Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC pqd8PD3r7WJCbWyNbGLBVtG S0066-782X2021000500844 abc.20200062 10.36660/abc.20200062 Comunicação Breve Pacientes Naïve Infectados por HIV Apresentam Disfunção Concomitante com Diminuição de Anticorpos Naturais contra Autoantígenos Derivados da Apolipoproteína B Definidos 0000-0001-8360-8465 Fonseca Henrique Andrade R. 1 2 Gidlund Magnus 2 Sant’Anna Viviane Rodrigues 1 2 Fernandes Esteferson Rodrigues 1 2 0000-0002-9911-4598 Fonseca Francisco A. H. 1 0000-0002-5738-2623 Izar Maria Cristina 1 Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina São Paulo SP Brasil Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina, São Paulo, SP - Brasil Universidade de Sao Paulo São Paulo SP Brasil Universidade de Sao Paulo, São Paulo, SP - Brasil Correspondência: Henrique Andrade Fonseca • Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina - Rua Loefgreen, 1350. CEP 04023-062, Vila Clementino, São Paulo, SP - Brasil E-mail: har.fonseca@yahoo.com.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Fonseca HA, Gidlund M, Fonseca FAH, Izar MC; Obtenção de dados: Fonseca HA, Fernandes ER; Análise e interpretação dos dados: Fonseca HA, Gidlund M, Sant’Anna VR, Fernandes ER; Análise estatística: Fonseca HA, Sant’Anna VR; Obtenção de financiamento: Fonseca HA, Fonseca FAH; Redação do manuscrito: Fonseca HA, Gidlund M, Sant’Anna VR, Izar MC.

Potencial conflito de interesses

Os autores declaram não haver conflito de interesses pertinentes.

 16 04 2021 04 2021 116 4 844 849 26 01 2020 23 04 2020 16 06 2020 This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License Fundamento:

Fatores de risco definidos para HIV e tradicionais podem estar associados a um aumento de eventos cardiovasculares. Estudos recentes sugerem que a resposta imune humoral à LDL modificada pode estar associada ao processo de aterosclerose.

 Objetivos:

Avaliar a presença de anti-LDL oxidada e de peptídeos derivados da Apolipoproteína B no sangue, bem como sua associação à função endotelial na infecção por HIV.

 Métodos:

Este estudo incluiu consecutivamente sujeitos com idade, sexo e dados demográficos correspondentes em dois grupos: (1) indivíduos infectados com HIV e naïve para terapia antiviral e (2) indivíduos não infectados. A aterosclerose subclínica foi avaliada pela espessura íntima-média, utilizando-se a ultrassonografia das artérias carótidas. A função endotelial foi determinada pela dilatação mediada por fluxo (DMF) da artéria braquial por ultrassonografia. Os níveis de autoanticorpos (IgM, IgG) de lipoproteínas de baixa densidade antioxidadas (LDL-ox), fragmentos de peptídeos antiapolipoproteína B (peptídeos ApoB-D e 0033G-Cys), e citocina foram avaliados por meio de ELISA.

 Resultados:

Os resultados deste estudo não mostraram diferenças na aterosclerose subclínica entre os grupos. Entretanto, os sujeitos infectados com HIV apresentaram uma DMF mais baixa, em comparação com os sujeitos não infectados. Portanto, os sujeitos infectados com HIV apresentaram níveis mais altos de citocinas inflamatórias, títulos de IgG anti-LDL-ox, e IgG anti-ApoB-D. Em contraste, títulos de IgM anti-ApoB-D foram mais baixos em indivíduos infectados com HIV e associados a funções endoteliais diminuídas.

 Conclusões:

Os resultados deste estudo mostram que a infecção por HIV, em sujeitos naïve, está associada à disfunção endotelial e à diminuição de anticorpos naturais para antígenos Apo-B.

 Introdução

Doenças cardiovasculares são mais prevalentes em indivíduos infectados por HIV, em comparação com indivíduos não infectados.1 A disfunção endotelial (DE) é o evento iniciador da formação de placas, associado à inflamação do espaço subendotelial causada pela oxidação da proteína de baixa densidade (LDL).2,3 A detecção de oxidação de LDL pode ser um marcador do processo e/ou do avanço da aterosclerose.4

Para superar alguns dos obstáculos relacionados à falta de mais epítopos restritos do que os expressos em um processo de oxidação artificial (cobre, ferro e outros) para gerar a LDL oxidada (LDL-ox), foi determinada a resposta autoimune a peptídeos da Apolipoproteína B (ApoB) - derivada de uma partícula de LDL. Estudos anteriores demonstraram que anticorpos contra um peptídeo específico (ApoB-D) podem ser considerados um marcador de ativação inflamatória.5–7 Entretanto, não foi demonstrado que infecções crônicas podem modular os autoanticorpos (AAC) em autoantígenos, especialmente na condição de deficiência do sistema imune.

 Materiais e métodos Sujeitos

Este trabalho conduziu um estudo piloto caso-controle transversal que incluiu prospectivamente 40 sujeitos infectados por HIV, naïve para terapia antirretroviral altamente ativa (HAART, do inglês highly active antiretroviral therapy), de ambos os sexos. Cinquenta e três sujeitos não infectados com HIV (controle) foram recrutados nas mesmas comunidades, utilizando-se os mesmos anúncios e fatores de risco cardiovasculares. Depois de fazer a coleta de sangue e avaliações clínicas, os pacientes infectados com HIV que iniciaram a HAART aderiram à medicação prescrita.

