Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC s9sc3yPvYBkzMThmxr4K7Cw 00037 S0066-782X2021000100037 abc.20190409 10.36660/abc.20190409 Artigo Original Avaliação da Senescência de Células Sanguíneas Mononucleares Periféricas e na Disfunção Endotelial entre Adultos com Alto Risco Cardiovascular 0000-0003-2006-6253 Raj Vijay 1 Charles Soniya 2 Goenka Luxitaa 3 Ramamoorthy Thilagavathi 4 C Marimuthu 5 C Emmanuel 5 Mala Kanchana 1 Kumarasamy Subramaniyan 6 0000-0001-7101-8513 George Melvin 3 SRM Medical College Hospital Research Centre Kancheepuram Tamil Nadu Índia SRM Medical College Hospital and Research Centre - Medical Research, Kancheepuram, Tamil Nadu - Índia SRM Institute of Science and Technology Kattankulathur Tamil Nadu Índia SRM Institute of Science and Technology – Biotechnology, Kattankulathur, Tamil Nadu - Índia SRM Medical College Hospital Research Centre Kancheepuram Tamil Nadu Índia SRM Medical College Hospital and Research Centre - Clinical Pharmacology,Kancheepuram, Tamil Nadu - Índia SRM Institute of Science and Technology School of Public Health Kattankulathur Tamil Nadu Índia SRM Institute of Science and Technology - School of Public Health, Kattankulathur, Tamil Nadu - Índia Gleneagles Global Health City Chennai Chennai Tamil Nadu Índia Gleneagles Global Health City Chennai, Chennai, Tamil Nadu - Índia SRM Medical College Hospital Research Centre Kancheepuram Tamil Nadu Índia SRM Medical College Hospital and Research Centre - General Medicine,Kancheepuram, Tamil Nadu - Índia Correspondência: Melvin George • Dept of Clinical Pharmacology, SRM Medical College Hospital & Research Centre, SRM Institute of Science & Technology, SRM Nagar, Kattankulathur - 603203, Kanchipuram, Chennai, TN, India E-mail: melvingeorge2003@gmail.com

Contribuição dos Autores

Concepção e desenho da pesquisa: Emmanuel C, Mala K, Kumarasamy S, George M; Obtenção de dados: Raj V, Charles S, Marimuthu C, Emmanuel C; Análise e interpretação dos dados: Raj V, Charles S, Goenka L, Ramamoorthy T, Marimuthu C, Emmanuel C, Mala K, Kumarasamy S, George M; Análise estatística: Goenka L, Ramamoorthy T, George M; Obtenção de financiamento: Mala K, George M; Redação do manuscrito: Goenka L, Ramamoorthy T, George M; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Raj V, Charles S, Goenka L, Ramamoorthy T, Marimuthu C, Emmanuel C, Mala K, Kumarasamy S, George M.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 03 02 2021 01 2021 116 1 37 47 26 06 2019 25 09 2019 23 10 2019 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

Doenças cardiovasculares (DCV) são uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. O envelhecimento biológico tem sido associado à ocorrência de resultados cardiovasculares. Entretanto, o mecanismo subjacente desse processo ainda é desconhecido.

 Objetivos

Buscamos avaliar se a senescência das células sanguíneas mononucleares periféricas (CSMP) e biomarcadores endoteliais poderiam influenciar o risco cardiovascular (CV) e ser marcadores adequados para a detecção precoce de doenças cardiovasculares em adultos.

 Métodos

Neste estudo transversal, pacientes livres de DCV foram classificados como baixo (n=32) e alto (n=28) escore de risco intracardaco (IHR) A senescência das CSMP foi avaliada estimando-se a atividade de telomerase (AT) e detectando-se a presença de células senescentes e disfunção endotelial, estimando-se a concentração de nitrito e nitrato e a capacidade antioxidante total (CAT). A análise estatística foi realizada com o software SPSS, versão 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Todos os p-valores <0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

 Resultados

A senescência de CSMP de 0,95 [p-valor = 0,0001; 95% IC (0,874-1,026)] foi um indicador significativo de pacientes com escore de IHR mais alto, com um valor de corte de 21,65, com sensibilidade e especificidade de 92% e 88% respectivamente. Identificou-se que a senescência de CSMP, nitrito e nitrato, e AT eram independentemente associadas a um escore de IHR alto.

 Conclusão

Os status de nitrito e nitrato e AT, e a senescência de CSMP são medidas adequadas para prever o alto risco cardiovascular em adultos com risco CV. Entretanto devem ser realizados estudos de acompanhamento de longo prazo para confirmar esses achados. (Arq Bras Cardiol. 2021; 116(1):37-47)

 Doenças Cardiovasculares Envelhecimento Celula Endotélio Biomarcadores Pontuação de Propensão Fatores de Risco Introdução

Doenças cardiovasculares (DCV), tais como aterosclerose e infarto do miocárdio (IM) associado, continuam sendo uma das mais conhecidas e principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo, inclusive na Índia. Além disso, os custos sociais e econômicos envolvidos no tratamento de DCV são altos. Estima-se que mais de 75% das mortes por causas cardiovasculares (CV) ocorrem em países com renda baixa e média.1 O envelhecimento cronológico é considerado um dos mais fortes indicadores da ocorrência de doenças CV e cerebrovasculares tais como IM, insuficiência cardíaca, aterosclerose e acidente vascular. Entretanto, o envelhecimento biológico pode ser considerado superior ao envelhecimento cronológico pela estratificação de risco de DCV.2 O processo de envelhecimento biológico refere-se particularmente ao acúmulo de danos endoteliais que ocorrem devido a vários mecanismos mecânicos, hemodinâmicos e imunológicos, e é determinado por fatores sociais e ambientais. Acredita-se que a senescência vascular (%) (SV), um tipo de envelhecimento biológico do sistema vascular tenha a relevância prognóstica e terapêutica na aterosclerose. O envelhecimento biológico tem sido associado à ocorrência de resultados CV adversos. Entretanto, o mecanismo subjacente desse processo ainda é desconhecido.3 Além disso, o envelhecimento arterial é o principal reflexo do envelhecimento biológico.4,5 A ausência de atividade de telomerase (AT) leva ao encurtamento dos telômeros, que é um determinante importante do envelhecimento biológico, levando a várias doenças vasculares. O termo disfunção endotelial se refere a várias condições patológicas que incluem a alteração das propriedades anticoagulantes e anti-inflamatórias do endotélio, a desregulação da modelagem vascular, e a deterioração da regulação do crescimento vascular. A disfunção endotelial leva a produção ou disponibilidade atenuada de óxido nítrico (NO) e causa a upregulation do stress oxidativo pelo aumento da produção de espécies reativas do oxigênio (ERO).6 A senescência celular demonstrou ser equivalente à senescência epitelial, e, portanto, à senescência vascular.7 0 Na prática clínica atual, o risco de DCV é estimado e quantificado com base em fatores de risco convencionais, tais como idade, diabetes, hipertensão, tabagismo, hipercolesterolemia e histórico familiar de DCV. Entretanto, indivíduos portadores de DCV podem ter apenas um ou nenhum dos fatores de risco tradicionais, e há a possibilidade de que esses fatores de risco possam não explicar totalmente o avanço da doença. Portanto, a avaliação de outros fatores de risco não tradicionais e incomuns pode ajudar clínicos a prever o risco futuro de DCV.8 Levantamos a hipótese de que a senescência das células sanguíneas mononucleares periféricas (CSMP) e biomarcadores endoteliais poderiam influenciar o risco CV e poderiam ser marcadores adequados para a detecção precoce de doenças cardiovasculares em adultos com alto risco CV.

