Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC 8ZN8sNgjrFBKYMDyjYjRbqL S0066-782X2021000500784 abc.20190813 10.36660/abc.20190813 Artigo Original Efeitos do Exercício Aeróbico Tardio na Remodelação Cardíaca de Ratos com Infarto do Miocárdio Pequeno 0000-0002-9726-3901 Souza Lidiane M. 1 0000-0001-7728-4505 Okoshi Marina P. 1 0000-0001-5613-1585 Gomes Mariana J. 1 0000-0002-3115-0795 Gatto Mariana 1 Rodrigues Eder A. 1 0000-0001-6344-5777 Pontes Thierres H. D. 1 Damatto Felipe C. 1 0000-0002-3275-3096 Oliveira Leiliane R. S. 1 Borim Patrícia Aparecida 1 0000-0002-3119-5723 Lima Aline R. R. 1 0000-0002-9831-8820 Zornoff Leonardo A. M. 1 0000-0001-8980-8839 Okoshi Katashi 1 0000-0003-1865-0207 Pagan Luana U. 1 Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Medicina de Botucatu Botucatu SP Brasil Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Botucatu, SP – Brasil. Correspondência: Luana U. Pagan • Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho Câmpus de Botucatu Faculdade de Medicina - Clinica médica - Av. Prof. Mário Rubens Guimarães, Montenegro, s/n. CEP 18618-687, Botucatu, SP – Brasil. E-mail: luanapagan@alunos.fmb.unesp.br

Contribuição dos Autores

Concepção e desenho da pesquisa: Souza LM, Okoshi MP, Gomes MJ, Gatto M, Rodrigues EA, Pontes THD, Damatto FC, Oliveira LRS, Borim PA, Lima ARR, Zornoff LAM, Okoshi K, Pagan LU; Obtenção de dados: Souza LM, Gomes MJ, Gatto M, Rodrigues EA, Pontes THD, Damatto FC, Oliveira LRS, Borim PA, Lima ARR, Pagan LU; Análise e interpretação dos dados e Análise estatística: Souza LM, Gomes MJ, Pagan LU; Obtenção de financiamento e Redação do manuscrito: Souza LM, Okoshi MP, Gomes MJ, Pagan LU; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Souza LM, Okoshi MP, Gomes MJ, Gatto M, Pagan LU.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 16 04 2021 04 2021 116 4 784 792 18 11 2019 26 02 2020 16 03 2020 This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License Resumo Fundamento:

O exercício físico tem sido considerado uma importante terapia não farmacológica para a prevenção e tratamento das doenças cardiovasculares. No entanto, seus efeitos na remodelação cardíaca leve não são claros.

 Objetivo:

Avaliar a influência do exercício aeróbico sobre a capacidade funcional, estrutura cardíaca, função ventricular esquerda (VE) e expressão gênica das subunidades da NADPH oxidase em ratos com infarto do miocárdio pequeno (IM).

 Métodos:

Três meses após a indução do IM, ratos Wistar foram divididos em três grupos: Sham; IM sedentário (IM-SED); e IM exercício aeróbico (IM-EA). Os ratos se exercitaram em uma esteira três vezes por semana durante 12 semanas. Um ecocardiograma foi realizado antes e após o treinamento. O tamanho do infarto foi avaliado por histologia e a expressão gênica por RT-PCR. O nível de significância para análise estatística foi estabelecido em 5%.

 Resultados:

Ratos com IM menor que 30% da área total do VE foram incluídos no estudo. A capacidade funcional foi maior no IM-EA do que nos ratos Sham e IM-SED. O tamanho do infarto não diferiu entre os grupos. Ratos infartados apresentaram aumento do diâmetro diastólico e sistólico do VE, diâmetro do átrio esquerdo e massa do VE, com disfunção sistólica. A espessura relativa da parede foi menor no grupo IM-SED do que nos grupos IM-EA e Sham. A expressão gênica das subunidades NADPH oxidase NOX2, NOX4, p22phox e p47phox não diferiu entre os grupos.

 Conclusão:

Infarto do miocárdio pequeno altera a estrutura cardíaca e a função sistólica do VE. O exercício aeróbico tardio pode melhorar a capacidade funcional e a remodelação cardíaca por meio da preservação da geometria ventricular esquerda. A expressão gênica das subunidades da NADPH oxidase não está envolvida na remodelação cardíaca, nem é modulada pelo exercício aeróbico em ratos com infarto do miocárdio pequeno.

 Palavras-chave: Exercício Atividade Física Disfunção Ventricular Infarto do Miocárdio Ratos Remodelação Ventricular Ecocardiografia/métodos NADPH Oxidase CNPq 308557/2018-2 310876/2018-4 FAPESP 2014/21972-3 2014/00747-1 CAPES 88882.432904/2019-01 153424/2018-4 O presente estudo foi financiado pelo CNPq (Proc. n. 308557/2018-2 e 310876/2018-4); FAPESP (Proc. n. 2014/21972-3 e 2014/00747-1); CAPES (Proc. n. 88882.432904/2019-01 e 153424/2018-4) e PROPe, UNESP. Introdução

Doenças cardiovasculares estão entre as principais causas de mortes no mundo, sendo o infarto do miocárdio (MI), a principal causa de morbidade e mortalidade.1

O IM agudo leva à remodelação cardíaca, definida como anormalidades na expressão do genoma resultando em mudanças moleculares, celulares e intersticiais que se manifestam clinicamente como alterações no tamanho, forma e função do coração.2 O estresse oxidativo, caracterizado por desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio e sistemas antioxidantes, é frequentemente observado na remodelação cardíaca.3 O complexo nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase, uma importante fonte de produção de espécies reativas celulares de oxigênio,4 costuma aumentar após o IM.5

Nas últimas décadas, o exercício físico emergiu como uma importante terapia não farmacológica para prevenir e tratar várias doenças cardiovasculares.6 O exercício aeróbico tem sido o foco de muitos estudos sobre a atenuação da remodelação cardíaca induzida por IM, melhora da capacidade funcional e qualidade de vida.7–10

Modelos animais de IM são amplamente usados para estudar a fisiopatologia e o tratamento da remodelação cardíaca. A maioria dos estudos que avaliam os efeitos do exercício nas alterações cardíacas pós-infarto do miocárdio utilizou roedores com grandes áreas de infarto, geralmente mais de 30% da área total do ventrículo esquerdo (VE).8,11–14 No entanto, ainda não está claro se o exercício aeróbico é útil para atenuar as alterações cardíacas após infarto do VE de tamanho menor. Neste estudo, objetivamos avaliar a influência do exercício físico aeróbico na capacidade funcional, estruturas cardíacas, função do VE e expressão do gene da subunidade NADPH oxidase em roedores com IM pequeno.

 Materiais e Métodos Animais experimentais

Ratos Wistar machos pesando 200-250 g foram adquiridos no Biotério Central da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP. Todos os animais foram mantidos em sala com temperatura controlada de 24 ± 2 °C e submetidos ao ciclo claro/escuro de 12 horas em gaiolas coletivas (três por gaiola). Comida e água foram fornecidas ad libitum.

Todos os experimentos e procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, SP, Brasil, que segue as diretrizes estabelecidas pelo Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicadas pelo US National Institutes of Health e pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (protocolo número 1237/2017).

O IM foi induzido ligando-se a artéria coronária descendente anterior esquerda por um método previamente descrito.3,14 Resumidamente, 60 ratos foram anestesiados com cetamina (60 mg/kg) e cloridrato de xilazina (1 mg/kg) e submetidos à toracotomia lateral esquerda. Após exteriorização do coração, o átrio esquerdo (AE) foi retraído para facilitar a ligadura da artéria coronária com fio de mononáilon 5-0 entre a via de saída do pulmão e o AE. O coração foi então recolocado no tórax, os pulmões inflados com pressão positiva e a toracotomia fechada. Quinze animais com operação simulada foram usados como controles.

