Resumo

Arq Bras Cardiol

abc

Arquivos Brasileiros de Cardiologia

Arq. Bras. Cardiol.

0066-782X 1678-4170

Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC

T6JVV6sNzHR6cvn6zqHCM3M

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abc.20190633

10.36660/abc.20190633

Artigo Original

Suplementação de Vitamina D Induz Remodelação Cardíaca em Ratos: Associação com a Proteína de Interação com a Tiorredoxina e a Tiorredoxina

0000-0003-1159-5030

Santos

Priscila P. dos

¹ ²

0000-0001-8825-6980

Rafacho

Bruna P. M.

¹ Gonçalves

Andrea F.

¹ Pires

Vanessa C. M.

0000-0003-1463-551X

Roscani

Meliza G.

¹ Azevedo

Paula S.

0000-0002-2875-9532

Polegato

Bertha F.

0000-0002-5980-4367

Minicucci

Marcos F.

¹ Fernandes

Ana Angélica H.

² Tanni

Suzana E.

0000-0002-9831-8820

Zornoff

Leonardo A. M.

0000-0003-4412-1990

Paiva

Sergio A. R. de

¹ ³ 1 UNESP Faculdade de Medicina de Botucatu

Botucatu

Brasil Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, Botucatu, SP - Brasil. 2 UNESP Instituto de Biociências de Botucatu

Botucatu

Brasil Instituto de Biociências de Botucatu-UNESP, Botucatu, SP - Brasil. 3 Centro de Pesquisa em Alimentos

São Paulo

Brasil Centro de Pesquisa em Alimentos, São Paulo, SP - Brasil.

Correspondência: Priscila Portugal dos Santos • Faculdade de Medicina de Botucatu, Rubião Júnior s/n. CEP 18618-970, Botucatu, SP - Brasil. E-mail: prilpolmed@yahoo.com.br, priscila.portugal@unesp.br

17 05 2021

05 2021

116 5 970 978 21 03 2019 14 04 2020 10 06 2020

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Resumo Fundamento:

A vitamina D (VD) tem um importante papel na função cardíaca. No entanto, a vitamina exerce uma curva “dose-resposta” bifásica na fisiopatologia cardiovascular e pode causar efeitos deletérios, mesmo em doses não tóxicas. A VD exerce suas funções celulares ligando-se ao seu receptor. Ainda, a expressão da proteína de interação com a tiorredoxina (TXNIP) é positivamente regulada pela VD. A TXNIP modula diferentes visa de sinalização celular que podem ser importantes para a remodelação cardíaca.

Objetivos:

Avaliar se a suplementação com VD leva à remodelação cardíaca, e se a TXNIP e a tiorredoxina (Trx) estão associadas com esse processo.

Métodos:

Duzentos e cinquenta ratos Wistar machos foram alocados em três grupos: controle (C, n=21), sem suplementação com VD; VD3 (n = 22) e VD10 (n=21), suplementados com 3,000 e 10,000 UI de VD/ kg de ração, respectivamente, por dois meses. Os grupos foram comparados por análise de variância (ANOVA) com um fator e teste post hoc de Holm-Sidak (variáveis com distribuição normal), ou pelo teste de Kruskal-Wallis e análise post-hoc de Dunn. O nível de significância para todos os testes foi de 5%.

Resultados:

A expressão de TXNIP foi mais alta e a atividade do Trx foi mais baixa no grupo VD10. Os animais que receberam suplementação com VD apresentaram aumento de hidroperóxido lipídico e diminuição de superóxido dismutase e glutationa peroxidase. A proteína Bcl-2 foi mais baixa no grupo VD10. Observou-se uma diminuição na β-oxidação de ácidos graxos, no ciclo do ácido tricarboxílico, na cadeia transportadora de elétrons, e um aumento na via glicolítica.

Conclusão:

A suplementação com VD levou à remodelação cardíaca e esse processo pode ser modulado por TXNIP e Trx, e consequentemente por estresse oxidativo.

Palavras-chave: Vitamina D Remodelação Ventricular Ratos Tiorredoxinas Estresse Oxidativo

Introdução

A Vitamina D (VD) é um composto lipossolúvel que sabidamente afeta órgãos-alvo clássicos, como ossos, intestinos e rins, e estimula o transporte de cálcio desses órgãos para o sangue.¹ No entanto, há evidências crescentes de que a VD afeta outros órgãos, incluindo o coração, e pode exercer um importante papel na função e no desenvolvimento cardíacos.²^,³

A prevalência da deficiência de VD aumentou nos últimos anos, tornando-se um problema de saúde pública em todo o mundo.⁴ Além disso, a deficiência de VD está associada a um risco aumentado de se desenvolver várias doenças crônicas, incluindo doenças cardiovasculares.⁵ Assim, pesquisadores têm recomendado aumento na exposição solar, fortificação de alimentos e suplementação de VD, tanto para pessoas em maior risco de hipovitaminose D como para a população geral.⁶^–⁹ No entanto, mais estudos com diferentes doses de suplementação de VD são urgentemente necessários,¹⁰^–¹² dado o número de estudos relatando efeitos cardiovasculares deletérios da VD em doses não tóxicas.¹⁰^,¹¹^,¹³^-¹⁵ Estudos com ratos urêmicos e ratos infartados suplementados com VD em doses que não induzem hipercalcemia (não hipercalcêmicas), desenvolveram hipertensão,¹³ alterações na aorta,¹³ hipertrofia ventricular esquerda,¹³^,¹⁴ disfunção cardíaca e alterações no metabolismo energético cardíaco.¹⁴ Além disso, estudo realizado com ratos normotensos mostrou que a suplementação de VD em doses não hipercalcêmicas levou ao aumento da pressão arterial e a alterações na estrutura e função vascular, mediados por geração de espécies reativas e alteração na biodisponibilidade de óxido nítrico.¹⁵ Esses dados indicam que a VD exerce uma curva “dose-resposta” bifásica na remodelação cardíaca.¹⁰

A remodelação cardíaca é causada por uma lesão no coração que pode levar a mudanças celulares, intersticiais e moleculares progressivas.¹⁶ As alterações celulares e moleculares incluem estresse oxidativo, apoptose, e mudança no metabolismo energético, que pode progredir para hipertrofia e disfunção ventricular.¹⁴

A VD exerce funções celulares ligando-se ao seu receptor e levando à regulação transcricional de genes alvos.¹⁷ Ainda, Chen e DeLuca¹⁸ identificaram um gene da proteína VDUP1 (VD3-up-regulated protein-1), estimulada pelo tratamento com 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) em células de linhagem promielocítica humana.¹⁸ Desde então, a VDUP1 tem sido identificada em vários tecidos, incluindo o coração.¹⁹

A proteína codificada pela VDUP1 é conhecida como proteína de interação com a tiorredoxina (TXNIP), e foi identificada como um regulador negativo da tiorredoxina (Trx). A TXNIP liga-se ao centro catalítico da Trx, formando um complexo estável por ligações dissulfeto, reduzindo sua atividade.²⁰ Isso causa um desequilíbrio antioxidante, uma vez que o sistema Trx é um importante sistema antioxidante redutor de tiol no coração.²¹^,²² De fato, estudos com células cancerosas mostraram que o tratamento com VD aumentou a produção de espécies reativas de oxigênio (EROS).²³^–²⁵

Estudos têm mostrado que tanto a Trx como a TXNIP modulam diversas vias por meio da interação direta com moléculas de sinalização intracelular. Essas proteínas participam na regulação de vias apoptóticas e hipertróficas, e modulam o metabolismo energético tanto em cardiomiócitos como em outros tipos celulares.²¹^,²²^,²⁶ Assim, a suplementação com VD em doses não hipercalcêmicas poderia levar a um desequilíbrio entre TXNIP e Trx no coração, resultando em remodelação cardíaca.

Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar se a suplementação com VD em doses não hipercalcêmicas leva à remodelação cardíaca, e se a TXNIP e a Trx estão associadas a esse processo.

Materiais e métodos Protocolo experimental

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais da Saúde (NIH, National Institutes of Health) para o uso e cuidado de animais em laboratório e aprovados pelo comitê de ética Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, São Paulo, Brasil (2008/694). Ratos machos de 250g foram alocados aleatoriamente em três grupos e alimentados com ração à base de cereal durante dois meses. Os grupos foram: 1) grupo controle (C, n=21), que não recebeu suplementação de VD [dieta baseada em cereal – Nuvilab CR1, com composição aproximada (por kg de mistura): 220g proteína; 40g gordura; 100g mineral; 80 g fibra; e 1,800 UI VD; 2) VD3 (n=22), suplementada com 3,000 UI VD/kg de ração; e 3) VD10 (n=21), suplementada com 10,000 UI de VD/kg de ração.

O tamanho amostral foi determinado com base em nossa experiência com modelos experimentais e análises. Também usamos esse tamanho amostral em um estudo prévio conduzido em nosso laboratório para avaliar a influência da suplementação com VD sobre a pressão arterial sistólica, reatividade vascular, e propriedades mecânicas.¹⁵ Os animais foram alocados aleatoriamente em caixas individuais. Subsequentemente, as caixas foram escolhidas aleatoriamente para compor os diferentes grupos.

Todos os animais receberam a mesma quantidade de alimentos. A suplementação de VD foi realizada adicionando-se colecalciferol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) diluído em óleo de milho à ração. Todos os grupos receberam 10mL de óelo de milho por quilo de ração.

O Conselho Nacional de Pesquisa (NRC, National Research Council) recomendou a quantidade de 1000 UI de VD por quilo de ração para os ratos.²⁷ Contudo, o conselho não estabeleceu um nível máximo de ingestão. Assim, nós utilizamos uma quantidade 10 vezes superior à dose diária recomendada como nosso limite máximo de ingestão. Shepard e DeLuca²⁸ demonstraram que ratos suplementados com doses acima de 1000 UI de VD/dia (~30000 UI/kg de ração) apresentaram sinais de toxicidade tais como diarreia, perda de apetite, diminuição no ganho de peso, e calcificação renal. As doses utilizadas em nosso estudo foram 4,8 e 11,8 vezes maior que as doses recomendadas para ratos e não chegaram a 1000 UI/dia. Ainda, em nosso estudo anterior,¹⁵ essas doses de VD não causaram sinais de toxicidade ou hipercalcemia. Assim, as doses usadas no presente estudo foram consideradas não tóxicas em termos de metabolismo do cálcio.

Estudo ecocardiográfico

Todos os animais foram avaliados por ecocardiografia transtorácica,²⁹ utilizando um equipamento disponível comercialmente (General Electric Medical Systems, Vivid S6, Tirat Carmel, Israel), equipado com um transdutor phased-array 5-12 MHz. Todas as medidas foram obtidas pelo mesmo observador de acordo com as recomendações da American Society of Echocardiography e da European Association of Echocardiography.³⁰

Após o exame ecocardiográfico, realizou-se eutanásia dos animais com injeção intraperitoneal de tiopental sódico em dose elevada (180 mg/Kg), e os animais foram sacrificados por decapitação. Foram coletados sangue e coração dos animais.

Avaliação de 25-hidroxivitamina D3 (25 (OH) D3) e cálcio<xref ref-type="bibr" rid="B31">31</xref>

Concentrações plasmáticas de 25 (OH) D₃ foram determinadas por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) conforme descrito por Asknes,³¹ com pequena modificação. O aparelho utilizado foi o cromatógrafo Waters 2695, com detector fotodiodo Waters 2996. A quantificação de 25 (OH) D₃ foi realizada determinando-se áreas de pico nos cromatogramas, calibrados por quantidades conhecidas dos padrões (H4014 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA).

Concentração sérica de cálcio foi determinada pelo método arsenazo III (kit Labor Lab, SP, Brasil).

Hidroperóxido lipídico cardíaco, enzima antioxidante e metabolismo cardíaco

Amostras do ventrículo esquerdo (200mg) foram usadas para as medidas das concentrações de proteína total e hidroperóxido lipídico (Hl) e para determinação da atividade da glutationa peroxidase (GPx), superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT).¹⁴ O metabolismo energético cardíaco foi avaliado pela atividade das enzimas 3-hidroxiacil CoA desidrogenase (HAD), fosfofrutoquinase, lactato desidrogenase (LDH), piruvato desidrogenase, citrato sintase (CS), complexo II (succinato desidrogenase) e ATP sintase. Os testes de atividade enzimática foram realizados a 20^oC com a absorbância medida por um espectrofotômetro Pharmacia Biotech (UV/visible Ultrospec 5000 com software Swift II Applications). Todos os reagentes foram adquiridos de Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA).

Western blot

Western blot foi realizado para avaliar a expressão de proteínas no ventrículo esquerdo. As amostras foram separadas em gel de poliacrilamida (SDS) a 10%, e as amostras transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi bloqueada com leite em pó desnatado 5% e incubada com anticorpo primário (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Europa): VDUP1 (IgG1 monoclonal de camundongo, sc271238); Trx-1 (IgG policlonal de coelho, sc20146); coativador 1-alfa do receptor gama ativado por proliferador de peroxissoma (PGC-1α – IgG polyclonal de coleho, sc13067); receptor ativado por proliferador de peroxissoma alfa (PPAR-α - rabbit polyclonal IgG, sc9000); Bcl-2 (IgG monoclonal de coelho, sc492); caspase 3 (IgG monoclonal de coelho - Cell Signaling Technology, Inc, Beverly, MA, EUA, 9664) e anticorpo secundário conjugado com peroxidase. O substrato quimioluminescente Super Signal® West Pico (Pierce Protein Research Products, Rockford, EUA) foi usado para detectar anticorpos ligados. GAPDH (IgG1 monoclonal de camundongo, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Europa, sc 32233) foi usado para normalização.

Teste de redução da insulina para Trx e Trx redutase (TrxR)

A atividade da Trx no coração foi determinada pelo teste de redução da insulina segundo método descrito por Yamamoto et al.,³² com pequena modificação. A atividade da TrxR foi determinada pelo ensaio de redução da insulina, segundo método descrito por Schutze et al.,³³ com pequena modificação.

Análise estatística

A normalidade dos dados foi verificada pelo teste de Kolmogorov–Smirnov. Para as variáveis com distribuição normal, os grupos foram comparados por análise de variância (ANOVA) com um fator, e análise post hoc de Holm-Sidak; os dados foram expressos em média ± desvio padrão (DP). Para as variáveis sem distribuição normal, os dados foram comparados pelo teste de Kruskal-Wallis e teste post-hoc de Dunn, e os dados foram expressos em mediana (e intervalos superiores e inferiores). As análises estatísticas foram realizadas usando o programa Sigma Stat para Windows v3.5 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA). Para avaliar a dose resposta da VD, utilizamos o teste de tendência – Trend test do software GraphPad – para as variáveis com distribuição normal, e a correlação de Spearman usada para as variáveis sem distribuição normal. O nível de significância estabelecido foi de 5% em todos os testes.