 Materiais e Métodos Desenho e Configuração do Estudo

O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional (973/IEC/2016). Todos os procedimentos do estudo foram seguidos de acordo com a Declaração de Helsinki. Todos os participantes deste estudo transversal passaram por triagem e foram recrutados no período entre janeiro de 2017 e dezembro de 2017, do departamento de pacientes externos (DPE) em Medicina Geral e das clínicas. A Figura 1 apresenta o delineamento do estudo de pesquisa.

– Pacientes com escore de risco intracardíaco mais alto.

Sujeitos do Estudo

Incluímos todos os adultos acima de 18 anos de idade, de ambos os sexos, que compareceram ao DPE de Medicina Geral e clínicas sem quaisquer doenças cardíacas. Os pacientes com risco cardiovascular mais alto e mais baixo foram incluídos. Os pacientes foram classificados com base em seu escore de risco intracardíaco (IHR). O escore IHR foi calculado com base na presença ou ausência de fatores de risco CV conhecidos. Excluímos pacientes com quaisquer doenças cardíacas ou doenças imunes ativas e doenças crônicas do fígado e do rim.

 Escore de Risco Intracardíaco

Depois de obter o consentimento informado, os participantes do estudo passaram por triagem de acordo com os critérios de inclusão/exclusão e o escore de IHR foi medido. O escore de IHR foi calculado utilizando-se a versão que não incluía dados sobre níveis de colesterol. O escore de IHR, composto de informação sobre histórico médico e dados sobre idade, sexo, status em relação a diabetes, hipertensão, tabagismo, histórico familiar de doença cardíaca, razão cintura-quadril, fatores psicossociais, dieta e atividade física. Os escores de IHR variaram entre 0 e 48, em que escores mais altos ou mais baixos indicam escores de IHR mais altos e mais baixos, respectivamente. Um escore de IHR alto foi definido em > 16 unidades.9

 Coleta de Amostras

Foram retirados 3 ml de sangue da veia antecubital no antebraço em tubos vacutainers com heparina e ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) separadamente. A amostra de sangue obtida nos tubos vacutainers com EDTA foi submetida e centrifugação a 2500 revoluções por minuto (rpm) por 10 minutos e o plasma isolado foi armazenado a -80°C. A amostra de sangue coletada nos tubos vacutainers com heparina foram processadas para separar a senescência de células sanguíneas mononucleares periféricas (CSMP), utilizando o reagente Ficoll-Histopaque. As CSMP isoladas foram fixadas com álcool 70% e foram armazenadas a 4°C para análises posteriores.10 A disfunção endotelial foi avaliada estimando-se a concentração de nitrito e nitrato e o status antioxidante.11

 Quantificação de Nitrito e Nitrato Totais

A estimativa de nitrito e nitrato totais foi realizada de acordo com kit de teste de reação de Griess, utilizando o kit de ensaio Nitrito/Nitrato (Sigma-Aldrich-Número no catálogo 23479, St. Louis, EUA), de forma a avaliar indiretamente a biodisponibilidade de óxido nítrico (NO). Filtros centrífugos com peso molecular de corte de 3.000 KDa foram utilizados para filtrar as amostras de plasma (300μl cada). A análise das amostras de plasma passante foi realizada utilizando-se microplacas para titulação de 96 poços, e a absorção foi medida a 540 nm em relação a padrões de referência.

 Estimativa da Atividade de Telomerase

A AT do plasma foi estimada usando-se a reação o TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA (Ensaio imunoenzimático fotométrico para detecção da atividade de telomerase, utilizando o Protocolo de amplificação da repetição de telomerase (TRAP, do inglês Telomerase Repeat Amplification Protocol), Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science-Número do catálogo 11854666910, Mannheim, Alemanha]. O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante.

 Estimativa da Capacidade Antioxidante Total (CAT)

O CAT do plasma foi estimado utilizando-se o teste de capacidade antioxidante equivalente ao Trolox (TEAC, do inglês Trolox equivalent antioxidant capacity). A análise foi realizada de acordo com as instruções do fabricante fornecidas no kit de ensaio antioxidante disponível comercialmente (Sigma-Aldrich-Número do catálogo CS0790, St. Louis, EUA). Esse ensaio foi baseado na capacidade de determinar a presença de antioxidantes de peso molecular baixo no plasma inibe a produção de ABTS+ produzido pela oxidação de ABTS [2,2’- azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)]. O CAT foi expresso na forma de equivalentes do Trolox (mM).

 Citometria de Fluxo (FACS)

As CSMP foram isoladas do sangue total utilizando o reagente Ficoll-Histopaque. Depois de isoladas, as CSMP foram fixadas com álcool 70% e foram armazenadas a 4°C durante a noite.10 As células isoladas foram, então, incubadas por 10 minutos com Rnase A (1mg/ml) por 10 minutos em temperatura ambiente. A senescência das CSMP (%) foram detectadas usando o reagente corante iodeto de propídio por citometria de fluxo (FC 500 Beckmann Coulter).

 Análise Estatística

A análise estatística do estudo foi realizada utilizando-se o software SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA), e p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A normalidade dos dados para variáveis contínuas foi verificada, utilizando-se gráficos Q-Q. As variáveis contínuas foram resumidas como média ± desvio padrão (DP) e os dados categóricos foram expressos em frequência (porcentagens). Diferenças nas variáveis categóricas entre os grupos foram avaliadas com o teste qui-quadrado. Testes paramétricos foram usados com base na distribuição de dados. As diferenças em variáveis contínuas entre os grupos foram analisadas utilizando o teste t de amostras independentes. A correlação de Pearson foi realizada para identificar quaisquer associações entre as diferentes variáveis. Traçamos a curva de característica de operação do receptor (ROC) para identificar o corte para todos os ensaios de laboratório para prever o escore de IHR alto. Um escore de IHR alto foi definido em > 16 unidades.9 Todas as premissas necessárias pra realizar a análise de regressão linear foram cumpridas. Modelos de regressão múltipla foram plotados para determinar se as variáveis independentes senescência de CSMP, nitrito e nitrato, CAT e AT poderiam prever o escore de IHR.

 Resultados Características de Linha de Base dos Pacientes do Estudo

As características de linha de base dos pacientes do estudo foram ilustradas (Tabela 1). Os pacientes do estudo (n=60) foram classificados em dois grupos de pacientes com escore de IHR mais baixo (n=32) e mais alto (n=28). Os pacientes com escore de IHR ≥16 foram classificados como pacientes com escore de IHR mais alto, e os com IHR < 16 foram classificados como de escore de IHR mais baixo. A média de idade dos pacientes do estudo com escores de IHR mais baixo e mais alto foi de 38,09±15,82 e 43,57±11,55 anos, respectivamente. Não houve diferença significativa quanto ao gênero dos grupos do estudo. Os escores médios de IHR entre os pacientes com escores de IHR mais baixo e mais alto foram 8,5±4,27 unidades e 20,46±2,19 unidades, respectivamente. Como esperado, a presença de fatores de risco de CV tais como diabetes e hipertensão foi maior entre pacientes com escore de IHR mais alto do que entre os com escore de IHR mais baixo.