 Lipídios e análise bioquímica

O colesterol total sérico, o colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C), e os triglicérides foram determinados enzimaticamente (Opera Bayer, Leverkusen, Alemanha), com o colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) estimado pela equação Friedewald quando os triglicérides eram <400 mg/dl.8 A glicose foi avaliada pelo método enzimático.

 Função endotelial e espessura íntima-média da carótida

Testes de ultrassom foram realizados para avaliar a aterosclerose subclínica por meio da espessura íntima-média da carótida (EIMC)9 e avaliação de vasorreatividade da dilatação mediada por fluxo (DMF) dependente do endotélio da artéria braquial.10

Brevemente, os pacientes tiveram que fazer jejum e não consumir nitratos e álcool, e não fazer uso de medicamentos vasoativos 24 horas antes dos exames. Depois de um repouso de 15-20 minutos, a artéria braquial da fossa antecubital direita foi visualizada, utilizando-se um transdutor linear com frequência de até 11 MHz, com monitoramento simultâneo por eletrocardiograma (ECG). As imagens foram obtidas pelo sistema de ultrassom HP SONOS 5500 (Hewlett Packard, Palo Alto, EUA). Quanto foi obtida a imagem ideal da artéria, o diâmetro do vaso de linha de base foi medido. Foi induzida a hiperemia reativa inflando-se o manguito até 200 mmHg, ou pelo menos 50 mmHg acima da PAS, no antebraço distal por 5 minutos e, em seguida, esvaziando-se o manguito. Imagens diastólicas finais foram obtidas no momento do surgimento do complexo QRS no ECG. Essas imagens foram capturadas na linha de base e um minuto após o esvaziamento da braçadeira. A mudança de porcentagem do diâmetro da linha de base até o valor detectado durante a hiperemia reativa foi calculada para determinar a DMF. As medidas de DMF e a EIMC foram avaliadas por um ultrassonografista experiente de maneira cega. As variabilidades de resultados do próprio sonógrafo e entre sonógrafos foram menores que 1% e 2%, respectivamente.

 Citocinas e células T CD4

As concentrações de citocina foram testadas utilizando-se kits ELISA disponíveis comercialmente. A carga viral plasmática e as contagens de células T CD4 foram determinadas para os sujeitos infectados com HIV. O nadir de células T CD4+ foi definido como o valor mais baixo registrado e confirmado em laboratório.

 Isolamento e síntese de autoantígeno

A partícula de LDL foi obtida do plasma total após a centrifugação (1.000 g; 4 °C; 15 min) e suplementada com benzamidina (2 mM), gentamicina (0,5%), cloranfenicol (0,25%), fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) (0,5 mM), e aprotinina (0,1 unidade/mL). Partículas de lipoproteína de baixa densidade (1,006<d<1,063 mg/mL) foram isoladas por ultracentrifugação sequencial (100.000 g; 4 °C), utilizando-se um rotor (70 Ti, ângulo fixo; Beckman Coulter, EUA) e uma ultracentrífuga (Hitachi, Japão). A partícula de LDL foi oxidada por cobre e utilizada como autoantígeno para avaliar os títulos de anticorpos.11 Os peptídeos de Apolipoproteína B (peptídeos ApoB) usados neste estudo foram compostos de dois fragmentos sintéticos: ApoB-D (ApoB-D, que é um fragmento de peptídeo ApoB com uma sequência de 22 aminoácidos derivados do domínio 3 da sequência da Apolipoproteína B na terceira porção conservada para digestões de tripsina),12 e o peptídeo-0033G-Cys (peptídeo-0033G-Cys, que é um fragmento de peptídeo com uma sequência de 21 aminoácidos derivados do domínio 3 da sequência da Apolipoproteína B na primeira porção conservada para digestão de tripsina).12

 Determinações de autoanticorpos

A quantificação da LDL-ox e dos autoanticorpos (AAC) derivados do peptídeo ApoB foi avaliada no plasma total por ELISA, conforme descrito anteriormente.13,14 Microplacas de 96 poços (Microplates 8096, Costar-EUA) foram cobertas com 10µg/mL do peptídeo ApoB-D ou 0033G-Cys em tampão carbonato/bicarbonato (0,1 mol/l; pH 9,6), que foi deixado em sensibilização durante a noite a 4ºC. Depois de três ciclos de lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) mais Polissorbato-20 (0,05%), a placa foi bloqueada com gelatina (3%; temperatura ambiente; 24 h). Amostras de plasma dos pacientes (50 μl/poço, 1:400 em tampão fosfatado, PBS, pH 7,4) foram acrescentadas às placas por 2 horas em temperatura ambiente. Em seguida, três ciclos adicionais de lavagem foram realizados, e foram acrescentados anticorpos conjugados com peroxidase horseradish de IgG secundário (anticorpo de cabra anti-IgG de humano, 0,1 µg/ml, KPL, Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, EUA) ou IgM (anticorpo de cabra anti-IgM de humano purificado, 10 µg/ml, KPL, Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, EUA), para avaliar os títulos de AAC de peptídeos anti-ApoB-D ou anti-0033G-Cys. Depois da incubação (1 hora), as placas foram lavadas (três ciclos), e foram acrescentados 3,3,5,5-tetrametilbenzidina (6,5% in dimetilsulfóxido; Sigma, St Louis, MO) e H2O2 (Sigma) diluídos em tampão fosfato-citrato (0,1mol/l; 250μl; pH 5,5) em temperatura ambiente, como enzima-substratos. A reação foi interrompida acrescentando-se H2SO4 (2mol/l). A densidade ótica (DO) das amostras foi medida em 450 nm. Títulos de autoanticorpos (AAC) foram expressos como índice de reatividade (IR), calculado como IR=(DOamostra–DOamostra em branco)/(DOIgG ou IgM–DOIgG ou IgM em branco) em que os anticorpos IgG ou IgM foram usados como controles. O coeficiente de variação intraensaios foi de 5,4% e o intraensaios foi de 2,0%.

