Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC RdXYRrH6pHzkFKywF4HCN5G S0066-782X2021000200248 abc.20190403 10.36660/abc.20190403 Artigo Original Galectina-3 Associada a Formas Graves e Mortalidade em Longo Prazo em Pacientes com Doença de Chagas 0000-0002-9323-8805 Fernandes Fábio * 1 0000-0002-4187-5482 Moreira Carlos Henrique Valente * 2 Oliveira Lea Campos 3 Souza-Basqueira Marcela 3 Ianni Barbara Maria 1 Lorenzo Claudia di 3 0000-0003-2437-2485 Ramires Felix José Alvarez 1 Nastari Luciano 1 Cunha-Neto Edecio 1 0000-0002-2740-0042 Ribeiro Antonio L. 4 Lopes Renato Delascio 5 Keating Sheila M. 6 Sabino Ester Cerdeira 3 0000-0002-8838-199X Mady Charles 1 Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina Hospital das Clínicas São Paulo SP Brasil Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina Hospital das Clínicas Instituto do Coração, São Paulo, SP- Brasil Instituto de Infectologia Emilio Ribas São Paulo SP Brasil Instituto de Infectologia Emilio Ribas, São Paulo, SP - Brasil Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina São Paulo SP Brasil Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina, São Paulo, SP - Brasil Universidade Federal de Minas Gerais Centro de Telessaúde Hospital das Clínicas Belo Horizonte MG Brasil Universidade Federal de Minas Gerais - Centro de Telessaúde - Hospital das Clínicas, Belo Horizonte, MG - Brasil Duke University Hospital Durham North Carolina EUA Duke University Hospital, Durham, North Carolina - EUA Blood Systems Research Institute San Francisco Califórnia EUA Blood Systems Research Institute, San Francisco, Califórnia – EUA Correspondência: Fábio Fernandes • Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina Hospital das Clínicas Instituto do Coração - Av. Dr. Eneas C. Aguiar, 44. CEP 05403-000, São Paulo, SP – Brasil E-mail: fabio.fernandes@incor.usp.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Fernandes F, Moreira CHV, Ianni BM, Ramires FJA, Nastari L, Cunha-Neto E, Ribeiro AL, Sabino EC, Mady C; Obtenção de dados: Fernandes F, Moreira CHV, Oliveira LC, Souza-Basqueira M, di Lorenzo C, Nastari L, Ribeiro AL, Keating SM, Sabino EC; Análise e interpretação dos dados: Fernandes F, Moreira CHV, Oliveira LC, Souza-Basqueira M, Ianni BM, di Lorenzo C, Ramires FJA, Lopes RD, Keating SM, Sabino EC, Mady C; Análise estatística: Moreira CHV, Ianni BM; Obtenção de financiamento: Fernandes F, Ramires FJA, Nastari L, Sabino EC, Mady C; Redação do manuscrito: Fernandes F, Moreira CHV, Ianni BM, Ramires FJA, Lopes RD, Sabino EC, Mady C; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Fernandes F, Moreira CHV, di Lorenzo C, Cunha-Neto E, Lopes RD, Sabino EC, Mady C.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Ambos os autores contribuíram igualmente como primeiro autor.

 01 03 2021 02 2021 116 2 248 256 02 07 2019 29 11 2019 27 12 2019 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

As características histopatológicas da doença de Chagas (DCC) são: presença de miocardite, destruição das fibras cardíacas e fibrose miocárdica. A Galectina-3 (Gal-3) é um biomarcador envolvido no mecanismo de fibrose e inflamação que pode ser útil para a estratificação de indivíduos com DCC por risco.

 Objetivos

Nosso objetivo foi avaliar se níveis elevados de Gal-3 estão associados a formas graves de cardiomiopatia chagásica (CC) e são preditivos de mortalidade.

 Métodos

Estudamos doadores de sangue (DS) positivos para anti-T. cruzi: não-CC-DS (187 DS sem CC com eletrocardiograma [ECG] e fração de ejeção do ventrículo esquerdo [FEVE] normais); CC-Não-Dis-DS (46 DS com CC e apresentando ECG anormal, mas FEVE normal); e 153 controles negativos correspondentes. Esta amostra foi composta por 97 pacientes com CC grave (CC-Dis). Usamos as correlações de Kruskall-Wallis e Spearman para testar a hipótese de associações, assumindo um p bicaudal <0,05 como significativo.

 Resultados

O nível de Gal-3 foi de 12,3 ng/mL para não-CC-DS, 12,0 ng/mL para CC-Não-Dis-DS, 13,8 ng/mL para controles e 15,4 ng/mL para CC-Dis. FEVE <50 foi associada a níveis mais elevados de Gal-3 (p=0,0001). Em nosso modelo de regressão linear ajustado, encontramos associação entre os níveis de Gal-3 e os parâmetros do ecocardiograma em indivíduos positivos para T. cruzi. Nos pacientes CC-Dis, encontramos uma associação significativa de níveis mais elevados de Gal-3 (≥15,3 ng/mL) e morte ou transplante cardíaco em acompanhamento de cinco anos (Hazard ratio – HR 3,11; IC95% 1,21– 8,04; p=0,019).

 Conclusões

Em pacientes com CC, níveis mais elevados de Gal-3 estiveram significativamente associados a formas graves da doença e maior taxa de mortalidade em longo prazo, o que significa que pode ser um meio efetivo para identificar pacientes de alto risco. (Arq Bras Cardiol. 2021; 116(2):248-256)

 Doença de Chagas Cardiomiopatia Chagásica Mortalidade Galectina 3 Biomarcadores Eletrocardiografia/métodos Insuficiência Cardíaca Introdução

A cardiomiopatia chagásica (CC), uma das principais causas de cardiopatia e morte na América Latina, tem um prognóstico ruim em comparação às cardiomiopatias não inflamatórias.1

O curso natural da doença de Chagas (DCC) envolve uma fase aguda, seguida da fase crônica. Ainda não se sabe, entretanto, quais pacientes têm maior probabilidade de progredir para as formas graves. Lesão direta pelo parasita, inflamação desencadeada pelo sistema imunológico e disfunção autonômica são fatores importantes na patogênese da CC. Quando o tecido cardíaco sofre lesão, a fibrose de substituição parece ser uma causa de desorganização estrutural e geométrica, e prejuízo funcional do coração.2

A galectina-3 (Gal-3) é secretada por macrófagos ativados e está envolvida na fibrogênese da insuficiência cardíaca (IC). Tal biomarcador foi recentemente associado ao desenvolvimento de IC e mortalidade. Em um modelo experimental de DCC, a Gal-3 promoveu infiltração celular no coração e fibrose.3,4

A falta de um bom marcador de infecção ativa ou CC incipiente torna o desenvolvimento de novos tratamentos nessa população um desafio. O uso de biomarcadores que podem prever com precisão os resultados clínicos na CC teria o potencial de orientar a terapia, identificando pacientes com maior risco e que necessitariam de intervenção mais precoce, intensiva e personalizada.5

O objetivo do nosso estudo foi avaliar se níveis elevados de Gal-3 estão associados a formas graves da CC e se trata-se de um fator preditivo de mortalidade ou necessidade de transplante cardíaco.

 Métodos Desenho do Estudo

As amostras foram coletadas durante o Retrovirus Epidemiology Donor Study-II (REDS-II),6 um estudo retrospectivo em que doadores de sangue (DS) soropositivos para T. cruzi foram identificados por triagem em bancos de sangue em 1996-2002 (233 da cidade de São Paulo), além de 153 doadores-controle soronegativo (pareados por ano de doação, idade e sexo). A amostra foi composta por 97 casos de CC previamente diagnosticados pelo Instituto do Coração (INCOR) da Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo. De julho de 2008 a outubro de 2010, indivíduos recrutados (pacientes DS e com CC) preencheram questionários de saúde e passaram por avaliações médicas, incluindo eletrocardiograma (ECG), ecocardiograma (ECO) e flebotomia com processamento e criopreservação de amostras para subsequentes análises cegas em lote de marcadores cardíacos, reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção de T. cruzi e outros biomarcadores (ver abaixo).

