Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC yxbKtFMR5prMQfWzkdcFRyb 00056 S0066-782X2021000100056 abc.20190535 10.36660/abc.20190535 Artigo Original Expressão de Proteína-1 Relacionada a Receptor de Lipoproteína de Baixa Densidade (LRP1) em Monócito em Correlação com EIMC em Pacientes Mexicanos Hipertensos Gamboa Ricardo 1 Jaramillo-Estrella María José 1 Martínez-Alvarado María del Rocio 1 Soto Maria Elena 1 Torres-Paz Yazmin Estela 1 Gonzalo-Calvo David de 2 Del Valle-Mondragón Leonardo 1 López-Marure Rebeca 1 Llorente-Cortés Vicenta C. 2 0000-0002-6806-3484 Huesca-Gómez Claudia 1 Instituto Nacional de Cardiologia Ignacio Chavez Ciudad de México México Instituto Nacional de Cardiologia Ignacio Chavez, Ciudad de México - México Hospital de Sant Pau Lipids and Cardiovascular Pathology Group Barcelona Catalunya Espanha Hospital de Sant Pau - Lipids and Cardiovascular Pathology Group, Barcelona, Catalunya – Espanha Correspondência: Claudia Huesca-Gómez • Instituto Nacional de Cardiologia Ignacio Chavez – Physiology - “. Juan Badiano No 1, Col. Sección XVI Mexico 14080 – México E-mail: claudia.huesca@cardiologia.org.mx

Contribuição dos Autores

Concepção e desenho da pesquisa: Llorente-Cortés VC, Huesca-Gómez C; Obtenção de dados: Gamboa R, Jaramillo-Estrella MJ, Martínez-Alvarado M del R, Torres-Paz YE, Gonzalo-Calvo D, Del Valle-Mondragón L, López-Marure R; Análise e interpretação dos dados: Gamboa R, Jaramillo-Estrella MJ, Soto ME, Huesca-Gómez C; Análise estatística: Soto ME, Huesca-Gómez C; Obtenção de financiamento: Huesca-Gómez C; Redação do manuscrito: Gamboa R, Jaramillo-Estrella MJ, Llorente-Cortés VC, Huesca-Gómez C; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Gamboa R, Llorente-Cortés VC.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 03 02 2021 01 2021 116 1 56 65 09 08 2019 07 02 2020 16 03 2020 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

A hipertensão arterial (HTA) representa um grande fator de risco de morbidade e mortalidade cardiovascular. Ainda não se sabe que mecanismos moleculares específicos estão associados ao desenvolvimento de hipertensão essencial.

 Objetivo

Neste trabalho, analisamos a associação entre expressão mRNA de monócito LRP1, expressão de proteína LRP1, e espessura íntima-média de carótida (EIMC) de pacientes com hipertensão essencial.

 Métodos

A expressão mRNA de monócito LRP1 e os níveis de proteína e EIMC foram quantificados em 200 indivíduos mexicanos, sendo 91 normotensos (NT) e 109 hipertensos (HT) A significância estatística foi definida em p < 0,05.

 Resultados

O grupo de pacientes HT tinha EIMC maior altamente significativa em comparação com os pacientes NT (p = 0,002), e isso está relacionado ao aumento na expressão mRNA de LRP1 (6,54 versus. 2,87) (p = 0,002) e expressão de proteína LRP1 (17,83 versus 6,25), respectivamente (p = 0,001). Essas diferenças foram mantidas mesmo quando dividimos nossos grupos de estudo, levando em consideração apenas aqueles que apresentavam dislipidemia na expressão de mRNA (p = 0,041) e de proteínas (p < 0,001). Também se identificou que a indução de LRP1 mediada por LRP1 em monócitos em de maneira dependente de dose e tempo, com diferença significativa em NT versus HT (0,195 ± 0,09 versus 0,226 ± 0,12, p = 0,046).

 Conclusão

Foi encontrado um aumento em EIMC em indivíduos com hipertensão, associada a expressões de proteína LRP1 e mRNA mais altas em monócitos, independente da presença de dislipidemia em pacientes HT. Esses resultados que a upregulation de LRP1 em monócitos de pacientes hipertensos mexicanos poderia estar envolvida na diminuição da EIMC. (Arq Bras Cardiol. 2021; 116(1):56-65)

 Monócitos LRP1 mRNA Hipertensão/epidemiologia, México Espessura Intima Média Carótida Apoio Complementar para Pesquisadores SNI-1-2009 CONACyT 119410 Fontes de Financiamento.O presente estudo foi financiado pelo Apoio Complementar para Pesquisadores em Processo de Consolidação SNI-1-2009 de CONACyT número 119410. Introdução

A hipertensão arterial (HTA) é uma doença crônica e multifatorial que constitui um problema grave de saúde pública.1 A hipertensão raramente causa sintomas em estágios iniciais; é uma assassina silenciosa, causando aterosclerose acelerada, dano a órgãos importantes, incapacidade e morte por doenças cardiovasculares.2

Lesões ateroscleróticas incluem células endoteliais alteradas, monócitos circulantes, migração de células musculares lisas vasculares (CMLV), e desenvolvimento de células espumosas.3 O endotélio alterado permite a entrada e retenção de lipoproteína de baixa densidade (LDL) na camada íntima.4 Quando o LDL está preso na íntima arterial, ele passa por alterações tais como oxidação e agregação, o que facilita a captação por monócitos-macrófagos da íntima e (CMLV), por meio de seu reconhecimento por receptores de LDL não clássicos.5 Esses receptores não são regulados por colesterol e permitem uma captação em massa de LDL modificado que causa acúmulo lipídico intracelular.

A proteína-1 relacionada a receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP1), que é uma proteína transmembrana multiligante6 pertencente à família LDLR. Ela é expressa em diferentes células semelhantes a neurônios, fibroblastos, células tumorais, hepatócitos, células musculares lisas vasculares, e monócitos e macrófagos.7 , 8 Sabe-se que ela participa na captação do LDL modificado9 e é tem expressão excessiva em placas ateroscleróticas em modelos animais e humano.10 , 11

Além disso, a expressão de genes de LRP1 é aumentada em células mononucleares de pacientes com obstrução coronária.12 , 13 Em monócitos e macrófagos, a LRP1 contribui para a captação do LDL modificado agregado.14 , 15 Entretanto, os efeitos da hipertensão na expressão de LRP1 em humanos não são exatamente conhecidos. Portanto, a obtenção de monócitos circulantes possibilitou o estudo dos mecanismos de sua participação na formação de placa aterosclerótica.16 De outra forma, o EIMC é considerado um excelente marcador não invasivo de doença cardiovascular, e foi associado a aterosclerose e fatores de risco cardiovascular17 , 18 e à prevalência de doença cardiovascular, provando que é útil no diagnóstico de aterosclerose.19 - 21 Conforme mencionado acima, o objetivo deste trabalho era o estudo de níveis de LRP1 e mRNA e de expressão de proteína e monócitos de pacientes com hipertensão arterial essencial, e sua correlação com a espessura íntima-média de carótida.