– Dados demográficos e fatores de risco dos participantes do estudo
No. Sl Características Sujeitos com IHR mais baixo (n=32) Sujeitos com IHR mais alto (n=28) p valor
1. Idade, anos 38,09±15,82 43,57±11,55 0,13
2. Sexo masculino, n (%) 20 (62,5%) 14 (50%) 0,33
3. Escore de risco intracardíaco (IHR) 8,5±4,27 20,46±2,19 0,0001
4. Tabagismo, n (%) 2 (6,2%) 5 (17,9%) 0,16
5. Diabetes, n (%) 1 (3,1) 22 (78,6%) 0,0001
6. Hipertensão, n (%) 32 (100%) 7 (25%) 0,003
7. Histórico familiar de doença cardíaca, n (%) 2 (6,2%) 4 (14,3%) 0,30
8. Sedentarismo, n (%) 8 (25%) 9 (32,1%) 0,54

Os dados foram expressos como média ± desvio padrão e frequência (porcentagem). Os dados estatísticos usados para a comparação de variáveis contínuas foram t teste com amostras independentes, e, para as variáveis contínuas, o teste qui-quadrado. Um p-valor menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Senescência de Células Sanguíneas Mononucleares Periféricas

A senescência das CSMP foi avaliada nos pacientes do estudo estimando-se a AT e detectando-se a presença de células senescentes (Figura 2). A senescência média de CSMP (%), a porcentagem de células senescentes foi significativamente mais baixa entre os pacientes com escore de IHR mais baixo (12,41 ± 7,40) do que em pacientes do escore de IHR mais alto (35,26 ± 10,02) [p=0,0001] ((Figura 3a). A média de AT (unidades/3000 células) foi significativamente mais alta entre pacientes com escore de IHR mais baixo do que com mais alto [(1,80±0,53 unidades/3000 células) versus (0,94±0,23 unidades/3000 células) [p=0,0001] (Figura 3b). A presença de fatores de risco cardíaco, tais como diabetes, hipertensão e tabagismo, influenciou os níveis de senescência de CSMP e AT (Tabela 2).

– Identificação e quantificação de células senescentes utilizando iodeto de propídio.

– Comparação da senescência de células mononucleares do sangue periférico, atividade telomerase, nitrito / nitrato e capacidade antioxidante total entre pacientes com escores de risco intermediário baixo e alto. O teste estatístico utilizado para comparar variáveis contínuas foi o teste T com amostras independentes; um p-valor menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

– Quantificação da senescência de células sanguíneas mononucleares periféricas e na disfunção endotelial baseada na presença e ausência de fatore de risco
Senescência de CSMP Nitrito e nitrato Atividade de telomerase CAT
Fatores de risco Presença Ausência Presença Ausência Presença Ausência Presença Ausência
Diabetes 34,99±9,99* 15,67±11,44 204,22±42,39* 145,41±55,19 0,96±0,23* 1,67±0,60 0,52±0,08* 0,66±0,14
Hipertensão 40,37±10,68* 20,79±13,26 224,71±28,01* 160,45±56,84 0,81±0,18* 1,47±0,59 0,40±0,09* 0,64±0,12
Tabagismo 36,05+12,38* 21,36+13,83 204,14±56,40 163,17±56,97 0,88±0,23* 1,46±0,60 0,51±0,12* 0,65±0,13
Doença cardíaca F/H/O 31,40±16,81 22,15±13,96 191,17±36,08 165,37±59,58 1,04±0,43 1,44±0,60 0,48±0,15 0,63±0,13
Sedentarismo 28,86±15,33 20,79±13,50 172,47±53,74 166,16±60,06 1,24±0,52 1,45±0,62 0,57±0,14 0,63±0,13

*p<0.05; CSMP: Células sanguíneas mononucleares periféricas; CAT: Capacidade antioxidante total. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. Os dados estatísticos usados para a comparação das variáveis foram t teste com amostras independentes. Um p-valor menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Disfunção Endotelial

A concentração de nitrito e nitrato foi ligeiramente mais alta entre pacientes com escore de IHR mais alto em comparação com pacientes com escore de IHR mais baixo [205,14±43,60 µmole/l versus 135,41±48,95 µmole/l (p=0,0001)] (Figura 3c). A CAT foi significativamente mais alta entre pacientes com escore de IHR mais baixo do que com mais alto [(0,71±0,08 mM/L) versus (0,50±0,09 mM/L) (p=0,0001] (Figura 3d). Entretanto a CAT foi estimada para apenas 30 sujeitos. Uma tendência semelhante foi observada entre pacientes fumantes, diabéticos e hipertensos (Tabela 2).

 A relação entre Senescência de CSMP e Disfunção Endotelial

Observamos uma correlação positiva entre idade e senescência de CSMP (r=0,36, p=0,005), mas uma correlação negativa significativa foi observada entre idade e CAT (r=-0,60, p=0,0001). O escore de IHR demonstrou correlações positivas significativas com senescência de CSMP (r=0,75, p=0,0001) e nitrito e nitrato (r=0,56, p=0,0001), enquanto correlações negativas significativas foram observadas com AT (r=-0,83, p=0,0001) e CAT (r=-0,92, p=0,0001). Além disso, a senescência de CSMP também demonstrou correlações significativas com variáveis nitrito e nitrato, CAT e atividade de telomerase (Figura 4).

– Correlação da senescência de CSMP com idade, nitrito / nitrato, atividade telomerase e capacidade antioxidante total.

Análise de Curva ROC para Senescência de CSMP e Disfunção Endotelial:

A curva ROC foi traçada para verificar se senescência de CSMP, nitrito e nitrato, status de antioxidante e AT poderiam prever um escore de IHR alto entre os pacientes do estudo. A análise demonstrou que a senescência 0,95 [p-valor = 0,0001; 95% CI (0,874-1,026)] foi um indicador significativo de pacientes com escore de IHR mais alto, com um valor de corte de 21,65, com uma sensibilidade e especificidade de 92% e 88% respectivamente (Figura 5).

– Curvas de características operacionais do receptor para a previsão do High Interheart Risk Score.

Modelos de Regressão Múltipla para Senescência de CSMP e Disfunção Endotelial

Modelos de regressão múltipla foram plotados para analisar os efeitos das variáveis independentes senescência de CSMP, nitrito e nitrato, e AT nas variáveis dependentes do escore de IHR (Tabela 3). Observou-se que a senescência de CSMP, nitrito e nitrato, e AT eram independentemente associadas a um escore de IHR alto (Tabela 3).

