Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC cqkp988DsWvNr9TZcRLsMjM S0066-782X2021005008203 S0066-782X2021001200737 abc.20200322 10.36660/abc.20200322 Artigo Original Atorvastatina Atenua o Remodelamento Vascular em Camundongos com Síndrome Metabólica Carvalho Karine Ferreira da Silva 1 Ferreira Amanda Araújo Marques 1 Barbosa Nayara Carvalho 1 Alves Juliano Vilela 2 0000-0002-5174-5710 Costa Rafael Menezes da 1 Universidade Federal de Jataí Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde Jataí GO Brasil Universidade Federal de Jataí - Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Jataí, GO - Brasil Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo Departamento de Farmacologia Ribeirão Preto SP Brasil Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo - Departamento de Farmacologia, Ribeirão Preto, SP - Brasil Correspondência: Rafael Menezes da Costa • Universidade Federal de Jataí - Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde - BR 364, km 195, 3800. CEP 75801-615, Jataí, GO – Brasil E-mail: rafael.menezess@yahoo.com.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa, Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante, Análise estatística e Redação do manuscrito: Carvalho KFS, Costa RM; Obtenção de dados: Carvalho KFS, Ferreira AAM, Barbosa NC, Alves JV; Análise e interpretação dos dados: Carvalho KFS, Ferreira AAM, Barbosa NC, Alves JV, Costa RM; Obtenção de financiamento: Costa RM.

Potencial conflito de interesse

Não há conflito com o presente artigo

 18 06 2021 10 2021 117 4 737 747 13 04 2020 14 09 2020 04 11 2020 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

A síndrome metabólica é caracterizada por um conjunto de comorbidades. Durante a síndrome, observam-se alterações estruturais no sistema cardiovascular, especialmente o remodelamento vascular. Uma das causas predisponentes para essas alterações é a inflamação crônica oriunda de mudanças na estrutura e composição do tecido adiposo perivascular. Atorvastatina é eficaz no tratamento das dislipidemias. No entanto, seus efeitos pleiotrópicos não são totalmente compreendidos. Supõe-se que, durante a síndrome metabólica, ocorre remodelamento vascular e que o tratamento com atorvastatina pode ser capaz de atenuar tal condição.

 Objetivos

Avaliar os efeitos do tratamento com atorvastatina sobre o remodelamento vascular em modelo experimental de síndrome metabólica.

 Métodos

Camundongos Swiss receberam dieta controle ou dieta hiperglicídica por 18 semanas. Após 14 semanas de dieta, os camundongos foram tratados com veículo ou atorvastatina (20mg/kg) durante 4 semanas. Foram avaliados o perfil nutricional e metabólico por testes bioquímicos; análise estrutural da artéria aorta por histologia e dosagem de citocinas por ensaio imunoenzimático. O nível de significância aceitável para os resultados foi p <0,05.

 Resultados

A dieta hiperglicídica promoveu o desenvolvimento de síndrome metabólica. Tal fato culminou no remodelamento hipertrófico do músculo liso vascular e tecido adiposo perivascular. Além disso, houve aumentos das citocinas TNF-α e IL-6 circulantes e no tecido adiposo perivascular. O tratamento com atorvastatina reduziu significativamente os danos metabólicos, o remodelamento vascular e os níveis de citocinas.

 Conclusão

Atorvastatina ameniza danos metabólicos associados à síndrome metabólica induzida por dieta hiperglicídica, além de atenuar o remodelamento vascular, sendo esses efeitos associados à redução de citocinas pró-inflamatórias.

 Dislipidemias Carbohidratos da Dieta Síndrome Metabólica Remodelamento Vascular Atorvastatina Inflamação Camundongo CNPq 433898/2018-06 Fontes de financiamento O presente estudo foi financiado pelo CNPq (Processo 433898/2018-06) Introdução

As doenças cardiovasculares representam grandes riscos para a qualidade de vida da população no mundo. No Brasil, aproximadamente 350 mil indivíduos morrem por doenças cardiovasculares anualmente.1 , 2 Dentre as diversas causas predisponentes para riscos cardiovasculares, destaca-se a síndrome metabólica (SM), caracterizada por um conjunto de comorbidades que envolvem aumento da circunferência abdominal (≥89 cm para mulheres e ≥102 cm para homens), aumento nos níveis de triglicerídeos (≥150 mg/dL), redução nos níveis de colesterol HDL (≤50 mg/dL para mulheres e ≤40 mg/dL para homens), aumento nos níveis pressóricos (≥130/85 mmHg) e aumento na glicemia de jejum (≥100 mg/dL). Dentre estas, a presença de pelo menos três comorbidades é elementar para o diagnóstico de SM.3 , 4

Durante a SM, observam-se alterações estruturais e funcionais dos componentes do sistema vascular.5 - 7 Em indivíduos com SM, há disfunção endotelial, além de aumento na migração e proliferação de células musculares lisas. Observa-se também a expansão do tecido adiposo perivascular (PVAT), evidenciada pelo aumento morfológico dos adipócitos, bem como a substituição do tecido adiposo marrom pelo tecido adiposo branco, resultando na diminuição da liberação de fatores relaxantes derivados do PVAT e consequente perda da sua capacidade de ação anticontrátil.8 - 11

A hipertrofia e a substituição dos adipócitos no PVAT são capazes de favorecer a produção e o acúmulo de citocinas pró-inflamatórias.12 Roedores submetidos à dieta hipercalórica e que desenvolveram SM mostraram aumento e acúmulo do PVAT nas artérias aorta e carótida. Tal fato promoveu a liberação de quimiocinas e recrutamento de monócitos e células T para o PVAT.13 Neste ambiente inflamatório, também é possível observar o aumento na produção de interleucina-6 (IL-6) e o infiltrado de macrófagos secretores do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) no PVAT.14 Este conjunto desencadeia a inflamação crônica do sistema vascular, prejudicando a estrutura e a função dos seus constituintes.

A inflamação dos vasos sanguíneos, de fato, contribui para o remodelamento vascular, aumento da resistência periférica e desordens circulatórias.7 , 15 , 16 Neste contexto, o remodelamento vascular é um processo crônico adaptativo, caracterizado por alterações na estrutura dos vasos sanguíneos, derivadas de citocinas pró-inflamatórias, além de interações entre fatores de crescimento, estímulos hemodinâmicos e espécies reativas de oxigênio. Compreende modificações no crescimento, morte e migração celular, e na síntese e degradação da matriz extracelular.17 - 19

Um fator importante a ser considerado nas alterações vasculares encontradas durante a SM é a dislipidemia, uma condição caracterizada pelo aumento de colesterol e triglicerídeos na circulação e redução dos níveis de HDL.20 Numerosos estudos estabeleceram que a dislipidemia leva a uma resposta inflamatória na vasculatura, refletida pela ativação das células endoteliais, recrutamento de leucócitos e produção de citocinas pró-inflamatórias.21 , 22 Camundongos hipercolesterolêmicos alimentados com dieta hiperlipídica mostram remodelamento da camada média da artéria femoral, associado ao recrutamento de macrófagos.23 Neste contexto, há correlação positiva entre os níveis de colesterol circulantes, inflamação crônica e remodelamento vascular.

Atorvastatina, inibidora da β-hidroxi-β-metil-glutaril coenzima A redutase, se apresenta como uma das estatinas mais eficazes no tratamento das dislipidemias, reduzindo a produção de colesterol LDL e aumentando a produção de colesterol HDL.24 , 25 Não obstante, nas últimas décadas, crescentes evidências, sejam experimentais ou clínicas, se acumularam para apoiar a ideia de que a atorvastatina exerce efeitos cardiovasculares benéficos, independentemente de seus efeitos primários.26 Em um modelo experimental de SM, a atorvastatina foi capaz de melhorar a reatividade e reduzir o remodelamento estrutural de artérias de resistência; ambos os efeitos foram associados à redução da inflamação e do estresse oxidativo.27 Além disso, a atorvastatina é capaz de inibir a secreção de metaloproteinase de matriz-9 em células vasculares e suprimir a expressão do fator de transformação do crescimento beta, diminuindo a fibrose vascular.28 - 30 Esses efeitos in vitro da atorvastatina também estão associados à sua capacidade anti-inflamatória.31 No contexto clínico, a atorvastatina reduz processos ateroscleróticos32 e quadros clínicos de síndrome coronária aguda.33 De fato, dentre os diversos efeitos pleiotrópicos da atorvastatina, é robusta a sua capacidade vasoprotetora. Ainda assim, não há evidências suficientes que atestam sobre os efeitos e os possíveis mecanismos envolvidos nas ações da atorvastatina, sob a perspectiva do músculo liso vascular e, de forma inédita, sob o PVAT como tecidos inflamatórios em condições de SM. Assim, neste estudo, hipotetizamos que, durante a SM, ocorre remodelamento vascular a níveis de músculo liso vascular e PVAT, ocasionado pelo aumento da inflamação vascular. Além disso, o tratamento com atorvastatina pode ser capaz de reduzir a inflamação vascular e, consequentemente, reverter os prejuízos associados à SM.