 Métodos População e Modelo do Estudo

Um total de 200 indivíduos mexicanos não relacionados (109 pacientes diagnosticados com hipertensão, e 91 indivíduos normotensos) foram recrutados no Instituto Nacional de Cardiologia “Ignacio Chávez”. Os critérios de inclusão de ambos os grupos eram: terem nascido no México e ser descendente de pelo menos 3 gerações anteriores, ter mais de 40 anos de idade, e concordar em participar do estudo, assinando o consentimento informado. Os controles eram indivíduos aparentemente saudáveis, assintomáticos, sem histórico familiar de hipertensão ou doença cardiovascular prematura, com pressão sanguínea ≤120/80 mmHg. Para o grupo de hipertensos, os indivíduos tinham pressão sanguínea ≥140/90 mmHg ou já tinham sido diagnosticados anteriormente com hipertensão essencial. O critério de exclusão foi sofrer de uma doença degenerativa crônica. Todos os participantes responderam a questionários padronizados e validados para obter informações sobre seu histórico familiar e médico, consumo de álcool e tabagismo, hábitos alimentares, e atividade física.

O comitê de ética do Instituto Nacional de Cardiologia “Ignacio Chávez” aprovou o projeto. Os pacientes preencheram formulários de consentimento informado antes do estudo. Todos os procedimentos estavam de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, conforme sua revisão de 2013.

 Medições Antropométricas

Os indivíduos selecionados passaram por medições antropométricas para determinar suas alturas em metros (m) e seus pesos em quilogramas (kg). A pressão sanguínea foi medida utilizando-se um esfigmomanômetro de mercúrio, em conformidade com as recomendações do VII Comitê Nacional Conjunto para Prevenção, Detecção, Avaliação, e Tratamento de Pressão Sanguínea Alta (JNC VII).

 Espessura da Íntima-média da Artéria Carótida

Um especialista em resolução de ultrassonografia avaliou a espessura íntima-média de carótida (EIMC). Todas as medições foram realizadas com o ultrassom A Sonosite Micromax acoplado a um transdutor linear de alta resolução e multifrequência. As medições foram feitas na carótida comum após exame de uma seção longitudinal de 10 mm a 2 cm de distância da bifurcação. A parede anterior ou proximal e na parede posterior ou distal foram medidas nas projeções lateral, anterior e posterior, seguidas de um eixo perpendicular à artéria, para discriminar duas linhas: uma para a interface íntima-sangue, e outra na interface média-adventício. Cinco medições foram obtidas da carótida direita, e 5 da carótida esquerda, usando valores médios (EIMC média) e máximos (EIMC máxima), automaticamente calculados pelo software. A EIMC foi considerada anormal com valores maiores ou iguais ao 75 percentil por idade e sexo.22

 Determinações Bioquímicas

Foram coletadas amostras de sangue após 12 horas de jejum. Foram medidos: glicemia, colesterol total (CT), triglicérides (TG), e colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C) em amostras frescas (plasma em jejum), usando procedimentos enzimáticos padronizados em um analisador Hitachi 902 (Hitachi Ltd, Tóquio, Japão); o colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) foi estimada utilizando-se a fórmula de DeLong et al.23 Todos os testes passaram por um esquema de controle de qualidade externo ( Lipid Standardization Program, Center for Disease Control em Atlanta, GA, EUA).

As concentrações de soro Ang II foram avaliadas por eletroforese na zona capitar conforme descrito anteriormente.24 Os níveis totais de proteína C reativa de alta sensibilidade total (PCR-as) foram determinados pela imunonefelometria em um nefelômetro BN Pro Spec (Dade Behring Marburg GmbH, Alemanha). Os valores de variação de coeficiente (VC) entre ensaios foram < 6% para todos esses ensaios. O colesterol não HDL (não HDL-C) foi calculado subtraindo-se o HDL-C do colesterol total. O valor de dislipidemia foi definido de acordo com fatores de risco cardiovascular convencionais: (TC) ≥200 mg/dL e/ou HDL-C ≤ 40mg/dL /ou LDL-C ≥130 mg/dL e/ou TG ≥150mg/dL.

 Separação de Monócito de Sangue Periférico

O sangue integral coletado em tubos com EDTA foi diluído 1:1 com heparina PBS 1×–1%; em seguida, foi adicionado Histopaque 1077 (10771, Sigma-Aldrich). As células sanguíneas mononucleares periféricas (CSMP) foram obtidas da faixa branca central do gradiente após a centrifugação. Em seguida, os monócitos foram obtidos pelo enriquecimento direto das células CD14+ pelo sistema de classificação magnética (MACS; Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemanha). Uma alíquota de 1 mL de reagente TripureTM (Roche Molecular Biochemicals) foi adicionada para coletar os monócitos. As células foram armazenadas a -80 °C.

 Linha Celular de Cultura THP-l

Células de leucemia monocítica humana foram mantidas em uma cultura em suspensão de meio RPMI-1640 (Gibco-BRL) contendo 2 mM de glutamina, 25 mM HEPES, 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, 50 U/mL de penicilina, e 50 μg/mL de estreptomicina (Sigma), suplementados com 10% soro fetal bovino (SFB), a 37°C, em 5% CO2. Células THP-1 paradas foram pré-incubadas com Ang II (1 µmol/L) para aumentar os períodos de análise dos efeitos da Ang II na expressão de LRP1 nos monócitos. A dose de angiotensina II foi selecionada com base em estudos prévios em nosso grupo e oferece uma concentração de plasma de angiotensina II de forma semelhante ao reportado em pacientes com hipertensão.25

 Extração de RNA e Síntese de cDNA

O RNA total foi extraído utilizando o Reagente de isolamento TripureTM (Roche Molecular Diagnostics, Indianápolis, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. O rendimento e a qualidade do RNA foram avaliados com eletroforese de gel de agarose 1%; RNA foi armazenado a -80 °C até serem analisadas. A reação de transcrição reversa foi realizada utilizando-se 1 µg do RNA total para síntese de cDNA de acordo com o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems Foster City, CA, EUA). O cDNA foi armazenado a -80 °C.

 Ensaios de Expressão Gênica

A expressão gênica de LRP1 (Hs00233899_m1) e HPRT (Hs99999909_m1) (gene endógeno) foram realizadas via uma reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real e semiquantitativa (RT-PCR), utilizando-se um kit comercial. A “Expressão Gênica TaqMan” foi realizada utilizando-se 1 µl de produtos de transcrição reversa misturados com 10 µl de TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), 1 µl 20x ensaios em 8 µl de água sem nuclease. Depois de misturar ligeiramente, a mistura foi transferida para uma microplaca de PCR de tempo real, utilizando o equipamento 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems).

As condições usadas foram: 50°C por 2 min e 10 min a 95°C, seguido de 40 ciclos a 95°C por 15s, e 60°C por 1min. Os níveis de expressão foram medidos em duplicata e os valores de ciclo de limiar [Ct] foram determinados e normalizados usando a expressão gênica endógena (HPRT).

 Análise Western Blot

A proteína total foi isolada de monócitos, utilizando-se o Reagente de isolamento TriPureTM (Roche Molecular Diagnostics, Indianápolis, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. A proteína foi quantificada utilizando-se o Ensaio proteico Pierce BCA (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). Valores equivalentes de proteína total (25 µg) foram carregados em gel SDS-poliacrilamida a 10% (v/v) sob condições de redução. As amostras foram eletrotransferidas para membranas de nitrocelulose, que estavam saturadas em temperatura ambiente 1 h em TTBS (20 mM Tris–HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,01% Tween 20 e 5% de leite desnatado). Foram realizadas análises de western blot utilizando anticorpos monoclonais específicos contra a LRP1 humana (85kDa -chain, clone 8B8 RDI 61067, diluição1:40) e os anticorpos secundários correspondentes (1:10.000 diluição; Dako; Glostrup, Dinamarca). O software QuantityOne (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) foi usado para quantificar as faixas presentes nas membranas via densitometria, e foram detectados utilizando o reagente de detecção ECL Prime Western Blotting (Amersham). Os níveis de expressão foram medidos em duplicata e normalizados pela comparação com a concentração de controle de proteína de carga. Os resultados foram expressos como unidades de intensidade arbitrária.