Resultados

Como observado na Tabela 1, a suplementação de VD foi efetiva, uma vez que a ingestão diária de colecalciferol foi diferente entre os três grupos, as concentrações de 25-hidroxicolecalciferol foram maiores no VD10 que em C, e o grupo VD3 apresentou um valor intermediário. Além disso, os animais que receberam ambas as doses de VD apresentaram um leve aumento nos níveis séricos de cálcio. No entanto, os grupos que receberam a suplementação de VD encontraram-se com níveis plasmáticos normais de cálcio. Essas variáveis mostraram uma resposta dose-dependente. O peso corporal e o consumo alimentar finais não foram diferentes entre os grupos e não apresentaram resposta dose-dependente.

Tabela 1 Peso corporal, vitamina D, consumo alimentar, cálcio sérico e 25-hidroxicolecalciferol plasmático nos grupos de animais suplementados com vitamina D e grupo controle

Variável	C	VD3	VD10	P1 Teste de comparação	P2 Teste de tendência
Peso corporal (g)	422±26,8 (21)	429±35,6 (22)	421±31,7 (21)	0,646	0,923
Consumo alimentar (g/dia)	25,7±1,54 (21)	25,9±1,91 (22)	24,9±1,98 (21)	0,166	0,154
Ingestão de VD (UI/dia)	45,5 (44,8-48,1) (21)	123 (118-128)* (22)	290 (283-310)*# (21)	<0,001	<0,001
25 (OH) D₃ (ng/mL)	14,6 (9,40-16,4) (7)	19,0 (17,2-32,4) (7)	35,6 (33,2-37,8)* (7)	0,007	<0,001
Ca (mg/dL)	8,25±1,10 (9)	9,32±1,15* (10)	9,44±0,54* (10)	0,023	0,011

Dados expressos em média ± DP ou mediana e percentis 25 e 75. Números em parênteses indicam o número de animais em cada grupo. C: grupo controle, sem suplementação de VD; VD3 e VD10: grupos que receberam suplementação com 3000 e 10000 UI vitamina D/kg de ração, respectivamente. VD: vitamina D; 25 (OH) D3: 25-hidroxicolecalciferol plasmático; Ca: cálcio sérico. P1: valor p para teste de ANOVA com um fator ou teste de Kruskal Wallis e Holm-Sidak ou teste post hoc de Dunn; P2: p valor para teste de tendência ou correlação de Spearman. Números em negrito representam os efeitos estatisticamente significativos

≠ grupo C;

≠ grupo VD3

Como observado nas Figuras 1A e lB e na Tabela 2, a suplementação com VD causou mudanças na TXNIP, atividade de Trx e proteína Trx, sem participação da TrxR. A expressão de TXNIP foi maior e a atividade da Trx menor no grupo VD10. Essas variáveis mostraram uma resposta dose-dependente. Ainda, observou-se uma redução na expressão de Trx de maneira dose-dependente.

Figura 1 Western blot. A: Esquerda: Western blots da proteína de interação com a tiorredoxina (TXNIP). Direita: densidade de banda da razão TXNIP/GAPDH (mediana); p= 0.002. B: Esquerda: Western blots da tiorredoxina (Trx). Direita: densidade de banda da razão Trx/GAPDH (mediana); p= 0,082. C: Esquerda: Western blots da proteína Bcl-2. Direita: densidade de banda da razão Bcl-2/GAPDH (mediana); p= 0,027. D: Esquerda: Western blots do coativador 1-alfa do receptor gama ativado por proliferador de peroxissoma (PGC-1α). Direita: densidade de banda da razão PGC-1α/GAPDH (mediana); p= 0,006. Número de animais: 11-12. C: grupo controle sem suplementação de VD; VD3: grupo suplementado com 3,000 UI VD/Kg de ração; VD10: suplementado com 10 000 UI VD/Kg de ração. Análise estatística: ANOVA com um fator. * ≠ grupo C; # ≠ grupo VD3. C+ animal controle para ajuste para a corrida em gel.

Tabela 2 Atividade enzimática da tiorredoxina (Trx) e da tiorredoxina redutase (TrxR) nos grupos de animais suplementados com vitamina D e grupo controle

Variáveis	C	VD3	VD10	P1 Teste de comparação	P2 Teste de tendência
Atividade da Trx (DO 340 nm x minuto)	0,251±0,08 (10)	0,226±0,06 (10)	0,115±0,07*# (10)	<0,001	<0,001
Atividade da TrxR (mU/mg proteína x minuto)	0,097 (0,096-0,098) (8)	0,097 (0,096-0,097) (9)	0,096 (0,085-0,098) (10)	0,383	0,117

Dados expressos em média ± DP ou mediana e percentis 25 e 75. Números em parênteses indicam o número de animais em cada grupo. C: grupo controle, sem suplementação de VD; VD3 e VD10: grupos que receberam suplementação com 3000 e 10000 UI vitamina D/kg de ração, respectivamente. Trx: atividade enzimática da tiorredoxina; DO: densidade ótica; TrxR: tiorredoxina redutase; P1: valor p para teste de ANOVA com um fator ou teste de Kruskal Wallis e Holm-Sidak ou teste post hoc de Dunn; P2: p valor para teste de tendência ou correlação de Spearman. Números em negrito representam os efeitos estatisticamente significativos

≠ grupo C;

≠ grupo VD3.

A Tabela 3 resume dados de estresse oxidativo e apoptose. Neste estudo, os animais que receberam suplementação com VD apresentaram aumento no estresse oxidativo, demonstrado por valores mais altos de peroxidação lipídica em VD10; além disso, observamos uma atividade mais baixa das enzimas antioxidantes. As atividades de SOD e GPx foram mais baixas nos animais que receberam suplementação de VD e a razão LH/(SOD+GPx+CAT) foi mais alta no grupo VD10. Para os dados de apoptose, a expressão de proteínas antiapoptóticas Bcl-2 foi mais baixa no VD10, com resposta dose-dependente (Figura 1C). O fator apoptótico caspase-3 clivado foi mais baixo no grupo VD3 que no grupo VD10 (Tabela 3).

Tabela 3 Variáveis do estresse oxidativo e apoptose nos grupos de animais suplementados com vitamina D e grupo controle

Variáveis	C	VD3	VD10	P1 Teste de comparação	P2 Teste de tendência
LH (nmol/g tecido)	143,8±13,9 (8)	134,1±20,1 (8)	179,6±11,8*# (8)	<0,001	<0,001
SOD (nmol/mg proteína)	19,9 (18,6-24,5) (8)	13,0 (11,8-14,0)* (8)	13,0 (11,8-14,2)* (8)	<0,001	0,001
GPx (umol/g tecido)	40,4±6,2 (8)	31,5±4,6* (8)	29,7±3,1* (8)	<0,001	<0,001
CAT (μmol/g tecido)	120,9±15,5 (8)	124,6±11,1 (8)	110,9±15,8 (8)	0,165	0,178
LH/(SOD+GPx+CAT)	0,79±0,09 (8)	0,80±0,14 (8)	1,18±0,09*# (8)	<0,001	<0,001
Caspase-3 (unidade arbitrária)	1,01±0,49 (12)	0,84±0,48 (12)	1,54±0,56# (12)	0,023	0,060

Dados expressos em média ± DP ou mediana e percentis 25 e 75. Números em parênteses indicam o número de animais em cada grupo. C: grupo controle, sem suplementação de VD; VD3 e VD10: grupos que receberam suplementação com 3000 e 10000 UI vitamina D/kg de ração, respectivamente. SOD: superóxido dismutase; GPx: glutationa peroxidase; CAT: catalase; LH: hidroperóxido lipídico; Caspase-3: Caspase-3-clivada. P1: valor p para ANOVA com um fator e teste de Holm-Sidak ou análise post-hoc de Dunn; P2: valor p para teste de tendência ou correlação de Spearman. Números em negrito representam os efeitos significativos.