Primeiro, realizamos um estudo transversal em que participantes positivos para T. cruzi preencheram um questionário e passaram por uma avaliação médica (parâmetros laboratoriais, ECG e ECO), resultando em grupos estratificados pelo status da CC. Em seguida, foi realizado um estudo de coorte longitudinal, no qual 97 pacientes soropositivos para T. cruzi, portadores de formas crônicas e mais graves de CC, foram acompanhados em um serviço ambulatorial do INCOR, onde havia dados sobre “tempo até o evento”.

Todas as amostras de sangue foram coletadas em tubos de EDTA e de soro, processadas para detecção do parasita ou submetidas à centrifugação e divididas em alíquotas. Todas as amostras foram congeladas no Brasil a -20 °C até o envio ao Laboratório Central REDS-II (Blood Systems Research Institute, San Francisco, CA) em gelo seco e mantidas a -70 °C.

Foram criados quatro grupos: um grupo controle soronegativo e três grupos soropositivos para T. cruzi: DS sem cardiomiopatia, apresentando ECG normal e fração de ejeção ventricular esquerda (FEVE) (Não-CC-DS); DS com CC e apresentando anormalidades no ECG, mas função sistólica normal (CC-Não-Dis-DS); e participantes com CC e disfunção ventricular esquerda (CC-Dis). A disfunção foi definida como FEVE <50% identificada no ECO.

Os dados relativos à análise de tempo até o evento estavam disponíveis apenas para os indivíduos do grupo CC-Dis. De julho a setembro de 2015, procedemos com a análise do prontuário e ligações para os pacientes com CC-Dis para monitorar eventos e anotar as respectivas datas.

Os comitês de ética locais aprovaram o protocolo do estudo e todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

 Procedimentos PCR

Coletamos de cada participante 20 mL de sangue anticoagulado com EDTA que foram imediatamente misturados com igual volume de solução de cloridrato de guanidina 6M/EDTA -0,2 M. O teste de PCR em tempo real de captura de alvo utilizado neste estudo foi desenvolvido com base no método PCR descrito por Virreira et al.,7 visando o DNA do minicírculo mitocondrial do cinetoplasto T. cruzi. A extração do DNA foi aprimorada com uma etapa de captura do alvo usando esferas magnéticas revestidas com um oligonucleotídeo de captura 20-mer específico para T. cruzi.

 Medidas Cardíacas

Foram registrados ECGs de repouso de 12 derivações (eletrocardiógrafo General Electric MAC 1200; GE Healthcare, Waukesha, WI).8,9

Os ecocardiogramas foram realizados em aparelho de ultrassom SequoiaTM 512 (Acuson, Mountain View, CA), de acordo com as diretrizes da American Society of Echocardiography.10,11 Os estudos foram gravados em formato digital e todas as medidas foram feitas em loops digitais, em uma estação de análise offline Digisonics (software versão 3.2; Digisonics, Houston, TX) no laboratório de ecocardiografia do departamento cardiovascular, no National Heart, Lung, and Blood Institute (Bethesda, MD).12

 Biomarcadores Solúveis

Biomarcadores associados à infecção por T. cruzi foram descritos anteriormente.12 Amostras de plasma foram testadas usando kits Milliplex (Millipore) com grânulos revestidos de anticorpo para detecção do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina (IL) 6 (IL-6), IL-8, IL-10 e interferon gama (IFNγ). Curvas e amostras-padrão foram testadas em duplicata. Os resultados foram adquiridos em um analisador Labscan 200 (Luminex) usando o software gerenciador Bio-Plex v6.1 (Bio-Rad). O IFN- esteve, na maioria dos casos, abaixo do limiar de detecção (57%).

As concentrações de peptídeo natriurético do tipo B (NT-proBNP) e troponina foram medidas em testes aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) no Sistema VITROS (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ).

Os níveis plasmáticos de Gal-3 foram determinados por um teste de fluorescência ligada à enzima e medidos em um sistema BioMerieux Vidas 30 (BioMerieux, Marcy l’Etoile, Lyon, França), seguindo as recomendações do fabricante.

 Análise Estatística

A normalidade foi avaliada pelo teste de Shapiro-Wilk. As variáveis contínuas sem distribuição normal foram: idade, níveis de Gal-3, fração de ejeção e outros biomarcadores cardíacos e inflamatórios, todos expressos em mediana e intervalo interquartil. As diferenças entre os grupos quanto às variáveis foram comparadas com o teste de Kruskal-Wallis, enquanto o teste do qui-quadrado ou de Fisher e a regressão logística foram usados para avaliar o tipo e a distribuição das variáveis. As classificações na análise de variância de um critério e análise post-hoc foram feitas por meio do teste de Dunn para avaliar as diferenças de valores medianos entre os grupos com ajuste de Bonferroni para comparações múltiplas. As correlações foram analisadas pela correlação de Spearman, reportando-se valores de p.

Curvas de características de operação do receptor (curva ROC) foram criadas para as variáveis Gal-3 e NT-proBNP para otimizar a definição do ponto de corte que melhor discriminaria o evento durante o acompanhamento, e foi identificada uma área sob a curva ROC (AUC). Ambas foram comparadas pelos testes DeLong e qui-quadrado.

Para a análise de tempo até o evento, o grupo CC-Dis foi dividido em dois perfis em relação aos valores de corte para Gal-3 e NT-proBNP: Gal-3 ou NT-proBNP baixos (≤ valor de corte) e Gal-3 ou NT-proBNP altos (≥ valor de corte). A incidência de eventos cumulativos nos estratos Gal-3 e NT-proBNP e o valor aditivo de Gal-3 em relação ao NT-proBNP foram analisados por um método semelhante a Kaplan-Meier, seguido do teste log-rank.

Modelos de regressão de risco proporcional de Cox bivariados e multivariados foram construídos para avaliar a associação dos valores de Gal-3 e NT-proBNP (abaixo versus acima ou igual ao valor de corte) com incidentes e eventos. Os modelos foram ajustados para sexo, idade, creatinina sérica, classificação da New York Heart Association (NYHA) e FEVE; Intervalos de confiança de 95% (IC) foram usados para representar a associação de cada marcador com os eventos no modelo final de risco proporcional de Cox ajustado. A sensibilidade foi analisada usando os valores de Gal-3 e NT-proBNP como variáveis contínuas. Valor de p<0,05 bicaudal foi considerado significativo.

Todos os gráficos e análises estatísticas foram feitos no software Stata (versão 13.0, Stata Corp., College Station, TX).

 Resultados

Dos 570 participantes originais do REDS-II, 483 tinham amostras disponíveis para o teste Gal-3; 153 eram negativos para T. cruzi e os demais foram classificados em três grupos: 187 Não-CC-DS apresentando ECG e FEVE normais; 46 CC-não-Dis; e 97 CC-Dis (Figura 1).

– Fluxograma de inclusão. CC: cardiomiopatia chagásica; Não-CC-DS: doadores de sangue com sorologia positiva para T. cruzi e sem cardiomiopatia, apresentando eletrocardiograma (ECG) e fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) normais; CC-Não-Dis-DS: doadores de sangue com sorologia positiva para T. cruzi apresentando anormalidades no ECG e FEVE normal em repouso; CC-Dis: pacientes com sorologia positiva para T. cruzi e CC, com disfunção ventricular esquerda.

Características Clínicas e Biomarcadores dos Pacientes

As características demográficas e clínicas estão descritas na Tabela 1. Os níveis de Gal-3 estavam mais altos nos pacientes do grupo CC-Dis, em comparação com outros grupos clínicos. Níveis mais elevados de Gal-3 também foram observados nos controles quando comparados aos não-CC-DS. Não observamos diferenças significativas nos níveis de Gal-3 entre Não-CC-DS e CC-não-Dis-DS, ou entre CC-não-Dis-DS e controles. Marcadores inflamatórios (TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10), bem como biomarcadores associados à disfunção ou dano cardíaco (NT-proBNP e troponina) estavam elevados em pacientes com CC-Dis em comparação aos outros grupos (Tabela 1).