 Análise Estatística

Os dados foram analisados usando o software SPSS v19 (SPSS Inc. Chicago EUA). Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DP) em variáveis contínuase as variáveis categóricas foram expressas em porcentagem. O teste usado para avaliar a normalidade foi o Shapiro-Wilk. A comparação entre grupos foi realizada usando o teste t Student não pareado para variáveis contínuas e teste qui-quadrado para variáveis categóricas. A análise de correlação foi feita de acordo como método de Pearson. Regressões logísticas múltiplas foram usadas para explorar as associações entre a expressão de EIMC e LRP1. Os dados são apresentados como razão de chance (RC), com um intervalo de confiança de 95%. Um valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. O tamanho da amostra foi calculado usando a referência de Schulz 2002.13 De acordo com proporções de amostras independentes levando em consideração uma incidência de gene de LRP1 de aproximadamente 0,08 nos casos e 0,02 nos controles, com um ∆ = 0,06, e um poder estatístico de 95%, p <0,05. De acordo com a seguinte fórmula, nosso valor de n foi = 70.

n = p o q o z α + z β p i q i p o q o 2 ( p i − p o ) 2

po= Probabilidade de que a expressão de LRP1 ocorra em casos

q0= Probabilidade de que a expressão de LRP1 não ocorra em casos

pi= Probabilidade de que a expressão de LRP1 ocorra em controles

qi= Probabilidade de que a expressão de LRP1 não ocorra em controles

1,96= valor <0,05

1,28= poder (0,84)

n = ( 0.8 ) ( 0.92 ) 1.96 + 1.28 p ( 0.02 ) q ( 0.98 ) ( 0.08 ) ( 0.92 ) 2 ( ( 0.08 ) − ( 0.02 ) ) 2 Resultados Características da População do Estudo

Uma população de 200 indivíduos mexicanos foi estudada, sendo que 91 eram indivíduos normotensos (NT), e 109 eram hipertensos (HT). As características bioquímicas e antropométricas da população estudada são mostradas na Tabela 1 . Da população total, 62,5% eram mulheres, e 37,5% eram homens. Idade, índice de massa corporal (IMC), EIMC, HDL-C, proteína C reativa, Ang II, e índices de LDL-C/HDL-C, TC/HDL-C, TG/HDL-C apresentaram estatísticas diferentes entre os grupos. Esses parâmetros foram mais altos no grupo dos hipertensos, em comparação com o grupo normotenso, exceto para os níveis de HDL-C, que foram mais baixos no grupo dos hipertensos. A prevalência de obesidade foi 19,8% no grupo dos normotensos e 44,1% in no grupo dos hipertensos. Quando foi feita a comparação entre ambos os sexos, com os mesmos parâmetros, não foram encontradas diferenças significativas. Também comparamos nossos grupos de acordo com níveis de dislipidemia conforme ATP III. Entretanto, houve apenas diferenças significativas em HDL-C (≤40 mg/dL), (NT= 16,5% versus HT= 32,7%, p=0,001) e triglicérides (≥150mg/dL) (NT= 42,7% versus HT= 57,3%, p=0,001) (dados não mostrados).

– Características antropométricas, clínicas e bioquímicas dos pacientes do estudo
Parâmetros Normotensos (N=91) Hipertensos (N=109) p
Idade (anos) 46,0±11,35 50,36±11,57 0,007
Sexo (F/M) (%) 61,5/37,5 64/36 0,313
Peso (kg) 71,44±14,30 75,21±12,71 0,056
Altura (cm) 161,99±9,81 159,39±9,06 0,057
BMI (Kg/m2) 26,92±4,06 29,36±3,77 <0,001
PSS (mmHg) 110,23±9,07 142,78±10,82 <0,001
DPS (mmHg) 69,90±75,85 91,94±7,72 <0,001
EIMC (mm) 0,587±0,16 0,729±0,16 0,002
EIMC máx. (mm) 0,606±0,18 0,787±0,16 0,008
Colesterol total (mg/dL) 197,32±40,41 198,91±37,42 0,772
Triglicérides (mg/dL) 166,56±94,45 192,95±98,43 0,001
Log TG 2,16±0,22 2,23±0,19 0,010
HDL-C (mg/dlL) 52,51±13,25 46,66±13,59 0,002
LDL-C (mg/dL) 117,02±33,20 122,23±31,74 0,258
LDL/HDL 2,36±0,84 2,76±0,91 0,001
Não HDL-C 144,80±41,28 152,67±36,54 0,154
CT/HDL 3,96±1,20 4,50±1,26 0,003
TG/HDL 3,62±2,73 4,65±3,21 0,017
Glicemia (mg/dL) 89,36±7,78 89,18±8,91 0,877
Proteína C reativa (mg/dL) 2,37±2,06 3,87±2,85 0,011
Tabagismo 1,83±0,38 1,67±0,51 0,491

Os valores são expressos como ± DP médio ou porcentagens de valore categóricos. O teste t Student não pareado e o teste qui-quadrado foram usados. IMC: índice de massa corporal; PSS; Pressão sanguínea sistólica; PSD: Pressão sanguínea diastólica; EIMC: espessura da íntima-média da artéria carótida; EIM máx.: Espessura íntima-média máxima; HDL-C: Lipoproteína de alta densidade; LDL-C: Lipoproteína de baixa densidade.

Correlação entre Hipertensão e Expressão de LRP1 de Monócitos.

Com o objetivo de saber os níveis de mRNA e expressão de proteína, foram realizadas análises em LRP1 para ambos os grupos ( Figura 1 ). Foram encontradas diferenças significativas entre os grupos de NT e HT na expressão de mRNA (p=0,002) e expressão de proteína (p=0,001). Portanto, quando os indivíduos foram comparados em grupos de homens e mulheres, uma diferença significativa só foi encontrar em LRP1 mRNA em nos indivíduos hipertensos. Houve uma expressão excessiva no grupo das mulheres em comparação com os homens (p=0,044). Além disso, encontramos um aumento na expressão de LRP1 mRNA e proteína em indivíduos dislipidêmicos hipertensos, em comparação com sujeitos dislipidêmicos normotensos (dados não exibidos.

– Quantificação da expressão de LRP1 no total de indivíduos e dividida por sexo. (A) Comparação da expressão de LRP1 em monócitos de indivíduos normotensos e hipertensos. Análise de PCR em tempo real da expressão de LRP1 mRNA. Os dados foram processados com um software especialmente projetado, baseado no valor Ct de cada amostra e normalizado por análise western blot HPRT1 (B) mostrando a expressão de proteína LRP1 em monócitos.

Por outro lado, para examinar se outros fatores, como EIMC e Ang II poderiam participar dos valores de pressão sanguínea, analisamos essas variáveis ( Tabela 2 ). Foi encontrada uma diferença significativa entre os grupos NT e HT em relação a EIMC (p=0,002) e Ang II (p=0,046), respectivamente. Entretanto, quando dividimos o grupo de acordo com o sexo, não encontramos diferenças em nenhum dos parâmetros estudados.

– Valores de EIMC e Ang II divididos por sexo
NT HTA p NT Mulheres NT Homens p HTA Mulheres HTA Homens p
EIM (mm) 0,568 ± 0,16 0,715 ± 0,16 0,002 0,553 ± 0,149 0,583 ± 0,178 0,303 0,692 ± 0,14 0,719 ± 0,19 0,643
Ang II (pmol/ml) 0,195± 0,09 0,226 ± 0,12 0,046 0,200 ±0,090 0,186 ± 0,090 0,468 0,220 ± 0,11 0,238 ± 0,14 0,482

NT: Normotensos; HTA: Hipertensos; EIM: espessura da íntima-média, Ang II: Angiotensina II. Teste t Student não pareado.