Foram realizados títulos de AAC Anti-LDL-ox similares para o ensaio com peptídeo de Apolipoproteína B, utilizando-se, contudo, microplacas de noventa e seis poços cobertos com 7,5 μg/ml de LDL-ox.13 Os anticorpos totais foram determinados em plasma total pelo método ELISA.

As amostras foram executadas triplicadas e a variação entre os triplos não ultrapassou 5% da média.

 Ética

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional da Universidade Federal de São Paulo e da Universidade de São Paulo (FO. 99/2009), e todos os participantes assinaram termos de consentimento informado antes do início do protocolo.

 Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o pacote de software SPSS 17.0 (Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). As variáveis categóricas foram comparadas por meio do teste qui-quadrado de Pearson. A distribuição de normalidade foi avaliada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. As análises entre grupos foram testadas por teste t ou teste Mann-Whitney. A interação entre a função endotelial e outras variáveis foram testadas com os testes de Pearson ou Spearman. Variáveis cuja interação foi identificada como significativa foram testadas com análise de regressão linear múltipla stepwise, com a função endotelial como variável dependente. Foi usado um nível de significância de 5% para todos os testes.

 Resultados

Os parâmetros clínicos e demográficos são apresentados na Tabela 1. Não houve diferença de EIMC entre sujeitos infectados com HIV e não infectados. A função endotelial foi diminuída em sujeitos infectados com HIV (p=0,040). (Tabela 1).

Características dos sujeitos infectados com HIV naïve e não infectados
Variáveis Geral (93) HIV- (Controle) (53) HIV+ (Naïve) (40) p-valores
Parâmetros clínicos
Sexo (masculino/feminino) 63/30 32/21 31/9 0,110
Idade (anos) 32 (1,0) 32 (1,7) 32 (1,3) 0,746
Circunferência abdominal (cm) 88 (83-97) 89,5 (76,5-100) 97 (83-96) 0,668
Índice de Massa Corporal (kg/m²) 24,8 (23-28) 25,5 (21,5-28,5) 25,2 (23,5-28) 0,586
Fumantes (%) 11 6 5 0,951
Pressão sanguínea sistólica (mmHg) 120 (110-120) 120 (110-120) 120 (110-120) 0,631
Pressão sanguínea diastólica (mmHg) 80 (70-80) 80 (70-80) 80 (70-80) 0,441
Análise bioquímica
Colesterol total (mg/dL)z 165 (139-185) 166 (144-191) 150 (124-176) 0,028
LDL-c (mg/dL) 98 (69-115) 103 (77-119) 91 (66-113) 0,095
HDL-c (mg/dL) 46 (37-65) 47 (40-57) 36 (30-46) 0,008
Triglicérides (mg/dL) 91 (52-122) 88 (67-131) 113 (73-131) 0,285
Glicose (mg/dL) 90 (86-94) 90 (86-94) 92 (86-96) 0,425
Parâmetros de infecção por HIV
Tempo de infecção (anos) – – 3 (1-6) N.A
Contagem de células CD4 (células/µL) – – 447 (366-590) N.A
Nadir CD4 (células/µL) – – 402 (356-537) N.A
Carga viral de HIV (cópias de RNA/µL) – – 2623 (485-26225) N.A
Coinfecção por HBV 0 0 4 N.A
Coinfecção por HCV 0 0 3 N.A
Terapia em uso
Anti-hipertensivos (indivíduos, N) 4 3 1 N.A
Estatinas (indivíduos, N) 0 0 0 N.A
Drogas neurológicas (indivíduos, N) 3 2 1 N.A
Marcadores inflamatórios
hs-CRP (mg/L) 1,20 (0,30-1,92) 0,51 (0,20-1,87) 1,48 (0,82-3,30) 0,017
IFN-γ (pg/dL) 2,84 (0,90-6,85) 1,43 (0,87-4,10) 3,89 (1,30-8,85) 0,021
TNF-α (pg/dL) 6,66 (5,58-7,31) 6,02 (5,51-6,94) 6,90 (6,54-7,63) 0,020
IL-6 (pg/dL) 1,54 (1,37-1,80) 1,54 (1,36-1,63) 1,50 (1,37-1,95) 0,028
IL-8 (pg/dL) 3,13 (2,50-4,60) 2,80 (2,20-4,40) 3,65 (2,70-5,50) 0,050
IL-10 (pg/dL) 1,75 (0,39-1,97) 1,79 (0,80-1,98) 0,87 (0,36-1,94) 0,088
Anticorpos totais
Total sérico de IgG (IR) 1,33 (1,19-1,38) 1,34 (1,20-1,38) 1,33 (1,18-1,37) 0,877
Total sérico de IgM (IR) 0,69 (0,55-0,84) 0,67 (0,49-0,82) 0,3(0.58-0.86) 0,310
Aterosclerose subclínica
Espessura íntima-média (mm) 0,67 (0,57-0,68) 0,67 (0,56-0,68) 0,67 (0,57-0,68) 0,971
Função endotelial
Dilatação mediada por fluxo (%) 11,6 (1,4) 13,7 (2,4) 9,3 (1,2) 0,040

HBV: vírus da hepatite B; HCV: vírus da hepatite C; N.A: não se aplica; IR: índice de reatividade.