≠ grupo C;

≠ grupo VD3.

A Tabela 4 resume dados do metabolismo energético cardíaco. Em relação à β-oxidação de ácidos graxos, a expressão de PGC-1α (Figura 1D) e a atividade de HAD foram mais baixas no grupo VD10. Ambas as variáveis apresentaram uma resposta dose-dependente. Quanto à via glicolítica, a atividade das enzimas PFK e LDH foi mais elevada no grupo VD10. A enzima LDH e o complexo PDH apresentaram aumento de maneira dose-dependente. O ciclo do ácido tricarboxílico (CAT) foi avaliado pela atividade da enzima CS, e a cadeia transportadora de elétrons (CTE) avaliada pela atividade do complexo II e da atividade da ATP sintase. A atividade da CS e do complexo II foi mais baixa no grupo VD10. Ambas as enzimas apresentaram uma resposta dose-dependente. A atividade da ATP sintase variou entre os grupos, sendo maior no grupo VD3. Essas alterações indicam que os animais que receberam suplementação com VD apresentaram déficit na oxidação de ácidos graxos, no CAT e na CTE, com aumento na via glicolítica.

Tabela 4 Variáveis do metabolismo energético cardíaco nos grupos de animais suplementados com vitamina D e grupo controle

Variáveis	C	VD3	VD10	P1 Teste de comparação	P2 Teste de tendência
PPARα (unidade arbitrária)	1,06±0,40 (12)	0,87±0,44 (12)	0,95±0,50 (11)	0,593	0,562
HAD (nmol/mg proteína)	69,9±10,8 (8)	65,8±13,1 (8)	34,4±5,14*# (8)	<0,001	<0,001
PFK (nmol/g tecido)	131±23,6 (6)	123±34,8 (6)	170±36,4 (6)	0,048	0,053
LDH (nmol/mg proteína)	220±18,1 (8)	209±10,0 (8)	256±9,60*# (8)	<0,001	<0,001
PDH (nmol/g tecido)	317±57,9 (6)	337±42,9 (6)	382±41,6 (6)	0,088	0,034
CS (umol/g tecido)	39,7±3,22 (8)	40,4±2,75 (8)	34,5±4,02*# (8)	0,004	0,005
Complexo II (umol/mg tecido)	6,36±0,90 (6)	6,27±1,18 (6)	3,40±0,67*# (6)	<0,001	<0,001
ATP sintase (umol/mg tecido)	45,4±2,96 (6)	53,0±5,42 (6)	44,6±8,04 (6)	0,049	0,824

Dados expressos em média ±DP. Números em parênteses indicam o número de animais em cada grupo. C: grupo controle, sem suplementação de VD; VD3 e VD10: grupos que receberam suplementação com 3000 e 10000 UI vitamina D/kg de ração, respectivamente. PPARα: receptor ativado por proliferador de peroxissoma alfa; HAD: 3-hidroxiacil CoA desidrogenase; PFK: fosfofrutoquinase; LDH: lactato desidrogenase; PDH: piruvato desidrogenase; CS: citrato sintase; Complexo II: complexo II respiratório; ATP: adenosina trifosfato. P1: valor p para ANOVA com um fator e análise post-hoc de Holm-Sidak; P2: valor de p para o teste de tendência. Números em negrito representam os efeitos significativos.

≠ grupo C;

≠ grupo VD3.

Não foram observadas diferenças entre os três grupos em relação às variáveis estruturais ou na função sistólica e diastólica no ecocardiograma após dois meses de suplementação com VD. As variáveis ecocardiográficas encontram-se descritas no material suplementar (Tabela S1).

Discussão

O presente estudo mostrou que a suplementação com VD, em doses não hipercalcêmicas durante dois meses, associou-se com maior expressão de TNIP e menor atividade da Trx. Além disso, os animais apresentaram alterações moleculares compatíveis com o processo de remodelação cardíaca, tais como estresse oxidativo, redução dos marcadores antiapoptóticos, e mudanças no metabolismo cardíaco, sem alterações na estrutura ou função cardíaca. Alterações na expressão de TXNIP e Trx podem ser um dos mecanismos envolvidos na remodelação cardíaca em animais suplementados com VD.

Um estudo prévio mostrou que a 1,25(OH)₂D₃ aumenta a expressão de TXNIP.¹⁸ A TXNIP interage com a Trx e atua como um regulador negativo de Trx, diminuindo sua expressão e sua atividade.²⁰ Neste estudo, observamos que a suplementação com VD aumentou a expressão de TXNIP e reduziu a atividade de Trx. Ambas são importantes moléculas de sinalização, modulando várias funções celulares no coração, tal como o equilíbrio redox (por uma ação direta sobre EROS ou atuando sobre homeostase de proteínas e enzimas antioxidantes), apoptose e metabolismo energético.²¹^,²²^,³⁵ Em nosso estudo, observamos que todas essas funções celulares foram afetadas pela suplementação com VD.

Em relação ao equilíbrio redox, observamos um aumento na peroxidação lipídica e diminuição na atividade das enzimas antioxidantes SOD e GPx. Essas alterações caracterizam o estresse oxidativo.³⁶ Uma diminuição nesses mecanismos antioxidantes pode induzir danos celulares graves, devido a desequilíbrios entre a produção e a remoção de radicais livres, como indicado pela razão LH/SOD+GPx+CAT no animais VD10.³⁷ O sistema SOD-CAT-GPx é considerado a primeira linha de defesa contra a formação de EROS.³⁶ Estudos in vitro (com células tumorais, adipócitos e células ósseas humanas) também mostraram um potencial papel pró-oxidante da VD. O tratamento com VD nessas células levou a mudanças no equilíbrio redox, como um aumento em EROS, e redução na SOD e glutationa.²⁴^,²⁵^,³⁸

A apoptose é o processo biológico pelo qual a morte celular programada ocorre, a partir da interação de fatores pró-inflamatórios e antiapoptóticos, tal como a proteína Bcl-2.³⁹ Neste estudo, mostramos uma menor expressão da Bcl-2 nos animais que receberam suplementação com VD, de maneira dose-dependente. Estudos com células tumorais também mostraram que o tratamento com VD levou ao aumento da apoptose,²⁴^,⁴⁰ e os mecanismos envolvidos foram redução de Bcl-2⁴¹ e maior estresse oxidativo.²⁴^,⁴⁰

As proteínas TXNIP e Trx participam na regulação de vias apoptóticas.²⁶ Em um estudo in vitro realizado por Min et al.⁴² mostrou que a TXNIP diminui a expressão do gene Bcl-2. Outro estudo, com células epiteliais humanas, mostrou que o tratamento com VD aumenta a atividade de TXNIP e diminui a atividade de Trx. Além disso, os autores observaram um aumento no estresse oxidativo, diminuição na expressão de Bcl-2 e ativação da apoptose.²⁶

Em nosso estudo, os animais suplementados com VD mostraram uma diminuição no fluxo de substratos oxidáveis para β-oxidação, CAT, e CTE. Por outro lado, os animais apresentaram um aumento na via glicolítica. Mudanças no metabolismo podem ser mediadas por dois importantes fatores de PGC-1α e PPAR α. O PGC-1α liga-se a PPARα e ao receptor do retinoide, formando um complexo que regula a transcrição de enzimas de β-oxidação e CTE, e inibe a oxidação do piruvato.⁴³ Neste estudo, a suplementação com VD causou redução da expressão de PGC-1α. Estudos mostraram que as proteínas TXNIP e Trx regulam vias do metabolismo energético,⁴⁴ por exemplo, modulando o PGC-1α.⁴⁵^,⁴⁶ Camundongos transgênicos com expressão aumentada de Trx no coração apresentaram elevada expressão de PGC-1α e melhora na função mitocondrial.⁴⁵^,⁴⁶

Nossos achados nos permitem supor que um dos mecanismos envolvidos nas alterações metabólicas e moleculares observadas nos animais suplementados com VD durante dois meses são as alterações no complmexo TXNIP/Trx.