Efeitos da Angiotensina II nos Níveis de Expressão do Monócito LRP1

Para estudar os efeitos da indução de LRP1 mediada por Ang II nos monócitos, a linha celular do monócito THP1 foi incubada com Ang II por 4h e 8h, com concentrações de 1 e 10 µM. Na linha celular do monócito THP1, a Ang II aumentou a expressão de LPR1 mRNA de maneira dependente de dose e tempo, sendo mais evidente após 8 horas de incubação ( Figura 2 ).

– Efeitos da angiotensina II na expressão de LRP1 em células THP1.

Associação entre Expressão de LRP1 Monócitos e Espessura Íntima/média da Carótida de Pacientes com Hipertensão.

Para saber se havia uma relação entre a espessura da EIMC e expressão de LRP1 mRNA e/ou expressão de proteína LRP1, foram realizadas regressões logísticas múltiplas ajustadas por perfil lipídico, idade e sexo ( Tabela 3 ). Uma diferença significativa foi encontrada entre EIMC e os níveis de expressão de LRP1 mRNA (p=0,047) e os níveis de proteína LRP1 (p=0,039) em pacientes hipertensos.

– Associação entre a expressão de LRP1 e EIMC ajustada para parâmetros lipídicos em pacientes com hipertensão
mRNA RC [95% de IC] p
Ajuste [-] 0,308 [0,230 – 38,650] 0,047
Modelo 1 0,310 [0,340 - 38,887] 0,046
Modelo 2 0,303 [-0,280 - 38,511] 0,053
Modelo 3 0,308 [0,131 – 38,832] 0,049
Modelo 4 0,312 [0,150 – 38,33] 0,038
Modelo 5 0,301 [-0,181 - 38,19] 0,052
Proteína RC [95% de IC] p
ajuste [-] 0,312 [1,771 - 65,319] 0,039
Modelo 1 0,294 [-2,150 - 65,208] 0,066
Modelo 2 0,211 [1,544 - 65,637] 0,040
Modelo 3 0,313 [1,445 - 65,77] 0,041
Modelo 4 0,317 [2,020 - 66,015] 0,038
Modelo 5 0,313 [1,528 - 65,6689] 0,040

Modelo 1: ajustado por todos os parâmetros lipídicos. Modelo 2: ajustado por colesterol total. Modelo 3: ajustado por triglicérides Modelo 4: ajustado por HDL-C. Modelo 5: ajustado por LDL-C. Análise de regressões logística múltipla.

Portanto, uma regressão logística ajustada para lipídios foi realizada para analisar se a dislipidemia poderia influenciar a associação entre LRP1 e EIMC em pacientes hipertensos, ( Tabela 3 , Modelos 1-4). Foi encontrada entre EIMC e expressão de LRP1 mRNA com todo o conjunto de parâmetros de lipídios: Modelo 1 (p=0,045), a associação foi mantida após o ajuste de cada parâmetro lipídico: Modelo 2: ajustado por colesterol total (p= 0,053), Modelo 3 ajustado por triglicérides (p=0,049), Modelo 4 ajustado por HDL-C (p=0,038), e Modelo 5 ajustado por LDL-C (p=0,052).

Entretanto, não observamos uma associação entre EIMC expressão de proteína LRP1 quando ajustamos o conjunto completo de parâmetros lipídicos, Modelo 1 (P=0,066). Entretanto, quando ajustamos cada parâmetro lipídico, encontramos uma associação Modelo 2: ajustado por colesterol total (p= 0,040), Modelo 3 ajustado por triglicérides (p=0,041), Modelo 4 ajustado por HDL-C (p=0,038), e Modelo 5 ajustado por LDL-C (p=0,040).

Depois disso, fizemos uma regressão linear entre EIMC e níveis de expressão ajustados por perfil lipídico e expressão de proteína ajustada por perfil lipídico, uma correlação positiva entre essas variáveis foi mantida ( Figura 3 ).

– Correlação entre EIM e níveis de expressão de mRNA e proteína LRP1 ajustada por CT, TG, HDL-C e LDL-C. P<0,005 é considerado estatisticamente significativo.

Discussão

Nossos resultados mostraram, conforme esperado, que a EIMC média era mais alta nos indivíduos hipertensos. Entretanto, esse valor foi associado de maneira importante com a expressão excessiva de LRP1 nos monócitos circulantes.

A EIMC é considerada um marcador de aterosclerose e um indicador excelente de morte e eventos cardiovasculares.26 Em pacientes hipertensos com doença arterial coronariana, a EIMC aumentada está intimamente associada a aterosclerose.27 Nossos dados mostram uma associação forte entre hipertensão e EIMC. Esses resultados estão de acordo com dados publicados anteriormente em estudos realizados em pacientes e modelos animais. Em um estudo envolvendo jovens com hipertensão limítrofe (130-140/85-89 mmHg), observou-se um aumento de EIMC nas artérias braquiais quando os pacientes foram comparados com sujeitos normotensos; foram encontradas associações entre EIMC e PSS ambulatorial de 24 horas.27 Além disso, hipertensão, juntamente com diabetes e idade, são consideradas fatores prognósticos independentes para hiperplasia da íntima na artéria radial.28 - 30 In Em um modelo de animais com hipertensão, foi relatado um espessamento significativo da íntima-média como causa direta da doença.31 , 32

A hipertensão está entre os principais fatores de risco na etiologia da doença vascular aterosclerótica.33 , 34 Entretanto os mecanismos pelos quais a pressão arterial aumenta a incidência de aterosclerose não estão totalmente claros. Estudos que focam em elucidar esses mecanismos têm uma importância crítica. Há uma associação forte entre hipertensão e a expressão de LRP1 na parede vascular de um modelo com rato.35 A upregulation da LRP1 por hipertensão tem consequências funcionais, já que promove acúmulo de lipídios intracelular e, portanto, a formação de células espumosas. A hipertensão também tem um impacto alto na remodelagem vascular, mudanças crônicas em forças hemodinâmicas, e alterações estruturais na parede vascular.36

Nossos resultados mostram a exposição excessiva em mRNA e expressão de receptor de LRP1 em monócitos de pacientes hipertensos. Nossos resultados também mostram que Ang II aumentou a expressão de LRP1 em culturas de THP-1 de maneira dependente de dose e tempo. Portanto, o mecanismo pelo qual a pressão sanguínea alta poderia regular a expressão de LRP1 poderia ser mediado pelo efeito da angiotensina II, que é considerado um dos principais mediadores de hipertensão. Também se relatou que a angiotensina induz a atividade dos fatores de transcrição Sp/Sp3, que estão envolvidos no reconhecimento do promotor LRP113 causando a expressão excessiva em um nível vascular e favorecendo a formação de células espumosas nas células musculares lisas vasculares humanas.33

Além da angiotensina II, o fluxo sanguíneo age na função e na estrutura do endotélio pela modulação da expressão gênica.37 As alterações funcionais que são sofridas pelos monócitos devido às contínuas mudanças em fluxo sanguíneo podem ter uma influência positiva na expressão do LRP1, estimulando a captação de LDL e causando um aumento na EIMC.