Como esperado, sujeitos infectados com HIV tinham níveis de marcador inflamatório significativamente mais altos do que indivíduos não infectados. Entretanto a citocina anti-inflamatória IL-10 não variou entre os grupos (Tabela 1).

Os títulos de AAC IgG e IgM totais séricos não variaram entre sujeitos infectados e não infectados com HIV (Tabela 1). A Figura 1 demonstrou que os títulos de AAC de IgG anti-LDL-ox eram mais altos em sujeitos infectados por HIV (p<0.001). Entretanto, os títulos de AAC de IgM anti-LDL-ox não variaram entre sujeitos infectados e não infectados com HIV. Os sujeitos infectados com HIV tiveram títulos mais altos de AAC de IgG anti-ApoB-D (p<0,001) e títulos mais baixos de IgM anti-ApoB-D em comparação com sujeitos não infectados (p=0,040). Nenhuma diferença foi encontrada entre os grupos em relação aos AAC de antipeptídeo-0033G-Cys.

Resposta humoral a LDL oxidada, peptídeo ApoB-D e peptídeo 0033 em pacientes infectados com HIV e controles não infectados. (A) Autoanticorpos (AAC) IgG anti-LDL-ox; (B) AAC IgM anti-LDL-ox; (C) AAC IgG peptídeo anti-ApoB-D; (D) AAC IgM anti-ApoB-D. (E) AAC IgG peptídeos anti-0033; (F) IgM peptídeos anti-0033. Diferenças significativas entre os grupos foram calculadas pelo teste de Mann-Whitney.

O presente estudo demonstrou que, em sujeitos infectados com HIV, a função endotelial foi associada aos títulos IgM anti-ApoB-D AAC [β=10,75; p=0,015] (Tabela 2). O modelo de regressão stepwise, incluindo fatores de risco cardiovascular tradicionais, marcadores relacionados ao HIV, e respostas imunes, mostrou que AAC IgM anti-ApoB-D estavam associados à função endotelial [β=7,28; p=0,002]. Não foram observadas associações entre IgG anti-ApoB-D e a função endotelial. Em relação à aterosclerose subclínica, as medidas de EIMC não foram associadas à resposta humoral para ambos os peptídeos.

Análise univariada ajustada de possíveis fatores de risco associados à função endotelial em sujeitos infectados com HIV
Variáveis
β p-valores
Idade (anos) -0,187 0,350
Circunferência abdominal -0,049 0,708
IgM peptídeo anti-ApoB-D 10,754 0,015
IgG peptídeo anti-ApoB-D 0,597 0,351
Nadir CD4 0,007 0,135
CD4 atual -0,010 0,126
Carga viral registrada 0,413 0,786
Tempo de infecção -0,215 0,718

O coeficiente β representa as alterações na porcentagem de dilatação mediada por fluxo nas variáveis preditoras. Foram feitos ajustes para hipertensão, tabagismo atual, e dislipidemia. IC: Intervalo de confiança.

 Discussão

O presente estudo mostrou que, em sujeitos infectados por HIV, naïve de terapia antirretroviral, uma função endotelial reduzida acompanha uma modulação distinta em AAC contra fragmentos de peptídeos ApoB, em comparação com sujeitos não infectados, independentemente dos títulos de AAC com totais séricos.

Dados relacionados a imunidade humoral de peptídeos ApoB sugerem que sua presença está associada ao avanço da doença aterosclerótica, como parte de uma resposta autoimune.5,14 Entretanto, esses AAC podem participar de eliminação de produtos pró-aterogênicos gerados a partir da oxidação de partículas LDL, e da modificação dos ApoB, desempenhando uma função dupla no processo de aterogênese.15,16

Este estudo também mostrou que AAC de IgM contra ApoB-D estavam associados à ED, corroborando com estudos anteriores.6,17 Nossos achados sugerem que há uma eliminação de autoantígenos ApoB por anticorpos naturais, sugerindo que eles possam estar envolvidos em reparos vasculares após um processo de lesão,18 entretanto, os efeitos da infecção por HIV da DMF podem ser atribuídos a um estágio distinto da doença e às diferentes terapias medicamentosas adotadas.19

Estudos de coorte e meta-análise demonstraram que a EIMC é mais alta em pacientes infectados com HIV, em comparação com não infectados.20 Acreditamos que o momento da infecção em nosso estudo não foi suficiente para promover modificações ateroscleróticas na carótida, detectadas por exame de ultrassom.

Os resultados do presente estudo sugerem que autoanticorpos para peptídeos definidos-ApoB podem ser um marcador de disfunção endotelial, ou mesmo de uma resposta inflamatória elevada, porém não de aterosclerose da carótida em pacientes infectados com HIV. Estudos clínicos coorte em pacientes submetidos a HAART merecem investigação adicional para confirmar esses resultados preliminares.