 Métodos Animais e delineamento experimental

Todos os procedimentos experimentais foram analisados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Jataí (Protocolo 02/2019). Camundongos Swiss machos, de 3 semanas de idade, foram adquiridos do Biotério Central da Universidade Federal de Goiás – Regional Goiânia – e acondicionados no Biotério de Experimentação Animal da Universidade Federal de Jataí, com temperatura controlada de 22 ± 2ºC, umidade de 50 ± 5% e ciclos claro-escuro de 12 horas, com livre acesso a água e alimento. Os camundongos foram mantidos durante todo o período experimental em caixas de polipropileno (comprimento [30] × largura [20] × altura [13] cm), na proporção de 3 camundongos por caixa.

Após uma semana de aclimatização, os camundongos receberam dieta controle ou dieta hiperglicídica por 18 semanas. Após 14 semanas de dietas, os camundongos foram tratados (diariamente/turno vespertino) por gavagem com veículo (solução salina) ou atorvastatina [(20mg/kg), Sigma-Aldrich, #PZ0001, Alemanha] durante 4 semanas.34 A dieta controle constitui-se em 22% de proteína, 70% de carboidrato e 8% de gordura, enquanto a dieta hiperglicídica constitui-se em 10% de proteína, 80% de carboidrato e 10% de gordura. A dieta hiperglicídica foi formada por 33% de dieta controle (Nuvilab® CR1, Nuvital, Brasil), 33% de leite condensado e 7% de sacarose por peso da dieta controle, sendo o restante água.6 O conteúdo energético foi de 12,16 kJ/g para a dieta controle e 13,35 kJ/g para a dieta hiperglicídica. Os camundongos foram eutanasiados por excesso de anestésicos (cetamina e xilazina, 140 mg/kg e 12 mg/kg, respectivamente, via intraperitoneal).

 Perfil nutricional e murinométrico do modelo experimental

O perfil nutricional foi determinado pelo consumo de alimentos e consequente ingestão calórica, além da eficiência alimentar. A ingestão calórica (por camundongo) foi calculada a partir da ingestão semanal de alimentos, multiplicada pelo valor energético da dieta (g × kcal). Com a finalidade de analisar a capacidade de o camundongo converter a energia consumida em massa corporal, a eficiência alimentar foi calculada, dividindo-se o ganho total de massa corporal (g) pela energia total ingerida (kcal), em porcentagem. O perfil murinométrico foi determinado pela análise da massa e gordura corporal. A massa corporal dos camundongos foi aferida semanalmente, utilizando balança analítica de precisão, e a obesidade foi caracterizada, ao final das dietas e tratamentos, pelo índice de adiposidade {[gordura corporal (g)/peso corporal final (g)]×100}, sendo a gordura corporal calculada pela soma das gorduras epididimal, retroperitoneal e visceral.35

 Obtenção de soro e PVAT

Os camundongos foram submetidos à privação alimentar por 8 horas. Após eutanásia, amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca e transferidas para tubos secos. O sangue foi centrifugado a 2.500 rpm por 15 minutos para separação do soro, utilizado nas dosagens bioquímicas e citocinas. O PVAT foi retirado mecanicamente dos segmentos de aorta torácica, congelado em nitrogênio líquido, pulverizado e homogeneizado em tampão fosfato salina (PBS) gelado. O extrato tecidual foi centrifugado a 13.000 rpm por 20 minutos para separação do material insolúvel. O sobrenadante foi coletado para as dosagens de citocinas.

 Avaliação do perfil lipídico e glicêmico

Foram determinados os níveis séricos de colesterol total, triglicerídeos e HDL (lipoproteínas de alta densidade), por métodos enzimáticos ( kits Labtest, Brasil), em amostras de soros provenientes da centrifugação do sangue total. A partir da concentração sérica de triglicerídeos, foram calculadas as concentrações de VLDL (lipoproteínas de muita baixa densidade), utilizando-se o seguinte cálculo: VLDL (mg/dL) = triglicerídeos (mg/dL)/5. A partir da concentração de HDL e VLDL, foi calculada a concentração de LDL (lipoproteínas de baixa densidade), utilizando o cálculo: LDL (mg/dL) = colesterol total – HDL – VLDL.36 A glicemia foi determinada após o tratamento com dietas. Uma gota de sangue foi colocada em fitas individuais específicas para leitura em glicosímetro (Accu-Check Active, Alemanha).

 Teste oral de tolerância à glicose (TOTG)

Um dia anterior ao final da 18ª semana de dietas e tratamentos, após 8 horas de jejum, a glicemia de cada camundongo foi verificada por glicosímetro (Accu-Check Active, Alemanha), caracterizando a glicemia do tempo zero. Em seguida, glicose na dose de 2 g/kg foi administrada aos camundongos por gavagem. A partir desse momento, o cronômetro foi acionado e novas determinações da glicemia foram feitas nos tempos de 30, 60, 90 e 120 minutos.37

 Avaliação morfoestrutural do músculo liso vascular e do PVAT

Aortas da região torácica foram removidas e então fixadas por 24 horas em paraformaldeído a 4%. As etapas seguintes envolveram a desidratação em concentrações crescentes de álcool etílico (70%, 80%, 90% e 100%) por 120 minutos, com posterior diafanização em álcool etílico absoluto cada (1:1) 1, 2 e 3 por 120 minutos e em xilol 1, 2 e 3 por 30 minutos, com posterior inclusão em parafina. As aortas foram incluídas em parafina e cortadas em micrótomo na espessura de 4,5 µm, para posterior coloração.

Para a coloração de hematoxilina e eosina, os cortes em lâminas foram submetidos ao processo de desparafinização, sendo mantidos em estufa a 65ºC, posterior imersão em xilol 1 e 2 por 20 minutos. Em seguida, foram imergidos em soluções decrescentes (100%, 90%, 70% e 50%) de álcool etílico durante 5 minutos e imersos em água destilada por 10 minutos. Seguida a hidratação, as lâminas foram imersas em corante hematoxilina por 6 minutos e, logo após, lavadas em água corrente por 10 minutos. A seguir, foram imersas em corante eosina por 6 minutos. Os cortes corados foram novamente desidratados e diafanizados, sendo montados com meio de montagem Permount® (Fisher Scientific, EUA) e lamínulas.

Imagens coloridas foram obtidas por câmera digital acoplada à microscópio óptico e analisadas pelo programa ImageJ (Instituto Nacional de Saúde, EUA). Para análise das imagens, foi delimitado o lúmen, a túnica média e adventícia com o objetivo de calcular as seguintes variáveis morfométricas: área de secção transversal (AST) da túnica média e espessura da túnica média. O volume dos adipócitos (v) foi calculado a partir da fórmula v = πd3 /6, em que (d) representa o diâmetro dos adipócitos. A massa do adipócito se deu pelo volume multiplicado pela densidade (0,92 g/cm3 ). O número de adipócitos foi determinado dividindo-se a massa do PVAT pela massa média de adipócitos.38

 Determinação dos níveis de citocinas inflamatórias

Os níveis de TNF-α e IL-6 no soro e no PVAT foram feitos pelo método imunoenzimático (ELISA) utilizando kits DuoSet ELISA Development Systems (R&D Systems, EUA) de acordo com as informações do fabricante. Placas de microtitulação (96 poços) foram recobertas com 50 μL/poço dos anticorpos específicos anti-TNF-α e anti-IL-6, nas concentrações descritas pelo fabricante, diluídos em PBS e incubados overnight a 4ºC. As placas foram lavadas com PBS/Tween-20 (0,05%), e as ligações não específicas foram bloqueadas com 100 μL de PBS contendo albumina do soro bovino 1% durante 2 horas em temperatura ambiente. Posteriormente, as amostras foram adicionadas, seguindo nova incubação por 2 horas em temperatura ambiente. Após esse período, as placas foram lavadas e foram adicionados 50 μL dos anticorpos biotinilados específicos para cada citocina. Após 2 horas, as placas foram lavadas e o conjugado estreptavidina-peroxidase, na diluição de 1:40, foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. Posteriormente, as placas foram lavadas e adicionou-se a dosagem de 100 μL do substrato tetrametilbenzidina. A densidade ótica foi medida a 630 nm no espectrofotômetro SpectraMAX 190 Microplate Reader (Molecular Devices, EUA). Os níveis de citocinas contidas nas amostras foram calculados a partir de uma curva padrão com 11 pontos obtidos por diluição seriada. Os resultados foram expressos em pg/mL para amostras de soro, e pg/mg de proteína para amostras de PVAT.

 Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DP). Os dados seguiram distribuição normal de acordo com o teste de Kolmogorov-Smirnov. Os resultados foram analisados pelo teste de análise de variância de duas vias (Two-Way ANOVA), seguido do pós-teste Tukey. O nível de significância mínima aceitável foi p <0,05. Por conveniência, o número de camundongos para cada grupo experimental foi igual a 6. O programa Prisma, versão 8.0 (GraphPad Software Inc., EUA) foi utilizado para analisar esses parâmetros, bem como para a construção dos gráficos.

 Resultados Perfil nutricional e murinométrico

A ingestão alimentar e a consequente ingestão calórica foram maiores nos camundongos mantidos com dieta hiperglicídica, bem como a eficiência alimentar; no entanto, este último parâmetro foi reduzido após o tratamento com atorvastatina. Os parâmetros murinométricos, como ganho de massa, depósitos de gorduras epididimal, retroperitoneal e visceral foram maiores nos camundongos mantidos em dieta hiperglicídica quando comparados aos camundongos mantidos em dieta controle. O tratamento com atorvastatina promoveu redução de tais parâmetros ( Tabela 1 ). Os camundongos mantidos em dieta hiperglicídica apresentaram maior aumento de massa corporal quando comparados aos camundongos mantidos em dieta controle. Além disso, camundongos mantidos em dieta hiperglicídica e tratados com atorvastatina apresentaram redução de massa corporal ( Figura 1A ). O índice de adiposidade, parâmetro para determinar a obesidade, foi maior nos camundongos mantidos em dieta hiperglicídica quando comparados aos camundongos mantidos em dieta controle. O tratamento com atorvastatina promoveu redução no índice de adiposidade dos camundongos mantidos em dieta hiperglicídica ( Figura 1B ).

– Comportamento alimentar e avaliação ponderal dos depósitos de gordura corporal
Dieta C + Veículo Dieta C + Atorvastatina Dieta H + Veículo Dieta H + Atorvastatina
Ingestão alimentar (g/semana) 22,6 ± 0,3 21,3 ± 0,4 31,7 ± 0,2 31,1 ± 0,5
Ingestão calórica (kcal/semana) 274,8 ± 3,7 259,1 ± 4,9 423,1 ± 2,67* 415,2 ± 6,7
Eficiência alimentar (%) 0,51 ± 0,01 0,53 ± 0,01 0,64 ± 0,02* 0,47 ± 0,03#
Ganho de massa (g) 25,0 ± 2,31 24,5 ± 2,25 37,3 ± 1,52* 27,9 ± 1,22#
Gordura epididimal (g) 0,97 ± 0,12 1,13 ± 0,11 2,68 ± 0,24* 1,31 ± 0,09#
Gordura retroperitoneal (g) 0,32 ± 0,06 0,61 ± 0,19 1,88 ± 0,12* 0,93 ± 0,19#
Gordura visceral (g) 0,75 ± 0,15 0,94 ± 0,13 1,67 ± 0,11* 1,01 ± 0,17#

Dados expressos como média ± DP. *, p <0,05 vs. dieta C + veículo; #, p <0,05 vs. dieta H + veículo (n = 6 para cada grupo experimental). Dieta C: dieta controle, dieta H: dieta hiperglicídica.

Atorvastatina atenua a obesidade associada à síndrome metabólica induzida por dieta hiperglicídica. As figuras mostram valores de massa corporal (A) e índice de adiposidade (B) de camundongos mantidos por 18 semanas em dieta controle ou dieta hiperglicídica, tratados com veículo ou atorvastatina (20 mg/kg por 4 semanas). Os resultados representam a média ± DP. *, p <0,05 vs. dieta controle_veículo; #, p <0,05 vs. dieta hiperglicídica_veículo (n = 6 para cada grupo experimental).

Perfil lipídico

Os camundongos mantidos em dieta hiperglicídica apresentaram dislipidemia quando comparados aos camundongos que receberam dieta controle. A dislipidemia pode ser observada a partir do aumento nos níveis de colesterol total ( Figura 2A ), em que as frações LDL ( Figura 2B ) e VLDL ( Figura 2C ) se encontraram aumentadas e a fração HDL ( Figura 2D ), diminuída. Houve também aumento nos níveis de triglicerídeos dos camundongos que receberam dieta hiperglicídica em comparação aos que foram mantidos em dieta controle ( Figura 2E ). Os camundongos mantidos em dieta hiperglicídica e que foram tratados com atorvastatina mostraram redução de tais parâmetros lipídicos.

– Atorvastatina atenua a dislipidemia associada à síndrome metabólica induzida por dieta hiperglicídica. As figuras mostram níveis de colesterol total (A), LDL (B), VLDL (C), HDL (D) e níveis de triglicerídeos (E) de camundongos mantidos por 18 semanas em dieta controle ou dieta hiperglicídica, tratados com veículo ou atorvastatina (20 mg/kg por 4 semanas). Os resultados representam a média ± DP. *, p <0,05 vs. dieta controle_veículo; #, p <0,05 vs. dieta hiperglicídica_veículo (n = 6 para cada grupo experimental).

Perfil glicêmico

A glicemia de jejum dos camundongos mantidos em dieta hiperglicídica estava aumentada quando comparada à glicemia de jejum dos camundongos mantidos em dieta controle. Os camundongos que receberam dieta hiperglicídica e tratamento com atorvastatina não mostraram redução na concentração glicêmica ( Figura 3A ). No TOTG ( Figura 3B ), camundongos que receberam dieta hiperglicídica apresentaram aumento na concentração glicêmica quando comparados aos camundongos que receberam dieta controle, sendo que, mesmo com o passar do tempo, os níveis de glicose não retornaram aos níveis basais, como observado nos camundongos que receberam dieta controle. Além disso, camundongos que receberam dieta hiperglicídica e tratados com atorvastatina apresentaram, com o passar do tempo, menor glicemia. A área sob a curva reflete os efeitos citados ( Figura 3C ).

– Atorvastatina atenua a intolerância à glicose associada à síndrome metabólica induzida por dieta hiperglicídica. As figuras mostram níveis de glicemia em jejum (A), curvas glicêmicas (B) e área sob a curva (C), obtidas no teste oral de tolerância à glicose de camundongos mantidos por 18 semanas em dieta controle ou dieta hiperglicídica, tratados com veículo ou atorvastatina (20 mg/kg por 4 semanas). Os resultados representam a média ± DP. *, p <0,05 vs. dieta controle_veículo; &, p <0,05 vs. dieta controle_atorvastatina; #, p <0,05 vs. dieta hiperglicídica_veículo (n = 6 para cada grupo experimental).

Morfologia muscular lisa

Camundongos mantidos em dieta hiperglicídica apresentaram aumento na AST vascular quando comparados aos camundongos mantidos em dieta controle. Camundongos que receberam dieta hiperglicídica e foram tratados com atorvastatina mostraram redução na AST ( Figura 4A ). De modo similar, camundongos que receberam dieta hiperglicídica apresentaram aumento na espessura da camada média do vaso quando comparados aos camundongos que receberam dieta controle. O tratamento com atorvastatina foi capaz de reduzir este aumento na espessura da camada média ( Figura 4B ).

– Atorvastatina atenua o remodelamento do músculo liso vascular associado à síndrome metabólica induzida por dieta hiperglicídica. As figuras mostram imagens representativas, tamanho da AST (A) e espessura da parede do vaso (B) de camundongos mantidos por 18 semanas em dieta controle ou dieta hiperglicídica, tratados com veículo ou atorvastatina (20 mg/kg por 4 semanas). Os resultados representam a média ± DP. *, p <0,05 vs. dieta controle_veículo; #, p <0,05 vs. dieta hiperglicídica_veículo (n = 6 para cada grupo experimental). Dieta C: dieta controle, Dieta H: dieta hiperglicídica.