– Achados clínicos, laboratoriais e ecocardiográficos
Não-CC-DS CC-não-Dis-DS CC-Dis Controles
n=187 (38,6%) n=46 (9,5%) n=97 (20,2%) n=153 (31,6%) valor de p
Idade (anos) 49 [41-58] 50 [44-59] 48,5 [43-54] 48 [42-55] 0,20
Masculino, n (%) 110 (58,8) 29 (63) 59 (60,2) 89 (58,2) 0,39
Fração de ejeção (%) 63 [60-65] 60 [55-65] 30 [20-40] 64 [60-65] <0,001*
Biomarcadores cardíacos
Galectina-3 (ng/mL) 12,3 [10-15,4] 12,0 [9,5-14,9] 15,4 [11,8-19,8] 13,8 [11,2-16,2] <0,001†
NT-proBNP (pg/mL) 40,6 [23,6-66,8] 59 [35,0-109,1] 748 [379,20-2223,41] 27,5 [19,3-48,1] <0,001‡
Troponina 0,012 [0,01-0,012] 0,012 [0,012-0,015] 0,021 [0,12-0,03] 0,012 [0,012-0,012] <0,001§
Marcadores inflamatórios
TNF-α 2,94 [1,64-4,59] 3,02 [1,25-4,69] 3,65 [2,57-5,52] 2,84 [1,62-3,91] 0,002#
IL-6 0,69 [0,32-1,63] 0,77 [0,32-1,8] 1,60 [0,64-3,13] 1,14 [0,32-1,7] <0,001**
IL-8 1,61 [0,95-2,79] 1,53 [0,99-2,5] 2,23 [1,38-3,2] 1,44 [0,95-2,54] 0,003††
IL-10 1,28 [0,32-4] 2,02 [0,32-4,11] 4,37 [1,62-8,06] 1,22 [0,32-3,35] <0,001‡‡
IFN-γ 0,32 [0,32-0,64] 0,32 [0,32-0,84] 0,32 [0,32-1,07] 0,32 [0,32-0,39] 0,06
Carga parasitária
Estimativa do parasita por 20mL 0,05 [0-2,5] 0,68 [0,03-5,47] 1,77 [0,16-5] - <0,001§§

Valores de p foram reportados para os testes de hipótese post-hoc de Kruskal-Wallis e Dunn.

Mediana [intervalo interquartil] reportada para todos os biomarcadores testados. Não-CC-DS, doadores de sangue sem cardiomiopatia chagásica; CC-Não-Dis-DS, doadores de sangue com cardiomiopatia chagásica; CC-Dis, pacientes com cardiomiopatia chagásica e disfunção cardíaca; NT-proBNP, N-terminal do pró-hormônio do peptídeo natriurético do tipo B; TNF, fator de necrose tumoral; IL, interleucina; IFN, interferon.

* Diferença estatisticamente significativa nos níveis de fração de ejeção entre Não-CC-DS /CC-Dis (p<0.001); CC-Não-Dis-DS/CC-Dis (p<0,001); CC-Não-Dis-DS/controles (p=0,042); CC-Dis/controles (p<0,001).

†Diferença estatisticamente significativa nos níveis de Gal-3 entre Não-CC-DS/CC-Dis (p<0,001); Não-CC-DS/controles (p=0,010); CC-Não-Dis-DS/CC-Dis (p<0,001); CC-Dis/controles (p=0,028).

‡Diferença estatisticamente significativa nos níveis de NT-proBNP entre Não-CC-DS/CC-Dis (p<0,001); Não-CC-DS/controles (p=0.004); CC-Não-Dis-DS/CC-Dis (p<0,001); CC-Não-Dis-DS/controles (p<0,001); CC-Dis/controles (p<0,001).

§ Diferença estatisticamente significativa nos níveis de troponina entre Não-CC-DS/CC-Dis (p=0,024); Não-CC-DS/CC-controles (p<0,001); CC-Não-Dis-DS/CC-Dis (p<0,001); CC-Não-Dis-DS/controles (<0,001); CC-Dis/controles (p<0,001).

#Diferença estatisticamente significativa nos níveis de TNF-α entre Não-CC-DS/CC-Dis (p=0,019); CC-Dis/controles (p<0,001).

**Diferença estatisticamente significativa nos níveis de IL-6 entre Não-CC-DS/CC-Dis (p<0,001); CC-Não-Dis-DS/CC-Dis (p=0,032); CC-Dis/controles (p=0,004).

††Diferença estatisticamente significativa nos níveis de IL-8 entre Não-CC-DS/CC-Dis (p=0,016); CC-Não-Dis-DS/CC-Dis (p=0,039); CC-Dis/controles (p=0,001).a

‡‡ Diferença estatisticamente significativa nos níveis de IL-10 entre Não-CC-DS/CC-Dis (p<0,001); CC-Não-Dis-DS/CC-Dis (p=0,001); CC-Dis/controles (p<0,001).

§§ Diferença estatisticamente significativa na estimativa do parasita por 20mL entre Não-CC-DS/CC-Dis (p=0,011); Não-CC-DS/controles (p<0,001).

A PCR positiva para T. cruzi indicou diferença estatisticamente significativa entre os grupos Não-CC-DS e CC: CC-Não-Dis-DS (p=0,010) e CC-Dis. Por outro lado, não foi observada diferença na parasitemia ao comparar os grupos CC-Não-Dis-DS e CC-Dis (Tabela 1). Também não encontramos diferença significativa em pacientes com CC-Dis entre a PCR para T. cruzi e a ocorrência do evento. Nenhuma associação significativa entre PCR para T. cruzi e Gal-3 foi encontrada.

A correlação de Spearman foi aplicada entre os indivíduos infectados por T. cruzi, para avaliar a relação entre Gal-3 e biomarcadores cardíacos, mediadores inflamatórios e carga parasitária. Houve uma correlação fraca para TNF-α (rs=0,25, p<0,001) e IL-8 (rs=0,22, p<0,001). Nenhuma associação entre Gal-3 e troponina, NT-proBNP, IL-6, IL-10, IFNγ, ou com carga parasitária foi observada.

O ecocardiograma foi realizado, correlação de Spearman, para verificar qualquer relação entre os níveis de Gal-3 e parâmetros ecocardiográficos em pacientes infectados por T. cruzi. Nenhuma correlação estatisticamente significativa moderada ou forte foi encontrada entre os níveis de Gal-3 e o diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo (DDFVE) (rs=0,09, p=0,07), dimensão sistólica final do ventrículo esquerdo (DSFVE) (rs=0,11, p=0,03), FEVE (rs=-0,16, p=0,001), diâmetro do átrio esquerdo (rs=0,11, p=0,02), volume atrial esquerdo indexado à área de superfície corporal (rs=0,09, p=0,18), área do átrio direito (rs=0,032, p=0,53) e relação E/e’ septal (rs=0,135, p=0,009).

 Sobrevivência e Análise de Risco

Os dados sobre tempo até o evento estavam disponíveis para 97 pacientes, com seguimento médio de 51,2 ± 10,8 meses e mediana de 58 meses (variação: 8 a 60 meses). Foram observados eventos em 28 pacientes (29%): três (10,8%) transplantes cardíacos e 25 (89,2%) óbitos por todas as causas. Entre os pacientes envolvidos em eventos, as concentrações médias de Gal-3 e NT-pro-BNP foram significativamente maiores, enquanto a fração de ejeção foi significativamente menor. Idade, sexo, classe NYHA>I, fração de ejeção na ecocardiografia e dados laboratoriais de pacientes com evento relatado estão na Tabela 2.

– Informações demográficas e laboratoriais dos pacientes com CC-Dis segundo óbito ou transplante cardíaco
Sem eventos Eventos valor de p
(n=69) (n=28)
Idade (anos) 49 [42-54] 47,5 [44,5-52] 0,96
Masculino, n (%) 42 (61%) 16 (57%) 0,73
Creatinina (mg/dL) 1,01 [0,85-1,14] 1,14 [0,87-1,23] 0,06
Fração de ejeção (%) 35 [25-40] 20 [20-30] 0,001
NYHA >1 29 20 0,009
Galectina-3 (ng/mL) 14,4 [10,9-19,1] 18,5 [14,7-23,4] 0,005
Baixo 39 7
Alto 30 21
NT-proBNP (pg/mL) 542 [281-1337] 2643 [1047-4771] <0,001
Baixo 50 7
Alto 19 21
Estimativa parasitária* 1,77 [0,19-4,2] 1,25 [0,16-12,61] 0,08

Mediana [25º, 75º percentil) por morte ou transplante de coração como resultado. CC-Dis: pacientes com sorologia positiva para T. cruzi e CC com disfunção ventricular esquerda; NT-proBNP: N-terminal do pró-hormônio do peptídeo natriurético do tipo B; NYHA: New York Heart Association. Galectina-3 baixa = <15,3 ng/mL; NT-proBNP baixo = <1278 pg/mL. *Carga parasitária por 20mL.

