levels and cardiac hypertrophy in this study. On the other hand, increased levels of GSH, an endogenous non-enzymatic antioxidant, were correlated with lower rates of cardiac hypertrophy. Thus, it is suggested that copaiba oil can protect RV against cardiac hypertrophy through its antioxidant proprieties. This finding is of tremendous importance because, according to Rosca et al., RV hypertrophy is correlated with an increased risk of sudden cardiac death.33 Since there was an association between systemic oxidative stress and a cardiac morphometric alteration, these markers may be a reflection of the changes in the RV promoted by PAH.

The present study was the first to test the systemic effect of copaiba oil in a Cor pulmonale model. Some oxidative stress peripheral markers to detect changes in the systemic redox state were evaluated. Evaluations in the peripheral blood are important and useful because they reflect the organism’s general state of health. Blood samples are easily accessible, available in large quantity, and its collection is less invasive than a tissue biopsy, for example. Thus, the evaluation of oxidative stress markers in the blood of patients with PAH could be useful to monitor the development of Cor pulmonale and the applied treatment, as performed in the animals used in the present study.

 Conclusions

The results obtained suggest that copaiba oil has an interesting systemic antioxidant effect, which is reflected in the RV morphometric and function improvement in this Cor pulmonale model. These results highlight the importance of copaiba oil as a potential adjuvant treatment for PAH.

Study Association

This article is part of the thesis of post doctoral submitted by Cristina Campos, from Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Universidade Federal do Rio Grande do Sul under the protocol number 31765. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013.

Sources of Funding: This study was funded by Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).