Todas essas alterações metabólicas e moleculares precedem as alterações na estrutura e função do coração.⁴⁷ Os animais tratados com VD por dois meses não apresentaram mudanças na estrutura ou função cardíaca. Contudo, estudos com um período mais longo de suplementação são necessários para avaliar se a VD leva a essas alterações.

Para a maioria das alterações observadas em nosso estudo, a VD mostrou uma resposta dose-dependente, e a intensidade dessas mudanças foi maior na dose mais elevada da vitamina.

Limitações

No presente estudo, a suplementação com VD foi realizada durante dois meses, o que nos permitiu observar somente mudanças bioquímicas, celulares e moleculares. Estudos com períodos mais longos de suplementação poderiam mostrar mudanças na estrutura e função cardíaca, o que seria mais relevante clinicamente.

Conclusão

Em nosso estudo, a suplementação com VD em doses não hipercalcêmicas levou a um processo precoce de remodelação cardíaca. O possível mecanismo das alterações cardíacas pela suplementação de VD é via modulação de TXNIP e Trx, e consequente estresse oxidativo.

*Material suplementar

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Original Article

Vitamin D Supplementation Induces Cardiac Remodeling in Rats: Association with Thioredoxin-Interacting Protein and Thioredoxin

0000-0003-1159-5030

Santos

Priscila P. dos

¹ ²

0000-0001-8825-6980

Rafacho

Bruna P. M.

¹ Gonçalves

Andrea F.

¹ Pires

Vanessa C. M.

0000-0003-1463-551X

Roscani

Meliza G.

¹ Azevedo

Paula S.

0000-0002-2875-9532

Polegato

Bertha F.

0000-0002-5980-4367

Minicucci

Marcos F.

¹ Fernandes

Ana Angélica H.

² Tanni

Suzana E.

0000-0002-9831-8820

Zornoff

Leonardo A. M.

0000-0003-4412-1990

Paiva

Sergio A. R. de

¹ ³ 1

Botucatu

Brazil Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, Botucatu, SP - Brazil. 2

Botucatu

Brazil Instituto de Biociências de Botucatu-UNESP, Botucatu, SP - Brazil. 3

São Paulo

Brazil Centro de Pesquisa em Alimentos, São Paulo, SP - Brazil.

Mailing Address: Priscila Portugal dos Santos • Faculdade de Medicina de Botucatu, Rubião Júnior s/n. Postal Code 18618-970, Botucatu, SP - Brazil. E-mail: prilpolmed@yahoo.com.br, priscila.portugal@unesp.br

Author Contributions

Conception and design of the research: Santos PP, Azevedo PS, Polegato BF, Minicucci MF, Minamoto SE, Zornoff LAM, Paiva SAR; Acquisition of data: Santos PP, Rafacho BPM, Gonçalves AF, Pires VCM, Roscani MG, Polegato BF, Fernandes AAH; Analysis and interpretation of the data: Santos PP, Azevedo PS, Minicucci MF, Fernandes AAH, Zornoff LAM, Paiva SAR; Statistical analysis: Santos PP, Minamoto SE, Paiva SAR; Obtaining financing: Paiva SAR; Writing of the manuscript: Santos PP, Azevedo PS, Zornoff LAM, Paiva SAR; Critical revision of the manuscript for intellectual contente: Santos PP, Rafacho BPM, Gonçalves AF, Azevedo PS, Polegato BF, Minicucci MF, Fernandes AAH, Zornoff LAM, Paiva SAR.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Abstract Background:

Vitamin D (VD) has been shown to play an important role in cardiac function. However, this vitamin exerts a biphasic “dose response” curve in cardiovascular pathophysiology and may cause deleterious effects, even in non-toxic doses. VD exerts its cellular functions by binding to VD receptor. Additionally, it was identified that the thioredoxin-interacting protein (TXNIP) expression is positively regulated by VD. TXNIP modulate different cell signaling pathways that may be important for cardiac remodeling.

Objective:

To evaluate whether VD supplementation lead to cardiac remodeling and if TXNIP and thioredoxin (Trx) proteins are associated with the process.

Methods:

A total of 250 Male Wistar rats were allocated into three groups: control (C, n=21), with no VD supplementation; VD3 (n = 22) and VD10 (n=21), supplemented with 3,000 and 10,000 IU of VD/ kg of chow respectively, for two months. The groups were compared by one-way analysis of variance (ANOVA) and Holm-Sidak post hoc analysis, (variables with normal distribution), or by Kruskal-Wallis test and Dunn's test post hoc analysis. The significance level for all tests was 5%.

Results:

TXNIP protein expression was higher and Trx activity was lower in VD10. The animals supplemented with VD showed increased lipid hydroperoxide and decreased superoxide dismutase and glutathione peroxidase. The protein Bcl-2 was lower in VD10. There was a decrease in fatty acid β-oxidation, tricarboxylic acid cycle and electron transport chain with shift to increase in glycolytic pathway.

Conclusion:

VD supplementation led to cardiac remodeling and this process may be modulated by TXNIP and Trx proteins and consequently oxidative stress.

Keywords: Vitamin D Ventricular Remodeling Rats Thioredoxins Oxidative Stress

Introduction

Vitamin D (VD) is a fat-soluble compound known to affect classical target organs, like bones, intestines and kidneys, and stimulates calcium transport from these organs to the blood.¹ However, increasing evidence has shown that VD affects other organs including the heart and may play an important role in cardiac development and function.²^,³

The prevalence of VD deficiency has increased in recent years, becoming a public health problem worldwide.⁴ Furthermore, VD deficiency is associated with an increased risk of developing several chronic diseases including cardiovascular diseases.⁵ Therefore, researchers have recommended increased sun exposure, food fortification and VD supplementation, both for people at higher risk for hypovitaminosis D and for the general population.⁶^–⁹ However, further research with different doses of VD supplementation is urgently needed,¹⁰^–¹² due to increasing reports of deleterious cardiovascular effects of VD in non-toxic doses.¹⁰^,¹¹^,¹³^-¹⁵ Uremic rats and infarcted rats, both supplemented with VD at non-hypercalcemic dosages presented hypertension,¹³ changes in the aorta,¹³ left ventricular hypertrophy,¹³^,¹⁴ cardiac dysfunction, and changes in cardiac energy metabolism.¹⁴ Additionally, study with normotensive rats showed that VD supplementation at non-hypercalcemic doses led to increased blood pressure and changes in vascular structure and function, mediated by generation of reactive species and changes in nitric oxide bioavailability.¹⁵ These data indicate that VD exerts a biphasic “dose response” curve on cardiac remodeling.¹⁰