O valor de corte da Gal-3 (<15,3 ng/mL) pela curva ROC foi usado para dividir os indivíduos CC-Dis em dois estratos (níveis baixo e alto), assim como o valor de corte de NT-proBNP (<1278 pg/mL). A curva ROC identificou o potencial de se alcançar um evento. Embora a AUC do NT-proBNP fosse maior do que a AUC da Gal-3, não houve diferenças (p=0,22).

Após o ajuste para sexo, idade, função renal, classe funcional da NYHA> I e FEVE, encontramos uma associação significativa de níveis mais elevados de Gal-3 com eventos subsequentes em acompanhamento de cinco anos (Tabela 3 e Figura 2). Além disso, o risco de eventos também aumentou à medida que os níveis de NT-proBNP aumentaram (Tabela 3). Resultados semelhantes foram observados quando Gal-3 e NT-proBNP (por aumento de 100 unidades) foram analisados como variáveis contínuas (Apêndice).

– Associação entre galectina-3 e morte ou transplante cardíaco no subgrupo CC-Dis, analisada por meio de modelos de regressão Cox e curva ROC, ambos brutos e ajustados para idade, sexo, nível de creatinina sérica, classe funcional NYHA>I e LVEF, e usando Galectina -3 e NT-proBNP como variáveis categóricas
Modelo bruto Modelo ajustado
AUC Valor de corte Nível de corte p RR (IC95%) p RR (IC95%)
Galectina-3 (ng/mL) 0,71 15,3 Baixo
Alto 0,007 3,27 (1,39-7,71) 0,04 2,63 (1,00-6,90)
NT-proBNP (pg/mL) 0,80 1278 Baixo
Alto <0,001 5,69 (2,41-13,42) 0,02 3,44 (1,21-9,78)

AUC: área sob a curva ROC; IC: intervalo de confiança; RR: razão de risco; FEVE: fração de ejeção do ventrículo esquerdo; NT-proBNP: N-terminal do pró-hormônio do peptídeo natriurético do tipo B; NYHA: New York Heart Association; ROC: curva característica de operação do receptor.

– Curvas de tempo até o evento entre os níveis de Gal-3. Curvas de tempo até o evento entre níveis estratificados de Gal-3 em CC-Dis. Valor de corte: Gal-3 <15,3 ng/mL.

Entre os pacientes que apresentam níveis mais elevados de Gal-3, houve diferenças nos eventos quando dicotomizados com ambos os estratos de NT-proBNP: os pacientes com níveis de NT-proBNP adicionalmente elevados tiveram probabilidade maior de evento do que os pacientes com NT-proBNP baixo. Além disso, os pacientes nos estratos de Gal-3 mais baixos, quando dicotomizados pelos níveis de NT-proBNP, foram mais propensos a qualquer evento quando o NT-proBNP era mais alto (Figura 3).

– Taxas de eventos em 5 anos em função das concentrações de Gal-3 e NT-proBNP entre pacientes com CC. A porcentagem de pacientes que experimentaram algum evento é mostrada para cada grupo. Gal-3 baixa: valores <15,3 ng/mL; Gal-3 alta: valores ≥15,3 ng/mL; NT-proBNP baixo: valores <1.278 pg/mL; NT-proBNP alto: valores ≥1.278 pg/mL.

Pacientes nos estratos mais altos de Gal-3 e NT-proBNP tiveram um risco 11 a 16 vezes maior de evento em comparação com pacientes com os níveis de biomarcadores mais baixos (RR não ajustado, 16,22; IC95%: 3,71-70,83; p<0,001; RR ajustada, 11,39; IC95%: 1,97–65,76; p=0,007). Indivíduos com Gal-3 baixa e NT-proBNP baixo tiveram as taxas de eventos mais baixas.

 Discussão

Níveis aumentados de Gal-3 foi um fator significativamente associado a formas graves de DCC e preditivo de morbidade/mortalidade subsequente.

Gal-3 é um biomarcador emergente que modula vários processos fisiológicos que contribuem para a IC, inflamação e fibrose.13-15 A inflamação é um pré-requisito para a recuperação do tecido e formação de cicatriz,16 e a Gal-3 teve um papel importante como mediador em infecções parasitárias, virais14,17 e bacterianas revelado.18 Na DCC, estudos experimentais mostraram que a Gal-3 tem expressão regulada positivamente após a infecção por T. cruzi em células dendríticas, células B19,20 e macrófagos CD68+. Os macrófagos CD68+ representam 50% do infiltrado de células mononucleares em corações com CC.21

O T. cruzi e vários mecanismos imunomediados têm um envolvimento direto na CC. Estudos anteriores reportaram que a Gal-3 se liga ao 45KD, aumentando sua adesão à matriz extracelular e até mesmo sua entrada nas células. Outros estudos já demonstraram a importância da Gal-3 no processo inicial de infecção pelo T. cruzi, pois ela permite que o parasita se acumule na matriz extracelular antes de invadir as células hospedeiras.22,23

Um modelo experimental de infecção aguda por T. cruzi mostrou que a indução de miocardite estava associada à suprarregulação de Col I, Gal-3, IFN- e IL-13.21 A Gal-3 foi detectada principalmente em células intersticiais e em níveis mais altos em áreas fibróticas. Nas áreas de fibrose miocárdica, a intensidade da miocardite e o remodelamento extracelular significativo da matriz foram correlacionados com a presença de Col I e Gal-3. Além disso, os miofibroblastos podem induzir a fibrose, que resulta em rigidez miocárdica e disfunção cardíaca. É importante ressaltar que os miofibroblastos também são uma fonte significativa de citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF- e IL-1, que têm um conhecido efeito deletério no miocárdio. No entanto, não encontramos nenhuma associação significativa entre Gal-3 e marcadores inflamatórios.

Sabino et al.,24 compararam a detecção do DNA do T. cruzi com marcadores clínicos e laboratoriais conhecidos de gravidade da CC e observaram que a presença de parasitemia estava associada a marcadores de progressão da doença, como duração do intervalo QRS e QT, menor FEVE e elevação de níveis de troponina e NT-proBNP. Observou-se, também, que a detecção do DNA do T. cruzi foi significativamente maior nos pacientes com cardiomiopatia em comparação ao grupo Não-CC-DS; entretanto, a PCR para T. cruzi não se correlacionou com a Gal-3. Também não houve diferença significativa na detecção do DNA do T. cruzi entre pacientes com CC com e sem disfunção, nem entre pacientes com CC que experimentaram ou não eventos. Assim, em nosso estudo, o parasitismo foi um marcador de alterações típicas da cardiomiopatia no ECG, mas não da gravidade da doença ou do prognóstico clínico.

De Boer et al.,25 sugeriram que a Gal-3 provavelmente representa um fenótipo único de alto risco para o desenvolvimento e progressão de IC ou outras doenças cardiovasculares. Elevações crônicas da Gal-3 induzem fibrogênese ativa e podem provocar remodelação cardíaca patológica. De Boer et al.25 também levantaram a hipótese de que pacientes com esse fenótipo de superexpressão de Gal-3 são mais propensos a ter uma via “fibrogênica” para a remodelação cardíaca. Em nosso estudo, níveis elevados de Gal-3 foram associados à forma mais grave de cardiomiopatia, mas sem uma forte associação com parâmetros ecocardiográficos. Assim, os níveis de Gal-3 definiram uma população com doença mais grave, caracterizada por disfunção ventricular sistólica e diastólica esquerda, maior diâmetro diastólico esquerdo e direito e níveis elevados de NT-proBNP e troponina.

Echeverria et al.,26 examinaram o valor diagnóstico de um painel de biomarcadores para distinguir a gravidade da CC e não encontraram associações entre os níveis de sST2 e Gal-3. No entanto, a amostra era pequena e não incluiu pacientes com estádio A (T. cruzi positivo, mas ECG e ecocardiografia normais), o que poderia ter permitido uma análise do papel dos biomarcadores em pacientes assintomáticos, já que eles também não fornecem qualquer informação prognóstica de Gal-3.