Três meses depois, os ratos que sobreviveram foram submetidos a um ecocardiograma transtorácico e teste ergométrico e, então, divididos em três grupos: Sham (n=15); IM sedentário (IM-SED, n=22) e IM exercício aeróbico (IM-EA, n=21) por três meses. Dezessete ratos infartados (28%) morreram durante a cirurgia ou no período pós-operatório. Os resultados iniciais do ecocardiograma foram usados para assegurar que os grupos IM sedentário e de exercício tivessem o mesmo grau de lesão cardíaca. Ao final do período experimental, os animais foram novamente submetidos a ecocardiograma e teste ergométrico, sendo eutanasiados no dia seguinte. Estudos anteriores demonstraram que a inclusão de 10 a 15 animais por grupo é suficiente para mostrar diferenças na remodelação cardíaca ao comparar ratos infartados e Sham.3,14

 Teste de esforço

A capacidade funcional foi avaliada antes, 45 dias após o início do exercício e ao final do experimento. Os ratos foram submetidos a 5 min/dia de adaptação ao ambiente de teste por uma semana antes da avaliação. Cada animal foi testado individualmente. O teste consistiu em um aquecimento inicial de 5 minutos a 5 m/min em uma esteira. Os ratos foram então submetidos a exercícios a 8 m/min, seguidos de incrementos de 3 m/min a cada 3 minutos, até a exaustão. A exaustão foi determinada quando o animal se recusou a correr mesmo após a estimulação elétrica ou foi incapaz de coordenar os passos.15,16 A velocidade máxima de corrida foi registrada e a distância total, calculada. Os resultados do teste de exercício de treinamento de 45 dias foram usados para ajustar a intensidade do exercício.

 Protocolo de treinamento de exercício

O exercício foi realizado em esteira, três dias/semana, durante três meses. Houve um período de adaptação, com aumento gradativo da velocidade e da duração do exercício. A velocidade da 1ª à 5ª semana foi de 5, 7,5, 10, 12 e 15 m/min. A duração do exercício da 1ª à 5ª semana foi de 10, 15, 25, 30 e 40 minutos. A partir da 6ª semana, cada sessão consistiu em 40 minutos de corrida a 60% da velocidade máxima alcançada no teste de exercício em esteira. O protocolo foi adaptado de Moreira et al.17 Após 45 dias de treinamento físico aeróbico, os animais tiveram sua performance de corrida reavaliada para ajuste da intensidade do exercício.

 Ecocardiografia

As estruturas cardíacas e a função do VE foram avaliadas por ecocardiograma transtorácico e Doppler tecidual usando um ecocardiógrafo disponível comercialmente (General Electric Medical Systems, modelo Vivid S6, Tirat Carmel, Israel) equipado com um transdutor multifrequência de 5–11,5 MHz, conforme descrito anteriormente.18–20 Os animais foram anestesiados com cetamina (50 mg/kg) e cloridrato de xilazina (1 mg/kg i.p.) e colocados em decúbito lateral esquerdo. Todas as estruturas cardíacas foram medidas manualmente pelo mesmo observador (KO). Os resultados foram a média de pelo menos cinco ciclos cardíacos nos traçados do modo-M. As seguintes variáveis estruturais foram medidas: diâmetro do AE, diâmetros diastólico e sistólico do VE (DDVE e DSVE, respectivamente), espessura diastólica da parede posterior do VE (EDPP) e diâmetro aórtico (AO). A massa do ventrículo esquerdo (MVE) foi calculada usando a fórmula [(DDVE + EDPP + ESPP)3− DDVE3] × 1,04. A espessura relativa da parede do VE (ERP) foi calculada com a fórmula 2 × EDPP/LVDD. A função sistólica foi avaliada pelos seguintes parâmetros: encurtamento fracionário endocárdico (EFE), velocidade de encurtamento da parede posterior (VEPP), mudança de área fracionada (MAF), índice de desempenho miocárdico (índice Tei) e velocidade sistólica do anel mitral (onda S’) obtida por imagem de Doppler tecidual. A função diastólica foi analisada pelas velocidades de influxo mitral diastólica precoce e tardia (ondas E e A), razão E/A, tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV), velocidade diastólica precoce (E’) e diastólica tardia (A’) do anel mitral (velocidades médias aritméticas de deslocamento das paredes lateral e septal) e razão E/E’.

 Coleta de tecidos para análise

Um dia após o ecocardiograma final, os animais foram pesados, anestesiados com tiopental sódico intraperitoneal (180 mg/kg) e eutanasiados. Seus corações foram removidos por toracotomia. O pulmão, átrios e ventrículos foram dissecados e pesados. Fragmentos de VE foram congelados em nitrogênio líquido e armazenados a −80 °C para análise posterior.

 Estudo morfológico

As amostras de VE foram fixadas em solução tamponada de formalina a 10% por 24 horas, em seguida lavadas em água e transferidas para solução com etanol, conforme método previamente descrito.21

Para calcular o tamanho do infarto, o VE foi cortado a uma distância de 5 a 6 mm do ápice.22 Cortes do coração foram submetidos à coloração com picrosirius red (PSR) e examinados em um microscópio composto (Leica DM LS; Nussloch, Alemanha) acoplado a um sistema de análise de imagem computadorizado (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, EUA).23 O tamanho do infarto foi calculado dividindo-se a soma dos comprimentos ventriculares do infarto endocárdico e epicárdico pela soma das circunferências ventriculares endocárdicas e epicárdicas totais (infarto e miocárdio viável).14 Os valores foram expressos em porcentagem da área total do VE. Apenas ratos com pequeno IM (<30% da área total do VE) pela avaliação histológica foram incluídos no estudo.

Os diâmetros dos cardiomiócitos foram avaliados em cortes transversais do VE corados com hematoxilina-eosina. Foi, então, medido o menor diâmetro de pelo menos 50 fibras cardíacas com o núcleo claramente identificado.24

 Expressão gênica de subunidades NADPH oxidase

A expressão gênica das subunidades NADPH oxidase NOX2, NOX4, p22phox e p47phox e os genes de referência foram analisados por Reação em Cadeia da Polimerase de Transcrição Reversa Quantitativa em Tempo Real (RT-PCR), conforme descrito anteriormente.25 O RNA total foi extraído de amostras do VE com TRIzol Reagente (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e tratado com DNase I (Invitrogen Life Technologies). Um micrograma de RNA foi transcrito reversamente usando um kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade, de acordo com métodos-padrão (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Alíquotas de cDNA foram então submetidas a PCR em tempo real usando um ensaio personalizado contendo primers sense e antisense (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) e sondas Taqman específicas para cada gene: NOX2 (Rn00576710 m1), NOX4 (Rn00585380 m1), p22phox (Rn00577357 m1) e p47phox (Rn00586945 m1). A amplificação e análise foram realizadas usando o sistema Step One Plus™ Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os dados de expressão foram normalizados para expressões gênicas de referência: ciclofilina (Rn00690933 m1) e GAPDH (Rn01775763 g1). As reações foram realizadas em triplicata e os níveis de expressão, calculados com base no método comparativo de TC (2−ΔΔCT).