– Modelos de regressão múltiplos para prever o escore de risco intracardíaco
Coeficientes
Modelo Coeficientes não padronizados Coeficientes padronizados t R quadrado ajustado p valor
B Padrão Erro Beta
1 (Constante) 27,449 1,295 21,197 0,679 0,0001
AtividadeTelomerase -9,575 0,854 -0,827 -11,216 0,000
2 (Constante) 21,160 2,470 8,567 0,716 0,0001
AtividadeTelomerase -8,357 0,904 -0,722 -9,242 0,0001
NitritoeNitrato 0,027 0,009 0,229 2,927 0,005
3 (Constante) 17,112 2,988 5,727 0,735 0,000
AtividadeTelomerase -6,608 1,169 -0,571 -5,652 0,000
NitritoeNitrato 0,021 0,009 0,179 2,274 0,027
Senescência 0,113 0,050 0,235 2,251 0,028

B: Coeficiente de regressão não padronizado; SEβ: Erro padrão de coeficiente; β: Coeficientes padronizados; p<0,05*

Discussão

A relação entre senescência de CSMP e disfunção endotelial e a ocorrência de DCV foi descrita em estudos anteriores.3,12 Entretanto, as informações relacionadas à relação entre senescência de CSMP, disfunção endotelial, e DCV entre sujeitos sem qualquer DCV estabelecida continuam escassas. Este é o primeiro estudo clínico realizado na população do sul da Índia que estimou a senescência de CSMP e que determinou sua relação com alto risco de CV usando um escore de IHR. O principal achado de nosso estudo foi de que senescência de CSMP, nitrito e nitrato, e AT eram independentemente associados a um escore de IHR alto. A gravidade da senescência de CSMP foi maior entre pacientes com risco de CV mais alto se comparado a pacientes com risco de CV mais baixo. A senescência de CSMP foi estimada com base em AT e na porcentagem de células senescentes (%) entre os pacientes do estudo.

Telômeros e telomerase têm um papel significativo no desenvolvimento e na patogênese de DCV. Sabe-se que, a cada divisão celular, o comprimento dos telômeros diminui, enquanto a inflamação e o stress oxidativo, que são mecanismos importantes envolvidos no desenvolvimento e na patogênese de DCV aumenta o índice de encurtamento levando à senescência celular.13-15 Além disso, a presença de AT mais baixa e comprimento dos telômeros de leucócitos (CTL) foi vista em células endoteliais senescentes, células musculares lisas vasculares (CMLV), placa aterosclerótica, e estas também estão associadas com a instabilidade da placa que leva a DCV. A ausência de AT que mantém a integridade do telômero e o comprimento do telômero torna a célula senescente e causa apoptose.16-18 Nosso estudo revelou que a AT foi significativamente mais baixa em pacientes com escore de IHR mais alto do que mais baixo. Em contraste com nossos achados, um estudo anterior chamado desenvolvimento de risco da artéria coronária em jovens adultos (CARDIA), conduzido entre pacientes jovens com desenvolvimento de risco de artéria coronária com cálcio da artéria coronária (CAC), revelou que a AT desempenha um papel vital no desenvolvimento da aterosclerose. Os achados do estudo demonstraram que níveis mais altos de telomerase previram a prevalência mais alta de CAC entre homens de idade jovem a meia idade. Entretanto, os pacientes com telômeros mais curtos apresentaram uma associação positiva entre AT e CAC.19 Em um estudo transversal anterior, a associação entre carga de aterosclerose subclínica de um lado, e CTL médio e abundância de telômeros curtos (% CTL < 3 kb), de outro, foi estudada em 4.066 indivíduos de meia idade assintomáticos, sem a presença de qualquer DCV. O estudo demonstrou que o CTL médio e telômeros curtos não foram indicadores significativos e independentes de aterosclerose subclínica.20 Em um dos maiores estudos de observação e genéticos, conduzido em 290.022 indivíduos de Copenhagen, revelou-se que a presença de telômeros curtos foi associada a risco mais alto de doença cardíaca isquêmica.21A diferença nas constatações do estudo pode ser atribuída à heterogeneidade observada na população do estudo e do tamanho da amostra do estudo. Além disso, uma revisão sistemática recente e meta-análise de vinte e quatro estudos revelou uma associação inversa entre comprimento de telômeros de leucócitos e o risco de doença cardíaca coronária (DCC), independente de fatores de risco vascular convencionais.3 A revisão sistemática incluiu pacientes cardiovasculares, enquanto nosso estudo incluiu pacientes sem DCV. Portanto, pode-se sugerir que a medição de AT e CTL pode ser um marcador útil para prever o risco futuro de DCV. Atualmente, estão sendo realizadas investigações para medir se estatinas podem ser utilizadas como possíveis agentes terapêuticos para a ativação da telomerase e como geroprotetores eficientes.22

Recentemente, as células senescentes despertaram a atenção por seu potencial como alvo terapêutico para doenças relacionadas à idade, como as DCV. Estudos demonstraram que a senescência celular é equivalente à senescência epitelial, e, portanto, à senescência vascular. De aí em diante, o presente estudo mediu a porcentagem de células senescentes (%) que foi significativamente mais baixa com escore de IHR mais baixo em comparação com pacientes com escore de IHR mais alto. A análise transcricional de CMLV humanas demonstraram que houve supressão da proteína Gla da matriz (PGM), um inibidor de calcificação, nas CMLV senescentes. Além disso, houve a upregulation da transcrição que codifica a proteína óssea morfogenética 2 (BMP2), que promove a calcificação.23 Portanto, pode-se sugerir que as CMLV senescentes podem desempenhar um papel importante no desenvolvimento no endurecimento e no enrijecimento relacionados à idade, ao aumentar a calcificação. O enrijecimento e endurecimento das artérias levam ao desenvolvimento de pressão sanguínea alta, que é considerada um dos principais fatores de risco para a ocorrência de doença arterial coronariana, HF, acidente vascular, e IM.24 Outro estudo que foi realizado para comparar a expressão de PGM em células intersticiais da válvula aórtica (CIVA) normais versus doentes, que demonstrou que a expressão de PGM era significativamente reduzida nas CIVA doentes em relação às normais. Esses achados implicam que a ausência de um mecanismo de defesa contra a calcificação pode contribuir para a calcificação a válvula aórtica.25Portanto, a estimativa da porcentagem de células senescentes pode ser um marcador novo em potencial para indicar o desenvolvimento e o avanço de DCV. Estratégicas terapêuticas novas que envolvem a prevenção, a retirada e a substituição de células senescentes estão em fase inicial. É necessário ter melhor entendimento e realizar mais pesquisas para compreender a biologia para que esse conhecimento possa se traduzir em aplicações terapêuticas.