O desenho transversal e a falta de um grupo que estivesse recebendo tratamento antirretroviral para permitir comparações dos efeitos das drogas HAART na função endotelial e na aterosclerose subclínica são limitações. Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre os sexos, o que pode ser justificado pelo pequeno número de sujeitos incluído neste estudo. Estudos adicionais, incluindo um número maior de pacientes, são necessários para confirmar nossos achados em relação a sexo, infecção e função endotelial. Para fins de ajuste, os efeitos de fatores de risco cardiovascular diferentes e marcadores de infecção foram avaliados como uma possível explicação para a resposta imune natural observada, associada à função vascular.

 Conclusão

Os achados deste estudo sugerem que a imunidade natural a antígenos ApoB está associada à DE. Mais estudos prospectivos são necessários para a avaliação de parâmetros imunológicos de HIV em resposta autoimune e seus efeitos na função vascular.

Fontes de financiamento

O presente estudo não contou com fontes de financiamento externas.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

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Edição de Abril de 2021, vol. 116 (4), págs. 844-849

Na Comunicação Breve “Pacientes Naïve Infectados por HIV Apresentam Disfunção Concomitante com Diminuição de Anticorpos Naturais contra Autoantígenos Derivados da Apolipoproteína B Definidos”, com número de DOI: https://doi.org/10.36660/abc.20200062, publicado no periódico Arquivos Brasileiros de Cardiologia, 116(4):844-849, na página 844, corrigir o título do artigo em português “Pacientes Naïve Infectados por HIV Apresentam Disfunção Concomitante com Diminuição de Anticorpos Naturais contra Autoantígenos Derivados da Apolipoproteína B Definidos” para: “Os Pacientes Naïve Infectados pelo HIV Apresentam DisfunçãoEndotelialConcomitante com a Diminuição de Anticorpos Naturais contra Definidos Autoantígenos Derivados da Apolipoproteína B”.

 Brief Communication HIV-Infected Naïve Patients Exhibit Endothelial Dysfunction Concomitant with Decreased Natural Antibodies Against Defined Apolipoprotein B Autoantigens 0000-0001-8360-8465 Fonseca Henrique Andrade R. 1 2 Gidlund Magnus 2 Sant’Anna Viviane Rodrigues 1 2 Fernandes Esteferson Rodrigues 1 2 0000-0002-9911-4598 Fonseca Francisco A. H. 1 0000-0002-5738-2623 Izar Maria Cristina 1 São Paulo SP Brazil Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina, São Paulo, SP - Brazil São Paulo SP Brazil Universidade de Sao Paulo, São Paulo, SP - Brazil Mailing Address: Henrique Andrade Fonseca • Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina - Rua Loefgreen, 1350. Postal Code 04023-062, Vila Clementino, São Paulo, SP - Brazil E-mail: har.fonseca@yahoo.com.br

Author contributions

Conception and design of the research and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Fonseca HA, Gidlund M, Fonseca FAH, Izar MC; Data acquisition: Fonseca HA, Fernandes ER; Analysis and interpretation of the data: Fonseca HA, Gidlund M, Sant’Anna VR, Fernandes ER; Statistical analysis: Fonseca HA, Sant’Anna VR; Obtaining financing: Fonseca HA, Fonseca FAH; Writing of the manuscript: Fonseca HA, Gidlund M, Sant’Anna VR, Izar MC.

Potential Conflict of Interest

The authors report no conflict of interest concerning the materials and methods used in this study or the findings specified in this paper.

 Abstract Backgorund:

Traditional and HIV-defined risk factors may be associated with an increase in cardiovascular events. Recent studies have suggested that the humoral immune response to modified LDL may be associated with the process of atherosclerosis.

 Objectives:

To evaluate the presence of anti-oxLDL and apolipoprotein B-derived peptides in the blood, and their association with the endothelial function in HIV-infection.

 Methods:

This study consecutively included subjects matched for age, gender, and demographic data in two groups: (1) HIV-infected and naïve for antiviral therapy and (2) uninfected individuals. Subclinical atherosclerosis was assessed by intimal-media thickness, using ultrasonography of the carotid arteries. Endothelial function was determined by flow-mediated dilatation (FMD) of the brachial artery by ultrasonography. Autoantibodies (IgM, IgG) anti-oxidized low-density lipoprotein (oxLDL), anti-apolipoprotein B-peptide fragments (ApoB-D and 0033G-Cys peptides), and cytokine levels were evaluated by ELISA.

 Results:

This study's results showed no difference in subclinical atherosclerosis between groups; however, HIV-infected subjects showed a lower FMD, when compared to non-infected subjects. Therefore, HIV-infected subjects showed higher levels of inflammatory cytokines, titers of IgG anti-oxLDL, and IgG anti-ApoB-D. In contrast, titers of IgM anti-ApoB-D were lower in HIV-infected individuals and associated with reduced endothelial functions.

 Conclusions:

This study's results show that HIV infection, in naïve subjects, is associated with endothelial dysfunction and a decline of natural antibodies to apo-B antigens.

