Este estudo foi um estudo transversal conduzido no Hospital Universitário Francisca Mendes (Unidade de Cardiologia) e na Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (doenças infecciosas / unidade de doença de Chagas), dois centros de atenção terciária especializados no estado do Amazonas, Brasil.

Os participantes foram recrutados de julho 2017 a julho 2018 e foram considerados elegíveis se apresentassem: 1) idade ≥ 18 anos; 2) perfil cardíaco de cardiomiopatia dilatada idiopática, em que qualquer outra causa de cardiomiopatia já tiver sido excluída; 3) resultado anormal no ecocardiograma (fração de ejeção do ventrículo esquerdo [FEVE] reduzido e/ou alterações no segmento) e/ou no eletrocardiograma (bloqueio de ramo, bloqueio atrioventricular, ou arritmias).

Os seguintes fatores de risco epidemiológicos foram considerados: 1) ser originário da região da Amazônia brasileira; 2) ser originário de áreas rurais; 3) ter hábito de ir à floresta; e 4) consumir frutos de palmeiras e/ou carne de animais silvestres.

Pacientes com qualquer evidência de cardiomiopatia isquêmica ou congênita, ou de doença valvular cardíaca não foram elegíveis para inclusão. Ainda, os participantes que relataram ter viajado a outra região brasileira ou a um país estrangeiro foram excluídos do estudo.

Todos os pacientes que preencheram os critérios de inclusão foram convidados a participar e, aqueles que aceitaram, assinaram o termo de consentimento. Os participantes foram primeiramente avaliados usando um questionário clínico e epidemiológico. Em seguida, as amostras de sangue foram coletadas, centrifugadas, separadas e armazenadas a -20^oC.

O diagnóstico de DC foi realizado por ELISA (Chagatest ELISA recombinante v. 4.0, Wiener Laboratorios, Argentina) e imunofluorescência indireta (Imuno-CON Chagas, WAMA Diagnostica, Brasil), seguindo-se as instruções dos fabricantes.

Para resultados indeterminados, utilizou-se o teste de immunoblotting para análise de antígenos secretados e excretados por tripomastigota (TESA, do inglês trypomastigote excreted-secreted antigen ), o TESA-blot. As frações de TESA foram obtidas a partir do sobrenadante de células MK2 infectadas pela cepa Y de T. cruzi , seguindo o protocolo descrito previamente.¹⁰

A extração de DNA foi realizada a partir de sangue periférico, seguindo-se o protocolo do kit comercial PureLink® Genomic DNA Mini (Invitrogen, Life Technologies, California, EUA). Este método foi realizado como um teste complementar para soros com resultados indeterminados nos exames sorológicos, para aumentar a acurácia diagnóstica.¹¹

As amostras foram submetidas à tipagem do DNA mitocondrial pela análise de polimorfismos nos genes que codificam a subunidade II(COII).¹² Os produtos de amplificação de PCR foram purificados utilizando-se o sistema Wizard SV Gel and PCR Clean-up System kit (Promega) e o sequenciamento realizado pelo sequenciador de DNA ABI 3130 (Applied Biosystems). Seguimos o protocolo do kit de sequenciamento BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) e sequências das cepas padrões: TcI (Silvio X10 cl1), TcII (Esmeraldo cl3), TcIII (M6241 cl6), TcIV (CANIII cl1), TcV (Mn cl2), e TcVI (CL Brener). A análise de evolução foi conduzida no MEGA X.¹³

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (Manaus, AM, Brasil) (número 69904017.9.0000.0005-2.191.571/28, julho 2017), em concordância com a resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde e diretrizes éticas da Declaração de Helsinki de 1975.

Os dados clínicos e epidemiológicos foram organizados utilizando o Microsoft Excel 2016 e a análise descritiva realizada utilizando o Stata/MP 13.0. As variáveis categóricas foram descritas em frequências e proporções (%), e as variáveis contínuas em médias e desvios padrões (DP).

Foram incluídos 53 pacientes, e oito foram excluídos – um morreu antes da coleta de sangue, dois comentaram ter morado em outro local, e cinco não compareceram à coleta de sangue.

Nas 45 amostras viáveis, foram realizados os dois testes sorológicos, o ELISA e a imunofluorescência indireta. Uma amostra foi reagente no teste ELISA mas não reagente na imunofluorescência indireta, e 13 foram reativos na imunofluorescência indireta. Essas 14 amostras (31%) foram submetidas ao teste TESA-blot, e todos deram negativos. Assim, nenhum dos casos suspeitos de CCC foi confirmado por método sorológico.

As amostras que apresentaram pelo menos uma reação sorológica positiva foram submetidas à análise molecular; dois foram positivas e identificadas como TcIII/IV ( Figura 1 ).

Figura 1

Dados clínicos e laboratoriais desses dois pacientes estão resumidos na Tabela 1 .