Neste estudo, a disfunção endotelial foi medida estimando-se a concentração de nitrito e nitrato e a CAT. A CAT foi ligeiramente mais baixa entre pacientes com escore de IHR mais alto em comparação com pacientes com escore de IHR mais baixo. Vários estudos epidemiológicos demonstraram que pessoas com maior consumo de vitaminas antioxidantes têm risco mais baixo de desenvolver IM e acidente vascular.26,27 Entretanto, uma revisão sistemática recente e meta-análise de ensaios controlados randômicos revelaram que a literatura atual não apresentava evidências para corroborar a hipótese do uso de vitaminas e antioxidantes para prevenir DCV.28Entretanto, uma revisão sistemática recente de estudos de observação demonstrou uma associação significativa entre níveis mais altos de capacidade de antioxidante total da dieta e fatores de risco de doenças cardiovasculares.29 Nosso estudo também demonstrou que as concentrações de nitrito e nitrato eram mais altas entre pacientes de alto risco em comparação com os de baixo risco. Em contraste, o estudo de Framingham demonstrou que uma concentração mais alta de nitrato no plasma foi associada a mortalidade global, mas não demonstrou estar associada à incidência de DCV.30 Isso pode se deter ao fato de que nitrito e nitrato presentes na dieta puderam ser metabolizados em NO e dessa forma promover a citoproteção e benefícios cardiovasculares.31 Os resultados em nosso estudo podem ser contrastantes, devido ao fato de que determinadas dietas, tais como vegetais, frutas e carnes processadas são fontes ricas em nitrito e nitrato.32 Portanto, há possibilidade de que pacientes de alto risco em nosso estudo estejam expostos a essas dietas. A resposta dependente do endotélio à vasodilatação é regulada pela liberação de NO sintetizado a partir de nitrato, nitrito e do aminoácido L-arginina da dieta, por meio de óxido nítrico-sintase endotelial (eNOS), que leva à produção de PGM cíclica intracelular. Entretanto, a disfunção endotelial leva ao desbalanço na produção de NO e ERO, levando à ocorrência de várias doenças relacionadas à idade, tais como as DCV. O acúmulo de ERO no plasma e intima arterial leva ao aumento da oxidação do lipoproteínas de baixa densidade (LDL); a captação desse LDL oxidado pelos macrófagos arteriais é um dos fatores importantes para a formação e avanço da placa aterosclerótica. Portanto, a presença de antioxidantes no plasma, partícula de LDL e parede da célula não podem inibir a oxidação do LDL, e podem proteger a vasorreatividade aumentando a liberação de NO endotelial e reduzindo a trombogenicidade.12,33Portanto, a determinação da CAT e da concentração de nitrito e nitrato pode acabar sendo um marcador potencial para previsão precoce de DCV no futuro.

Limitações

A principal limitação deste estudo está relacionada ao tamanho limitado da amostra. Outra limitação é que este estudo não teve um acompanhamento prospectivo de longo prazo com a confirmação de eventos clínicos. Em vez disso, o risco foi calculado com base no escore de risco intracardaco. Além disso, as amostras de sangue foram coletadas em diferentes momentos, o que pode ter afetado os níveis de testes laboratoriais.

 Conclusões

Este estudo demonstrou que a senescência de CSMP, AT e nitrito e nitrato são medidas adequadas para prever risco cardiovascular alto em adultos com risco CV. Portanto, a medição dos marcadores acima pode ser utilizada como ferramenta adicional de avaliação de risco para prever o risco de doenças cardiovasculares entre adultos. Entretanto, estudos de acompanhamento prospectivos de longo prazo, com a avaliação de eventos clínicos, precisam ser realizados para confirmar esses achados.

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Vinculação Acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Fontes de Financiamento.O presente estudo foi financiado pelo Selective Excellence Initiative Scheme of SRMIST, Kattankulathur, Chennai, India.

 Original Article Assessment of Peripheral Blood Mononuclear Cells Senescence and Endothelial Dysfunction among Adults with High Cardiovascular Risk 0000-0003-2006-6253 Raj Vijay 1 Charles Soniya 2 Goenka Luxitaa 3 Ramamoorthy Thilagavathi 4 C Marimuthu 5 C Emmanuel 5 Mala Kanchana 1 Kumarasamy Subramaniyan 6 0000-0001-7101-8513 George Melvin 3 India SRM Medical College Hospital and Research Centre - Medical Research, Kancheepuram, Tamil Nadu - India India SRM Institute of Science and Technology – Biotechnology, Kattankulathur, Tamil Nadu - India India SRM Medical College Hospital and Research Centre - Clinical Pharmacology, Kancheepuram, Tamil Nadu - India India SRM Institute of Science and Technology - School of Public Health, Kattankulathur, Tamil Nadu - India India Gleneagles Global Health City Chennai, Chennai, Tamil Nadu - India India SRM Medical College Hospital and Research Centre - General Medicine, Kancheepuram, Tamil Nadu - India Mailing Address: Melvin George • Dept of Clinical Pharmacology, SRM Medical College Hospital & Research Centre, SRM Institute of Science & Technology, SRM Nagar, Kattankulathur - 603203, Kanchipuram, Chennai, TN, India E-mail: melvingeorge2003@gmail.com

Author Contributions

Conception and design of the research: Emmanuel C, Mala K, Kumarasamy S, George M; Acquisition of data: Raj V, Charles S, Marimuthu C, Emmanuel C; Analysis and interpretation of the data: Raj V, Charles S, Goenka L, Emmanuel C,Ramamoorthy T, Marimuthu C, Mala K, Kumarasamy S, George M; Statistical analysis: Goenka L, Ramamoorthy T, George M; Obtaining financing: Mala K, George M; Writing of the manuscript: Goenka L, Ramamoorthy T, George M; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Raj V, Charles S, Goenka L, Ramamoorthy T, Marimuthu C, Emmanuel C, Mala K, Kumarasamy S, George M.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

 Abstract Background

Cardiovascular diseases (CVD) are one of the leading causes of mortality and morbidity worldwide. Biological aging has been associated with the occurrence of adverse cardiovascular outcomes; however, the underlying mechanism of this process remains unknown.

 Objectives

This study sought to evaluate if peripheral blood mononuclear cell (PBMC) senescence and endothelial biomarkers could influence cardiovascular (CV) risk and be suitable markers for the early detection of cardiovascular diseases in adults.

 Methods

In this cross-sectional study patients free of CVD were classified as lower (n=32) and higher Interheart Risk (IHR) scores (n=28). PBMC senescence was assessed by estimating the telomerase activity (TA) and detecting the presence of senescent cells and endothelial dysfunction by estimating the concentration of nitrite and nitrate and of total antioxidant capacity (TAC). Statistical analysis was performed with SPSS version 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). All p-values <0.05 were considered statistically significant.

 Results

PBMC senescence 0.95 [p-value = 0.0001; 95% CI (0.874-1.026)] was a significant predictor of patients with higher IHR scores with a cut-off value of 21.65 with a sensitivity and specificity of 92% and 88% respectively. PBMC senescence, nitrite and nitrate and TA were found to be independently associated with high IHR scores.