 Análise estatística

A normalidade dos dados foi avaliada pelo teste de Shapiro-Wilk. Comparações entre os grupos foram realizadas por análise de variância (ANOVA) unilateral, seguida do teste de Bonferroni para variáveis paramétricas, que são expressas em média ± desvio-padrão. As variáveis não paramétricas foram comparadas pelo teste de Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn, sendo expressas em mediana e percentis. O tamanho do infarto foi comparado pelo teste t de Student não pareado. Todas as análises estatísticas foram realizadas no software SigmaStat 12.0, com nível de significância de 5%.

 Resultados Grupos experimentais e parâmetros anatômicos

No início do protocolo de exercício, o grupo Sham tinha 15 animais, IM-SED tinha 22 e IM-EA tinha 21. Após análise histológica, os ratos com infarto ≥ 30% da área total do VE (9 no IM-SED e 9 no grupo IM-EA) foram excluídos do estudo. Apenas um rato do IM-SED morreu durante o protocolo de exercícios. Os parâmetros anatômicos são mostrados na Tabela 1. O peso corporal final não diferiu entre os grupos. Os pesos dos átrios e do ventrículo direito (VD) foram maiores no IM-EA do que no grupo Sham. Não foram encontradas diferenças entre os grupos IM-EA e IM-SED.

Dados anatômicos
SHAM (n=15) IM-SED (n=12) IM-EA (n=12)
PC (g) 536 ± 29,7 537 ± 66,8 529 ± 44,7
VE (g) 0,90 (0,87-0,97) 0,99 (0,93-1,03) 0,99 (0,90-1,11)
VE/PC (g/kg) 1,73 ± 0,10 1,90 ± 0,19 1,88 ± 0,23
VD (g) 0,23 ± 0,03 0,26 ± 0,04 0,29 ± 0,05*
VD/PC (g/kg) 0,43 ± 0,05 0,48 ± 0,07 0,54 ± 0,08*
Peso atrial (g) 0,10 (0,08-0,11) 0,13 (0,10-0,13) 0,13 (0,11-0,14)*
Atrial/PC (g/kg) 0,19 (0,15-0,22) 0,22 (0,19-0,24) 0,27 (0,22-0,28)*
Pulmão/PC (g/kg) 3,60 (3,19-3,70) 3,43 (3,09-3,72) 3,66 (3,58-4,13)

Dados expressos em média ± desvio-padrão ou mediana e percentis. IM-SED: infarto do miocárdio sedentário; IM-EA: infarto do miocárdio e exercício aeróbico; n: número de animais; PC: peso corporal; VE: peso do ventrículo esquerdo; VD: peso do ventrículo direito. ANOVA e teste de Bonferroni ou Kruskal-Wallis e Dunn;

p<0,05 vs. Sham.

O tamanho do infarto, avaliado pela análise histológica do VE, não diferiu entre os grupos infartados (IM-SED 18,7 ± 6,41; IM-EA 23,6 ± 6,14% da área total do VE; p>0,05; Figura 1).

Fotos histológicas representativas de porções do ventrículo esquerdo com coloração por picrosirius red dos grupos Sham, infarto do miocárdio sedentário (IM-SED) e infarto do miocárdio e exercício aeróbico (IM-EA). Avaliação ecocardiográfica

Antes do exercício, não houve diferenças nos parâmetros ecocardiográficos entre os grupos IM-EA e IM-SED (dados não mostrados). Os dados estruturais ecocardiográficos finais estão listados na Tabela 2. Ambos os grupos infartados tinham diâmetros sistólico e diastólico, diâmetro do AE e massa do VE maiores em comparação com o grupo Sham. A espessura diastólica da parede posterior do VE foi maior no IM-EA do que no Sham, e a espessura relativa da parede foi menor no IM-SED do que nos grupos IM-EA e Sham. A função sistólica do VE é demonstrada na Tabela 3. Os grupos infartados apresentaram menor alteração da área fracionada e fração de encurtamento endocárdico, bem como maior índice Tei em relação ao Sham. A função diastólica do VE é apresentada na Tabela 4. A onda E’ (média e septal) foi menor em ambos os grupos com infarto em relação ao grupo Sham. O grupo IM-EA teve menor relação E/A em relação ao Sham. A razão E’/A’ foi menor no IM-SED do que no Sham. Não foram observadas diferenças entre os grupos de ratos infartados submetidos a exercício e sedentários.

Dados estruturais ecocardiográficos
SHAM (n=15) IM-SED (n=10) IM-EA (n=12)
FC (bpm) 267 ± 32,9 278 ± 19,7 290 ± 28,7
DDVE (mm) 8,19 ± 0,44 9,99 ± 0,81* 9,93 ± 0,98*
DSVE (mm) 4,13 (3,96-4,30) 7,16 (6,60-8,21)* 7,25 (6,73-8,16)*
EPPD (mm) 1,42 (1,40-1,45) 1,53 (1,45-1,61) 1,67 (1,58-1,85)*
AO (mm) 4,20 ± 0,15 4,12 ± 0,22 4,13 ± 0,25
AE(mm) 5,68 ± 0,42 6,71 ± 0,75* 6,97 ± 1,07*
AE/AO 1,37 (1,30-1,42) 1,64 (1,47-1,79)* 1,66 (1,47-1,82)*
DSVE/PC (mm/kg) 15,2 (14,8-16,3) 17,9 (16,9-20,3)* 18,5 (17,8-20,1)*
AE/PC (mm/kg) 10,7 ± 0,95 12,4 ± 1,42* 13,5 ± 2,46*
MVE (g) 0,84 (0,76-0,91) 1,29 (1,17-1,43)* 1,27 (1,22-1,63)*
IMVE (g/kg) 1,57 (1,46-1,70) 2,32 (2,12-2,63)* 2,44 (2,31-3,08)*
ERP 0,35 ± 0,02 0,31 ± 0,02* 0,35 ± 0,04#
% area IM Sem infarto 26,23 ± 5,77 27,62 ± 7,67

Dados expressos em média ± desvio-padrão ou mediana e percentis. IM-SED: infarto do miocárdio sedentário; IM-EA: infarto do miocárdio e exercício aeróbico; n: número de animais; FC: frequência cardíaca; DDVE e DSVE: diâmetros diastólico e sistólico do ventrículo esquerdo, respectivamente; EPPD: espessura da parede posterior diastólica do ventrículo esquerdo; AO: diâmetro da aorta; AE: diâmetro do átrio esquerdo; PC: peso corporal; MVE: massa ventricular esquerda; IMVE: índice de massa ventricular esquerda; ERP: espessura relativa da parede. % área IM: porcentagem da área de infarto do miocárdio. ANOVA e teste de Bonferroni ou Kruskal-Wallis e Dunn;

p<0,05 vs Sham;

p<0,05 vs IM-SED.

 Parâmetros ecocardiográficos da função sistólica do ventrículo esquerdo
SHAM (n=15) IM-SED (n=10) IM-EA (n=12)
FEE (%) 49,7 ± 3,40 27,0 ± 5,23* 26,6 ± 7,91*
VEPP (mm/s) 42,1 ± 5,66 35,9 ± 5,37 38,7 ± 9,28
FVA (%) 67,3 ± 5,07 41,1 ± 9,95* 37,6 ± 10,5*
Tei index 0,46 ± 0,06 0,58 ± 0,12* 0,58 ± 0,15*
S’ average (cm/s) 3,55 ± 0,40 3,15 ± 0,34 3,20 ± 0,47

Dados expressos como média ± desvio-padrão. IM-SED: infarto do miocárdio sedentário; IM-EA: infarto do miocárdio e exercício aeróbico; n: número de animais; FEE: fração de encurtamento do endocárdio; FVA: fração de variação da área; VEPP: velocidade de encurtamento da parede posterior; Índice Tei: índice de desempenho miocárdico; Média S’: velocidades médias máximas de deslocamento sistólico para as paredes lateral e septal do anel mitral avaliadas por Doppler tecidual. ANOVA e Bonferroni;

p <0,05 vs Sham.