Além de uma alta prevalência da obesidade, a população mexicana está enfrentando um problema sério de dislipidemia, que foi explicada por uma interação de fatores genéticos e ambientais.38

Na análise de sujeitos com dislipidemia de acordo com o risco cardiovascular convencional, observamos um aumento na expressão de LRP1 mRNA e de proteína em indivíduos dislipidêmicos hipertensos, o que poderia significar que LRP1 tem expressão excessiva por hipertensão independente da dislipidemia.

Estudos prévios mostraram que a concentração de proteína-1 relacionada a receptor de lipoproteína de baixa densidade circulante solúvel (sLRP1) poderia estar intimamente associado a hipercolesterolemia (LDL-C>200 mg/dL) e um efeito de upregulation de hipercolesterolemia na expressão de LRP1 em células dos modelos in vitro e in vivo da parede vascular.39 Em nossos resultados, apesar de observarmos uma porcentagem alta de hipercolesterolemia em indivíduos normotensos e hipertensos, não foram encontradas diferenças significativas entre ambos os grupos. Uma explicação possível sobre essas diferenças poderia ser: a) a associação entre sLPR1 e colesterol foi realizada em populações hipercolesterolêmicas (com hipercolesterolemia grave); b) a LRP1 poderia ser expressa em uma variedade de tecidos e a especificidade poderia ser diferente; em nosso caso, medimos a expressão de LRP1 em monócitos; c) as populações são muito diferentes, nosso estudo é feito em uma mistura de indígenas americanos [65%], europeus [31%], e africanos [3%], enquanto o deles foi feito inteiramente com caucasianos.40

Nossos dados indicam que a expressão de LRP1 em monócitos de pacientes hipertensos está correlacionada com o aumento de EIMC. A regressão logística ajustada mostra que a correlação entre EIMC e expressão de LRP1 mRNA é mantida mesmo após o ajuste de parâmetros lipídicos. Entretanto, essa associação foi perdida quando o ajuste foi feito com proteína LRP1. Esses resultados podem ser explicados pelo efeito positivo forte de LDL modificado sobre a estabilidade da proteína LRP1.41 , 42 Portanto, a dislipidemia provavelmente contribui para manter uma expressão de proteína LRP1 em monócitos alta em pacientes hipertensos. Isso poderia justificar porque a associação entre EIMC e expressão de proteína LRP1 após o ajuste do perfil lipídico é perdida.

 Conclusões

Nossos achados permitem que sugiramos que o efeito da hipertensão na aterosclerose pode ocorrer pela expressão excessiva de LRP1 em monócitos circulantes. A Ang II induziu a upregulation de LRP1 em monócitos, e pode ter um papel importante no aumento de EIMC associado ao fator de risco cardiovascular indução de progressão de lesão aterosclerótica. Esses resultados reforçam que a alta relevância de expressão excessiva de LRP1 na formação e na progressão de placas ateroscleróticas em seres humanos.

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Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de María José Jaramillo-Estrella pela Universidad Nacional Autonoma de México.

Fontes de Financiamento .O presente estudo foi financiado pelo Apoio Complementar para Pesquisadores em Processo de Consolidação SNI-1-2009 de CONACyT número 119410.

 Original Article Monocyte Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 1 (LRP1) Expression Correlates with cIMT in Mexican Hypertensive Patients Gamboa Ricardo 1 Jaramillo-Estrella María José 1 Martínez-Alvarado María del Rocio 1 Soto Maria Elena 1 Torres-Paz Yazmin Estela 1 Gonzalo-Calvo David de 2 Del Valle-Mondragón Leonardo 1 López-Marure Rebeca 1 Llorente-Cortés Vicenta C. 2 0000-0002-6806-3484 Huesca-Gómez Claudia 1 Mexico Instituto Nacional de Cardiologia Ignacio Chavez, Ciudad de México - Mexico Spain Hospital de Sant Pau - Lipids and Cardiovascular Pathology Group, Barcelona, Catalunya – Spain Mailing Address: Claudia Huesca-Gómez • Instituto Nacional de Cardiologia Ignacio Chavez – Physiology - “. Juan Badiano No 1, Col. Sección XVI Mexico 14080 – Mexico E-mail: claudia.huesca@cardiologia.org.mx

Author Contributions

Conception and design of the research: Llorente-Cortés VC, Huesca-Gómez C; Acquisition of data: Gamboa R, Jaramillo-Estrella MJ, Martínez-Alvarado M del R, Torres-Paz YE, Gonzalo-Calvo D, Del Valle-Mondragón L, López-Marure R; Analysis and interpretation of the data: Gamboa R, Jaramillo-Estrella MJ, Soto ME, Huesca-Gómez C; Statistical analysis: Soto ME, Huesca-Gómez C; Obtaining financing: Huesca-Gómez C; Writing of the manuscript: Gamboa R, Jaramillo-Estrella MJ, Llorente-Cortés VC, Huesca-Gómez C; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Gamboa R, Llorente-Cortés VC.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background

Arterial hypertension (HTA) represents a major risk factor for cardiovascular morbidity and mortality. It is not yet known which specific molecular mechanisms are associated with the development of essential hypertension.

 Objective

In this study, we analyzed the association between LRP1 monocyte mRNA expression, LRP1 protein expression, and carotid intima media thickness (cIMT) of patients with essential hypertension.

 Methods

The LRP1 monocyte mRNA expression and protein levels and cIMT were quantified in 200 Mexican subjects, 91 normotensive (NT) and 109 hypertensive (HT). Statistical significance was defined as p < 0.05.

 Results

HT patients group had highly significant greater cIMT as compared to NT patients (p=0.002) and this correlated with an increase in the expression of LRP1 mRNA expression (6.54 vs. 2.87) (p = 0.002) and LRP1 protein expression (17.83 vs. 6.25), respectively (p = 0.001). These differences were maintained even when we divided our study groups, taking into account only those who presented dyslipidemia in both, mRNA (p = 0.041) and proteins expression (p < 0.001). It was also found that Ang II mediated LRP1 induction on monocytes in a dose and time dependent manner with significant difference in NT vs. HT (0.195 ± 0.09 vs. 0.226 ± 0.12, p = 0.046).

 Conclusion

An increase in cIMT was found in subjects with hypertension, associated with higher mRNA and LRP1 protein expressions in monocytes, irrespective of the presence of dyslipidemias in HT patients. These results suggest that LRP1 upregulation in monocytes from Mexican hypertensive patients could be involved in the increased cIMT. (Arq Bras Cardiol. 2021; 116(1):56-65)

 Monocytes LRP1 mRNA Hypertension/epidemiology Mexico Carotid Intima Media Thickness Introduction

Arterial hypertension (HTA) is a chronic and multifactorial disease that constitutes a serious public health problem.1 Hypertension rarely causes symptoms in the early stages; it is a silent killer, causing accelerated atherosclerosis, damage to major organs, disability, and death from cardiovascular diseases.2

Atherosclerotic lesions include altered endothelial cells, circulating monocytes, vascular smooth muscle cells (VSMC) migration, and foam cell development.3 The altered endothelium allows the entrance and retention of low density lipoprotein (LDL) into the intima layer.4 Once LDL is trapped in the arterial intima, it undergoes changes, such as oxidation and aggregation, that facilitate its uptake by intimal monocytes-macrophages and VSMC through their recognition by non-classic LDL receptors.5 These receptors are not regulated by cholesterol and allow a massive uptake of modified LDL, causing intracellular lipid accumulation.