 Conclusion

PBMC senescence, TA and nitrite, and nitrate status are suitable measures to predict high cardiovascular risk in adults with CV risk. Nevertheless, long-term follow-up studies are needed to confirm these findings. (Arq Bras Cardiol. 2021; 116(1):37-47)

 Cardiovascular Diseases Cell Aging Endothelium Biomarkers Propensity Score Risk Factors Introduction

Cardiovascular diseases (CVD) such as atherosclerosis and associated myocardial infarction (MI) are still one of the well-known and leading causes of mortality and morbidity worldwide, especially in India. Moreover, the social and economic costs incurred in the treatment of CVD are high. It has been estimated that more than 75% of the cardiovascular (CV) deaths occur in lower and middle-income countries.1 Chronological aging is considered to be one of the strongest predictors for the occurrence of CV and cerebrovascular diseases, such as MI, heart failure (HF), atherosclerosis, and stroke; however, biological aging can be considered superior to chronological aging in the stratification of the CVD risk.2 The process of biological aging particularly refers to the accumulation of endothelial damage, which occurs due to several mechanical, hemodynamic, and immunological mechanisms, and is determined by both social and environmental factors. Vascular Senescence (%) (VS), a kind of biological aging of the vascular system, is postulated to have prognostic and therapeutic relevance in atherosclerosis. Biological aging has been associated with the occurrence of adverse CV outcomes; however, the underlying mechanism of this process remains unknown.3 Moreover, arterial aging is the primary reflection for biological aging.4,5 The absence of telomerase activity (TA) leads to the shortening of telomeres, which is an important determinant of biological aging leading to several vascular diseases. The term endothelial dysfunction refers to a number of pathological conditions that include the altered anticoagulant and anti-inflammatory properties of the endothelium, dysregulation of vascular modelling and the impaired regulation of vascular growth. Endothelial dysfunction leads to attenuated production or the availability of nitric oxide (NO) and leads to the up-regulation of oxidative stress through the increased production of reactive oxygen species (ROS)6. Cell senescence has proven to be equivalent to endothelial senescence and thus vascular senescence.7 In the current clinical practice, the risk of CVD is estimated and quantified on the basis of conventional risk factors such as age, diabetes, hypertension, smoking, hypercholesterolemia, and family history of CVD.8 Nevertheless, individuals with CVD might have only one, or none of the traditional risk factors and there is a possibility that these risk factors might not fully account for the disease progression. Therefore, the evaluation of other non-traditional and uncommon risk factors might aid clinicians in predicting the future risk of CVD. In this light, we hypothesized that peripheral blood mononuclear cell (PBMC) senescence and endothelial biomarkers could influence the CV risk and could be suitable markers for the early detection of cardiovascular disease among adults with high CV risk.

 Materials & Methods Study Design and Setting

The study protocol was approved by the Institutional Ethics Committee (973/IEC/2016). All the study procedures were followed according to the Declaration of Helsinki. All the study participants of this cross-sectional study were screened and recruited between January 2017 and December 2017 from the General Medicine outpatient department (OPD) and hospital wards. Figure 1 provides the outline of the study.

– Flow chart representations of the research study.

Study Subjects

This study included all adults over 18 years of age, of both genders, who received medical care at the General Medicine OPD and hospital wards with no cardiac diseases. Patients with both higher and lower cardiovascular risk were included. Patients were classified on the basis of their Interheart Risk (IHR) score. The IHR score was calculated based on the presence or absence of known CV risk factors. Patients with any cardiac disease, active immune disease, and chronic liver or kidney diseases were excluded from the study.

 Interheart Risk Score

After obtaining the informed consent form, the study participants were screened according to the inclusion/exclusion criteria, and the IHR score was measured. The IHR score was calculated using the version which did not include data on cholesterol levels. The IHR score consisted of information on medical history and data on the domains of age, gender, status with respect to diabetes, hypertension, smoking, family history of heart disease, waist-to-hip ratio, psychosocial factors, diet, and physical activity. The scores of the IHR ranged from 0 to 48, where higher and lower scores indicated higher IHR and lower IHR scores respectively. A high IHR score was defined as value16 units.9

 Sample Collection

Three ml of blood was obtained from the antecubital vein of the forearm in both heparin and Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) vacutainers separately. The blood sample obtained in the EDTA vacutainers was subjected to centrifugation at 2,500 revolutions per minute (rpm) for 10 minutes and the isolated plasma was stored at -80°C. The blood sample collected in the heparin vacutainers were processed for the separation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Senescence (PBMCs), using Ficoll-Histopaque reagent. The isolated PBMCs were those fixed with 70% ethanol and were stored at 4°C until further analysis.10 Endothelial dysfunction was assessed by estimating the concentration of nitrite and of nitrate and antioxidant status.11

 Quantification of Total Nitrite and Nitrate

The estimation of total nitrite and nitrate was performed according to the Griess reaction assay kit using the Nitrite/Nitrate Assay Kit (Sigma-Aldrich-Catalogue Number 23479, St. Louis, USA), so as to indirectly assess the bioavailability of nitric oxide (NO). Centrifugal filters, with a molecular weight 3,000 KDa cut-off, was used to filter the plasma samples (300μl each).The analysis of the flow through plasma samples was performed using a 96-well microtiter plate, and the absorbance was read at 540nm against the reference standards.

 Estimation of Telomerase Activity

Plasma TA was estimated using the Telo TAGGG Telomerase Polymerase chain reaction (PCR) ELISA [Photometric enzyme immunoassay for the detection of telomerase activity, utilizing the Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP), Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science-Catalog Number 11854666910, Mannheim, Germany]. The assay was performed according to manufacturer’s instructions.

 Estimation of Total Antioxidant Capacity (TAC)

The plasma TAC was estimated using the Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay. The analysis was performed according to manufacturer’s instructions provided in the commercially available Antioxidant Assay Kit (Sigma-Aldrich-Catalog Number CS0790, St. Louis, USA). This assay was based on the ability to determine if the presence of low molecular weight antioxidants in the plasma will inhibit the production of ABTS+ produced by the oxidation of ABTS [2, 2-Azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)]. The TAC was expressed in the form of Trolox equivalents (mM).

 Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Analysis

The PBMCs were isolated from the whole blood using Ficoll-Histopaque reagent. After the isolation of PBMCs, these were fixed with 70% ethanol and stored at 4°C overnight.10 The isolated cells were then incubated for 10 minutes with RNase A (1mg/ml) for 10min at room temperature. PBMC senescence (%) was then detected using the staining regent propidium iodide by flow cytometry (FC 500 Beckmann Coulter).

 Statistical Analysis

Statistical analysis for the study was performed using SPSS 16.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA); p<0.05 was considered statistically significant. The normality of data for continuous variables was checked using Q-Q plots. Continuous variables were summarized as the mean ± standard deviation (SD), and categorical data were expressed as the frequency (Percentages). Differences in the categorical variables between groups were evaluated with the chi-square test. Parametric tests were used based on the distribution of data. Differences in continuous variables between groups were analyzed using the Independent Samples t-Test. Pearson’s correlation was performed to identify any association between the different variables. A Receiver operating curve (ROC) was plotted to identify the cut-off for all the laboratory assays so as to predict the high IHR score. A high IHR score was defined as value16 units.9 All the necessary assumptions for performing the linear regression analysis were met. Multiple regression models were plotted to determine if the independent variable PBMC senescence, nitrite and nitrate, TAC, and TA could predict high IHR score.

 Results Baseline Characteristics of Study Patients

The baseline characteristics of the study patients have been illustrated (Table 1). The study patients (n=60) were classified into two groups of patients with lower (n=32) and higher IHR (n=28) scores. Patients with an IHR score≥16 were classified as higher IHR score patients and those with an IHR<16 were classified as lower IHR score patients. The mean age of study patients with lower and higher IHR scores was found to be 38.09±15.82 and 43.57±11.55 years, respectively. There was no significant difference in gender among the study groups. The mean IHR scores among patients with lower and higher IHR score patients were 8.5±4.27 units and 20.46±2.19 units, respectively. As expected, the presence of CV risk factors, such as diabetes and hypertension, were greater among patients with higher IHR scores than patients with lower IHR scores.