 Keywords: HIV Infection Atherosclerosis Endothelium Vascular Apolipoproteunes B, Carotid Arteries/ultrasonography

Cardiovascular disease is more prevalent in HIV-infected, as compared to non-infected, individuals.1 Endothelial dysfunction (ED) is the initiating event in plaque formation, associated with sub-endothelial space inflammation caused by low density lipoprotein (LDL) oxidation.2,3 Detection of LDL oxidation can be a marker of atherosclerosis processes and/or progression.4

To overcome some of the obstacles related to the lack of more restricted epitopes than those expressed in an artificial oxidation process (copper, iron, and others) to generate oxidized LDL (oxLDL), the autoimmune response to apolipoprotein B (apoB) peptides-derived from an LDL particle was determined. Previous studies showed that antibodies against a specific peptide (ApoB-D) can be considered a marker of inflammatory activation.5–7 However, it has not been shown that chronic infection can modulate the autoantibodies (Abs) into auto-antigens, especially in the immune system deficiency condition.

Materials and methods Subjects

This study conducted a cross-sectional, case-control, pilot study including prospectively 40 HIV-infected subjects, naïve for highly active antiretroviral therapy (HAART) for both genders. Fifty-three HIV non-infected subjects (control) were recruited from the same communities, using the same advertisements and cardiovascular risk factors. After blood collections and clinical evaluations, HIV-infected patients who began HAART therapy adhered to the prescribed medications.

 Lipids and biochemical analysis

Serum total cholesterol, high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), and triglycerides were determined enzymatically (Opera Bayer, Leverkusen, Germany) with low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), estimated by the Friedewald equation when triglycerides were <400 mg/dl.8 Glucose was evaluated by the enzymatic method.

 Endothelial function and carotid intima-media thickness

Ultrasound tests were performed to evaluate the subclinical atherosclerosis by carotid intimal medial-thickness (cIMT)9 and vasoreactivity assessment of endothelial-dependent flow-mediated dilation (FMD) of the brachial artery.10

Briefly, patients were required to fast and abstain from nitrates, alcohol, and vasoactive medications for 24 h prior to the tests. After a 15-20 min rest, the brachial artery in the right antecubital fossa was viewed, using a linear transducer with a frequency of up to 11 MHz, together with simultaneous monitoring by means of an electrocardiogram (ECG). Images were obtained by HP SONOS 5500 ultrasound system (Hewlett Packard, Palo Alto, USA). Once the optimal image of the artery was achieved, the baseline vessel diameter was measured. Reactive hyperemia was induced by inflating the blood pressure cuff to 200 mmHg, or at least 50 mmHg above SBP, on the distal forearm for 5 min and then deflating the cuff. End-diastolic images were obtained at the time of onset of the QRS complex on ECG. These images were acquired at baseline and one min after cuff deflation. The percentage change from the baseline diameter to the value detected during reactive hyperemia was calculated to determine the FMD. The FMD and cIMT measurements were evaluated by an experienced sonographer in a blinded fashion. The intra-sonographer and inter-sonographer variability were less than 1% and 2%, respectively.

 Cytokines and CD4 T-cells

Cytokine concentrations were tested using commercially available ELISA kits. Plasma viral load and CD4 T-cell counts were determined for HIV-infected subjects. The nadir CD4+ T-cell count was defined as the lowest registered and laboratory-confirmed value.

 Autoantigen isolation and synthesis

The LDL particle was obtained from total plasma after centrifugation (1,000 g; 4 °C; 15 min) and supplemented with benzamidine (2 mM), gentamicin (0.5%), chloramphenicol (0.25%), phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) (0.5 mM), and aprotinin (0.1 unit/mL). Low-density lipoprotein particles (1.006<d<1.063 mg/mL) were isolated by sequential ultracentrifugation (100,000 g; 4 °C), using a rotor (70 Ti, fixe angle; Beckman Coulter, USA) and an ultracentrifuge (Hitachi, Japan). The LDL particle was copper-oxidized and used as an autoantigen to evaluate autoantibodies titers.11 The apolipoprotein B-peptides (apoB-peptides) used in this study consisted of two synthetic fragments: ApoB-D (ApoB-D, which is an ApoB-peptide fragment with a 22-amino-acid sequence derivate of domain 3 of the apolipoprotein B sequence in the third conserved portion for tripsin digestions)12 and peptide-0033G-Cys (peptide-0033G-Cys, which is a peptide fragment with a 21-amino-acid derivate of domain 3 of the apolipoprotein B sequence in the first conserved portion for trypsin digestion).12

 Determinations of autoantibodies

The quantification of oxLDL and apoB-peptide derivate autoantibodies (Abs) was assessed in total plasma by ELISA, as previously described.13,14 Ninety-six-well microtiter plates (Microplates 8096, Costar-USA) were coated with 10µg/mL of the ApoB-D or 0033G-Cys peptide in carbonate/bicarbonate buffer (0.1 mol/l; pH 9.6), which was left for sensitization overnight at 4ºC. After three cycles of washing with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) plus Tween-20 (0.05%), the plate was blocked with gelatin (3%; room temperature; 24 h). Patients’ plasma samples (50 μl/well, 1:400 in phosphate buffer, PBS, pH 7.4) were added to the plates for 2 hours at room temperature. Next, three more cycles of washing were performed, and secondary IgG horseradish peroxidase-conjugated antibodies (purified goat anti-human IgG, 0.1 µg/ml, KPL, Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, USA) or IgM (purified goat anti-human IgM, 10 µg/ml KPL, Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, USA) were added to evaluate the titers of anti-ApoB-D or anti-0033G-Cys peptide Abs. After incubation (1 hour), the plaques were washed (three cycles), and 3,3,5,5-tetramethylbenzidine (6.5% in dimethyl sulfoxide; Sigma, St Louis, MO) and H2O2 (Sigma) diluted in citrate/phosphate buffer (0.1mol/l; 250μl; pH 5.5) were added (room temperature), as enzyme substrates. The reaction was stopped by adding H2SO4 (2mol/l). The optical density (OD) of samples was measured at 450 nm. Autoantibodies (Abs) titers were expressed as the reactivity index (RI), calculated as RI=(ODsample–ODsample blank)/(ODIgG or IgM–ODIgG or IgM blank) where the IgG or IgM antibodies were used as controls. The intra-assay coefficient of variation was 5.4% and the intra-assay was 2.0%.