The low-density lipoprotein receptor–related protein 1 (LRP1), which is a transmembrane multiligand receptor6 belonging to the LDLR family, is expressed in different cells such as neurons, fibroblasts, tumoral cells, hepatocytes, vascular smooth muscle cells, and monocytes and macrophages.7 , 8 It is known to participate in the uptake of modified LDL9 and is over expressed in atherosclerotic plaques in both animal and human models.10 , 11

Furthermore, LRP1 gene expression is increased in mononuclear cells from patients with coronary occlusion.12 , 13 In monocytes and macrophages, LRP1 contributes to the uptake of modified aggregated LDL.14 , 15 Nevertheless, the effects of hypertension on LRP1 expression in humans are not exactly known. Therefore, obtaining circulating monocytes made it possible to study the mechanisms of their participation in the formation of atherosclerotic plaque.16 In another way, the cIMT is considered an excellent non-invasive marker for cardiovascular disease; it has been associated with atherosclerosis and cardiovascular risk factors17 , 18 and the prevalence of cardiovascular disease, proving it is useful in the diagnosis of atherosclerosis.19 - 21 Accordingly, the purpose of this paper was to study the LRP1 mRNA levels and protein expression in monocytes from patients with essential arterial hypertension and their correlation with carotid intima media thickness.

 Methods Study Population and Design

A total of 200 unrelated Mexican subjects (109 patients diagnosed with essential hypertension and 91 normotensive subjects) were recruited at the Instituto Nacional de Cardiología “Ignacio Chávez”. The inclusion criteria for both groups were: to be Mexican by birth with at least 3 previous generations, be older than 40 years, and to agree to participate in the study by signing an informed consent. Controls were apparently healthy, asymptomatic individuals, without a family history of hypertension or premature cardiovascular disease, with blood pressure ≤120/80 mmHg. For the hypertensive group, subjects had blood pressure ≥140/90 mmHg or had been previously diagnosed with essential hypertension. The exclusion criterion was suffering from a chronic degenerative disease. All participants answered standardized and validated questionnaires to obtain information on their family and medical history, alcohol and tobacco consumption, eating habits, and physical activity.

The ethics committee of the Instituto Nacional de Cardiología “Ignacio Chavez” approved the project; the patients gave written informed consent prior to the study. All procedures were in agreement with the Helsinki Declaration of 1975, as revised in 2013.

 Anthropometric Measurement

The selected subjects underwent anthropometric measurements to determine their height in meters (m) and weight in kilograms (kg). Blood pressure was measured using a mercury sphygmomanometer, following the recommendations of the VII Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure (JNC VII).

 Carotid Intima Media Thickness

A specialist in sonography resolution assessed the carotid intima media thickness (cIMT); all measurements were performed with A Sonosite Micromax ultrasound coupled to a 13 MHz multifrequency high-resolution linear transducer. Measurements were made on the common carotid after the examination of a 10-mm longitudinal section at a 2-cm distance from the bifurcation, the anterior or proximal wall, and the posterior or distal wall were measured on the lateral, anterior, and posterior projections, followed by an axis perpendicular to the artery to discriminate two lines: one for the intima-blood interface and the other to the media-adventitious interface. Five measurements were obtained of the right carotid and five of the left carotid, using average (average cIMT) and maximum values (maximum cIMT), automatically calculated by the software. cIMT was considered abnormal with values greater than or equal to 75 percentile by age and sex.22

 Biochemical Determinations

Blood samples were collected after a 12-hour fasting period; glucose, total cholesterol (TC), triglycerides (TG), and high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) were measured in fresh samples (fasting plasma) using standardized enzymatic procedures in a Hitachi 902 analyzer (Hitachi Ltd,Tokio, Japan); low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) was estimated using the DeLong et al. formula.23 All assays were under an external quality control scheme (Lipid Standardization Program, Center for Disease Control in Atlanta, GA, USA).

Ang II serum concentrations were evaluated by capillary zone electrophoresis as previously described.24 Total high-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP) levels were determined by immunonephelometry on a BN Pro Spec nephelometer (Dade Behring Marburg GmbH, Germany). Inter-assay coefficient of variation (CV) values were <6 % for all of these assays. Non-HDL-cholesterol (non HDL-C) was calculated by subtracting HDL-C from total cholesterol. The dyslipidemia value was defined according to conventional cardiovascular risk factors: (TC) ≥200 mg/dL and/or HDL-C ≤ 40mg/dL and/or LDL-C ≥130 mg/dL and/or TG ≥150mg/dL.

 Separation of Peripheral Blood Monocyte

Collected whole-blood in tubes with EDTA was diluted 1:1 with PBS 1×–1% heparin; Histopaque 1077 (10771, Sigma-Aldrich) was subsequently added. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were obtained from the central white band of the gradient after centrifugation. Next, monocytes were obtained by directly enriching for CD14+ cells by the magnetic sorting system (MACS; Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany). 1 mL aliquot of TripureTM reagent (Roche Molecular Biochemicals) was then added for collecting the monocytes. Cells were stored at −80 °C.

 Cell Line THP-l Culture

Human monocytic leukemia cells were maintained in a suspension culture of RPMI-1640 medium (Gibco-BRL) containing 2 mM glutamine, 25 mM HEPES, 1.5 g/L sodium bicarbonate, 50 U/mL penicillin, and 50 μg/mL streptomycin (Sigma), supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), at 37°C, in 5% CO2. Arrested THP-1 cells were pre-incubated with Ang II (1 µmol/L) for increasing periods of time to analyze the effect of Ang II on LRP1 expression in the monocytes. The dose of angiotensin II was selected on the basis of previous studies in our group and provides a plasma concentration of angiotensin II similar to that reported in patients with hypertension.25

 RNA Extraction and cDNA Synthesis

Total RNA was extracted using monocyte TripureTMIsolation Reagent (Roche Molecular Diagnostics, Indianapolis, USA), according to the manufacturer’s instructions. RNA yield and quality were assessed by 1% agarose gel electrophoresis; RNA was stored at -80°C until analysis. Reverse transcription reaction was performed using 1 µg of total RNA for cDNA synthesis according to High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems Foster City, CA, USA). The cDNA was stored at -80°C.

 Gene Expression Assays

LRP1 gene expression (Hs00233899_m1) and HPRT (Hs99999909_m1) (endogenous gene) were performed via semi-quantitative real-time reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), using a commercial kit. The “TaqMan Gene Expression” was performed using 1 µl reverse transcription products mixed with 10 µl of TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 µl 20x assays and 8 µl nuclease-free water. After gentle mixing, the mixture was transferred to a real-time PCR microplate, using 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems) equipment.

The used conditions were: 50°C for 2 min and 10 min at 95°C, followed by 40 cycles at 95°C for 15s, and 60°C for 1min. Expression levels were measured in duplicate and the threshold cycle [Ct] values were determined and normalized using the endogenous gene expression ( HPRT ).

 Western Blot analysis

Total protein was isolated from monocytes using TriPureTMIsolation Reagent (Roche Molecular Diagnostics), according to the manufacturer’s instructions. The protein was quantified using Pierce BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Equivalent amounts of total protein (25 µg) were loaded onto 10% (v/v) SDS-polyacrylamide gels under reducing conditions. The samples were electrotransferred to nitrocellulose membranes, which were saturated at room temperature for 1 h in TTBS (20 mM Tris–HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.01% Tween 20 and 5% non-fat milk). Western blot analyses were performed using specific monoclonal antibodies against human LRP1 (85kDa -chain, clone 8B8 RDI 61067, dilution 1:40) and the corresponding secondary antibodies (1:10,000 dilution; Dako; Glostrup, Denmark). The QuantityOne software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) was used to quantify the bands present in the membranes via densitometry, and they were detected using ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (Amersham). The expression levels were measured in duplicate and normalized by comparing them with the concentration of a loading protein control. The results were expressed as arbitrary units of intensity.