Morfologia do tecido adiposo perivascular

Para verificar se houve alterações na morfologia do PVAT, foi avaliada a túnica adventícia a partir da medida e do número dos adipócitos presentes na mesma, sendo possível observar que os camundongos que receberam dieta hiperglicídica apresentaram adipócitos maiores ( Figura 5A ) e em menor número ( Figura 5B ) quando comparados com os camundongos que receberam dieta controle. O grupo que recebeu dieta hiperglicídica e tratamento com atorvastatina obteve redução no tamanho e aumento no número dos adipócitos.

– Atorvastatina atenua o remodelamento do PVAT associado à síndrome metabólica induzida por dieta hiperglicídica. As figuras mostram imagens representativas (A) e o tamanho de adipócitos PVAT (B) de camundongos mantidos por 18 semanas em dieta controle ou dieta hiperglicídica, tratados com veículo ou atorvastatina (20 mg/kg por 4 semanas). Os resultados representam a média ± DP. *, p <0,05 vs. dieta controle_veículo; #, p <0,05 vs. dieta hiperglicídica_veículo (n = 6 para cada grupo experimental). Dieta C: dieta controle, Dieta H: dieta hiperglicídica.

Perfil inflamatório

Foram determinadas as concentrações de citocinas pró-inflamatórias TNF-α ( Figuras 6A e 6C ) e IL-6 ( Figuras 6B e 6D ) no soro e no PVAT. Os camundongos que receberam dieta hiperglicídica apresentaram maiores concentrações de TNF-α e IL-6, tanto no soro quanto no PVAT, quando comparados aos camundongos que receberam dieta controle. O tratamento com atorvastatina reduziu os níveis de TNF-α e IL-6, tanto no soro quanto no PVAT, de camundongos mantidos em dieta hiperglicídica.

– Atorvastatina atenua os aumentos nas concentrações de citocinas pró-inflamatórias associados à síndrome metabólica induzida por dieta hiperglicídica. As figuras mostram níveis de TNF-α (A e C) e IL-6 (B e D) no soro e no PVAT, respectivamente, de camundongos mantidos por 18 semanas em dieta controle ou dieta hiperglicídica, tratados com veículo ou atorvastatina (20 mg/kg por 4 semanas). Os resultados representam a média ± DP. *, p <0,05 vs. dieta controle_veículo; &, p <0,05 vs. dieta controle_atorvastatina; #, p <0,05 vs. dieta hiperglicídica_veículo (n = 6 para cada grupo experimental).

Discussão

A dieta hiperglicídica resultou em mudanças murinométricas e metabólicas em camundongos. Silva et al.39 submeteu um modelo experimental à dieta semelhante, verificando aumentos em idênticos parâmetros utilizados neste estudo.39 Neste contexto, Leopoldo et al.,40 utilizando modelos experimentais, definiu as categorias de adiposidade após submissão à dieta hiperglicídica, tais quais variam entre: normal – índice de adiposidade (%) 4,17 a 4,55; excesso de peso – índice de adiposidade (%) 5,69 a 6,23; e obesidade – índice de adiposidade (%) 7,53 a 10,02.40 Nossos resultados demostram índice de adiposidade de aproximadamente 10% para os camundongos mantidos em dieta hiperglicídica, o que classifica o modelo experimental como obeso.

A glicose é um carboidrato que atua como uma das principais fontes de energia para o organismo e, em excesso, através de vias metabólicas, é armazenada em forma de glicogênio. Se a capacidade de armazenamento da ingesta de carboidratos excede a glicogênese, o excedente é convertido em triacilgliceróis e é incorporado a colesteróis provenientes da dieta e a apolipoproteínas, responsáveis pelo transporte de triglicerídeos até os tecidos de armazenamento, como, por exemplo, o tecido adiposo.41 Dessa forma, o excesso de carboidratos ofertados na dieta dos camundongos corrobora para o aumento da massa corporal e do índice de adiposidade.

Os camundongos mantidos em dieta hiperglicídica apresentaram dislipidemia e aumento da glicose sérica em jejum. Mullugeta et al.,42 demostrou, em portadores de diabetes melito do tipo 2, que a hiperglicemia e a resistência à insulina estão associados à dislipidemia, ou seja, hiperglicemia promove prejuízos no metabolismo lipídico. Além disso, demostrou-se que indivíduos hiperglicêmicos apresentam valores séricos de triglicerídeos, colesterol total e frações aumentados quando comparados aos indivíduos normoglicêmicos.42 , 43

O tratamento com atorvastatina se mostrou eficiente para o controle dos níveis de colesterol total e frações. Além disso, a atorvastatina reduziu os níveis de triglicerídeos, a massa corporal e o índice de adiposidade. Silva et al.44 também demostrou a eficácia da atorvastatina em doses diárias de 10 mg ou 20 mg sobre a correção do perfil lipídico de indivíduos, em que, além da terapêutica sobre o colesterol, os triglicerídeos também foram reduzidos.44 Sabe-se que VLDL e LDL são lipoproteínas constituídas por quantidades significativas de triacilgliceróis; sendo assim, propomos que, com a redução dos níveis de VLDL e LDL, por meio da ação da atorvastatina, é observada diminuição de triglicerídeos. Parhofer et al.45 descreve o efeito redutor de triglicerídeos principalmente pela a inibição da síntese de colesterol, e também salientam que VLDL e LDL têm o mesmo mecanismo de remoção. Assim, ao reduzir a quantidade de LDL na circulação sanguínea, pode-se também diminuir significantemente os níveis de VLDL.45

A dieta hiperglicídica, de acordo com o TOTG, induziu nos camundongos intolerância à glicose. Sabe-se que a exposição crônica do organismo à hiperglicemia acaba afetando a atividade insulínica no que diz respeito a síntese, secreção e ação deste hormônio, o que, de fato, é observado no diabetes melito tipo 2.6 Sendo assim, é possível sugerir que os resultados levantados no perfil glicêmico de camundongos mantidos em dieta hiperglicídica corroboram para o desenvolvimento de diabetes melito tipo 2. Kissebah et al.,46 demonstrou que o aumento da gordura visceral está associado à intolerância à glicose e à resistência à insulina; Taylor et al.,47 demonstrou que a gordura visceral está relacionada com o desenvolvimento de diabetes melito.46 , 47 Estudos descrevem que o aumento da gordura visceral predispõe a produção e secreção de citocinas, tais como IL-6 e TNF-α, e adipocinas como resistina e adiponectina, que estão associadas ao desenvolvimento de resistência à insulina e disfunções no metabolismo e no controle da glicose, por interferência na sinalização intracelular na insulina.48 , 49 O aumento da gordura visceral, bem como o aumento de TNF-α e IL-6, justificam o desequilíbrio no perfil glicêmico.

A terapia com atorvastatina foi capaz de atenuar a intolerância à glicose nos camundongos mantidos em dieta hiperglicídica. Huptas, et al.50 obteve resultados promissores em relação ao tratamento de indivíduos portadores de SM com atorvastatina, ele demostrou melhoras no metabolismo da glicose mediante a redução da intolerância à glicose e da resistência à insulina. Suzuki et al.,51 utilizando modelos experimentais de intolerância à glicose e de resistência à insulina, realizou TOTG e teste de tolerância à insulina (TTI) com ou sem o tratamento com atorvastatina, e demostrou que o grupo tratado tem TOTG e TTI reduzidos em comparação ao grupo que recebeu veículo.50 , 51

Não se sabe ao certo por quais mecanismos a atorvastatina melhora os parâmetros relacionados ao metabolismo da glicose. Tal melhora pode estar relacionada à diminuição do processo de gliconeogênese.51 No entanto, é possível sugerir que tal redução da intolerância à glicose pode estar relacionada com a redução dos depósitos de gordura visceral; além disso, pode estar relacionada à redução da produção de citocinas (TNF-α e IL-6), que são potenciais causas de disfunções metabólicas.