Cardiac remodeling is caused by an injury to the heart, which can lead to progressive cellular, interstitial, and molecular changes.¹⁶ The cellular and molecular alterations include oxidative stress, apoptosis, and cardiac energy metabolism change, which can progress to hypertrophy and ventricular dysfunction.¹⁴

VD exerts its cellular functions by binding to VD receptor and leading to transcriptional regulation of target genes.¹⁷ Additionally, Chen and DeLuca¹⁸ identified a VD3-up-regulated protein1 (VDUP1) gene that is up-regulated in the human HL-60 promyelocytic cell line by 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3) treatment.¹⁸ Since then, VDUP1 has been identified in various tissues, including the heart.¹⁹

The protein encoded by VDUP1 is known as thioredoxin-interacting protein (TXNIP) and was identified as a negative regulator of thioredoxin (Trx). TXNIP binds to the catalytic center of Trx forming a stable disulfide-linked complex, reducing its activity.²⁰ This causes an antioxidant imbalance, since the Trx system is an important antioxidant thiol reducing system in the heart.²¹^,²² Indeed, studies with cancer cell showed that VD treatment enhanced reactive oxygen species (ROS) production.²³^–²⁵

Studies have shown that both Trx as TXNIP modulate different pathways by direct interaction with intracellular signaling molecules. These proteins participate in the regulation of apoptotic and hypertrophic pathways and modulate energy metabolism in both cardiomyocytes and other cell types²¹^,²²^,²⁶. Therefore, VD supplementation at non-hypercalcemic doses could lead to an imbalance of TXNIP and Trx in the heart, resulting in cardiac remodeling.

Thus, the aim of the present study was to evaluate whether VD supplementation at non-hypercalcemic doses leads to cardiac remodeling and whether TXNIP and Trx proteins are associated with this process.

Materials and Methods Experimental protocol

All experiments were performed in accordance with the National Institutes of Health's Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals and were approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the Botucatu Medical School, UNESP, São Paulo, Brazil (2008/694). Male Wistar rats of 250 g were randomly allocated into three groups and fed a cereal-based chow for two months. The groups were: 1) control group (C, n=21), with no supplementation of VD (cereal-based diet -Nuvilab CR1, with the approximate composition [kg mixture]: protein, 220g; fat, 40g; mineral, 100g; fiber, 80g and VD, 1,800 IU); 2) VD3 (n=22), supplemented with 3,000 IU VD/kg of chow; and 3) VD10 (n=21), supplemented with 10,000 IU VD/kg of chow.

The sample size was determined based on our experience with experimental models used and analyzes; it was also used on a previous study carried out in our laboratory, to assess the influence of VD supplementation on systolic arterial pressure, vascular reactivity, and mechanical properties.¹⁵ The animals were randomly placed in individual boxes. Subsequently the boxes are chosen at random to compose the different groups.

All animals were fed the same amount of chow. VD supplementation was performed by adding cholecalciferol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) diluted with corn oil, to the chow. All animal groups received 10 mL of corn oil per kg of chow.

The National Research Council recommended the amount of 1,000 IU of VD per kg of chow for the rats.²⁷ However, the council has not established an upper intake level. Therefore, we used 10 times the recommended daily dose as our tolerable upper intake level. Shepard and DeLuca²⁸ showed that rats supplemented with doses above 1,000 IU of VD/day (~ 30,000 IU/kg of chow) presented toxicity signs such as diarrhea, loss of appetite, decrease in weight gain, and kidney calcification. The doses used in our study were 4.8 and 11.8 times higher than the recommended dose for rats and did not reach the 1,000 IU/day. Furthermore, in our previous study,¹⁵ these VD doses did not cause toxicity signs or hypercalcemia. Therefore, the doses used in the present study were considered non-toxic in terms of calcium metabolism.

Echocardiographic study

All animals were evaluated by transthoracic echocardiography,²⁹ using a commercially available echocardiographic machine (General Electric Medical Systems, Vivid S6, Tirat Carmel, Israel) equipped with a 5-12 MHz phased array transducer. All measurements were obtained by the same observer according to the American Society of Echocardiography and the European Association of Echocardiography's recommendations.³⁰

After the echocardiographic study, euthanasia of animals was performed with intraperitoneal injection of sodium thiopental at excessive dose (180 mg / kg), and the animals were decapitated. The blood and the hearts of animals were collected.

Assessment of 25-hydroxyvitamin D3 (25 (OH) D3) and calcium<xref ref-type="bibr" rid="B31">31</xref>

Plasma concentrations of 25 (OH) D₃ were measured by high performance liquid chromatography (HPLC) as described by Asknes³¹ with slight modification.³¹ The apparatus used was the Waters 2695 chromatograph with photodiode detector Waters 2996. 25 (OH/) D₃ was quantified by determining peak areas on high-performance liquid chromatograms, calibrated against known amounts of standards (H4014 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

Serum concentration of calcium was measured through arsenazo III method (test kit, Labor Lab, SP, Brazil).

Cardiac lipid hydroperoxide, antioxidant enzyme and cardiac energy metabolism

Left ventricular samples (200 mg) were used for the measurements of total protein and lipid hydroperoxide (LH) concentration and for determination of glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activity.¹⁴ Cardiac energy metabolism was assessed by 3-hydroxyacyl coenzyme-A dehydrogenase (HADH), phosphofructokinase, lactate dehydrogenase (LDH), pyruvate dehydrogenase, citrate synthase (CS), complex II (succinate dehydrogenase), and ATP synthase activities. The enzyme activity assays were performed at 25°C with the absorbance measured using a Pharmacia Biotech spectrophotometer (UV/visible Ultrospec 5000 with Swift II Applications software). All of the reagents were from Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

Western blot

Western blot was performed to analyze protein expression in the left ventricle. Samples were separated on 10% SDS-polyacrylamide gel and the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane. The membrane was blocked with 5% nonfat dry milk and incubated with primary antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Europa): VDUP1 (mouse monoclonal IgG1, sc271238); Trx-1 (rabbit polyclonal IgG, sc20146); peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1α - rabbit polyclonal IgG, sc13067); peroxisome proliferator-activated receptor-α (PPAR-α - rabbit polyclonal IgG, sc9000); Bcl-2 (rabbit monoclonal IgG, sc492); caspase 3 (rabbit monoclonal IgG - Cell Signaling Technology, Inc, Beverly, MA, USA, 9664), and secondary peroxidase-conjugated antibody. Super Signal® West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce Protein Research Products, Rockford, USA) was used to detect bound antibodies. GAPDH (mouse monoclonal IgG1, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Europe, sc 32233) was used for blot normalization.

Insulin reduction assay for Trx and thioredoxin reductase (TrxR)

The activity of Trx in the heart was determined by the insulin reduction assay, according to the method described by Yamamoto et al. 2003³² with slight modification. The activity of TrxR in the heart was determined by the insulin reduction assay, according to the method described by Schutze et al.³³ with slight modification.

Statistical analysis

The normality of the data was verified by Kolmogorov–Smirnov statistical test. The groups were compared by one-way analysis of variance (ANOVA) and Holm-Sidak post hoc analysis, for variables with normal distribution, and data are expressed as mean ± standard deviation (SD). Otherwise, the groups were compared using the Kruskal-Wallis test and Dunn's post hoc analysis and the data are expressed as medians (including the lower and upper quartiles). The statistical analyses were performed using Sigma Stat for Windows v3.5 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA). To assess the dose-response of VD, test for trend was used: Trend test of the statistical package GraphPad Prism software was used for variables with normal distribution; and the Spearman correlation used for variables without normal distribution.³⁴ The significance level for all tests was 5%.