Encontramos níveis de Gal-3 mais elevados no grupo controle em comparação ao grupo Não-CC-DS. No entanto, os valores foram menores em comparação ao grupo CC-Dis. Sabe-se, desde os estudos pioneiros de Carlos Chagas,27 que até 60% dos pacientes infectados não apresentam evidências que sugiram envolvimento cardiovascular ou gastrointestinal. Acredita-se que esses indivíduos tenham a forma denominada “indeterminada”, definida em nosso estudo como Não-CC-DS. Como resultado, a sobrevida nesse grupo de pacientes parece ser comparável à da população geral. Nossos resultados mostraram baixos níveis de Gal-3 neste grupo, o que suporta este conceito.

O fenótipo da galectina-3 é um fator importante no início e progressão da IC. Sabe-se que pacientes com IC com baixos níveis de Gal-3 têm progressão lenta e resultados melhores do que pacientes com IC e altos níveis de Gal-3.25,28Mostrou-se que a Gal-3 pode prever o desenvolvimento de mortalidade por todas as causas e IC na população geral,28 além de ser usada para definir e identificar pacientes com IC em risco muito baixo de mortalidade em 30 e 180 dias, e de reinternações por IC após um episódio agudo.29 Uma metanálise feita por Chen et al.30 relatou a Gal-3 sérica como fator preditor de mortalidade por todas as causas e mortalidade cardiovascular em pacientes com IC.30

O achado mais surpreendente de nosso estudo foi a relação entre a Gal-3 e o risco de eventos entre pacientes com CC. Como Gal-3 e NT-proBNP foram preditores independentes de eventos adversos, também mostramos que o aumento de ambos os marcadores estava associado às taxas mais altas de morte ou transplante cardíaco em pacientes com CC.

Limitações do Estudo

Este foi um estudo realizado em um único centro, com uma amostra relativamente pequena. Além disso, fizemos apenas uma medida pontual de Gal-3 e NT-proBNP e, portanto, não avaliamos mudanças dinâmicas nesses biomarcadores ao longo do tempo. Outra limitação foi a utilização de testes não paramétricos para analisar associações entre variáveis contínuas, resultando em perda de eficiência.

 Conclusões

Níveis elevados de Gal-3 no plasma foram significativamente associados à disfunção cardíaca e gravidade da CC. Nossos resultados sugerem que uma abordagem baseada em biomarcadores para estratificação de risco em pacientes com DCC pode ajudar os médicos a identificar pacientes com maior probabilidade resultados desfavoráveis e, potencialmente, guiá-los no desenvolvimento de estratégias de tratamento para este grupo de alto risco.

 Agradecimentos

Agradecemos a Biomerieux pela doação dos kits de Galectina-3.

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Vinculação Acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

* Material suplementar

Para informação adicional, por favor, clique aqui.

Fontes de Financiamento.O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

 Original Article Galectin-3 Associated with Severe Forms and Long-term Mortality in Patients with Chagas Disease 0000-0002-9323-8805 Fernandes Fábio * 1 0000-0002-4187-5482 Moreira Carlos Henrique Valente * 2 Oliveira Lea Campos 3 Souza-Basqueira Marcela 3 Ianni Barbara Maria 1 Lorenzo Claudia di 3 0000-0003-2437-2485 Ramires Felix José Alvarez 1 Nastari Luciano 1 Cunha-Neto Edecio 1 0000-0002-2740-0042 Ribeiro Antonio L. 4 Lopes Renato Delascio 5 Keating Sheila M. 6 Sabino Ester Cerdeira 3 0000-0002-8838-199X Mady Charles 1 Brasil Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina Hospital das Clínicas Instituto do Coração, São Paulo, SP- Brasil Brasil Instituto de Infectologia Emilio Ribas, São Paulo, SP - Brasil Brasil Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina, São Paulo, SP - Brasil Brasil Universidade Federal de Minas Gerais - Centro de Telessaúde - Hospital das Clínicas, Belo Horizonte, MG - Brasil EUA Duke University Hospital, Durham, North Carolina - EUA EUA Blood Systems Research Institute, San Francisco, Califórnia – EUA Mailing Address: Fábio Fernandes • Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina Hospital das Clínicas Instituto do Coração - Av. Dr. Eneas C. Aguiar, 44. Postal Code 05403-000, São Paulo, SP – Brazil E-mail: fabio.fernandes@incor.usp.br

Author contributions

Conception and design of the research: Fernandes F, Moreira CHV, Ianni BM, Ramires FJA, Nastari L, Cunha-Neto E, Ribeiro AL, Sabino EC, Mady C; Acquisition of data: Fernandes F, Moreira CHV, Souza-Basqueira M, di Lorenzo C, Nastari L, Ribeiro AL, Keating SM, Sabino EC; Analysis and interpretation of the data: Fernandes F, Moreira CHV, Souza-Basqueira M, Ianni BM, di Lorenzo C, Ramires FJA, Lopes RD, Keating SM, Sabino EC, Mady C; Statistical analysis: Moreira CHV, Ianni BM; Obtaining financing: Fernandes F, Ramires FJA, Nastari L, Sabino EC, Mady C; Writing of the manuscript: Fernandes F, Moreira CHV, Ianni BM, Ramires FJA, Lopes RD, Sabino EC, Mady C; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Fernandes F, Moreira CHV, di Lorenzo C, Cunha-Neto E, Lopes RD, Sabino EC, Mady C.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Both authors contributed equally as first author.

 Abstract Background

The histopathological characteristics of Chagas disease (ChD) are: presence of myocarditis, destruction of heart fibers, and myocardial fibrosis. Galectin-3 (Gal-3) is a biomarker involved in the mechanism of fibrosis and inflammation that may be useful for risk stratification of individuals with ChD.

 Objectives

We sought to evaluate whether high Gal-3 levels are associated with severe forms of Chagas cardiomyopathy (CC) and whether they are predictive of mortality.

 Methods

We studied anti-T. cruzi positive blood donors (BD): Non-CC-BD (187 BD without CC with normal electrocardiogram [ECG] and left ventricular ejection fraction [LVEF]); CC-Non-Dys-BD (46 BD with CC with abnormal ECG but normal LVEF); and 153 matched serum-negative controls. This cohort was composed of 97 patients with severe CC (CC-Dys). We used Kruskall-Wallis and Spearman’s correlation to test hypothesis of associations, assuming a two-tailed p<0.05 as significant.

 Results

The Gal-3 level was 12.3 ng/mL for Non-CC-BD, 12.0 ng/mL for CC-Non-Dys-BD, 13.8 ng/mL for controls, and 15.4 ng/mL for CC-Dys. LVEF<50 was associated with higher Gal-3 levels (p=0.0001). In our linear regression adjusted model, we found association between Gal-3 levels and echocardiogram parameters in T. cruzi-seropositive subjects. In CC-Dys patients, we found a significant association of higher Gal-3 levels (≥15.3 ng/mL) and subsequent death or heart transplantation in a 5-year follow-up (Hazard ratio – HR 3.11; 95%CI 1.21–8.04; p=0.019).

 Conclusions

In ChD patients, higher Gal-3 levels were significantly associated with severe forms of the disease and more long-term mortality, which means it may be a useful means to identify high-risk patients. (Arq Bras Cardiol. 2021; 116(2):248-256)

 Chagas Disease Chagas, Cardiomyopathy Mortality Galectin-3 Biomarkers Electrocardiography/methods Heart Failure Introduction

Chagas cardiomyopathy (CC), one of the leading causes of heart disease and death in Latin America, has a poor prognosis compared to noninflammatory cardiomyopathies.1

The natural history of Chagas disease (ChD) involves an acute phase, followed by the chronic phase. It is still unknown, however, which patients are more likely to progress to severe forms. Direct parasite injury, inflammation triggered by the immune system, and autonomic dysfunction are role-players in the pathogenesis of CC. When the cardiac tissue is injured, replacement fibrosis appears to be a cause of structural disorganization, geometry, and functional heart impairment.2

Galectin-3 (Gal-3) is secreted by activated macrophages and is involved in the fibrogenesis of heart failure (HF). This biomarker has recently been linked to development of HF and mortality. In an experimental model of ChD, Gal-3 promoted cell infiltration in the heart and fibrosis.3,4

The lack of a good marker of active infection or incipient CC makes the development of new treatments in this population a challenge. The use of biomarkers that can accurately predict clinical outcomes in CC would have the potential to guide therapy, by identifying patients at higher risk and who would need an earlier, more intensive, and personalized strategy.5

The aim of our study was to evaluate whether high Gal-3 levels are associated with severe forms of CC and whether it is a predictive factor for subsequent mortality or the need for heart transplantation.