 Parâmetros ecocardiográficos da função diastólica do ventrículo esquerdo
SHAM (n=15) IM-SED (n=10) IM-EA (n=12)
Mitral E (cm/s) 77,0 (71,0-85,0) 72,5 (69,3-79,5) 75,5 (72,8-78,0)
Mitral A (cm/s) 49,1 ± 12,2 54,3 ± 11,9 59,9 ± 16,8
E/A 1,71 (1,42-1,79) 1,32 (1,26-1,49) 1,23 (1,07-1,35)*
TRIV (m/s) 26,5 ± 3,42 29,7 ± 5,75 28,0 ± 3,79
E’ média (cm/s) 4,20 ± 0,63 3,52 ± 0,62* 3,58 ± 0,50*
E’ lateral (cm/s) 4,16 ± 0,73 3,20 ± 0,56* 3,24 ± 0,74*
E’ septal (cm/s) 4,24 ± 0,61 3,84 ± 0,88 3,92 ± 0,79
E/E’ média 19,1 ± 2,65 21,8 ± 3,47 21,6 ± 2,35
A’ média (cm/s) 3,05 (2,65-3,90) 3,77 (2,96-4,85) 3,82 (2,81-4,04)
A’ lateral (cm/s) 3,40 (2,80-3,80) 3,95 (3,17-4,85) 4,15 (3,27-4,55)
A’ septal (cm/s) 3,25 ± 1,12 3,81 ± 1,21 3,11 ± 0,76
E’/A’ 1,34 ± 0,39 0,95 ± 0,25* 1,05 ± 0,35

Dados expressos em média ± desvio-padrão ou mediana e percentis. IM-SED: infarto do miocárdio sedentário; IM-EA: infarto do miocárdio e exercício aeróbico; n: número de animais; Mitral E: velocidade de pico do influxo mitral diastólico inicial; Mitral A: velocidade de pico do influxo mitral diastólico tardio; TRIV: tempo de relaxamento isovolumétrico; E’: pico da velocidade de deslocamento diastólico inicial do anel mitral; A’: pico da velocidade de deslocamento diastólico tardio do anel mitral. ANOVA e teste de Bonferroni ou Kruskal-Wallis e Dunn;

p<0,05 vs Sham.

 Capacidade funcional

A capacidade funcional não diferiu entre os grupos antes do exercício. Ao final do experimento, a capacidade funcional foi melhor no IM-EA do que nos demais grupos (Figura 2).

Capacidade funcional avaliada pelo teste de esforço máximo. Tempo de corrida (A) antes e depois do exercício; distância percorrida (B) antes e depois do exercício. IM-SED: infarto do miocárdio sedentário; IM-EA: infarto do miocárdio e exercício aeróbico; n: número de animais. Dados expressos em média ± desvio-padrão; ANOVA e Bonferroni; *p<0,05 vs Sham; #p<0,05 vs IM-SED. Estudo morfométrico

O diâmetro dos cardiomiócitos foi menor nos grupos com infarto do que no Sham (Figura 3).

Diâmetros dos cardiomiócitos. IM-SED: infarto do miocárdio sedentário; IM-EA: infarto do miocárdio e exercício aeróbico; n: número de animais. Dados expressos em média ± desvio-padrão; ANOVA e Bonferroni; *p<0,05 vs SHAM. Expressão gênica

A expressão gênica das subunidades NADPH oxidase NOX2, NOX4, p22phox e p47phox não diferiu entre os grupos (Tabela 5).

Expressão gênica de subunidades do complexo NADPH oxidase
Gene SHAM (n=9) IM-SED (n=5) IM-EA (n=5)
Nox2 1,00 ± 0,56 0,83 ± 0,34 1,07 ± 0,26
Nox4 0,99 (0,62-1,20) 1,38 (0,60-1,95) 1,36 (0,79-1,40)
p22phox 1,00 ± 0,35 1,12 ± 0,51 1,16 ± 0,18
p47phox 1,00 ± 0,56 0,83 ± 0,34 1,07 ± 0,26

Dados expressos em média ± desvio-padrão ou mediana e percentis. IM-SED: infarto do miocárdio sedentário; IM-EA: infarto do miocárdio e exercício aeróbico; n: número de animais; ANOVA e teste de Bonferroni ou Kruskal-Wallis e Dunn; p>0,05.

 Discussão

Neste estudo, avaliamos os efeitos do exercício físico aeróbico na capacidade funcional, remodelação cardíaca e expressão gênica das subunidades da NADPH oxidase em corações de ratos com pequeno IM.

Modelos experimentais de roedores com IM tem sido amplamente utilizados para investigar a fisiopatologia e o tratamento da remodelação cardíaca e insuficiência cardíaca.26,27 No entanto, como a anatomia da circulação coronária de um rato não é uniforme, a ligadura da artéria coronária leva a uma ampla gama de tamanhos de infarto, remodelação e disfunção do VE.22 Portanto, uma característica essencial dos estudos que visam estabelecer estratégias terapêuticas é avaliar animais com infarto de tamanhos comparáveis. Portanto, a avaliação ecocardiográfica do tamanho do IM e do grau de lesão cardíaca antes de iniciar estratégias terapêuticas deveria ser obrigatória.

Observamos anteriormente que o tamanho mínimo do infarto para induzir anormalidades estruturais, funcionais e clínicas era de 36%, 38% e 40% da área total do VE, respectivamente.28 Portanto, não esperávamos encontrar alterações cardíacas consideráveis na avaliação de ratos com IM menor de 30%. No entanto, este estudo mostrou que, ao final do período experimental, os grupos infartados apresentavam aumento do diâmetro diastólico e sistólico do VE, diâmetro do AE e massa do VE, com disfunção sistólica caracterizada por redução da fração de encurtamento endocárdico e alteração da área fracionada, bem como aumento do índice Tei. Exceto no que diz respeito à redução septal e onda E’ média, a função diastólica não diferiu entre os grupos infartados e Sham. Nossos dados, portanto, mostram que a remodelação cardíaca com dilatação das câmaras cardíacas esquerdas, e a disfunção sistólica do VE pode ser bem caracterizada em ratos com área de infarto pequena.

O fato do peso corporal não diferir entre os grupos reforça o leve grau de lesão miocárdica. A caquexia cardíaca é caracterizada por uma redução significativa no peso corporal,29,30 e pode ser encontrada em ratos que apresentam grandes áreas de infarto.22

Neste estudo, foi utilizado um protocolo de exercício aeróbico de intensidade moderada adaptado de estudos publicados anteriormente.17 A velocidade máxima de corrida foi estabelecida para cada rato de acordo com sua capacidade funcional, avaliada por teste de esforço máximo em esteira no início e no meio do protocolo.15 Ao final do experimento, notamos que o exercício era seguro e o grupo IM-EA atingiu um tempo de esteira e distância percorrida maiores do que os grupos IM-SED e Sham. Há muito tempo se sabe que o exercício aeróbico melhora a capacidade funcional na insuficiência cardíaca tanto animal quanto humana.31 Os resultados do grupo Sham também destacaram uma capacidade funcional reduzida causada pelo estilo de vida sedentário.

Apesar de melhorar o desempenho funcional, os efeitos do exercício aeróbico na remodelação cardíaca não foram substanciais em ratos com IM pequeno. Como um achado comum em ratos IM é a diminuição na espessura relativa da parede do VE,22 podemos concluir que o exercício foi útil na preservação da geometria do VE, pois a relação entre a espessura da parede posterior diastólica e o diâmetro diastólico do VE foi reduzida no IM-SED e preservada no IM-EA.