Anti-oxLDL Abs titers were performed similarly to the apolipoprotein B peptide assay but using ninety-six-well microtiter plates coated with 7.5 μg/ml of oxLDL.13 The total antibodies were determined in total plasma by the ELISA method.

Samples were run in triplicate and the variation within the triplicates did not exceed 5% of the mean.

 Ethics

The study was approved by the institutional ethics committee of the Federal University of São Paulo and University of São Paulo (FO. 99/2009), and written informed consent was obtained from all participants prior to beginning the protocol.

 Statistical analysis

Statistical analyses were performed using the SPSS 17.0 software package (Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Categorical variables were compared by Pearson's chi-square test. Distribution of normality was assessed by the Kolmogorov-Smirnov test. Between group analyses were tested by a t test or Mann-Whitney test. Interaction between endothelial function and other variables were tested by Pearson or Spearman tests. Variables identified to have significant interaction were tested with stepwise multiple linear regression analyses, with an endothelial function as a dependent variable. A significance level of 5% was used for all tests.

 Results

Clinical and demographic parameters are presented in Table 1. There were no differences in the cIMT among HIV-infected and non-infected subjects. The endothelial function was decreased in HIV-infected subjects (p=0.040). (Table 1).

Characteristics of the HIV naïve infected and uninfected subjects
Variables Overall (93) HIV- (Control) (53) HIV+ (Naïve) (40) p-values
Clinical parameters
Gender (males/females) 63/30 32/21 31/9 0.110
Age (years) 32 (1.0) 32 (1.7) 32 (1.3) 0.746
Abdominal circumference (cm) 88 (83-97) 89.5 (76.5-100) 97 (83-96) 0.668
Body mass index (kg/m²) 24.8 (23-28) 25.5 (21.5-28.5) 25.2 (23.5-28) 0.586
Smokers (%) 11 6 5 0.951
Systolic blood pressure (mmHg) 120 (110-120) 120 (110-120) 120 (110-120) 0.631
Diastolic blood pressure (mmHg) 80 (70-80) 80 (70-80) 80 (70-80) 0.441
Biochemical analysis
Total cholesterol (mg/dL) 165 (139-185) 166 (144-191) 150 (124-176) 0.028
LDL-c (mg/dL) 98 (69-115) 103 (77-119) 91 (66-113) 0.095
HDL-c (mg/dL) 46 (37-65) 47 (40-57) 36 (30-46) 0.008
Triglycerides (mg/dL) 91 (52-122) 88 (67-131) 113 (73-131) 0.285
Glucose (mg/dL) 90 (86-94) 90 (86-94) 92 (86-96) 0.425
HIV parameters of infection
Time of infection (years) − − 3 (1-6) N.A
CD4 count (cells/µL) − − 447 (366-590) N.A
CD4 nadir (cells/µL) − − 402 (356-537) N.A
HIV viral load (RNA copies/µL) − − 2623 (485-26225) N.A
HBV coinfection 0 0 4 N.A
HCV coinfection 0 0 3 N.A
Therapies in use
Antihypertensive (individuals, N) 4 3 1 N.A
Statins (individuals, N) 0 0 0 N.A
Neurological drugs (individuals, N) 3 2 1 N.A
Inflammatory markers
hs-CRP (mg/L) 1.20 (0.30-1.92) 0.51 (0.20-1.87) 1.48 (0.82-3.30) 0.017
IFN-γ (pg/dL) 2.84 (0.90-6.85) 1.43 (0.87-4.10) 3.89 (1.30-8.85) 0.021
TNF-α (pg/dL) 6.66 (5.58-7.31) 6.02 (5.51-6.94) 6.90 (6.54-7.63) 0.020
IL-6 (pg/dL) 1.54 (1.37-1.80) 1.54 (1.36-1.63) 1.50 (1.37-1.95) 0.028
IL-8 (pg/dL) 3.13 (2.50-4.60) 2.80 (2.20-4.40) 3.65 (2.70-5.50) 0.050
IL-10 (pg/dL) 1.75 (0.39-1.97) 1.79 (0.80-1.98) 0.87 (0.36-1.94) 0.088
Total antibodies
IgG total serum (RI) 1.33 (1.19-1.38) 1.34 (1.20-1.38) 1.33 (1.18-1.37) 0.877
IgM total serum (RI) 0.69 (0.55-0.84) 0.67 (0.49-0.82) 0.73(0.58-0.86) 0.310
Subclinical atherosclerosis
Intima-media Thickness (mm) 0.67 (0.57-0.68) 0.67 (0.56-0.68) 0.67 (0.57-0.68) 0.971
Endothelial function
Flow-mediated Dilatation (%) 11.6 (1.4) 13.7 (2.4) 9.3 (1.2) 0.040

HBV: hepatitis B virus; HCV: hepatitis C virus; N.A: not applicable; RI: reactivity index.