De acordo com Mulvany (1999), o remodelamento vascular pode ser classificado a partir de medidas da AST e espessura da parede. O aumento da AST e da espessura da parede é característico de remodelamento do tipo hipertrófico.52 Uma das causas do remodelamento vascular é a inflamação mediada por aumento de citocinas pró-inflamatórias. Estudos relacionados à SM mostram que a hipertrofia do PVAT resulta na migração, ativação de células imunes e aumento da secreção dessas citocinas, levando a um processo inflamatório crônico de baixa intensidade.53 - 55

As mudanças na estrutura e na composição do PVAT refletem-se na túnica média do vaso, pois, fisiologicamente, o PVAT é constituído de adipócitos que agem como reguladores da proliferação de células da musculatura lisa vascular (CMLV). A mudança por adipócitos não especializados culmina em aumento da proliferação de CMLV e hipertrofia da musculatura lisa. Esta hipertrofia apresenta papel significativo em doenças vasculares como, por exemplo, reestenose e hipertensão arterial.56

TNF-α e IL-6 se encontram em concentrações aumentadas durante a inflamação crônica presente na obesidade, na resistência à insulina e na SM. Além disso, há clara relação do aumento dessas citocinas em mudanças fenotípicas do PVAT.57 , 58 Citocinas pró-inflamatórias promovem o remodelamento e a disfunção vascular, uma vez que concentrações aumentadas de TNF-α promovem a hiperplasia neointimal e a disfunção endotelial. De forma semelhante, a IL-6, quando em concentrações aumentadas, pode induzir a infiltração de macrófagos no PVAT, contribuindo para o desenvolvimento de aneurisma e remodelamento vascular associado à inflamação do PVAT.59 , 60

A partir de uma dieta hiperlipídica, foi induzida em coelhos hipercolesterolemia para levantamento das alterações que a condição poderia desenvolver nas artérias pulmonares dos animais. As artérias apresentaram aumento da proliferação de CMLV, bem como hipertrofia da túnica média e hiperplasia da túnica íntima, além disso, no tecido pulmonar, havia grande infiltrado de células inflamatórias como, por exemplo, macrófagos; houve aumento de IL-6 no soro desses animais. Os coelhos foram tratados com atorvastatina, evidenciando-se a reversão da condição hipercolesterolêmica, do remodelamento vascular e dos processos inflamatórios no tecido pulmonar.61 Similarmente, atorvastatina inibe o remodelamento vascular induzido por aldosterona, via redução de citocinas pró-inflamatórias.31

Como limitação desse estudo, não é possível estabelecer uma relação casuística direta entre o tratamento farmacológico com atorvastatina, as amenidades no perfil metabólico e o remodelamento vascular. A partir do delineamento experimental utilizado nesse estudo, mostramos que a atorvastatina reduz a adiposidade e melhora os perfis lipídicos, glicêmicos e inflamatórios. Na literatura, é clássico que tais fatos são benéficos para a estrutura e a função vascular. Sendo assim, não temos a clareza absoluta de que o remodelamento vascular atenuado se deu por ações diretas da atorvastatina sobre a vasculatura, ou por meio de efeitos adjacentes ao metabolismo. Ressaltamos que, em organismos multicomplexos, mecanismos isolados não justificam a gênese de doenças, sendo que, nesse contexto, há sempre uma vasta interação entre mecanismos e sistemas para tal. Portanto, independentemente da ação direta ou pleiotrópica da atorvastatina, a terapia final se mostra promissora para o contexto deste estudo.

 Conclusão

Em resumo, este estudo mostra que o tratamento com atorvastatina atenua os danos metabólicos associados à síndrome metabólica induzida por dieta hiperglicídica, além de atenuar o remodelamento do músculo liso vascular e do PVAT, sendo esses efeitos associados à redução de citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-6.

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Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Fontes de financiamento O presente estudo foi financiado pelo CNPq (Processo 433898/2018-06)

 Original Article Atorvastatin Attenuates Vascular Remodeling in Mice with Metabolic Syndrome Carvalho Karine Ferreira da Silva 1 Ferreira Amanda Araújo Marques 1 Barbosa Nayara Carvalho 1 Alves Juliano Vilela 2 0000-0002-5174-5710 Costa Rafael Menezes da 1 Brazil Universidade Federal de Jataí - Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Jataí, GO - Brazil Brazil Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo - Departamento de Farmacologia, Ribeirão Preto, SP - Brazil Mailing address: Rafael Menezes da Costa • Universidade Federal de Jataí - Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde - BR 364, km 195, 3800. Postal Code 75801-615, Jataí, GO – Brazil E-mail: rafael.menezess@yahoo.com.br

Author Contributions

Conception and design of the research, Statistical analysis, Writing of the manuscript and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Carvalho KFS, Costa RM; Acquisition of data: Carvalho KFS, Ferreira AAM, Barbosa NC, Alves JV; Analysis and interpretation of the data: Carvalho KFS, Ferreira AAM, Barbosa NC, Alves JV, Costa RM; Obtaining financing: Costa RM.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background

Metabolic syndrome is characterized by an array of comorbidities. During this syndrome, structural changes are observed in the cardiovascular system, especially vascular remodeling. One of the predisposing causes for these changes is chronic inflammation resulting from changes in the structure and composition of perivascular adipose tissue. Atorvastatin is effective in the treatment of dyslipidemias. However, its pleiotropic effects have not been completely understood. We hypothesize that metabolic syndrome may lead to vascular remodeling and that atorvastatin therapy may be able to attenuate this condition.

 Objectives

To assess the effects of atorvastatin therapy on vascular remodeling in an experimental model of metabolic syndrome.

 Methods

Swiss mice received a control diet or a hyperglicemic diet for 18 weeks. After 14 weeks of diet, mice were treated with vehicle or atorvastatin (20mg/kg) during for 4 weeks. Nutritional and metabolic profiles were assessed by biochemical tests; moreover, a histological assessment of aorta structure was conducted, and cytokine levels were determined by the immunoenzyme assay. The acceptable level of significance for the results was set at p<0.05.

 Results

Hyperglicemic diet promoted the development of metabolic syndrome. It indeed culminated in hypertrophic remodeling of vascular smooth muscle and perivascular adipose tissue. Furthermore, there were increases in the levels of circulating TNF-α and IL-6 and in the perivascular adipose tissue. Atorvastatin therapy significantly reduced metabolic damages, vascular remodeling, and cytokine levels.

 Conclusion

Atorvastatin attenuate metabolic damages associated with metabolic syndrome induced by hyperglycemic diet, in addition to attenuating vascular remodeling; both effects are associated with reduced levels of pro-inflammatory cytokines.

 Dyslipidemias Dietary Carbohydrates Metabolic Syndrome Vascular Remodeling Atorvastatin Inflammation Mice Introduction

Cardiovascular diseases pose great risks for the quality of life of the world population. In Brazil, nearly 350 thousand individuals die from cardiovascular diseases every year.1 , 2 One of the most important predisposing causes for cardiovascular risks is metabolic syndrome (MS), characterized by an array of comorbidities involving increased abdominal circumference (≥ 89 cm for women and ≥ 102 cm for men), increased levels of triglycerides (≥ 150 mg/dL), reduced levels of HDL cholesterol (≤ 50 mg/dL for women and ≤ 40 mg/dL for men), increased levels of blood pressure (≥ 130/85 mmHg), and increased levels of fasting glucose (≥ 100 mg/dL). The presence of at least three of these comorbidities is pivotal for the diagnosis of MS.3 , 4

During MS there are structural and functional changes in components of the vascular system.5 - 7 Individuals with MS present endothelial dysfunction, in addition to increased migration and proliferation of smooth muscle cells. An expansion of perivascular adipose tissue (PVAT) is also observed, as shown by morphological increase of adipocytes and by the replacement of brown adipose tissue with white adipose tissue, resulting in a reduction in the release of PVAT-derived relaxing factors and consequent lack of anti-contractile capacity.8 - 11

Hypertrophy and replacement of adipocytes in the PVAT may favor the production and accumulation of pro-inflammatory cytokines.12 Rodents that underwent a high-calorie diet and developed MS showed increase in and accumulation of PVAT in the aorta and the carotid arteries. This fact promoted the release of chemokines and recruitment of monocytes and T-cells to PVAT.13 In this inflammatory environment, increased production of interleukin-6 (IL-6) and infiltrate of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) releasing macrophages may also be observed in the PVAT.14 This set triggers chronic vascular system inflammation, impairing the structure and the function of the constituents of this system.

Blood vessel inflammation indeed contributes to vascular remodeling, increased peripheral resistance, and circulatory desorders.7 , 15 , 16 In this context, vascular remodeling is a chronic adaptive process characterized by changes in blood vessel structure derived from pro-inflammatory cytokines, in addition to growth factors, hemodynamic stimulation, and reactive oxygen species. It encompasses changes in cell growth, death, and migration and in synthesis and degradation of the extracellular matrix.17 - 19

An important factor to be considered in the vascular changes found during MS is dyslipidemia, a condition characterized by increased circulating levels of cholesterol and triglycerides and reduced levels of HDL.20 Numerous studies established that dyslipidemia leads to an inflammatory vascular response, reflected in the activation of endothelial cells, recruitment of leukocytes, and production of pro-inflammatory cytokines.21 , 22 Hypercholesterolemic mice fed with a high-fat diet showed remodeling in the medial layer of the femoral artery, associated with recruitment of macrophages.23 In this context, there is a positive correlation between levels of circulating cholesterol, chronic inflammation, and vascular remodeling.