 Methods Study Design

Samples were collected during the Retrovirus Epidemiology Donor Study-II (REDS-II),6 a retrospective cohort study in which T. cruzi-seropositive blood donors (BD) were identified by screening blood banks in 1996-2002 (233 from the city of Sao Paulo), in addition to 153 serum-negative control BDs (matched by year of donation, age and gender). This cohort of BD was composed of 97 previously diagnosed cases of CC from the Heart Institute (INCOR) of the Medical School of Universidade de São Paulo. From July 2008 to October 2010, recruited individuals (BD and CC patients) filled in health questionnaires and went through medical evaluations, including electrocardiogram (ECG), echocardiogram (ECHO), and phlebotomy with processing and cryopreservation of samples for subsequent batched blinded analyses of cardiac markers, polymerase chain reaction (PCR) for detection of T. cruzi, and other biomarkers (see below).

First, we performed a cross-sectional study in which T. cruzi-seropositive participants filled in a questionnaire and received a medical evaluation (laboratory, ECG, and ECHO parameters), resulting in groups stratified by CC status. Then, a longitudinal cohort study was carried out, in which 97 T. cruzi-seropositive patients suffering from chronic and more severe CC forms were followed up in an outpatient service from INCOR, in which time-to-event data was available.

All blood samples were collected in EDTA and serum tubes, processed for parasite detection, or submitted to spinning and divided in aliquots. All specimens were frozen in Brazil at -20°C until shipped to the REDS-II Central Laboratory (Blood Systems Research Institute, San Francisco, CA) on dry ice and maintained at -70°C.

Four groups were created: a control serum-negative group and three T. cruzi seropositive groups: BD without cardiomyopathy, presenting with normal ECG and left ventricular ejection fraction (LVEF) (Non-CC-BD); BD with CC, presenting with ECG abnormalities but normal systolic function (CC-Non-Dys-BD); and participants with CC and left ventricular dysfunction (CC-Dys). The dysfunction was defined as LVEF <50% upon ECHO.

Data regarding time-to-event analysis were available only for CC-Dys subjects. From July to September 2015, we proceeded with CC-Dys patients’ chart analysis and phone calls to monitor events and get respective dates.

The local ethics committees approved the study protocol, and all participants signed an informed consent form.

 PCR Procedures

From each participant, we collected 20 mL of EDTA-anti-coagulated blood that were immediately mixed with an equal volume of 6 M guanidine hydrochloride -0.2M EDTA solution. The target-capture real-time PCR assay used in this study was developed based on the PCR method described by Virreira et al.,7 targeting the kinetoplast T. cruzi mitochondrial minicircle DNA. The DNA extraction was improved with a target-capture step using magnetic beads coated with a T. cruzi-specific 20-mer capture oligonucleotide.

 Cardiac Measurements

Resting 12-lead ECGs were recorded (General Electric MAC 1200 electrocardiograph; GE Healthcare, Waukesha, WI).8,9

Echocardiograms were performed using a SequoiaTM 512 ultrasound machine (Acuson, Mountain View, CA), per guidelines by the American Society of Echocardiography.10,11 Studies were recorded in digital format, and all measurements were made on digital loops using a Digisonics offline analysis station (version 3.2 software; Digisonics, Houston, TX) at the Cardiovascular Branch, Echocardiography Laboratory, of the National Heart, Lung, and Blood Institute (Bethesda, MD).12

 Soluble Biomarkers

Biomarkers associated with T. cruzi infection have been previously described.12 Blinded plasma samples were tested using Milliplex kits (Millipore) with antibody-coated beads for detection of tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin (IL) 6 (IL-6), IL-8, IL-10, and interferon gamma (IFNγ). Standard curves and samples were tested in duplicate. Results were acquired on a Labscan 200 analyzer (Luminex) using the Bio-Plex manager software v6.1 (Bio-Rad). IFNγ was predominantly below the threshold of detection (57%).

Concentrations of N-terminal pro B-type natriuretic peptides (NT-proBNPs) and troponin were measured using U.S. Food and Drug Administration-cleared assays on the VITROS System (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, NJ).

Plasma Gal-3 levels were determined by an enzyme-linked fluorescence assay and measured on a BioMerieux Vidas 30 system (BioMerieux, Marcy l’Etoile, Lyon, France), following the manufacturer’s recommendations.

 Statistical Analyses

Normality was tested with the Shapiro-Wilk test. Continuous non-normally distributed variables were: age, Gal-3 levels, ejection fraction, and other cardiac and inflammatory biomarkers, being expressed as median and interquartile range. Differences between groups as to variables were compared using the Kruskal-Wallis test, while chi-squared or Fisher’s test and logistic regression were used to assess variable type and distribution. Use of ranks in one-criterion variance analysis and post-hoc analysis was made with Dunn’s test to evaluate median-value differences between the groups with Bonferroni adjustment for multiple comparisons. For analysis of correlations, the Spearman’s correlation was used, reporting p values.

Receiver operating characteristic (ROC) curves were performed for Gal-3 and NT-proBNP to optimize the definition of the cutoff points that would best discriminates the event at follow-up, and an area under the curve (AUC) were identified. Both curves were compared with DeLong and chi-squared tests.

For a time-to-event analysis, the CC-Dys group was divided in two profiles regarding Gal-3 and NT-proBNP cutoff values: low Gal-3 or NT-proBNP (≤ cutoff) and high Gal-3 or NT-proBNP (≥ cutoff). Analysis of incidence of cumulative events across Gal-3 and NT-proBNP strata and the additive value of Gal-3 relative to NT-proBNP was made by a Kaplan-Meier-like method followed by log-rank test.

Bivariate and multivariate Cox proportional-hazards regression models were constructed to evaluate the association of Gal-3 and NT-proBNP values (below versus above or equal to the cutoff value) with incident events. Models were adjusted for sex, age, serum creatinine, New York Heart Association (NYHA) classification and LVEF; 95% confidence intervals (CI) were used to depict the association of each marker and the events in the final fitted Cox proportional-hazards model. Sensitivity was analyzed using Gal-3 and NT-proBNP as continuous variables. A two-tailed p<0.05 was considered as significant.

All graphs and statistical analyses were made in the software Stata (version 13.0, Stata Corp., College Station, TX).

 Results

Of the original 570 participants in REDS-II, 483 had samples available for Gal-3 testing; 153 were anti-T. cruzi serum-negative BD, and the remainder were sorted into three groups: 187 Non-CC-BD presenting with normal ECG and LVEF; 46 CC-non-Dys; and 97 CC-Dys (Figure 1).

– Flowchart of inclusion. CC: Chagas cardiomyopathy; Non-CC-BD: blood donors with positive T. cruzi serology and without cardiomyopathy, presenting normal electrocardiogram (ECG) and left ventricular ejection fraction (LVEF); CC-Non-Dys-BD: blood donors with positive T. cruzi serology and presenting ECG abnormalities and normal LVEF at rest; CC-Dys: patients with positive T. cruzi serology and CC, with left ventricular dysfunction.

Patient Clinical and Biomarker Characteristics

Demographic and clinical characteristics are described in Table 1. Gal-3 levels were greater in patients from the CC-Dys group, than other clinical groups. Higher Gal-3 levels were also seen in controls when compared with Non-CC-BD. We did not observe significant differences in Gal-3 levels between Non-CC-BD and CC-non-Dys-BD, or between CC-non-Dys-BD and controls. Inflammatory markers (TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10), as well as biomarkers associated with, cardiac dysfunction or damage (NT-proBNP and troponin) were elevated in CC-Dys patients compared to other groups (Table 1).