Entre as várias alterações induzidas pelo IM, o aumento do estresse oxidativo tem papel importante na progressão da remodelação cardíaca.5 Neste estudo, a expressão gênica das subunidades do complexo NADPH oxidase NOX2, NOX4, p22phox e p47phox não diferiu entre os grupos, o que sugere que essa importante fonte de geração de espécies reativas de oxigênio4 não esteve envolvida na remodelação cardíaca observada em ratos com infarto pequeno. Foi observado aumento da expressão gênica de NOX2 e NOX4 em roedores com IM de tamanhos grandes.32 Uma limitação deste estudo é que avaliamos o complexo NADPH oxidase por meio da análise da expressão gênica de suas subunidades. Portanto, estudos adicionais são necessários para avaliar a atividade do complexo NADPH oxidase.

Uma vez que a transição da disfunção VE compensada para a insuficiência cardíaca é encontrada principalmente em corações com infarto transmural grande,22 a maioria dos autores avaliou os efeitos do exercício em corações com grandes infartos,8,10,33,34 e a maioria desses estudos mostrou efeitos favoráveis do exercício aeróbico na remodelação cardíaca induzida pelo IM.8,10,33 Apenas alguns pesquisadores analisaram os efeitos do exercício no coração de ratos com IM pequeno.35,36 Ao iniciarem o exercício dentro de quatro semanas após a indução do IM, esses autores observaram efeitos benéficos do exercício físico.35,36 Neste estudo, mostramos pela primeira vez que o exercício aeróbico tardio, iniciado três meses após o IM, quando a remodelação cardíaca está estável, atenua as alterações da geometria cardíaca em ratos com pequeno infarto. Nosso estudo, portanto, reforça o conceito de benefício potencial da reabilitação cardíaca após síndromes coronarianas agudas, independentemente do grau de lesão cardíaca.37

 Conclusão

Em conclusão, o IM pequeno altera as estruturas cardíacas e a função sistólica do VE. Exercício físico aeróbico tardio melhora a capacidade funcional e atenua a alteração da geometria do VE. A expressão gênica das subunidades da NADPH oxidase não está envolvida na remodelação cardíaca e não é modulada pelo exercício aeróbico em ratos com infarto do miocárdio pequeno.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi financiado pelo CNPq (Proc. n. 308557/2018-2 e 310876/2018-4); FAPESP (Proc. n. 2014/21972-3 e 2014/00747-1); CAPES (Proc. n. 88882.432904/2019-01 e 153424/2018-4) e PROPe, UNESP.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Lidiane Moreira de Souza pela Programa de pós-graduação em Fisiopatologia em Clínica Médica na Faculdade Medicina de Botucatu - UNESP.

 Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Colin Edward Knaggs pela edição em inglês. Apoio financeiro foi concedido pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (protocolos 308557/2018-2 e 310876/2018-4); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (protocolos 2014/21972-3 e 2014/00747-1); a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) (protocolos 88882.432904/2019-01 e 153424/2018-4); e Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa (PROPe) da UNESP.

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Author Contributions

Conception and design of the research: Souza LM, Okoshi MP, Gomes MJ, Gatto M, Rodrigues EA, Pontes THD, Damatto FC, Oliveira LRS, Borim PA, Lima ARR, Zornoff LAM, Okoshi K, Pagan LU; Data acquisition: Souza LM, Gomes MJ, Gatto M, Rodrigues EA, Pontes THD, Damatto FC, Oliveira LRS, Borim PA, Lima ARR, Pagan LU; Analysis and interpretation of the data and Statistical analysis: Souza LM, Gomes MJ, Pagan LU; Obtaining financing and Writing of the manuscript: Souza LM, Okoshi MP, Gomes MJ, Pagan LU; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Souza LM, Okoshi MP, Gomes MJ, Gatto M, Pagan LU.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background:

Physical exercise has been considered an important non-pharmacological therapy for the prevention and treatment of cardiovascular diseases. However, its effects on minor cardiac remodeling are not clear.

 Objective:

To evaluate the influence of aerobic exercise on the functional capacity, cardiac structure, left ventricular (LV) function, and gene expression of NADPH oxidase subunits in rats with small-sized myocardial infarction (MI).

 Methods:

Three months after MI induction, Wistar rats were divided into three groups: Sham; sedentary MI (MI-SED); and aerobic exercised MI (MI-AE). The rats exercised on a treadmill three times a week for 12 weeks. An echocardiogram was performed before and after training. The infarction size was evaluated by histology, and gene expression was assessed by RT-PCR. The significance level for statistical analysis was set at 5%.

 Results:

Rats with MI lower than 30% of the LV total area were included in the study. Functional capacity was higher in MI-AE than in Sham and MI-SED rats. The infarction size did not differ between groups. Infarcted rats had increased LV diastolic and systolic diameter, left atrial diameter, and LV mass, with systolic dysfunction. Relative wall thickness was lower in MI-SED than in the MI-AE and Sham groups. Gene expression of the NADPH oxidase subunits NOX2, NOX4, p22phox, and p47phox did not differ between groups.

 Conclusion:

Small-sized MI changes cardiac structure and LV systolic function. Late aerobic exercise is able to improve functional capacity and cardiac remodeling by preserving the left ventricular geometry. NADPH oxidase subunits gene expression is not involved in cardiac remodeling or modulated by aerobic exercise in rats with small-sized MI.

 Keywords: Exercise, Physical Exercise Ventricular Dysfunction Myocardial Infarction Rats Ventricular Remodeling Echocardiography/methods NADPH Oxidase CNPq 308557/2018-2 310876/2018-4 FAPESP 2014/21972-3 2014/00747-1 CAPES 88882.432904/2019-01 153424/2018-4 This study was funded by CNPq (Process number 308557/2018-2 and 310876/2018-4); FAPESP (Process number 2014/21972-3 and 2014/00747-1); CAPES (Process number 88882.432904/2019-01 and 153424/2018-4), and PROPe, UNESP. Introduction

Cardiovascular diseases are a leading cause of death worldwide; in this class of diseases, myocardial infarction (MI) is the main cause of morbidity and mortality.1

Acute MI leads to cardiac remodeling, which is defined as abnormalities in genome expression resulting in molecular, cellular and interstitial changes that manifest clinically as alterations in heart size, shape and function.2 Oxidative stress, characterized by an imbalance between reactive oxygen species production and antioxidant systems, is often observed during cardiac remodeling.3 The nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase complex, an important source of cellular reactive oxygen species production,4 is usually increased after MI.5

In recent decades, physical exercise has emerged as an important non-pharmacological therapy for preventing and treating several cardiovascular diseases.6 Aerobic exercise has been the focus of many studies for attenuating MI-induced cardiac remodeling and improving functional capacity and quality of life.7–10

Animal MI models are widely used for studying the pathophysiology and treatment of cardiac remodeling. Most studies evaluating the effects of exercise on post-MI cardiac changes have used rodents with large infarcted areas, usually more than 30% of the total left ventricle (LV) area.8,11–14 However, it is not clear yet whether aerobic exercise is useful to attenuate cardiac changes following smaller-size LV infarction. In this study we aimed to evaluate the influence of aerobic physical exercise on functional capacity, cardiac structures, LV function, and NADPH oxidase subunit gene expression in rodents with small-sized MI.

 Materials and methods Experimental animals

Male Wistar rats weighing 200-250 g were purchased from the Central Animal House, Botucatu Medical School, UNESP. All animals were kept in a temperature-controlled room at 24 ± 2º C and put on a 12-hour light/dark cycle in collective cages (three per cage). Food and water were supplied ad libitum.