Tabela 1

Variável	Total (n=45)
Idade (anos)	59,3 ± 12,3
Sexo
Masculino	35 (77,8%)
Feminino	10 (22,2%)
Área
Rural	34 (75,6%)
Urbana	11 (24,4%)
Origem
Acre	4 (9,0%)
Amazonas	32 (71,1%)
Maranhão	1 (2,2%)
Pará	6 (13,3%)
Roraima	2 (4,4%)
Fatores de susceptibilidade
Agricultura/extrativismo/pescaria	27 (60,0%)
Consumo de carne de caça	32 (71,1%)
Consumo de fruto do açaizeiro	30 (66,7%)
Hábito de entrar na floresta	30 (66,7%)
Eletrocardiograma
Bloqueio de ramo direito	2 (4,4%)
Bloqueio de ramo esquerdo	4 (8,9%)
Bloqueio fascicular anterior esquerdo	2 (4,4%)
Fibrilação atrial	3 (6,7%)
Repolarização ventricular	21 (46,7%)
Normal	13 (28,9%)
Ecocardiograma transtorácico
FEVE (%)	30,3 ± 10,7
Diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo (mm)	64,6 ± 9,1
Acinesia localizada	7 (15,6%)
Parede anterior septal	3 (42,8%)
Parede lateral inferior	2 (28,6%)
Parede septal inferior	1 (14,3%)
Parede inferior	1 (14,3%)
Hipocinesia difusa	11 (24,4%)
Comorbidades
Diabetes mellitus	9 (20,0%)
Hipertensão	22 (49,0%)

Dados expressos em média ± desvio padrão e porcentagens; FEVE: fração de ejeção do ventrículo esquerdo.

Por muito tempo, acreditou-se que não existiam casos de DC na Amazônia brasileira. No entanto, isso mudou ao longo dos anos com relatos de muitos casos de DC aguda e crônica.

De acordo com o consenso brasileiro, o diagnóstico de DC deve ser confirmado pela combinação de dois métodos sorológicos. Estudos prévios realizados no estado do Amazonas¹⁴ relataram uma baixa prevalência de baixa morbidade da DC, e discutiram a provável baixa eficácia dos testes sorológicos comerciais disponíveis para as cepas circulantes, considerando que esses testes são realizados com diferentes cepas.¹¹

Até o momento, foram relatados oito casos de CCC,^{6 - 8} e quatro desses pacientes (50%) apresentaram aneurisma apical, uma frequência esperada de acordo com estudos com pacientes de áreas endêmicas.¹⁵ Ferreira et al.⁸ estudaram pacientes com disfunção sistólica do ventrículo esquerdo de causa desconhecida, e encontraram uma prevalência de CCC de 8,1%.

Em nosso estudo, os dois pacientes que apresentaram resultado de DNA positivo não apresentaram aneurisma, e um deles apresentou achados eletrocardiográficos normais. Um ECG normal não é comum (5%) segundo estudos prévios, mas é possível mesmo na presença de uma doença cardíaca clínica ou disfunção no ecocardiograma.^{16 , 17} Vale destacar, no entanto, que a presença de DNA do T. cruzi pode não ser suficiente para confirmar CCC, e não podemos excluir uma possível coincidência na identificação do genótipo do parasita no paciente com disfunção ventricular grave, sem aneurisma apical ou diagnóstico sorológico, e com um ECG normal. O segundo paciente com DNA positivo apresentou bloqueio de ramo direito e bloqueio fascicular anterior esquerdo no ECG. Nesse paciente, a presença de DNA de T. cruzi e alterações típicas no ECG torna o diagnóstico de CCC possível mesmo sem diagnóstico sorológico.

Embora o presente estudo não tenha identificado novos casos de CCC, como proposto inicialmente, nossos resultados levantam algumas questões: a doença de Chagas crônica, e consequentemente a CCC, é ainda subdiagnosticada na região da Amazônia brasileira? Os métodos sorológicos disponíveis têm se tornado menos eficiente em relação às cepas circulantes do parasita nesta região?

Apesar de técnicas moleculares não terem sido utilizadas no diagnóstico de DC devido a possíveis resultados falso positivos, o método foi incluído no estudo com base em estudos prévios que corroboram sua especificidade em infecções crônicas, e seu papel como um método complementar em casos em que resultados nos testes sorológicos persistirem inconclusivos.¹⁸ Nós identificamos o DNA do parasita em duas amostras, e determinamos seu genótipo como TcIII/TcIV.

Esta é a primeira vez em que a cepa TcIII/TcIV do T. cruzi é encontrada em uma fase crônica da doença. Este fato pode estar relacionado com a presença de TcIII nos vetores e reservatórios, e TcIV na fase aguda da DC, conforme relatado previamente na região.^{11 , 19} Outros estudos mostraram uma reatividade satisfatória ao teste sorológico e TESA-blot em regiões endêmicas no Brasil e no Panamá.⁹ No entanto, devido à região amazônica ainda ter uma epidemiologia particular, todos os recursos disponíveis foram usados neste estudo a fim de chegar a um resultado satisfatório para o paciente, incluindo uma PCR qualitativa reativa.²⁰

O pequeno tamanho amostral limitou nossa capacidade de demonstrar o real cenário da CCC em nossa região. Similarmente, temos visto uma baixa reatividade dos kits sorológicos comerciais disponíveis e uma reatividade cruzada moderada com outras doenças endêmicas.