Atorvastatin, an inhibitor of β-hydroxy-β-methylglutaryl-coenzyme A reductase, has shown to be one of the most effective statins in the treatment of dyslipidemias, reducing the production of LDL-cholesterol and increasing the production of high density lipoprotein (HDL) cholesterol.24 , 25 However, over the last decades, a growing body of evidence, both experimental and clinical, has accumulated to support the idea that atorvastatin exerts beneficial cardiovascular effects, regardless of its primary effects.26 In an experimental MS model, atorvastatin was able to improve reactivity and reduce structural remodeling of resistance arteries, both of which were associated with reduced inflammation and reduced oxidative stress.27 Furthermore, atorvastatin is able to inhibit the secretion of matrix metalloproteinase 9 in vascular cells and suppress the expression of transforming growth factor beta, thus reducing vascular fibrosis.28 - 30 These in vitro effects of atorvastatin also associated with its anti-inflammatory capacity.31 In the clinical context, atorvastatin reduces atherosclerotic processes32 and clinical manifestations of acute coronary syndrome.33 Indeed, one of the several pleiotropic effects of atorvastatin is its robust vasoprotective capacity. Nevertheless, there is no sufficient evidence to confirm the effects and the possible mechanisms involved in the actions of atorvastatin from the perspective of the vascular smooth muscle and, unprecedentedly, of PVAT as inflammatory tissues in conditions of MS. Therefore, in this study we hypothesize that MS leads to vascular remodeling of vascular smooth muscle and of PVAT, resulting from increased vascular inflammation. Moreover, atorvastatin therapy may be able to reduce vascular inflammation and thus revert the damages associated with MS.

 Methods Animals and experimental design

All experimental procedures were analyzed by the Ethics Committee on Animal Use of Universidade Federal de Jataí (Protocol 02/2019). Three-week old male Swiss mice were obtained from the Central Vivarium of Universidade Federal de Goiás – Regional Goiânia and housed in the Animal Experimentation Vivarium of Universidade Federal de Jataí, under a controlled temperature of 22 ± 2ºC, humidity of 50 ± 5%, and 12-hour light/dark cycles, and ad libitum access to water and food. During the entire experimental period, mice were kept in polypropylene cages (30 cm long x 20 cm wide x 13 cm high), in groups of 3 mice per cage.

After one week of acclimatization, mice received a control diet or a hyperglycemic diet for 18 weeks. After 14 weeks of diet, mice were treated (daily in the afternoon) by gavage with vehicle (saline) or atorvastatin (20mg/kg, Sigma-Aldrich, #PZ0001, Germany) for 4 weeks.34 The control diet consisted of 22% of protein, 70% of carbohydrate, and 8% of fat, whereas the hyperglycemic diet consisted of 10% of protein, 80% of carbohydrate, and 10% of fat. The hyperglycemic diet included 33% of control diet (Nuvilab® CR1, Nuvital, Brazil), 33% of condensed milk, and 7% of sucrose by weight, the remaining being water.6 The energy density was 12.16 kJ/g for the control diet and 13.35 kJ/g for the hyperglycemic diet. Mice were euthanized by overdose anesthesia (ketamine and xylazine, 140 mg/kg and 12 mg/kg, respectively, administered intraperitoneally).

 Nutritional and murinometric profile of the experimental model

The nutritional profile was determined by food consumption and consequent caloric intake, in addition to feed efficiency. Caloric intake (by mouse) was calculated based on weekly food intake multiplied by the energy content of the diet (g x kcal). In order to analyze the capacity of each mouse to convert the ingested calories into body mass, feed efficiency was calculated by dividing the overall body mass gain (g) by the overall energy intake (kcal), in percent. The murinometric profile was determined by analysis of body mass and fat. Mice’s body mass was measured every week using a high accuracy analytical balance, and obesity was characterized by the adiposity index {[body fat (g)/ final body weight (g)]x100} at the end of the diets and treatments, and body fat was calculated by the sum of epididymal, retroperitoneal and visceral fats.35

 Collection of serum and PVAT

Mice were subjected to an 8-hour fasting. After euthanasia, blood samples were collected through cardiac puncture and transferred into dry tubes. Blood was centrifuged at 2,500 rpm for 15 minutes to separate the serum to be used in the determination of mice’s biochemical and cytokine levels. PVAT was mechanically removed from segments of the thoracic aorta, frozen in liquid nitrogen, pulverized and homogenized in cold phosphate buffer solution (PBS). The tissue specimen was centrifuged at 13,000 rpm for 20 minutes to separate the insoluble material. The supernatant was collected for determination of cytokine levels.

 Assessment of lipid and glucose profiles

Serum levels of total cholesterol total, triglycerides, and HDL-cholesterol were determined by enzymatic methods (kits Labtest, Brazil) in blood samples obtained after whole blood centrifugation. The concentration of very low-density lipoproteins (VLDL) was calculated based on the serum concentration of triglycerides, using the following formula: VLDL (mg/dL)= Triglycerides (mg/dL)/5. The concentration of low-density lipoproteins (LDL) was calculated based on HDL and VLDL concentrations, using the following formula: LDL (mg/dL) = Total cholesterol total - HDL - VLDL.36 Glucose was determined after treatment with the diets. A drop of blood was applied to individual test strips specific for blood glucose measurement (Accu-Check Active, Germany).

 Oral glucose tolerance test (OGTT)

On the day before the end of the 18th week of diets and treatments, after 8-hour fasting, mice’s blood glucose was measured by a glucometer (Accu-Check Active, Germany), in order to determine baseline blood glucose levels. Subsequently, a 2 g/kg dose of glucose was administered to mice by gavage. From this moment on, a chronometer was started and new blood glucose measurements were conducted at 30, 60, 90 and 120 minutes.37

 Morphostructural assessment of vascular smooth muscle and PVAT

Specimens of thoracic aortas were removed and then fixed in 4% paraformaldehyde for 24 hours. The next stages involved dehydration in increasing concentrations of ethyl alcohol (70%, 80%, 90% and 100%) for 120 minutes, with subsequent diaphanization in absolute ethyl alcohol (1:1) 1, 2 and 3 for 120 minutes and in xylol 1, 2 and 3 for 30 minutes, with subsequent inclusion in paraffin. Aorta specimens were included in paraffin and sectioned in a microtome at a thickness of 4.5 µm for subsequent staining.

For hematoxylin and eosin staining, slides were deparaffinized, kept in a greenhouse at 65ºC, and then immersed in xylol 1 and 2 for 20 minutes. Subsequently, slides were immersed in decreasing concentrations of ethyl alcohol (100%, 90%, 70% and 50%) for 5 minutes and immersed in distilled water for 10 minutes. After hydration, slides were immersed in hematoxylin for 6 minutes and immediately after washed in running water for 10 minutes. Subsequently, they were immerse in eosin for 6 minutes. Sections were dehydrated and diaphanized again and then mounted with Permount® Mounting Medium (Fisher Scientific, USA) and glass slides.

Stained images were obtained by a digital camera coupled to an optical microscope and analyzed with the ImageJ software (National Institutes of Health, USA). For the analysis of images, lumen, tunica media, and tunica adventitia were delimited in order to calculate the following morphometric variables: cross-sectional area (CSA) and thickness of tunica media. The volume of adipocytes (v) were calculated by the formula v=πd3/6, where (d) represents the diameter of adipocytes. The mass of adipocytes was calculated by volume multiplied by density (0.92 g/cm3). The number of adipocytes was determined by dividing the mass of PVAT by mean mass of adipocytes.38

 Determination of levels of inflammatory cytokines

The levels of TNF-α and IL-6 in serum and in the PVAT were assessed by the immunoenzyme assay (ELISA) using DuoSet ELISA Development Systems kits (R&D Systems, USA) according to manufacturer’s instructions. Microtiter 96-well plates were covered with 50 μl/well of specific anti-TNF-α and anti-IL-6 antibodies at the concentrations described by the manufacturer, diluted in PBS, and incubated overnight at 4ºC. Plates were washed with PBS/Tween-20 (0.05%), and nonspecific binding sites were blocked with 100 μl of PBS containing 1% bovine serum albumin for 2 hours at room temperature. Subsequently, samples were added, and a new incubation was conducted for 2 hours at room temperature. After this period, plates were washed and 50μl of biotinylated antibodies specific for each cytokine were added. After 2 hours, plates were washed, and streptavidin-peroxidase conjugate diluted at 1:40 was added to each well. Plates were incubated for 1 hour at room temperature. Subsequently, plates were washed and 100μl of tetramethylbenzidine substrate were added. Optical density was measured at 630 nm in a SpectraMAX 190 Microplate Reader spectrophotometer (Molecular Devices, USA). The levels of cytokines in the samples were calculated based on an 11-point standard curve obtained by serial dilution. Results were expressed in pg/mL for serum samples and pg/mg of protein for samples of PVAT.