Results

As shown in Table 1, VD supplementation was effective, since daily intake of cholecalciferol was different between the three groups, and 25-hydroxycholecalciferol concentrations were higher in VD10 than in C, and VD3 had an intermediary value. Additionally, the animals receiving both VD doses showed a slight increase in serum calcium level. However, the supplemented groups were in normocalcemic range. These variables showed a dose-dependent response. The final body weight and food consumption did not differ among groups and did not present a dose-dependent response.

Table 1 Body weight, vitamin D and food ingestion, serum calcium and plasma 25-hydroxycholecalciferol (OH) D3 in the groups of rats supplemented with vitamin D and control group

Variable	C	VD3	VD10	P1 Comparison test	P2 Trend test
Body weight (g)	422±26.8 (21)	429±35.6 (22)	421±31.7 (21)	0.646	0.923
Food ingestion (g/day)	25.7±1.54 (21)	25.9±1.91 (22)	24.9±1.98 (21)	0.166	0.154
VD ingestion (IU/day)	45.5 (44.8-48.1) (21)	123 (118-128)* (22)	290 (283-310)*# (21)	<0.001	<0.001
25 (OH) D₃ (ng/mL)	14.6 (9.40-16.4) (7)	19.0 (17.2-32.4) (7)	35.6 (33.2-37.8)* (7)	0.007	<0.001
Ca (mg/dL)	8.25±1.10 (9)	9.32±1.15* (10)	9.44±0.54* (10)	0.023	0.011

Data expressed as mean±SD or median with 25 and 75 percentiles. Numbers in parentheses indicate the numbers of animals in each group. C: control group, with no supplementation of VD; VD3 and VD10: supplemented with 3,000 and 10.000 IU VD/kg of chow, respectively; VD: vitamin D; 25 (OH) D3: plasma 25-hydroxycholecalciferol; Ca: serum calcium. P1: p value of 1-way ANOVA or Kruskal Wallis and Holm-Sidak or Dunn's test post hoc analysis; P2: p value of Trend test or Spearman correlation. Bold numbers represent the significant effects that were considered.

≠ C group;

≠ VD3 group.

As shown in Figures 1A and 1B and Table 2, VD supplementation changed were TXNIP, Trx activity and Trx protein, without TrxR participation. Protein expression of TXNIP was higher and Trx activity was lower in VD10. These variables showed a dose-dependent response. Additionally, there was a decrease in the protein expression of Trx in a dose-dependent manner.

Figure 1 Western blot. A: Left: representative western blots showing thioredoxin-interacting protein (TXNIP). Right: median TXNIP/GAPDH ratio band density; p= 0.002. B: Left: representative western blots showing thioredoxin (Trx). Right: median Trx/GAPDH ratio band density; p= 0.082. C: Left: representative western blots showing Bcl-2. Right: median Bcl-2/GAPDH ratio band density; p= 0.027. D: Left: representative western blots showing peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α (PGC-1α). Right: median PGC-1α/GAPDH ratio band density; p= 0.006. Number of animals: 11-12. C: control group, with no supplementation of VD; VD3: supplemented with 3,000 IU VD/Kg of chow; VD10: supplemented with 10,000 IU VD/kg of chow. Statistical analysis 1-way ANOVA. * C group; # ≠ VD3 group. C+ is a control animal for adjustment for gel running.

Table 2 Thioredoxin (Trx) and thioredoxin reductase (TrxR) enzymatic activity in the groups of rats supplemented with vitamin D and control group

Variables	C	VD3	VD10	P1 Comparison test	P2 Trend test
Trx activity (OD 340 nm x minute)	0.251±0.08 (10)	0.226±0.06 (10)	0.115±0.07*# (10)	<0.001	<0.001
TrxR activity (mU/mg protein x minute)	0.097 (0.096-0.098) (8)	0.097 (0.096-0.097) (9)	0.096 (0.085-0.098) (10)	0.383	0.117

Data expressed as mean ± SD or median with 25 and 75 percentiles. Numbers in parentheses indicate the numbers of animal in each group. C: control group, with no supplementation of VD; VD3 and VD10: supplemented with 3,000 and 10.000 IU VD/kg of chow. Trx activity: thioredoxin enzymatic activity; OD: optical density; TrxR: thioredoxin reductase. P1: p value of 1-way ANOVA or Kruskal Wallis and Holm-Sidak or Dunn's test post hoc analysis; P2: p value of Trend test or Spearman correlation. Bold numbers represent statistically significant effects.

≠ C group;

≠ VD3 group.

Table 3 summarizes the oxidative stress and apoptosis data. In this study, the animals supplemented with VD presented an increase in oxidative stress, shown by the higher lipid peroxidation values in the VD10; in addition, we observed a lower activity of antioxidant enzymes. SOD and GPx activity were lower in VD-supplemented animals and the LH/(SOD+GPx+CAT) ratio was higher in VD10. These alterations in variables showed a dose-dependent response. For apoptosis data, the expression of anti-apoptotic Bcl-2 protein was lower in VD10 and showed a dose-dependent response (Figure 1-C). The apoptotic factor, caspase-3-cleaved, was lower in VD3 than in VD10 (Table 3).

Table 3 Variables of oxidative stress and apoptosis in the groups of rats supplemented with vitamin D and control group

Variables	C	VD3	VD10	P1 Comparison test	P2 Trend test
LH (nmol/g tissue)	143.8±13.9 (8)	134.1±20.1 (8)	179.6±11.8*# (8)	<0.001	<0.001
SOD (nmol/mg protein)	19.9 (18.6-24.5) (8)	13.0 (11.8-14.0)* (8)	13.0 (11.8-14.2)* (8)	<0.001	0.001
GPx (umol/g tissue)	40.4±6.2 (8)	31.5±4.6* (8)	29.7±3.1* (8)	<0.001	<0.001
CAT (μmol/g tissue)	120.9±15.5 (8)	124.6±11.1 (8)	110.9±15.8 (8)	0.165	0.178
LH/(SOD+GPx+CAT)	0.79±0.09 (8)	0.80±0.14 (8)	1.18±0.09*# (8)	<0.001	<0.001
Caspase-3 (arbitrary unit)	1.01±0.49 (12)	0.84±0.48 (12)	1.54±0.56# (12)	0.023	0.060

Data expressed as mean±SD or median with 25 and 75 percentiles. Numbers in parentheses indicate the numbers of animals in each group. C: control group, with no supplementation of VD; VD3 and VD10: supplemented with 3,000 and 10.000 IU VD/Kg of chow, respectively. SOD: superoxide dismutase; GPx: gluthathione peroxidase; CAT: catalase; LH: lipid hydroperoxide; Caspase-3: Caspase-3-cleaved. P1: p value of 1-way ANOVA and Holm-Sidak or Dunn's test post hoc analysis; P2: p value of Trend test or Spearman correlation. Bold numbers represent statistically significant effects.

≠ C group;

≠ VD3 group.