– Clinical, laboratory, and echocardiographic findings
Non-CC-BD CC-Non-Dys-BD CC-Dys Controls
n=187 (38.6%) n=46 (9.5%) n=97 (20.2%) n=153 (31.6%) p-value
Age (y) 49 [41-58] 50 [44-59] 48.5 [43-54] 48 [42-55] 0.20
Male, n (%) 110 (58.8) 29 (63) 59 (60.2) 89 (58.2) 0.39
Ejection fraction (%) 63 [60-65] 60 [55-65] 30 [20-40] 64 [60-65] <0.001*
Cardiac biomarkers
Galectin-3 (ng/mL) 12.3 [10-15.4] 12.0 [9.5-14.9] 15.4 [11.8-19.8] 13.8 [11.2-16.2] <0.001†
NT-proBNP (pg/mL) 40.6 [23.6-66.8] 59 [35.0-109.1] 748 [379.20-2223.41] 27.5 [19.3-48.1] <0.001‡
Troponin 0.012 [0.01-0.012] 0.012 [0.012-0.015] 0.021 [0.12-0.03] 0.012 [0.012-0.012] <0.001§
Inflammatory markers
TNF-α 2.94 [1.64-4.59] 3.02 [1.25-4.69] 3.65 [2.57-5.52] 2.84 [1.62-3.91] 0.002#
IL-6 0.69 [0.32-1.63] 0.77 [0.32-1.8] 1.60 [0.64-3.13] 1.14 [0.32-1.7] <0.001 **
IL-8 1.61 [0.95-2.79] 1.53 [0.99-2.5] 2.23 [1.38-3.2] 1.44 [0.95-2.54] 0.003††
IL-10 1.28 [0.32-4] 2.02 [0.32-4.11] 4.37 [1.62-8.06] 1.22 [0.32-3.35] <0.001‡‡
IFN-γ 0.32 [0.32-0.64] 0.32 [0.32-0.84] 0.32 [0.32-1.07] 0.32 [0.32-0.39] 0.06
Parasite load
Parasite estimate per 20mL 0.05 [0-2.5] 0.68 [0.03-5.47] 1.77 [0.16-5] - <0.001§§

p-values were reported for Kruskal-Wallis and Dunn post-hoc hypothesis testing. Median [interquartile range] reported for all biomarkers tested. Non-CC-BD, blood donors without Chagas cardiomyopathy; CC-Non-Dys-BD, blood donors with Chagas cardiomyopathy; CC-Dys, Chagas cardiomyopathy patients with cardiac dysfunction; NT-proBNP, N-terminal pro B-type natriuretic peptide; TNF, tumor necrosis factor; IL, interleukin; IFN, interferon. *Statistically significant difference in ejection fraction levels between Non-CC BD/CC-Dys (p<0.001); CC-Non-Dys-BD/CC-Dys (p<0.001); CC-Non-Dys-BD/controls (p=0.042); CC-Dys/controls (p<0.001). †Statistically significant difference in Gal-3 levels between Non-CC-BD/CC-Dys (p<0.001); Non-CC-BD/controls (p=0.010); CC-Non-Dys-BD/CC-Dys (p<0.001); CC-Dys/controls (p=0.028). ‡Statistically significant difference in NT-proBNP levels between Non-CC-BD/CC-Dys (p<0.001); Non-CC-BD/controls (p=0.004); CC-Non-Dys-BD/CC-Dys (p<0.001); CC-Non-Dys-BD/controls (p<0.001); CC-Dys/controls (p<0.001). §Statistically significant difference in troponin levels between Non-CC-BD/CC-Dys (p=0.024); Non-CC-BD/CC-controls (p<0.001); CC-Non-Dys-BD/CC-Dys (p<0.001); CC-Non-Dys-BD/controls (<0.001); CC-Dys/controls (p<0.001). #Statistically significant difference in TNF-α levels between Non-CC-BD/CC-Dys (p=0.019); CC-Dys/controls (p<0.001). **Statistically significant difference in IL-6 levels between Non-CC-BD/CC-Dys (p<0.001); CC-Non-Dys-BD/CC-Dys (p=0.032); CC-Dys/controls (p=0.004). ††Statistically significant difference in IL-8 levels between Non-CC-BD/CC-Dys (p=0.016); CC-Non-Dys-BD/CC-Dys (p=0.039); CC-Dys/controls (p=0.001). ‡‡Statistically significant difference in IL-10 levels between Non-CC-BD/CC-Dys (p<0.001); CC-Non-Dys-BD/CC-Dys (p=0.001); CC-Dys/controls (p<0.001). §§Statistically significant difference in parasite estimate per 20mL between Non-CC-BD/CC-Dys (p=0.011); Non-CC-BD/controls (p<0.001).

Positive T. cruzi PCR indicated a statistically significant difference between Non-CC-BD and CC groups: CC-Non-Dys-BD (p=0.010) and CC-Dys. By contrast, no difference in parasitemia was observed when comparing CC-Non-Dys-BD and CC-Dys (Table 1). However, we did not finda

significant difference in CC-Dys patients between T. cruzi PCR and event occurrence. No significant association between T. cruzi PCR and Gal-3 was found.

Among the T. cruzi infected subjects, Spearman’s correlation was applied to assess the relationship between Gal-3 and cardiac biomarkers, inflammatory mediators, and parasite load. There was a weak correlation for TNF- (rs=0.25, p<0.001) and IL-8 (rs=0.22, p<0.001). By contrast, no association between Gal-3 and Troponin, NT-proBNP, IL-6, IL-10, IFN-, or with parasite load was found.

Echocardiography was carried out, and we used Spearman’s correlation, to verify any relationship between Gal-3 levels and echocardiographic parameters among T. cruzi infected patients. No moderate or strong statistically significant correlation was found between Gal-3 levels and left ventricular end-diastolic diameter (LVEDD) (rs=0.09, p=0.07), left ventricular end-systolic dimension (LVESD) (rs=0.11, p=0.03), LVEF (rs=-0.16, p=0.001), left atrial diameter (rs=0.11, p=0.02), left atrial volume indexed to body surface area (rs=0.09, p=0.18), right atrial area (rs=0.032, p=0.53) and septal E/e’ ratio (rs=0.135, p=0.009).

 Survival and Risk Analysis

Time-to-event data were available for 97 patients, with mean follow-up of 51.2 ± 10.8 months and median of 58 months (range: 8 to 60 months). Events were observed in 28 patients (29%), and were due to three (10.8%) heart transplantations and 25 (89.2%) deaths by all causes. Among event-experienced patients, median concentrations of Gal-3 and NT-pro-BNP were significantly higher, while the ejection fraction was significantly lower. Age, sex, NYHA class >I, ejection fraction on echocardiography, and laboratory data of event-experienced patients are compared in Table 2.

– Demographic and laboratory information of CC-Dys patients according to death or heart transplantation
No events Events p-value
(n=69) (n=28)
Age (y) 49 [42-54] 47.5 [44.5-52] 0.96
Male, n (%) 42 (61%) 16 (57%) 0.73
Creatinine (mg/dL) 1.01 [0.85-1.14] 1.14 [0.87-1.23] 0.06
Ejection fraction (%) 35 [25-40] 20 [20-30] 0.001
NYHA >1 29 20 0.009
Galectin-3 (ng/mL) 14.4 [10.9-19.1] 18.5 [14.7-23.4] 0.005
Low 39 7
High 30 21
NT-proBNP (pg/mL) 542 [281-1337] 2643 [1047-4771] <0.001
Low 50 7
High 19 21
Parasite estimate* 1.77 [0.19-4.2] 1.25 [0.16-12.61] 0.08

Median [25th, 75th percentile) by death or heart transplantation as an outcome. CC-Dys: patients with positive T. cruzi serology and CC with left ventricular dysfunction; NT-proBNP: N-terminal pro B-type natriuretic peptide; NYHA: New York Heart Association. Low Galectin-3 = <15.3 ng/mL; Low NT-proBNP = <1278 pg/mL. *Parasite load per 20mL.

Gal-3 cutoff point (<15.3 ng/mL) by ROC curve was used to divide CC-Dys subjects into two strata (low and high levels), as was the NT-proBNP cutoff point (<1278 pg/mL). ROC identified the potential to reach an event. Although the AUC of NT-proBNP was larger than the Gal-3 AUC, there were no differences (p=0.22).