All experiments and procedures were approved by the Animal Experimentation Ethics Committee of the Botucatu Medical School, UNESP, SP, Brazil, which follows the guidelines established by the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by the U.S. National Institutes of Health, and Brazilian College for Animal Experimentation (protocol number 1237/2017).

MI was induced by ligating the left anterior descending coronary artery according to a previously described method.3,14 Briefly, 60 rats were anesthetized with ketamine (60 mg/kg) and xylazine hydrochloride (1 mg/kg) and subjected to left lateral thoracotomy. After exteriorization of the heart, the left atrium was retracted to facilitate ligation of the coronary artery with a 5-0 monofilament nylon suture between the pulmonary outflow tract and the left atrium. The heart was then placed back in the thorax, the lungs inflated with positive pressure, and the thoracotomy was closed. Fifteen sham-operated animals were used as controls.

Three months later, the rats that survived were subjected to transthoracic echocardiogram and exercise testing and then assigned to three groups: Sham (n=15); sedentary MI (MI-SED, n=22) and aerobic exercised MI (MI-AE, n=21) for three months. Seventeen infarcted rats (28%) died during surgery or in the post-operative period. Initial echocardiogram results were used to assure that sedentary and exercise MI groups had the same degree of cardiac injury. At the end of the experimental period, the animals were again subjected to echocardiogram and exercise testing, and euthanized the next day. Previous studies have shown that the inclusion of 10 to 15 animals per group is sufficient to show differences in cardiac remodeling when comparing infarcted and Sham rats.3,14

 Exercise testing

Functional capacity was evaluated before, 45 days after initiating exercise, and at the end of the experiment. Rats underwent 5 min/day an adaption to test environment for one week before evaluation. Each animal was tested individually. The test consisted of an initial 5-minute warm-up at 5 m/min on a treadmill. The rats were then subjected to exercise at 8 m/min followed by increments of 3 m/min every 3 minutes until exhaustion. Exhaustion was determined when the animal refused to run even after electric stimulation or was unable to coordinate steps.15,16 The maximum running speed was recorded and total distance was calculated. Exercise test results from 45-day training were used to adjust exercise intensity.

 Exercise training protocol

Exercise was performed on a treadmill three days/week for three months. There was an adaptation period, with a gradual increase in speed and exercise duration. Speed from the 1st to the 5th week was 5, 7.5, 10, 12 and 15 m/min. Exercise duration from the 1st to the 5th week was 10, 15, 25, 30 and 40 minutes. From the 6th week on, each session consisted of 40 minutes of running at 60% of maximum velocity reached in the treadmill exercise test. The protocol was adapted from Moreira et al.17 After 45 days of aerobic exercise training, animals had their running performance reevaluated as to adjust exercise intensity.

 Echocardiography

Cardiac structures and LV function were evaluated by transthoracic echocardiogram and tissue Doppler imaging using a commercially available echocardiograph (General Electric Medical Systems, Vivid S6 model, Tirat Carmel, Israel) equipped with a 5–11.5 MHz multifrequency transducer, as previously described.18–20 The animals were anesthetized with ketamine (50 mg/kg) and xylazine hydrochloride (1 mg/kg i.p.), and placed in left lateral decubitus. All cardiac structures were manually measured by the same observer (KO). Results were the mean of at least five cardiac cycles on M-mode tracings. The following structural variables were measured: left atrium diameter (LA), LV diastolic and systolic diameters (LVDD and LVSD, respectively), LV diastolic posterior wall thickness (DPWT) and aortic diameter (AO). Left ventricular mass (LVM) was calculated using the formula [(LVDD + DPWT + DSWT)3− LVDD3] × 1.04. LV relative wall thickness (RWT) was calculated with the formula 2 × DPWT/LVDD. Systolic function was assessed by the following parameters: endocardial fractional shortening (EFS), posterior wall shortening velocity (PWSV), fractional area change (FAC), myocardial performance index (Tei index), and systolic velocity of the mitral annulus (S’ wave) obtained by tissue Doppler imaging. The diastolic function was analyzed by early and late diastolic mitral inflow velocities (E and A waves), E/A ratio, isovolumetric relaxation time (IVRT), early diastolic (E’) and late diastolic (A’) velocity of the mitral annulus (arithmetic average travel speeds of the lateral and septal walls), and E/E’ ratio.

 Collection of tissues for analysis

One day after final echocardiogram, the animals were weighed, anesthetized with intraperitoneal sodium thiopental (180 mg/kg) and euthanized. Their hearts were removed by thoracotomy. The lung, atria and ventricles were dissected and weighed. Fragments of LV were frozen in liquid nitrogen and stored at −80 °C for posterior analysis.

 Morphologic study

LV samples were fixed in a 10% buffered formalin solution for 24 hours, then washed in water and transferred to a solution with ethanol, according to a previously described method.21

To calculate infarction size, the LV was cut at a distance of 5 to 6 mm from the apex.22 Heart slices were stained with picrosirius red (PSR) and examined under a compound microscope (Leica DM LS; Nussloch, Germany) coupled to a computerized imaging analysis system (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA).23 The infarction size was calculated by dividing the sum of endocardial and epicardial infarcted ventricular lengths by the sum of the total (infarcted and viable myocardium) endocardial and epicardial ventricular circumferences.14 Values were expressed as percentage of the total LV area. Only rats with small-sized MI (<30% of total LV area) at histological evaluation were included in the study.

Cardiomyocyte diameters were assessed in LV transverse sections stained with hematoxylin-eosin. The smallest diameter of at least 50 cardiac fibers with the nucleus clearly identified was measured.24

 Gene expression of NADPH oxidase subunits

Gene expression of NADPH oxidase subunits NOX2, NOX4, p22phox, and p47phox and reference genes was analyzed by Real-Time Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), as previously described.25 Total RNA was extracted from LV samples with TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) and treated with DNase I (Invitrogen Life Technologies). One microgram of RNA was reverse-transcribed using a High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit, according to standard methods (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Aliquots of cDNA were then submitted to real-time PCR using a customized assay containing sense and antisense primers and Taqman (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) probes specific to each gene: NOX2 (Rn00576710 m1), NOX4 (Rn00585380 m1), p22phox (Rn00577357 m1), and p47phox (Rn00586945 m1). Amplification and analysis were performed using the Step One Plus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Expression data were normalized to reference gene expressions: cyclophilin (Rn00690933 m1) and GAPDH (Rn01775763 g1). Reactions were performed in triplicate and expression levels calculated based on the CT comparative method (2−ΔΔCT).

 Statistical analyzes

Data normality was evaluated by the Shapiro-Wilk test. Comparisons between groups were performed by one-way analysis of variance (ANOVA), followed by the Bonferroni test for parametric variables, which are expressed as mean ± standard deviation. Non-parametric variables were compared using the Kruskal-Wallis test followed by Dunn's test, being expressed as median and percentiles. Infarction size was compared by the unpaired Student t test. Statistical analyzes were performed on the SigmaStat 12.0 software. The significance level was set at 5%.

 Results Experimental groups and anatomical parameters

At the beginning of the exercise protocol, the Sham group had 15 animals, MI-SED had 22, and MI-AE had 21. After histologic analysis, the rats with infarction size ≥ 30% of total LV area (9 in MI-SED and 9 in MI-AE group) were excluded from the study. Only one rat from MI-SED died during the exercise protocol. Anatomical parameters are shown in Table 1. Final body weight did not differ between groups. Atria and right ventricle (RV) weights were higher in MI-AE than in Sham group. No differences between MI-AE and MI-SED groups were found.