 Statistical analysis

Results were expressed as mean ± standard deviation (SD). Data followed a normal distribution, according to the Kolmogorov-Smirnov test. Results were analyzed by two-way analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey post-hoc test. The minimum acceptable level of significance was p<0.05. For convenience reasons, the number of mice for each experimental group was 6. The Prisma software, version 8.0 (GraphPad Software Inc., USA) was used to analyze these parameters and to design the graphs.

 Results Nutritional and murinometric profile

Food intake and, consequently, calorie intake were higher in mice fed with the hyperglycemic diet, as well as feed efficiency. However, this last parameter was reduced after atorvastatin therapy. Murinometric parameters, such as mass gain, deposits of epididymal, retroperitoneal and visceral fats were higher in mice that received the hyperglycemic diet compared with those that received the control diet. Atorvastatin therapy led to a decrease in these parameters ( Table 1 ). Mice on the hyperglycemic diet showed a greater increase in body mass compared to those on the control diet. Furthermore, mice fed with the hyperglycemic diet and treated with atorvastatin had a decrease in their body mass ( Figure 1A ). The adiposity index, the parameter used to determine obesity, was higher in mice that received the hyperglycemic diet compared to those that received the control diet. Atorvastatin therapy led to a decrease in the adiposity index among mice on the hyperglycemic diet ( Figure 1B ).

– Eating behavior and weight assessment of body fat deposits
CD + Vehicle CD + Atorvastatin HD + Vehicle HD + Atorvastatin
Food intake (g/week) 22.6 ± 0.3 21.3 ± 0.4 31.7 ± 0.2 31.1 ± 0.5
Calorie intake (kcal/week) 274.8 ± 3.7 259.1 ± 4.9 423.1 ± 2.67* 415.2 ± 6.7
Feed efficiency (%) 0.51 ± 0.01 0.53 ± 0.01 0.64 ± 0.02* 0.47 ± 0.03#
Mass gain (g) 25.0 ± 2.31 24.5 ± 2.25 37.3 ± 1.52* 27.9 ± 1.22#
Epididymal fat (g) 0.97 ± 0.12 1.13 ± 0.11 2.68 ± 0.24* 1.31 ± 0.09#
Retroperitoneal fat (g) 0.32 ± 0.06 0.61 ± 0.19 1.88 ± 0.12* 0.93 ± 0.19#
Visceral fat (g) 0.75 ± 0.15 0.94 ± 0.13 1.67 ± 0.11* 1.01 ± 0.17#

Dados expressed as mean ± SD. *, p<0.05 vs. CD + Vehicle;#, p<0.05 vs. HD + Vehicle (n=6 for each experimental group). CD: Control Diet, HD: Hyperglycemic Diet.

– Atorvastatin attenuates obesity associated with metabolic syndrome induced by hyperglycemic diet. The figures show body mass (A) and adiposity index (B) of mice fed with a control diet or with a hyperglycemic diet for 18 weeks and treated with vehicle solution or atorvastatin (20 mg/kg for 4 weeks). Results expressed as mean ± SD. *, p<0.05 vs. Control Diet_Vehicle; #, p<0.05 vs. Hyperglycemic Diet_Vehicle (n=6 for each experimental group).

Lipid profile

Mice fed with the hyperglycemic diet had dyslipidemia compared with those fed with the control diet. Dyslipidemia may be observed based on increased levels of total cholesterol ( Figure 2A ), in which LDL ( Figure 2B ) and VLDL ( Figure 2C ) fractions were increased and HDL fraction ( Figure 2D ) was reduced. There was also an increase in the levels of triglycerides of mice that received the hyperglycemic diet compared to those that received the control diet ( Figure 2E ). Mice on the hyperglycemic diet and treated with atorvastatin showed a decrease in these lipid parameters.

– Atorvastatin attenuates dyslipidemia associated with metabolic syndrome induced by hyperglycemic diet. The figures show the levels of total cholesterol (A), LDL (B), VLDL (C), HDL (D), and triglycerides (E) of mice fed with a control diet or with a hyperglycemic diet for 18 weeks and treated with vehicle solution or atorvastatin (20 mg/kg for 4 weeks). Results expressed in mean ± SD. *, p<0.05 vs. Control Diet_Vehicle; #, p<0.05 vs. Hyperglycemic Diet_Vehicle (n=6 for each experimental group).

Glucose profile

Fasting serum glucose of mice fed with the hyperglycemic diet was increased when compared to that of mice fed with the control diet. Mice that received the hyperglycemic diet and atorvastatin therapy did not show a decrease in glucose concentration ( Figure 3A ). In the OGTT ( Figure 3B ), mice on the hyperglycemic diet had an increased glucose concentration compared with mice on the control diet, and blood glucose levels did not return to baseline levels over time, as observed in mice on control diet. Moreover, mice fed with the hyperglycemic diet and treated with atorvastatin had lower blood glucose levels over time. The area under the curve shows the above mentioned effects ( Figure 3C ).

– Atorvastatin attenuates glucose intolerance associated with metabolic syndrome induced by hyperglycemic diet. The figures show the levels of fasting glucose (A), glucose curves (B), and area under the curve (C) obtained in the oral glucose tolerance tests of mice fed with a control diet or with a hyperglycemic diet for 18 weeks and treated with vehicle solution or atorvastatin (20 mg/kg for 4 weeks). Results expressed as mean ± SD. *, p<0.05 vs. Control Diet_Vehicle; &, p<0.05 vs. Control Diet_Atorvastatin; #, p<0.05 vs. Hyperglycemic Diet_Vehicle (n=6 for each experimental group).

Morphology of smooth muscle

Mice fed with the hyperglycemic diet had an increase in vascular CSA compared to those fed with the control diet. Mice that received the hyperglycemic diet and were treated with atorvastatin showed decreased CSA ( Figure 4A ). Similarly, there was an increase in the thickness of vessel tunica media among mice on the hyperglycemic diet compared to those on the control diet. Atorvastatin therapy was able to reduce this increase in thickness of tunica media ( Figure 4B ).

– Atorvastatin attenuates remodeling of vascular smooth muscle associated with metabolic syndrome induced by hyperglycemic diet. The figures show representatives images, size of CSA (A) and vessel wall thickness (B) of mice fed with a control diet or with a hyperglycemic diet for 18 weeks and treated with vehicle solution or atorvastatin (20 mg/kg for 4 weeks). Results expressed as mean ± SD. *, p<0.05 vs. Control Diet_Vehicle; #, p<0.05 vs. Hyperglycemic Diet_Vehicle (n=6 for each experimental group). CD: Control Diet, HD: Hyperglycemic Diet.

Morphology of perivascular adipose tissue

In order to investigate whether there were changes in PVAT morphology, the present study assessed the size and the number of adipocytes presents in the tunica adventitia. It was possible to observe that mice fed with the hyperglycemic diet had larger adipocytes ( Figure 5A ) and in a smaller number ( Figure 5B ) compared to mice fed with the control diet. The group that received the hyperglycemic diet and atorvastatin therapy showed a reduction in the size of adipocytes and an increase in their number.

– Atorvastatin attenuates PVAT remodeling associated with metabolic syndrome induced by hyperglycemic diet. The figures show representative images (A) and size of PVAT adipocytes (B) of mice fed with a control diet or with a hyperglycemic diet for 18 weeks and treated with vehicle solution or atorvastatin (20 mg/kg for 4 weeks). Results expressed as mean ± SD. *, p<0.05 vs. Control Diet_Vehicle; #, p<0.05 vs. Hyperglycemic Diet_Vehicle (n=6 for each experimental group). CD: Control Diet, HD: Hyperglycemic Diet.