After adjusting for sex, age, renal function, NYHA functional class >I, and LVEF, we found a significant association of higher levels of Gal-3 with subsequent events in a 5-year follow-up (Table 3 and Figure 2). Complementarily, the risk of events also increased as the levels of NT-proBNP climbed (Table 3). Similar results were seen when Gal-3 and NT-proBNP (by 100-unit increase) were analyzed as continuous variables (Appendix).

– Association between galectin-3 and death or heart transplantation in the CC-Dys subgroup using ROC and Cox regression models, both crude and adjusted for age, sex, serum creatinine level, NYHA functional class >I and LVEF, and using Galectin-3 and NT-proBNP as categorical variables
Crude Model Adjusted Model
AUC Cutoff Cutoff Level p HR (95%CI) p HR (95%CI)
Galectin-3 (ng/mL) 0.71 15.3 Low
High 0.007 3.27 (1.39-7.71) 0.04 2.63 (1.00-6.90)
NT-proBNP (pg/mL) 0.80 1278 Low
High <0.001 5.69 (2.41-13.42) 0.02 3.44 (1.21-9.78)

AUC: area under the curve; CI: confidence interval; HR: hazard ratio; LVEF: left ventricular ejection fraction; NT-proBNP: N-terminal pro B-type natriuretic peptide; NYHA: New York Heart Association; ROC: receiver operating characteristic

– Time-to-event curves between Gal-3 levels. Time-to-event curves between stratified Gal-3 levels results in CC-Dys. Cutoff level: Gal-3 <15.3 ng/mL.

Among patients presenting higher Gal-3 levels, we found differences in events when dichotomized with both NT-proBNP strata: patients with additionally high NT-proBNP levels were more likely to experience any event than patients with low NT-proBNP. Moreover, patients in the lower Gal-3 strata, when dichotomized with NT-proBNP levels, were more likely to present any event when NT-proBNP was higher (Figure 3).

– Event frequency at 5-year as a function of Gal-3 and NT-proBNP concentrations among CC patients. The percentage of patients who experienced any event is shown for each group. Low Gal-3: values <15.3 ng/mL; high Gal-3: values ≥15.3 ng/mL; low NT-proBNP: values <1,278 pg/mL; high NT-proBNP: values ≥1,278 pg/mL.

Patients in the higher strata of both Gal-3 and NT-proBNP levels had 11 to 16-fold increased risk of event compared with those with the lowest biomarker levels (unadjusted HR, 16.22; 95%CI: 3.71–70.83; p<0.001; adjusted HR, 11.39; 95%CI: 1.97–65.76; p=0.007). Subjects with low Gal-3 and low NT-proBNP had the lowest event rates.

 Discussion

Increased Gal-3 was significantly associated with severe forms of ChD and predictive of subsequent morbidity/mortality.

Gal-3 is an emerging biomarker and modulates several physiological processes that contribute to HF, inflammation, and fibrosis.13-15 Inflammation is a prerequisite for tissue healing and scar formation,16 and Gal-3 has been shown to play a major role as a mediator in parasitic, viral,14,17 and bacterial infection.18 In ChD, experimental studies have shown that Gal-3 has upregulated expression following T. cruzi infection in dendritic cells, B cells,19,20 and CD68+ macrophages. Significantly, CD68+ macrophages represent 50% of the mononuclear cell infiltrate in hearts with CC.21

T. cruzi and several immune-mediated mechanisms have a direct involvement in CC. Previous studies have reported that Gal-3 binds to 45KD, enhancing its adhesion to the extracellular matrix and even its entry into cells. Other studies have shown the importance of Gal-3 in the early process of T. cruzi infection, as it allows parasites to accumulate in the extracellular matrix before invading host cells.22,23

An experimental model of acute T. cruzi infection showed that induction of myocarditis was associated with the upregulation of Col I, Gal-3, IFN-, and IL-13.21 Gal-3 was primarily detected in interstitial cells and was higher in fibrotic areas. In myocardial areas of fibrosis, the intensity of myocarditis and significant matrix extracellular remodeling was correlated with the presence of Col I and Gal-3. In addition, myofibroblasts can induce fibrosis, which results in myocardial stiffness and cardiac dysfunction. Importantly, myofibroblasts are also a significant source of proinflammatory cytokines, including TNF-α and IL-1, which have a known deleterious effect on the myocardium. However, we did not find any significant association between Gal-3 and inflammatory markers.

Sabino et al.24 compared the detection of T. cruzi DNA with known clinical and laboratory markers of CC severity and observed that the presence of parasitemia was associated with markers of disease progression, such as QRS and QT interval duration, lower LVEF, and elevated troponin and NT-proBNP levels. It was also observed that detection of T. cruzi DNA was significantly higher in patients with cardiomyopathy as compared to Non-CC-BD group; however, T. cruzi PCR did not correlate with Gal-3. Moreover, there was no significant difference in the detection of T. cruzi DNA between CC patients with and without dysfunction, nor between CC patients who did or did not experience events. Thus, in our study, parasitism was a marker of typical ECG changes in cardiomyopathy, but not of disease severity or clinical prognosis.

De Boer et al.25 suggested that Gal-3 likely represents a unique phenotype at high risk for the development and progression of HF or other cardiovascular diseases. Chronic elevations in Gal-3 induce active fibrogenesis and may provoke pathological cardiac remodeling. De Boer et al.25 also hypothesized that patients with this phenotype of Gal-3 overexpression are more likely to have a “fibrogenic” pathway for cardiac remodeling. In our study, high levels of Gal-3 were associated with the most severe form of cardiomyopathy, but without a strong association with echocardiographic parameters. So, Gal-3 levels defined a population with more severe disease, characterized by left systolic and diastolic ventricular dysfunction, higher left and right diastolic diameter, and elevated of NT-proBNP and troponin levels.

Echeverria et al.26 examined the diagnostic value of a panel of biomarkers to distinguish the severity of CC and found no associations between sST2 and Gal-3 levels. However, the sample size was small and did not include patients with stage A (positive T. cruzi, but normal ECG and echocardiography), which could have allowed the examination of the role played by the biomarkers in asymptomatic patients. They also do not provide any prognostic information of Gal-3.

We found higher Gal-3 levels in the control group compared to the Non-CC-BD group. However, the values were lower compared to the CC-Dys group. It is known, since Carlos Chagas’ pioneering studies,27 that up to 60% of infected patients have no evidence suggesting cardiovascular or gastrointestinal involvement. These individuals are thought to have the so-called indeterminate form, defined as Non-CC-BD in our study. As a result, survival in this group of patients appears to be comparable to the general population. Our results showed low Gal-3 levels in this group, which supports this concept.

Galectin-3 phenotype is an important factor in the onset and progression of HF. It is known that HF patients with low Gal-3 levels have slow progression and better outcomes than patients with HF and high Gal-3 levels.25,28 Gal-3 was shown to predict the development of all-cause mortality and HF in the general population28 and can be used to define and identify patients with HF at very low risk for 30-day and 180-day mortality, and HF rehospitalizations after an episode of acute HF.29 A meta-analysis by Chen et al.30 reported the value of serum Gal-3 as a predictor factor of all-cause mortality and cardiovascular mortality in HF patients.30

Our study’s most striking finding was the relationship between Gal-3 and the risk of events among patients with CC. Because both Gal-3 and NT-proBNP were independent predictors of adverse events, we also showed that the increase of both markers was associated with the highest rates of death or heart transplantation in patients with CC.

Study Limitations

This was a single-center study with a relatively small sample. In addition, we had only a single-time point measure of Gal-3 and NT-proBNP and, therefore, did not assess dynamic changes in these biomarkers over time. Another limitation was the use of non-parametric tests to analyze associations between continuous variables, resulting in loss of efficiency.

 Conclusions

High plasma Gal-3 levels were significantly associated with cardiac dysfunction and CC severity. Our findings suggest that a biomarker-based approach for risk stratification in ChD patients might help physicians identify patients who are more likely to have worse outcomes and potentially guide the development of treatment strategies for this high-risk group.

 Acknowledgment

We thank Biomerieux for donating Galectin-3 kits.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

*Supplemental Materials

For additional information, please click here.

Sources of Funding.There were no external funding sources for this study.