Table 4 summarizes data of cardiac energy metabolism. In relation to fatty acids β-oxidation, protein expression of PGC-1α (Figure 1-D) and OHADH activity were lower in VD10. Both variables showed a dose-dependent response. The protein expression of PPARα did not differ among the groups and did not present a dose-dependent response. For the glycolytic pathway, the activity of PFK and LDH enzymes showed higher values in the VD10 group. The LDH enzyme and PDH complex showed an increase in a dose-dependent manner. The tricarboxylic acid cycle (TCA) was evaluated by the activity of CS, and the electron transport chain (ETC) was evaluated by the activity of complex II and ATP synthase activity. The activity of CS and complex II was lower in VD10. Both enzymes showed a dose-dependent response. The activity of ATP synthase differed between the groups, with higher values in the VD3 group. These alterations indicate that the animals supplemented with VD presented impairment in fatty acids oxidation, TCA, and ETC, with a shift to an increase in the glycolytic pathway.

Table 4 Variables of cardiac energy metabolism in the groups of rats supplemented with vitamin D and control group

Variable	C	VD3	VD10	P1 Comparison test	P2 Trend test
PPARα (arbitrary unit)	1.06±0.40 (12)	0.87±0.44 (12)	0.95±0.50 (11)	0.593	0.562
OHADH (nmol/mg protein)	69.9±10.8 (8)	65.8±13.1 (8)	34.4±5.14*# (8)	<0.001	<0.001
PFK (nmol/g tissue)	131±23.6 (6)	123±34.8 (6)	170±36.4 (6)	0.048	0.053
LDH (nmol/mg protein)	220±18.1 (8)	209±10.0 (8)	256±9.60*# (8)	<0.001	<0.001
PDH (nmol/g tissue)	317±57.9 (6)	337±42.9 (6)	382±41.6 (6)	0.088	0.034
CS (umol/g tissue)	39.7±3.22 (8)	40.4±2.75 (8)	34.5±4.02*# (8)	0.004	0.005
Complex II (umol/mg tissue)	6.36±0.90 (6)	6.27±1.18 (6)	3.40±0.67*# (6)	<0.001	<0.001
ATP synthase (umol/mg tissue)	45.4±2.96 (6)	53.0±5.42 (6)	44.6±8.04 (6)	0.049	0.824

Data expressed as mean ± SD. Numbers in parentheses indicate the number of animals in each group. C: control group, with no supplementation of VD; VD3 and VD10: supplemented with 3,000 and 10,000 IU vitamin D/kg of chow, respectively. PPARα: peroxisome proliferator-activated receptor α; OHADH: 3-hydroxyacyl coenzyme-A dehydrogenase; PFK: phosphofructokinase; LDH: lactate dehydrogenase; PDH: pyruvate dehydrogenase; CS: citrate synthase; Complex II: respiratory complex II; ATP: adenosine triphosphate. P1: p value of 1-way ANOVA and Holm-Sidak post hoc analysis; P2: p value of Trend test. Bold numbers represent statistically significant effects.

≠ C group;

≠ VD3 group

No differences were observed between the three groups in relation to structural variables, or in systolic and diastolic function by echocardiogram after two months of VD supplementation. Echocardiographic variables are provided in the supplementary material (Table S1).

Discussion

This study showed that VD supplementation, in non-hypercalcemic doses, for two months in normal rats was associated with higher expression of TXNIP and lower Trx activity. In addition, the animals presented molecular alterations compatible with the cardiac remodeling process, such as oxidative stress, decreased anti-apoptotic markers, and alterations in cardiac energy metabolism, without changes in cardiac structure and function. Changes in the expression of TXNIP and Trx may be one of the mechanisms involved in the cardiac remodeling in animals supplemented with VD.

A previous study showed that 1,25(OH)₂D₃ upregulates the expression of TXNIP.¹⁸ TXNIP interacts with Trx and acts as a negative regulator of Trx, by decreasing its expression and its activity.²⁰ In this study, we observed that VD supplementation led to higher expression of TXNIP and lower activity of Trx. TXNIP and Trx are important signaling molecules, thereby modulating various cellular functions in the heart such as the redox balance (by a direct action on ROS or acting on homeostasis of proteins and antioxidant enzymes), apoptosis and energy metabolism.²¹^,²²^,³⁵ In our study, we observed that all these cellular functions were affected by VD supplementation.

In relation to redox balance, we observed an increase in lipid peroxidation and decrease in the activity of antioxidant enzymes: SOD and GPx. These alterations characterize oxidative stress.³⁶ A decrease in these antioxidant mechanisms can induce severe cell damages due to imbalances between the production and the removal of free radicals, as indicated by the LH/SOD+GPx+CAT ratio in VD10 animals.³⁷ The SOD-CAT-GPx system is considered the first line of defense against oxyradical formation.³⁶ Studies in vitro (with tumor cells, adipocytes, and human bone cells) have also shown a potential prooxidant role of VD. Treatment with VD in these cells led to changes in redox balance, such as an increase in ROS, and SOD and glutathione reduction.²⁴^,²⁵^,³⁸

Apoptosis is the biological process by which programmed cell death occurs, requiring the interaction of pro- and anti-apoptotic factors, such as the Bcl-2 protein.³⁹ In this study, we showed lower expression of Bcl-2 in animals supplemented with VD, in a dose-dependent manner. Studies with tumor cells also showed that VD treatment led to increased apoptosis,²⁴^,⁴⁰ and the mechanisms involved are decreased Bcl-2⁴¹ and increased oxidative stress.²⁴^,⁴⁰

TXNIP and Trx proteins have been shown to participate in the regulation of apoptosis pathways.²⁶ An in vitro study performed by Min et al.⁴² showed that TXNIP down-regulates Bcl-2 gene expression. Another study, with human epithelial cells, showed that treatment with VD increases TXNIP and decreases Trx activity. In addition, the authors observed increased in oxidative stress, decreased Bcl-2 expression and apoptosis activation.²⁶

In our study, the animals supplemented with VD showed a decrease in the flow of oxidizable substrates for β-oxidation, TCA, and ETC. On the other hand, the animals presented an increase in the glycolytic pathway. Changes in metabolism may be mediated by two important transcription factors, PGC-1α and PPAR α. PGC-1α binds to PPARα and retinoid receptor, forming a complex that regulates the transcription of enzymes of fatty acids β-oxidation and ETC, and inhibits pyruvate oxidation.⁴³ In this study, VD supplementation led to lower PGC-1α expression. Studies have shown that TXNIP and Trx proteins regulate energy metabolism pathways,⁴⁴ for example, modulating the PGC-1α.⁴⁵^,⁴⁶ Transgenic mice that overexpress Trx in the heart presented increased expression of PGC-1α and improvement of mitochondrial function.⁴⁵^,⁴⁶

Our findings allow us to suppose that one of the mechanisms involved in metabolic and molecular alterations observed in animals supplemented with VD for two months are changes in the TXNIP/Trx complex.

All these metabolic and molecular changes precede the changes in the structure and function of the heart.⁴⁷ The animals supplemented with VD for two months showed no changes in cardiac structure and function. However, studies with prolonged supplementation are necessary to assess whether VD can lead to such changes.

For most of the changes observed in our study, VD showed a dose-dependent response, and the intensity of these changes increased at the highest dose of VD.

Limitations

VD supplementation in this study was carried out for two months, which allowed us to observe only biochemical, cellular, and molecular changes. Studies with longer supplementation periods could show changes in cardiac structure and function, which is clinically more relevant.

Conclusion

In conclusion, in our study, VD supplementation in non-hypercalcemic doses lead to early process of cardiac remodeling. The possible mechanism of cardiac changes by VD supplementation is by TXNIP and Trx modulation and consequently oxidative stress.

Sources of Funding

This study was partially funded by FAPESP and CAPES.

Study Association

This article is part of the thesis doctoral submitted by Priscila Portugal dos Santos from Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP.

*Supplemental Materials

For additional information, please click here.