Anatomical data
SHAM (n=15) MI-SED (n=12) MI-AE (n=12)
BW (g) 536 ± 29.7 537 ± 66.8 529 ± 44.7
LV (g) 0.90 (0.87-0.97) 0.99 (0.93-1.03) 0.99 (0.90-1.11)
LV/BW (g/kg) 1.73 ± 0.10 1.90 ± 0.19 1.88 ± 0.23
RV (g) 0.23 ± 0.03 0.26 ± 0.04 0.29 ± 0.05*
RV/BW (g/kg) 0.43 ± 0.05 0.48 ± 0.07 0.54 ± 0.08*
Atrial weight (g) 0.10 (0.08-0.11) 0.13 (0.10-0.13) 0.13 (0.11-0.14)*
Atrial/BW (g/kg) 0.19 (0.15-0.22) 0.22 (0.19-0.24) 0.27 (0.22-0.28)*
Lung/BW (g/kg) 3.60 (3.19-3.70) 3.43 (3.09-3.72) 3.66 (3.58-4.13)

Data are expressed as mean ± standard deviation or median and percentiles. MI-SED: sedentary myocardial infarction; MI-AE: aerobic exercise myocardial infarction; n: number of animals; BW: body weight; LV: left ventricle weight; RV: right ventricle weight. ANOVA and Bonferroni or Kruskal-Wallis and Dunn's test;

p<0.05 vs. Sham.

Infarction size, assessed by LV histological analysis, did not differ between infarcted groups (MI-SED 18.7 ± 6.41; MI-AE 23.6 ± 6.14% of total LV area; p>0.05; Figure 1).

Representative histological photos of picrosirius red-stained portions of left ventricles from the groups SHAM, sedentary myocardial infarction (MI-SED), and aerobic exercise myocardial infarction (MI-AE). Echocardiographic evaluation

Before exercise, there were no differences in echocardiographic parameters between MI-AE and MI-SED groups (data not shown). Final echocardiographic structural data are listed in Table 2. Both infarcted groups had higher LV systolic and diastolic diameters, left atrial diameter, and LV mass compared to the Sham group. LV diastolic posterior wall thickness was higher in MI-AE than in Sham, and relative wall thickness was lower in MI-SED than in MI-AE and Sham groups. LV systolic function is shown in Table 3. Infarcted groups had lower fractional area change and endocardial fractional shortening, as well as higher Tei index when compared to Sham. LV diastolic function is presented in Table 4. E’ (average and septal) wave was lower in both infarcted groups as related to the Sham group. MI-AE had lower E/A ratio than Sham. E’/A’ ratio was lower in MI-SED than in Sham. No differences were observed between exercised and sedentary infarcted groups.

Echocardiographic structural data
SHAM (n=15) MI-SED (n=10) MI-AE (n=12)
HR (bpm) 267 ± 32.9 278 ± 19.7 290 ± 28.7
LVDD (mm) 8.19 ± 0.44 9.99 ± 0.81* 9.93 ± 0.98*
LVSD (mm) 4.13 (3.96-4.30) 7.16 (6.60-8.21)* 7.25 (6.73-8.16)*
DPWT (mm) 1.42 (1.40-1.45) 1.53 (1.45-1.61) 1.67 (1.58-1.85)*
AO (mm) 4.20 ± 0.15 4.12 ± 0.22 4.13 ± 0.25
LA (mm) 5.68 ± 0.42 6.71 ± 0.75* 6.97 ± 1.07*
LA/AO 1.37 (1.30-1.42) 1.64 (1.47-1.79)* 1.66 (1.47-1.82)*
LVDD/BW (mm/kg) 15.2 (14.8-16.3) 17.9 (16.9-20.3)* 18.5 (17.8-20.1)*
LA/BW (mm/kg) 10.7 ± 0.95 12.4 ± 1.42* 13.5 ± 2.46*
LVM (g) 0.84 (0.76-0.91) 1.29 (1.17-1.43)* 1.27 (1.22-1.63)*
LVMI (g/kg) 1.57 (1.46-1.70) 2.32 (2.12-2.63)* 2.44 (2.31-3.08)*
RWT 0.35 ± 0.02 0.31 ± 0.02* 0.35 ± 0.04#
% area MI No infarction 26.23 ± 5.77 27.62 ± 7.67

Data are expressed as mean ± standard deviation or median and percentiles. MI-SED: sedentary myocardial infarction; MI-AE: aerobic exercise myocardial infarction; n: number of animals; HR: heart rate; LVDD and LVSD: left ventricular diastolic and systolic diameters respectively; DPWT: left ventricular diastolic posterior wall thickness; AO: aorta diameter; LA: left atrial diameter; BW: body weight; LVM: left ventricular mass; LVMI: left ventricular mass index; RWT: relative wall thickness. % area MI: percentage of myocardial infarcted area. ANOVA and Bonferroni or Kruskal-Wallis and Dunn's test;

p<0.05 vs Sham;

p<0.05 vs MI-SED.

 Echocardiographic parameters of left ventricular systolic function
SHAM (n=15) MI-SED (n=10) MI-AE (n=12)
EFS (%) 49.7 ± 3.40 27.0 ± 5.23* 26.6 ± 7.91*
PWSV (mm/s) 42.1 ± 5.66 35.9 ± 5.37 38.7 ± 9.28
FAC (%) 67.3 ± 5.07 41.1 ± 9.95* 37.6 ± 10.5*
Tei index 0.46 ± 0.06 0.58 ± 0.12* 0.58 ± 0.15*
S’ average (cm/s) 3.55 ± 0.40 3.15 ± 0.34 3.20 ± 0.47

Data are expressed as mean ± standard deviation. MI-SED: sedentary myocardial infarction; MI-AE: aerobic exercise myocardial infarction; n: number of animals; EFS: endocardial fractional shortening; PWSV: posterior wall shortening velocity; Tei index: myocardial performance index; S’ average: mean maximum systolic displacement velocities for lateral and septal walls of the mitral annulus assessed by tissue Doppler imaging. ANOVA and Bonferroni;

p<0.05 vs Sham.

 Echocardiographic parameters of left ventricular diastolic function
SHAM (n=15) MI-SED (n=10) MI-AE (n=12)
Mitral E (cm/s) 77.0 (71.0-85.0) 72.5 (69.3-79.5) 75.5 (72.8-78.0)
Mitral A (cm/s) 49.1 ± 12.2 54.3 ± 11.9 59.9 ± 16.8
E/A 1.71 (1.42-1.79) 1.32 (1.26-1.49) 1.23 (1.07-1.35)*
IVRT (m/s) 26.5 ± 3.42 29.7 ± 5.75 28.0 ± 3.79
E’ average (cm/s) 4.20 ± 0.63 3.52 ± 0.62* 3.58 ± 0.50*
E’ lateral (cm/s) 4.16 ± 0.73 3.20 ± 0.56* 3.24 ± 0.74*
E’ septal (cm/s) 4.24 ± 0.61 3.84 ± 0.88 3.92 ± 0.79
E/E’ average 19.1 ± 2.65 21.8 ± 3.47 21.6 ± 2.35
A’ average (cm/s) 3.05 (2.65-3.90) 3.77 (2.96-4.85) 3.82 (2.81-4.04)
A’ lateral (cm/s) 3.40 (2.80-3.80) 3.95 (3.17-4.85) 4.15 (3.27-4.55)
A’ septal (cm/s) 3.25 ± 1.12 3.81 ± 1.21 3.11 ± 0.76
E’/A’ 1.34 ± 0.39 0.95 ± 0.25* 1.05 ± 0.35

Data are expressed as mean ± standard deviation or median and percentiles. MI-SED: sedentary myocardial infarction; MI-AE: aerobic exercise myocardial infarction; n: number of animals; Mitral E: peak velocity of early-diastolic mitral inflow; Mitral A: peak velocity of late-diastolic mitral inflow; IVRT: isovolumetric relaxation time; E’: peak initial diastolic displacement velocity of the mitral annulus; A’: peak late diastolic displacement velocity of the mitral annulus. ANOVA and Bonferroni or Kruskal-Wallis and Dunn's test;

p<0.05 vs Sham.