As expected, HIV-infected subjects had significantly higher inflammatory marker levels than did non-infected individuals; however, the anti-inflammatory cytokine IL-10 did not differ between the groups (Table 1).

Serum total IgG and IgM Abs titers did not differ among HIV-infected and uninfected subjects (Table 1). Figure 1 demonstrated that titers of IgG anti-oxLDL Abs were higher in HIV-infected subjects (p<0.001). However, the titers of IgM anti-oxLDL Abs did not differ among HIV-infected and uninfected subjects. HIV-infected subjects had higher titers of IgG anti-ApoB-D Abs (p<0.001) and lower titers of IgM anti-ApoB-D when compared to non-infected subjects (p=0.040). No differences were observed among groups for the anti-peptide-0033G-Cys Abs.

Humoral response to oxidized LDL, ApoB-D peptide and 0033-peptide in HIV-infected patients and non-infected controls. (A) IgG anti-oxLDL autoantibodies (Abs); (B) IgM anti-oxLDL Abs; (C) IgG anti-ApoB-D peptide Abs; (D) IgM anti-ApoB-D Abs. (E) IgG anti-0033-peptide Abs; (F) IgM anti-0033-peptide. Significant differences between groups were calculated by the Mann-Whitney test.

The present study showed that in HIV-infected subjects the endothelial function was associated with IgM anti-ApoB-D Abs titers [β=10.75; p=0.015] (Table 2). The stepwise regression model, including traditional cardiovascular risk factors, HIV-related markers, and immune responses showed that IgM anti-ApoB-D Abs were associated with the endothelial function [β=7.28; p=0.002]. Associations among IgG anti-ApoB-D and the endothelial function were not observed. Regarding subclinical atherosclerosis, the cIMT measures were not associated with the humoral response for both peptides.

Univariate adjusted analysis of potential risk factors associated with endothelial function in HIV-infected subjects
Variables
β p-values
Age (years) -0.187 0.350
Abdominal circumference -0.049 0.708
IgM anti-ApoB-D peptide 10.754 0.015
IgG anti-ApoB-D peptide 0.597 0.351
Nadir CD4 0.007 0.135
Current CD4 -0.010 0.126
Log viral load 0.413 0.786
Time of infection -0.215 0.718

β-coefficient represent the changes in the percentage of flow-mediated dilatation for the predictor variables. Adjustments were made for hypertension, current smoking, and dyslipidemia. CI: Confidence interval.

 Discussion

The present study showed that, in HIV-infected subjects, naïve of antiretroviral therapy, a reduced endothelial function accompanies distinct modulation in Abs against apoB-peptides fragments, as compared to non-infected subjects, regardless of serum total Abs titers.

Data related to humoral immunity and apoB peptides suggest that their presence is associated with atherosclerotic disease progression, as part of an autoimmune response.5,14 However, these Abs can participate in the clearance of pro-atherogenic products generated from the oxidation of LDL particles and the modification of apoB, performing a dual role in the atherogenesis process.15,16

This study also showed that IgM Abs against ApoB-D were associated with ED, corroborating with previous studies.6,17 Our findings suggest that there is a clearance of apoB autoantigens by natural antibodies, suggesting that they may be involved in vascular repair after an injury process,18 however the effects of HIV infection on FMD may be attributable to a distinct stage of disease and distinct drug therapies adopted.19

Cohort studies and meta-analysis showed that cIMT in HIV-infected, when compared to non-infected, subjects is higher.20 We believe the time of infection in our study was not enough to promote carotid atherosclerosis modification detected by an ultrasound exam.

The present study's results suggest that autoantibodies to defined-apoB peptides can be a marker of endothelial dysfunction, or even of an elevated inflammatory response, but not of carotid atherosclerosis in HIV-infected patients. Cohort and clinical trials with patients submitted to HARRT merit further investigation to confirm these preliminary results.

The cross-sectional design and the lack of a group receiving antiretroviral therapy for comparisons of the effects of HAART drugs on endothelial function and subclinical atherosclerosis are a limitation. No significant differences were found among sex groups, which may be justified by the small number of subjects included in this study. Additional studies, including a larger number of patients, are needed to confirm our findings related to sex, infection, and endothelial function. For adjustments, the effects of different cardiovascular risk factors and infection markers were evaluated as a possible explanation for the observed natural immune response associated with the vascular function.

 Conclusion

This study's findings suggest that natural immunity to apoB antigens is associated with ED. Further prospective studies for the evaluation of HIV immunological parameters in autoimmune response and these effects on vascular function are warranted.

Sources of Funding

There was no external funding source for this study.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation.

April 2021 Issue, vol. 116 (4), págs. 844-849

In Brief Communication “Pacientes Naïve Infectados por HIV Apresentam Disfunção Concomitante com Diminuição de Anticorpos Naturais contra Autoantígenos Derivados da Apolipoproteína B Definidos”, with DOI number: https://doi.org/10.36660/abc.20200062, published in the Journal Arquivos Brasileiros de Cardiologia, on page 844, correct the title of the article in Portuguese “Pacientes Naïve Infectados por HIV Apresentam Disfunção Concomitante com Diminuição de Anticorpos Naturais contra Autoantígenos Derivados da Apolipoproteína B Definidos” to: “Os Pacientes Naïve Infectados pelo HIV Apresentam Disfunção Endotelial Concomitante com a Diminuição de Anticorpos Naturais contra Definidos Autoantígenos Derivados da Apolipoproteína B”.