 Statistical Analysis

Data were analyzed using the SPSS v19 software (SPSS Inc. Chicago USA). The results were expressed as the mean ± standard deviation (SD) in the continuous variables and percentages for categorical variables. The Shapiro-Wilk test used to assess normality. The comparison between groups was performed using the unpaired Student’s t-test for continuous variables and chi square test for categorical variables. The correlation analysis was done according to the Pearson method. Multiple logistic regressions were used to explore the associations between cIMT and LRP1 expression. Data is presented as odds ratios (OR) with a confidence interval of 95%. A p <0.05 value was considered as statistically significant. The sample size was calculated taking the reference of Schulz 2002,13 according to proportions of independent samples, taking into account an incidence of the LRP1 gene of approximately 0.08 in the cases and 0.02 in the controls with a ∆ = 0.06, with a statistical power of 95%, p <0.05. According to the following formula our value of n was =79

n = p o q o z α + z β p i q i p o q o 2 ( p i − p o ) 2

po= Probability that LRP1 expression occurs in cases

q0= Probability that LRP1 expression doesn’t occur in cases

pi= Probability that LRP1 expression occurs in controls

qi= Probability that LRP1 expression doesn’t occur in controls

1.96= value <0.05

1.28= power (0.84)

n = ( 0.8 ) ( 0.92 ) 1.96 + 1.28 p ( 0.02 ) q ( 0.98 ) ( 0.08 ) ( 0.92 ) 2 ( ( 0.08 ) − ( 0.02 ) ) 2 Results Characteristics of the Study Population

A population of 200 Mexican subjects was studied, of which 91 were normotensive (NT) and 109 were hypertensive (HT) subjects. The biochemical and anthropometric characteristics of the studied population are shown in Table 1 . Out of the total population, 62.5% was female and 37.5% was male. Age, body mass index (BMI), cIMT, HDL-C, C-reactive protein, Ang II, and LDL-C/HDL-C, TC/HDL-C, TG/HDL-C indexes were statistically different between groups. These parameters were higher in the hypertensive group as compared to the normotensive group, except for HDL-C levels, which were lower in the hypertensive group. Obesity prevalence was 19.8% in normotensive and 44.1% in hypertensive subjects. No significant differences were found when the comparison was made between both genders of the same parameters. Also, we compared our groups according to dislipidemia levels according to ATP III; however, significant differences were only found in HDL-C (≤40 mg/dL), (NT= 16.5% vs HT= 32.7%, p=0.001) and triglycerides (≥150mg/dL) (NT= 42.7% vs HT= 57.3%, p=0.001) (data no shown).

– Anthropometric, clinical, and biochemical characteristics of study patients
Parameters Normotensive (n=91) Hypertensive (n=109) p
Age (years) 46.0±11.35 50.36±11.57 0.007
Gender (W/M) (%) 61.5/37.5 64/36 0.313
Weight (kg) 71.44±14.30 75.21±12.71 0.056
Height (cm) 161.99±9.81 159.39±9.06 0.057
BMI (Kg/m2) 26.92±4.06 29.36±3.77 <0.001
SBP (mmHg) 110.23±9.07 142.78±10.82 <0.001
DBP (mmHg) 69.90±75.85 91.94±7.72 <0.001
cIMT mean (mm) 0.587±0.16 0.729±0.16 0.002
cIMT max (mm) 0.606±0.18 0.787±0.16 0.008
Total cholesterol (mg/dL) 197.32±40.41 198.91±37.42 0.772
Triglycerides (mg/dL) 166.56±94.45 192.95±98.43 0.001
Log TG 2.16±0.22 2.23±0.19 0.010
HDL-C (mg/dlL) 52.51±13.25 46.66±13.59 0.002
LDL-C (mg/dL) 117.02±33.20 122.23±31.74 0.258
LDL/HDL 2.36±0.84 2.76±0.91 0.001
Non HDL-C 144.80±41.28 152.67±36.54 0.154
CT/HDL 3.96±1.20 4.50±1.26 0.003
TG/HDL 3.62±2.73 4.65±3.21 0.017
Glucose (mg/dL) 89.36±7.78 89.18±8.91 0.877
C Reactive Protein (mg/dL) 2.37±2.06 3.87±2.85 0.011
Smoking 1.83±0.38 1.67±0.51 0.491

The values are expressed as mean ± SD or percentages for categorical values. Unpaired Student T Test and chi-square test for categorical values were used. BMI: body mass index; SBP: Systolic blood pressure; DBP: Diastolic blood pressure; cIMT mean: carotid intima media thickness mean; IMT max: Intima-media thickness maximal; HDL-C: High density lipoprotein cholesterol; LDL-C: Low density lipoprotein cholesterol.

Correlation Between Hypertension and Expression of LRP1 in Monocytes

With the purpose of ascertaining the levels of mRNA and protein expression, an LRP1 analysis was performed for both groups ( Figure 1 ). Significant differences were found between NT versus HT groups in mRNA expression (P=0.002) and for protein expression (p=0.001). When men and women subjects were compared, the only signficiant difference found was in LRP1 mRNA in hypertensive subjects and there was an overexpression in women as compared to men (p=0.044). Moreover, an increase in the LRP1 mRNA and protein expression was found in hypertensive dyslipidemic subjects as compared to normotensive dyslipidemic subjects (data no shown).

– Quantification of LRP1 expression in total subjects and broken down by genders. (A) Comparison of LRP1 expression in monocytes from normotensive and hypertensive subjects. Real-time PCR analysis of LRP1 mRNA expression. Data were processed with a specially designed software, based on the Ct value of each sample, and normalized to HPRT1 (B) Western blot analysis showing LRP1 protein expression in monocytes.

Conversely, to examine if others factors like cIMT and Ang II variable were analyzed to determine whether they could participate in the blood pressure values ( Table 2 ). A significant difference was found between NT versus HT for cIMT (p=0.002) and Ang II (p=0.046), respectively. However, when subjects were broken down by gender, no differences were found in either of the two parameters.

– Values of cIMT and Ang II broken down by gender
NT HTA p NT Women NT Men p HTA Women HTA Men p
IMT (mm) 0.568 ± 0.16 0.715 ± 0.16 0.002 0.553 ± 0.149 0.583 ± 0.178 0.303 0.692 ± 0.14 0.719 ± 0,19 0.643
Ang II (pmol/ml) 0.195± 0.09 0.226 ± 0.12 0.046 0.200 ±0.090 0.186 ± 0.090 0.468 0.220 ± 0.11 0.238 ± 0,14 0.482

NT: Normotensive; HTA: Hypertensive; IMT: mean intima-media thickness, Ang II: Angiotensin II. Unpaired Student T Test.

Angiotensin II Effect on Monocyte <italic>LRP1</italic> Expression Levels

To study the effect of Ang II mediated LRP1 induction on monocytes, the THP1 monocyte cell line was incubated with Ang II for 4h and 8h, with concentrations of 1 and 10 µM. In the THP1 monocyte cell line, Ang II increased LPR1 mRNA expression in a dose and time dependent manner, being more evident at 8 hours of incubation ( Figure 2 ).

– Effect of angiotensin II on the LRP1 expression in THP1 cells.

Association between monocytes LRP1 expression and carotid intima/media thickness from patients with hypertension.

To know if there was a relationship between the thickness of the cIMT and LRP1 mRNA expression and/or LRP1 protein expression, multiple logistic regressions adjusted by lipid profile, age, and gender were conducted ( Table 3 ). A significant difference was found between cIMT and the LRP1 mRNA expression levels (p=0.047) and LRP1 protein levels (p=0.039) in hypertensive patients.