– Demographics and Risk Factors of Study Participants
Sl No. Characteristics Subjects with lower IHR (n=32) Subjects with higher IHR (n=28) p-value
1. Age, years 38.09±15.82 43.57±11.55 0.13
2. Male Gender, n (%) 20 (62.5%) 14 (50%) 0.33
3. Interheart Risk (IHR) Score 8.5±4.27 20.46±2.19 0.0001
4. Smoking, n (%) 2 (6.2%) 5 (17.9%) 0.16
5. Diabetes, n (%) 1 (3.1) 22 (78.6%) 0.0001
6. Hypertension, n (%) 32 (100%) 7 (25%) 0.003
7. Family history of Heart Disease, n (%) 2 (6.2%) 4 (14.3%) 0.30
8. Sedentary Lifestyle, n (%) 8 (25%) 9 (32.1%) 0.54

Data was expressed as Mean ± Standard Deviation and Frequency (Percentage). The statistical tests used to compare continuous variables were the independent samples t-test, while for the categorical variables, the chi-square test was used; p-value less than 0.05 was considered statistically significant.

Peripheral Blood Mononuclear Cell Senescence

PBMC senescence was assessed among the study patients by estimating the TA and detecting the presence of senescent cells (Figure 2). For the mean PBMC senescence (%), the percentage of senescent cells was significantly lower among patients with lower IHR scores (12.41 ± 7.40) than patients with higher IHR scores (35.26 ± 10.02) [p=0.0001] ((Figure 3a). The mean TA (Units/3000cells) was significantly greater among patients with lower rather than higher IHR scores, [(1.80±0.53 Units/3000cells) versus (0.94±0.23 Units/3000cells) [p=0.0001] (Figure 3b). The presence of cardiac risk factors, such as diabetes, hypertension, and smoking, influenced the levels of PBMC senescence and TA (Table 2).

– Identification and Quantification of Senescent Cells using Propidium Iodide.

– Comparision of peripheral blood mononuclear cell senescence, telomerase activity, nitrite/nitrate and total antioxidant capacity among patients with low and high interheart risk score. The statistics tests used to compare continuous variables were independent samples t-test; p-value less than 0.05 were consideres statistically significant.

– Quantification of Peripheral Blood Mononuclear Cell Senescence and Endothelial Dysfunction based on the presence and absence of risk factors
PBMC Senescence Nitrite & Nitrate Telomerase Activity TAC
Risk Factors Presence Absence Presence Absence Presence Absence Presence Absence
Diabetes 34.99±9.99* 15.67±11.44 204.22±42.39* 145.41±55.19 0.96±0.23* 1.67±0.60 0.52±0.08* 0.66±0.14
Hypertension 40.37±10.68* 20.79±13.26 224.71±28.01* 160.45±56.84 0.81±0.18* 1.47±0.59 0.40±0.09* 0.64±0.12
Smoking 36.05+12.38* 21.36+13.83 204.14±56.40 163.17±56.97 0.88±0.23* 1.46±0.60 0.51±0.12* 0.65±0.13
F/H/O Heart Disease 31.40±16.81 22.15±13.96 191.17±36.08 165.37±59.58 1.04±0.43 1.44±0.60 0.48±0.15 0.63±0.13
Sedentary Lifestyle 28.86±15.33 20.79±13.50 172.47±53.74 166.16±60.06 1.24±0.52 1.45±0.62 0.57±0.14 0.63±0.13

*p<0.05; PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cells; TAC: Total Antioxidant Capacity. Data was expressed as Mean ± Standard Deviation. The statistical tests used to compare the variables were independent samples t-tests; p-value less than 0.05 was considered statistically significant.

Endothelial Dysfunction

The concentration of nitrite and nitrate was slightly higher among patients with higher IHR scores when compared to patients with lower IHR scores [205.14±43.60 µmole/l versus 135.41±48.95 µmole/l (p=0.0001)] (Figure 3c). The TAC was significantly higher among patients with lower IHR than with higher IHR scores [(0.71±0.08 mM/L) versus (0.50±0.09 mM/L) (p=0.0001] (Figure 3d). However, the TAC was estimated for only 30 subjects. A similar trend was observed among smokers, diabetics, and hypertensive patients (Table 2).

 The Relationship Between PBMC Senescence and Endothelial Dysfunction

We observed a significant positive correlation between age and PBMC senescence (r=0.36, p=0.005), but a significant negative correlation was observed between age and TAC (r=-0.60, p=0.0001). IHR scores demonstrated significant positive correlations with PBMC senescence (r=0.75, p=0.0001) and nitrite & nitrate (r=0.56, p=0.0001), whereas significant negative correlations were observed with TA (r=-0.83, p=0.0001) and TAC (r=-0.92, p=0.0001). Additionally, PBMC senescence also showed significant correlations with the variables nitrite and nitrate, TAC, and telomerase activity (Figure 4).

– Correlation of PBMC senescence with age, nitrite/nitrate, telomerase activity and total antioxidant capacity.

ROC Curve Analysis for PBMC Senescence and Endothelial Dysfunction:

The ROC curve was plotted to check if PBMC senescence, nitrite and nitrate, antioxidant status, and TA could predict high IHR scores among the studied patients. The analysis demonstrated that PBMC senescence of 0.95 [p-value = 0.0001; 95% CI (0.874-1.026)] was a significant predictor of patients with higher IHR scores, with a cut-off value of 21.65, and with a sensitivity and specificity of 92% and 88%, respectively (Figure 5).

– Receiver operating characteristic curves for the prediction of High Interheart Risk Score.

Multiple Regression Models for PBMC Senescence and Endothelial dysfunction

Multiple regression models were plotted to analyze the effect of the independent variables of PBMC senescence, nitrite and nitrate, and TA on the dependent variable IHR score (Table 3). It was observed that PBMC senescence, nitrate and nitrite, and TA were independently associated with high IHR scores (Table 3).

– Multiple Regression Models to predict Interheart Risk Score
Coefficients
Model Unstandardized Coefficients Standardized Coefficients t Adjusted R Square p-value
B Std. Error Beta
1 (Constant) 27.449 1.295 21.197 0.679 0.0001
TelomeraseActivity -9.575 .854 -0.827 -11.216 .000
2 (Constant) 21.160 2.470 8.567 .716 0.0001
TelomeraseActivity -8.357 .904 -0.722 -9.242 0.0001
NitriteandNitrate .027 .009 0.229 2.927 0.005
3 (Constant) 17.112 2.988 5.727 .735 0.000
TelomeraseActivity -6.608 1.169 -0.571 -5.652 0.000
Nitrite and Nitrate .021 .009 0.179 2.274 0.027
Senescence .113 .050 0.235 2.251 0.028

B: Unstandardized Regression Coefficient; SEβ: Standard Error of Coefficient; β: Standardized Coefficient; p<0.05*

Discussion

The relationship between PBMC senescence and endothelial dysfunction, and the occurrence of CVD has been described in previous studies;3,12 however, the information regarding the relationship between PBMC senescence, endothelial dysfunction, and CVD among subjects with no established CVD remains sparse. To the best of our understanding, this is the first clinical study conducted in the South Indian population that estimated PBMC senescence and determined its relationship with high CV risk using the IHR score. The main finding of our study was that PBMC senescence, nitrite and nitrate, and TA were independently associated with high IHR scores. The severity of PBMC senescence was greater among patients with higher CV risk when compared to patients with lower CV risk. PBMC senescence was estimated on the basis of TA and the percentage of senescent cells (%) among the studied patients.