 Functional capacity

Functional capacity did not differ between groups before exercise. At the end of the experiment, functional capacity was better in MI-AE than in the other groups (Figure 2).

Functional capacity evaluated by maximal exercise test. Running time (A) before and after exercise; running distance (B) before and after exercise. MI-SED: sedentary myocardial infarction; MI-AE: aerobic exercise myocardial infarction; n: number of animals. Data are expressed as mean ± standard deviation; ANOVA and Bonferroni; *p<0.05 vs SHAM; #p<0.05 vs MI-SED. Morphometric study

Cardiomyocyte diameter was smaller in infarcted groups than in Sham (Figure 3).

Cardiomyocyte diameters. MI-SED: sedentary myocardial infarction; MI-AE: aerobic exercise myocardial infarction; n: number of animals. Data are expressed as mean ± standard deviation; ANOVA and Bonferroni; *p<0.05 vs SHAM. Gene expression

Gene expression of NADPH oxidase subunits NOX2, NOX4, p22phox, and p47phox did not differ between groups (Table 5).

Gene expression of NADPH oxidase complex subunits
Gene SHAM (n=9) MI-SED (n=5) MI-AE (n=5)
Nox2 1.00 ± 0.56 0.83 ± 0.34 1.07 ± 0.26
Nox4 0.99 (0.62-1.20) 1.38 (0.60-1.95) 1.36 (0.79-1.40)
p22phox 1.00 ± 0.35 1.12 ± 0.51 1.16 ± 0.18
p47phox 1.00 ± 0.56 0.83 ± 0.34 1.07 ± 0.26

Data are expressed as mean ± standard deviation or median and percentiles. MI-SED: sedentary myocardial infarction; MI-AE: aerobic exercise myocardial infarction; n: number of animals; ANOVA and Bonferroni or Kruskal-Wallis and Dunn's test; p>0.05.

 Discussion

In this study, we evaluated the effects of aerobic physical exercise on functional capacity, cardiac remodeling and gene expression of NADPH oxidase subunits in small-sized MI rat hearts.

The rodent experimental MI model has been widely used to investigate the pathophysiology and treatment of cardiac remodeling and heart failure.26,27 However, as a rat's coronary circulation anatomy is not uniform, coronary artery ligation leads to a wide range of infarct sizes, cardiac remodeling, and LV dysfunction.22 Therefore, an essential feature of studies aimed to establish therapeutic strategies is to evaluate animals with comparable infarction sizes. Thus, echocardiographic assessment of MI size and cardiac injury degree before initiating therapeutic strategies should be mandatory.

We have previously observed that the minimum infarct size for inducing structural, functional, and clinical abnormalities was 36%, 38%, and 40% of the total LV area, respectively.28 We therefore did not expect to find considerable cardiac changes by evaluating rats with MI sizes below 30%. However, this study showed that, at the end of the experimental period, infarcted groups presented increased LV diastolic and systolic diameter, left atrial diameter, and LV mass, with systolic dysfunction characterized by reduced endocardial fractional shortening and fractional area change, as well as increased Tei index. Except for reduced septal and average E’ wave, the diastolic function did not differ between infarcted and Sham groups. Our data therefore showed that cardiac remodeling with left cardiac chambers dilation and LV systolic dysfunction can be well characterized in rats with small-sized infarction area.

The fact that body weight did not differ between groups reinforces the slight degree of myocardial injury. Cardiac cachexia is characterized by a significant reduction in body weight,29,30 and can be found in post-infarction rats with large infarction areas.22

In this study, we used a moderate intensity aerobic exercise protocol adapted from previously published studies.17 Maximum running velocity was established for each rat according to its functional capacity, evaluated by maximum effort test performed on a treadmill at the beginning and middle of the exercise protocol.15 At the end of the experiment, we noted that exercise was safe and the MI-AE group attained a higher treadmill time and distance run than MI-SED and Sham groups. Aerobic exercise has long been shown to improve functional capacity in both animal and human heart failure.31 The Sham rat results also underlined a reduced functional capacity caused by sedentary lifestyle.

Despite improving functional performance, the effects of aerobic exercise on cardiac remodeling were not substantial in small-sized MI rats. As a common finding in MI rats is a decrease in LV relative wall thickness,22 we may conclude that exercise was helpful in preserving LV geometry, as the relationship between LV diastolic posterior wall thickness and LV diastolic diameter was reduced in MI-SED and preserved in the MI-AE group.

Among various MI-induced alterations, increased oxidative stress plays an important role in cardiac remodeling progression.5 In this study, gene expression of NADPH oxidase complex subunits NOX2, NOX4, p22phox, and p47phox did not differ between groups, which suggests that this important source of reactive oxygen species generation4 was not involved in the cardiac remodeling observed in rats with small-sized infarction. Increased gene expression of NOX2 and NOX4 has been observed in large-sizes MI rodents.32 One limitation of this study is that we have evaluated NADPH oxidase complex by analyzing the gene expression of its subunits. Therefore, additional studies are needed to assess the activity of the NADPH oxidase complex.

Since transition from compensated LV dysfunction to heart failure is mainly found in hearts with large transmural infarction,22 most authors have evaluated the effects of exercise on hearts with large infarct sizes8,10,33,34 and most studies have shown favorable effects of aerobic exercise on MI-induced cardiac remodeling.8,10,33 Only a few researchers have analyzed the cardiac effects of exercise in rats with small-sized MI.35,36 By initiating exercise within four weeks post MI induction, these authors have observed beneficial cardiac effects of physical exercise.35,36 In this study we showed for the first time that late aerobic exercise, initiated three months after MI, when cardiac remodeling is stable, attenuates cardiac geometry changes in rats with small-sized infarction. Our study therefore reinforces the concept of potential benefit from cardiac rehabilitation after acute coronary syndromes, regardless of cardiac injury degree.37

 Conclusion

In conclusion, small-sized MI changes cardiac structures and the left ventricular systolic function. Late aerobic physical exercise improves functional capacity and attenuates left ventricular geometry change. NADPH oxidase subunits gene expression is not involved in cardiac remodeling nor is modulated by aerobic exercise in rats with small-sized MI.

Sources of Funding

This study was funded by CNPq (Process number 308557/2018-2 and 310876/2018-4); FAPESP (Process number 2014/21972-3 and 2014/00747-1); CAPES (Process number 88882.432904/2019-01 and 153424/2018-4), and PROPe, UNESP.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Lidiane Moreira de Souza, from Programa de pós-graduação em Fisiopatologia em Clínica Médica na Faculdade Medicina de Botucatu - UNESP.

 Acknowledgements

We would like to thank Colin Edward Knaggs for the English editing. Financial support was provided by the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (protocols 308557/2018-2 and 310876/2018-4); the São Paulo Research Foundation (FAPESP) (protocols 2014/21972 - 3 and 2014/00747-1); the Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES) (protocols 88882.432904/2019-01 and 153424/2018-4); and the Pro-Rectory of Post-Graduate Studies and Research (PROPe) at UNESP.