– Association between the expression of LRP1 and cIMT adjusted for lipid parameters in patients with hypertension
mRNA OR [CI 95%] p
Adjustment [-] 0.308 [0.230 – 38.650] 0.047
Model 1 0.310 [0.340 - 38.887] 0.046
Model 2 0.303 [-0.280 - 38.511] 0.053
Model 3 0.308 [0.131 – 38.832] 0.049
Model 4 0.312 [0.150 – 38.33] 0.038
Model 5 0.301 [-0.181 - 38.19] 0.052
Protein OR [CI 95%] p
adjustment [-] 0.312 [1.771 - 65.319] 0.039
Model 1 0.294 [-2.150 - 65.208] 0.066
Model 2 0.211 [1.544 - 65.637] 0.040
Model 3 0.313 [1.445 - 65.77] 0.041
Model 4 0.317 [2.020 - 66.015] 0.038
Model 5 0.313 [1.528 - 65.6689] 0.040

Model 1: adjusted by all lipid parameters. Model 2: adjusted by total Cholesterol. Model 3: adjusted by Triglycerides. Model 4: adjusted by HDL-C. Model 5: adjusted by LDL-C. Multiple logistic regressions analysis.

Therefore, an adjusted logistic regression for lipids was performed to analyze whether dyslipidemia could influence the association between LRP1 and cIMT in hypertensive patients ( Table 3 , Models 1-4). An association between cIMT and LRP1 mRNA expression with the entire set of lipid parameters was found: Model 1 (p=0.046), the association was maintained after adjusting each of the lipid parameters, Model 2 adjusted by total cholesterol (p= 0.053), Model 3 adjusted by triglycerides (p=0.049), Model 4 adjusted by HDL-C (p=0.038), and Model 5 adjusted by LDL-C (p=0.052).

However, we did not observe an association between cIMT and LRP1 protein expression when adjusting the complete set of lipid parameters, Model 1 (p=0.066). Nevertheless, when we adjusted with each lipid parameter, an association was found: Model 2 adjusted by total cholesterol (p=0.040), Model 3 adjusted by Triglycerides (p=0.041), Model 4 adjusted by HDL-C (p=0.038), and Model 5 adjusted by LDL-C (p=0.040).

Afterwards, a linear regression was made between cIMT and expression levels of both LRP1 mRNA and protein expression adjusted by lipid profile; a positive correlation between these variables was maintained ( Figure 3 ).

– Correlation between cIMT and the expression levels of mRNA and LRP1 protein adjusted for CT, TG, HDL-C, and LDL-C. P<0.005 is considered as statistically significant.

Discussion

As expected, our results showed that the average cIMT was higher in hypertensive subjects than in normotensive subjects. However, this value was associated in an important way with the LRP1 overexpression in circulating monocytes.

cIMT is considered an atherosclerosis marker and an excellent predictor of death and cardiovascular events.26 In hypertensive patients with coronary artery disease, increased cIMT is closely associated with atherosclerosis.27 Our data showed a strong association between hypertension and cIMT. These results agree with previously published data in studies made in patients and animal models. In a study of young people with borderline hypertension (130-140/85-89 mmHg), an increase in the cIMT in the brachial arteries was observed when patients were compared to normotensive subjects; an association between cIMT and ambulatory SBP of 24 hours was found.27 In addition, hypertension, diabetes, and age are considered independent prognostic factors for intima hyperplasia in the radial artery.28 - 30 In a hypertension animal model, a significant thickening of the intima-media was reported as the direct cause of the illness.31 , 32

Hypertension is among the main risk factors in the etiology of atherosclerotic vascular disease.33 , 34 However, the mechanisms by which arterial pressure increases the incidence of atherosclerosis are not completely clear. Studies that focus on elucidating these mechanisms are critically important. There is a strong association between hypertension and the LRP1 expression in the vascular wall of a rat model.35 The upregulation of LRP1 by hypertension has functional consequences as it promotes intracellular lipid accumulation and, thus, the formation of foam cells. Hypertension also has a high impact on vascular remodeling, chronic changes in hemodynamic forces, and structural alterations in the vascular wall.36

Our results show overexpression on both mRNA and protein expression of the LRP1 receptor in monocytes from hypertensive patients. They also show that Ang II increased the expression of LRP1 in cultures of THP-1 in a time and dose dependent manner. Therefore, the mechanism through which high blood pressure regulates the expression of LRP1 could be mediated by the angiotensin II effect, which is considered one of the main hypertension mediators. It has also been reported that angiotensin induces the activity of Sp1/Sp3 transcription factors, which are involved in the recognition of LRP1 promoter,13 causing LRP1 overexpression at a vascular level and favoring the formation of foam cell in human vascular smooth muscle cells.33

In addition to angiotensin II, blood flow acts on the function and structure of the endothelium through the modulation of the gene expression.37 The functional changes that are experienced by monocytes due to continuous changes in blood flow might have a positive influence on LRP1 expression, thus stimulating LDL uptake and causing an increase in cIMT.

In addition to a high prevalence of obesity, the Mexican population is facing a serious problem of dyslipidemia, which is explained by an interaction of genetic and environmental factors.38

In the analysis of dyslipidemia subjects according to conventional cardiovascular risk factors, we found an increase in the LRP1 mRNA and protein expression in hypertensive dyslipidemic subjects as compared to normotensive dyslipidemic subjects, which could mean that LRP1 is overexpressed by hypertension regardless of dyslipidemia.

Previous studies have shown that circulating soluble low-density lipoprotein receptor-related protein 1 (sLRP1) concentration may be intimately associated with hypercholesterolemia (LDL-C>200 mg/dL) and an upregulating effect of hypercholesterolemia on the expression of LRP1 in cells of the vascular wall in in vitro and in vivo models.39 Despite observing a high percentage of hypercholesterolemia in normotensive and hypertensive subjects, our results found no significant differences between both groups. A possible explanation for these differences could be: a) the association between sLPR1 and cholesterol was performed in hypercholesterolemic populations (severe hypercholesterolemia); b) the LRP1 could be expressed in a wide range of tissues and the specificity could be different; in our case, the LRP1 expression in monocytes was measured; c) the populations are very different; whereas our study was done using a mixture of indigenous American [65%], European [31%], and African [3%] subjects, the other study consisted solely of Caucasians.40

Our data indicate that the expression of LRP1 in monocytes from hypertensive patients correlates with increased cIMT. Adjusted logistic regression shows that the correlation between cIMT and LRP1 mRNA expression is maintained even after adjusting lipid parameters. However, this association was lost when the adjustment was done with LRP1 protein. These results can be explained by the strong positive effect of modified LDL on the stability of LRP1 protein.41 , 42 Therefore, dyslipidemia probably contributes to maintaining a high LRP1 protein expression in monocytes from hypertensive patients. This could justify why the association between cIMT and LRP1 protein expression after adjustment for lipid profile is lost.

 Conclusions

Our findings suggest that the effect of hypertension on atherosclerosis might occur through the overexpression of LRP1 in circulating monocytes. Ang II induced monocyte LRP1 upregulation, and it may play an important role in the increased cIMT associated with cardiovascular risk factor induction of atherosclerotic lesion progression. These results reinforce the high relevance of LRP1 overexpression in the formation and progression of atherosclerotic plaques in humans.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by María José Jaramillo-Estrella, from Universidad Nacional Autonoma de México.

Sources of Funding This study was funded by Complementary Support for Researchers in the Consolidation Process SNI-1-2009 de CONACyT number 119410.