Inflammatory profile

Concentrations of the pro-inflammatory cytokines called TNF-α ( Figures 6A and 6C ) and IL-6 ( Figures 6B and 6D ) were determined in the serum and in PVAT. Mice on the hyperglycemic diet showed higher concentration of TNF-α and IL-6, both in serum and in PVAT, compared to mice on the control diet. Atorvastatin therapy reduced the levels of TNF-α and IL-6 both in the serum and in the PVAT of mice fed with the hyperglycemic diet.

– Atorvastatin attenuates increased concentrations of pro-inflammatory cytokines associated with metabolic syndrome induced by hyperglycemic diet. The figures show the levels of TNF-α (A and C) and IL-6 (B and D) in serum and in PVAT, respectively, of mice fed with a control diet or with a hyperglycemic diet for 18 weeks and treated with vehicle solution or atorvastatin (20 mg/kg for 4 weeks). Results expressed as mean ± SD. *, p<0.05 vs. Control Diet_Vehicle; &, p<0.05 vs. Control Diet_Atorvastatin; #, p<0.05 vs. Hyperglycemic Diet_Vehicle (n=6 for each experimental group).

Discussion

The hyperglycemic diet resulted in murinometric and metabolic changes in mice. Silva et al.39 subjected an experimental group to a similar diet and found increases in parameters identical to those used in this study.39 In this context, Leopoldo et al.,40 using experimental models, defined the categories of adiposity after study participants received a hyperglycemic diet, which vary from: normal – adiposity index (%) 4.17-4.55; overweight – adiposity index (%) 5.69-6.23; and obesity – adiposity index (%) 7.53-10.02.40 Our results showed an adiposity index of nearly 10% for mice fed with the hyperglycemic diet, which classifies the experimental group as obese.

Glucose is a carbohydrate that represents one of the main energy sources for the body and, when in excess, through metabolic pathways, is stored as glycogen. If the capacity to store carbohydrate intake exceeds glycogenesis, the remaining excess is converted into triacylglycerol and incorporated into cholesterols obtained from the diet and into apolipoproteins, responsible to transport triglycerides to storage tissues, such as adipose tissue.41 Thus, carbohydrate excess in the diet of mice contributes to increases in body mass and adiposity index.

Mice that received the hyperglycemic diet showed dyslipidemia and increased fasting serum glucose. Mullugeta et al.42 showed that hyperglycemia and insulin resistance are associated with dyslipidemia in individuals with type II diabetes mellitus, i.e., hyperglycemia leads to impaired lipid metabolism. Furthermore, it was found that hyperglycemic individuals had increased serum levels of triglycerides, total cholesterol and its fractions compared to normoglycemic individuals.42 , 43

Atorvastatin therapy proved to be efficient to control the levels of total cholesterol and its fractions. Moreover, atorvastatin reduced the levels of triglycerides, body mass, and adiposity index. Silva et al.44 also showed the effectiveness of atorvastatin in daily doses of 10 mg or 20 mg on the correction of individuals’ lipid profile, in which cholesterol therapy led also to a decrease in the level of triglycerides.44 It is known that VLDL and LDL are lipoproteins consisting significant amounts of triacylglycerols; thus, we propose that by reducing the levels of VLDL and LDL through atorvastatin therapy may lead to reduced levels of triglycerides. Parhofer et al.45 describes the lowering effect of triglycerides, especially by the inhibition of cholesterol synthesis, and also highlight that VLDL and LDL have the same removal mechanism; hence, the reduction in the number of circulating LDL particles may also significantly reduce VLDL levels.45

According to the OGTT, the hyperglycemic diet induced glucose intolerance in mice. Chronic exposure to hyperglycemia is known to eventually affect insulin activity with regard to synthesis, secretion of action of this hormone, which is indeed observed in type II diabetes mellitus.6 Therefore, it is possible to suggest that the results found for the glucose profile of mice on the hyperglycemic diet contribute to the development of type II diabetes mellitus. Kissebah et al.46 showed that increased visceral fat is associated with glucose intolerance and insulin resistance, and Taylor et al.47 found that visceral fat is related to the development of diabetes mellitus.46 , 47 Previous studies described that increased visceral fat predisposes to production and secretion of cytokines, such as IL-6 and TNF-α, and adipokines, such as resistin and adiponectin, which are associated with the development of insulin resistance and disorders in glucose metabolism and control, due to interference with insulin intracellular signaling.48 , 49 Increased visceral fat, as well and increased levels of TNF-α and IL-6, justify the imbalances in glucose profile.

Atorvastatin therapy was able to attenuate glucose intolerance in mice fed with the hyperglycemic diet. Huptas et al.50 obtained promising results with atorvastatin therapy in individuals with MS, showing improvements in glucose metabolism through reduced glucose intolerance and reduced insulin resistance. Using experimental models of glucose intolerance and insulin resistance, Suzuki et al.51 performed OGTT and insulin tolerance test (ITT) in groups treated and not treated with atorvastatin and showed that the treated group had reduced levels of glucose and insulin in OGTT and ITT compared to the group that received the vehicle solution.50 , 51

The mechanisms through which atorvastatin improves parameters related to glucose metabolism are not known yet. This improvement may be related to decreased gluconeogenesis.51 However, it is possible to suggest that reduced glucose intolerance may be related to reduced deposits of visceral fat and may also be related to reduced production of cytokines (TNF-α and IL-6), which are potential causes of metabolic disorders.

According to Mulvany (1999), vascular remodeling may be classified based on measures of CTA and wall thickness. Increased CTA and wall thickness is typical of hypertrophic remodeling.52 One of the causes of vascular remodeling is inflammation mediated by increased levels of pro-inflammatory cytokines. Studies on MS showed that PVAT hypertrophy results in migration, activation of immune cells and secretion of the above mentioned cytokines, leading to a low-intensity chronic inflammatory process.53 - 55

Changes in the structure and composition of PVAT reflect in vessel tunica media, because PVAT is physiologically constituted by adipocytes that act as regulators of the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs). The change to non-specialized adipocytes culminates in increased VSMC proliferation and smooth muscle hypertrophy. This hypertrophy has a major role in vascular diseases such as restenosis and arterial hypertension.56

TNF-α and IL-6 are found in increased concentrations during chronic inflammation present in obesity, insulin resistance, and MS. Additionally, there is a clear relationship between increased levels of these cytokines and phenotypic changes in PVAT.57 , 58 Pro-inflammatory cytokines promote vascular remodeling and dysfunction, since increased concentrations of TNF-α promote neointimal hyperplasia and endothelial dysfunction. Similarly, increased concentration of IL-6 may induce macrophage infiltration into PVAT, contributing to development of aneurism and vascular remodeling associated with PVAT inflammation.59 , 60

Hypercholesterolemia was induced from a hyperlipidemic diet in rabbits to investigate what changes this condition could develop in their pulmonary arteries. These arteries had increased VSMC proliferation, tunica media hypertrophy, and tunica intima hyperplasia. Furthermore, there were a large infiltrate of inflammatory cells, e.g., macrophages, in lung tissue a higher concentration of serum IL-6 in the rabbits. These animals were treated with atorvastatin, which led to a reversal of hypercholesterolemia, vascular remodeling, and inflammatory processes in lung tissue.61 Similarly, atorvastatin inhibits aldosterone-induced vascular remodeling by decreasing pro-inflammatory cytokines.31

The main limitation of this study was the impossibility of establishing a direct causal relationship of pharmacological therapy with atorvastatin with improvements in metabolic profile and vascular remodeling. Based on the experimental design used in this study, we showed that atorvastatin reduces adiposity and improves lipid, glucose and inflammatory profiles. Literature has extensively shown that these facts are beneficial for vascular structure and function. Therefore, it is not clear yet whether attenuated vascular remodeling may be explained by direct actions of atorvastatin on vessels or by effects underlying the metabolism. We reinforce that, in multicomplex organisms, isolated mechanisms do not justify the genesis of diseases, since it always involves a vast interaction between mechanisms and systems. Therefore, regardless whether atorvastatin has a direct or pleiotropic action, the final therapy has shown to be promising for the context of this study.

 Conclusions

In short, this study shows that atorvastatin therapy attenuates the metabolic damages associated with MS induced by hyperglycemic diet, in addition to attenuating remodeling of vascular smooth tissue and PVAT; these effects are associated with reduced levels of the pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-6.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Sources of Funding: This study was partially funded by CNPq (Process 433898/2018-06).