Telomeres and telomerase play a significant role in the development and pathogenesis of CVD. It is well-known that, with each cell division, the length of telomeres shortens, whereas inflammation and oxidative stress, which are major mechanisms involved in the development and pathogenesis of CVD, are known to increase the rate of telomere shortening, leading to cell senescence.13-15 Moreover, the presence of lower TA and shorter leukocyte telomere length (LTL) has been seen in the senescent endothelial cells, vascular smooth muscle cells (VSMCs), and atherosclerotic plaque, and these are also associated with plaque instability leading to CVD. The absence of TA, which maintains the telomere integrity and telomere length, makes the cell senescent and causes apoptosis.16-18 Our study revealed that TA was significantly lower among patients with higher than lower IHR scores. In contrast to our findings, an earlier study, named coronary artery risk development in young adults (CARDIA), conducted among young patients with coronary artery risk development with prevalent coronary artery calcium (CAC), revealed that TA plays a vital role in the development of atherosclerosis. The findings of the study demonstrated that higher levels of telomerase predicted a higher prevalence of CAC among young to middle-aged men. However, patients with shorter telomere length presented a positive association between TA and CAC.19 In an earlier cross-sectional study, the association between subclinical atherosclerosis burden and both average LTL and the abundance of short telomeres (%LTL<3 kb) was studied among 4,066 asymptomatic middle-aged subjects without the presence of any CVD. The study showed that the average LTL and short telomeres were not significant and independent predictors of subclinical atherosclerosis.20 In one of the largest observational and genetic studies, conducted in 290,022 individuals from Copenhagen, it was revealed that the presence of short telomeres was associated with a higher risk of ischemic heart disease.21The differences in the study findings might be attributable to the heterogeneity observed in the study population and the sample size of the study. Moreover, a recent systematic review and meta-analysis of twenty-four studies revealed an inverse association between leukocyte telomere length and the risk of coronary heart disease (CHD), regardless of conventional vascular risk factors.3 The systematic review included cardiovascular patients, whereas our study included patients free of CVD. Therefore, it can be suggested that measuring TA and LTL might be a useful marker for predicting the future risk of CVD. Presently, investigations are being carried out to gauge if statins could be used as potential therapeutic agents for telomerase activation and as effective geroprotectors.22

Lately, senescent cells have gained attention as a therapeutic target for several age-related diseases, such as CVD. Studies have shown that cell senescence has been equivalent to endothelial senescence, and thus vascular senescence as well. The present study then measured the percentage of senescent cells (%), which was significantly lower among patients with lower IHR scores, when compared to those with higher IHR scores. The transcriptional analysis of human VSMCs demonstrated that there was a suppression of the matrix Gla protein (MGP), an inhibitor of calcification, in the senescent VSMCs. Furthermore, there was also an up-regulation of transcript encoding bone morphogenic protein 2 (BMP2), which is a promoter of calcification.23 Therefore, it can be suggested that the senescent VSMCs might play a prominent role in the development of age-related hardening and stiffening through increased calcification. The stiffening and hardening of arteries lead to the development of high blood pressure, which is considered to be one of the major risk factors for the occurrence of coronary artery disease, HF, stroke, and MI.24 Another study conducted to compare MGP expression in normal versus diseased aortic valve interstitial cells (AVICs) showed that the MGP expression was significantly decreased in the diseased AVICs relative to normal AVICs. These findings imply that the absence of an anti-calcification defense mechanism might contribute to the calcification of the aortic valve.25Therefore, estimating the percentage of senescent cells might be a potential and novel marker for predicting the development and progression of CVD. Novel therapeutic strategies that involve the prevention, removal, and replacement of the senescent cells are at their inception. Further understanding and more research are required to understand this biology so as to translate this knowledge into therapeutic applications.

The present study measured endothelial dysfunction by estimating the concentration of nitrite and nitrate and the TAC. TAC was found to be significantly lower among patients with higher IHR scores when compared to patients with lower IHR scores. Several epidemiological studies have demonstrated that people with a higher intake of antioxidant vitamins have a lower risk of developing MI and stroke.26,27 However, a recent systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials revealed that the current literature provided no evidence to support the use of vitamins and antioxidants for the prevention of CVD.28 However, a recent systematic review of observational studies demonstrated a substantial association between higher levels of dietary total antioxidant capacity and risk factors of cardiovascular diseases.29 Our study also showed that the nitrite and nitrate concentrations were higher among high-risk patients when compared to low-risk patients. In contrast, the Framingham offspring study demonstrated that a higher plasma nitrate concentration was associated with all-cause mortality but was not found to be associated with the incidence of CVD.30 This might be due to the fact that the nitrite and nitrate concentrations present in the diet could be metabolized into NO, thereby promoting cytoprotection and cardiovascular benefits.31The results in our study might be contrasting due to the fact that certain diets, such as vegetables, fruits, and processed meats, are rich sources of nitrites and nitrates.32 Hence, there are possibilities that high risk patients in our study had been exposed to such diets. The endothelial-dependent response to vasodilation is regulated by the release of NO synthesized from the dietary nitrate, nitrite and amino acid L-arginine, via the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) ,which leads to the production of intracellular cyclic GMP. However, endothelial dysfunction leads to the imbalance in the production of NO and ROS, in turn leading to the occurrence of several age-related diseases, such as CVD. The accumulation of ROS in the arterial plasma and intima leads to an increase in the low-density lipoprotein (LDL) oxidation; the uptake of this oxidized LDL by the arterial macrophages is one of the prominent factors for the formation and progression of atherosclerotic plaque. Therefore, the presence of antioxidants in the plasma, LDL particle, and cell wall can inhibit the LDL oxidation and can safeguard the vasoreactivity by increasing the release of endothelial NO and by reducing thrombogenicity.12,33 Therefore, determining the TAC and the concentration of nitrite and nitrate can turn out to be a potential marker for the early prediction of CVD in the future.

Limitations

The main limitation of our study is with respect to the limited sample size. Another limitation is that our study did not have a prospective long-term follow-up with the confirmation of clinical events; instead, we calculated the risk based on the interheart risk score. Additionally, the blood samples were collected at different time points, which could have had an effect on the levels of laboratory assays.

 Conclusions

Our study demonstrated that PBMC senescence, TA, and nitrite and nitrate are suitable measures to predict high cardiovascular risk in adults with CV risk. Therefore, measurements of the above markers might be used as an additional risk assessment tool to predict the risk of cardiovascular diseases among adults. Nevertheless, long-term prospective follow-up studies with the adjudication of clinical events are required to confirm these findings.

Sources of Funding. The study was funded by Selective Excellence Initiative Scheme of SRMIST, Kattankulathur, Chennai, India.