Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC prtKfCnhZGwK3MNhCF68kBf 00004 S0066-782X2021000100004 abc.20190391 10.36660/abc.20190391 Artigo Original Treino de Força Reduz Stress Oxidativo Cardíaco e Renal em Ratos com Hipertensão Renovascular 0000-0001-8839-3416 Miguel-dos-Santos Rodrigo 1 2 3 Santos Jucilene Freitas dos 4 Macedo Fabricio Nunes 3 5 0000-0001-7869-2922 Marçal Anderson Carlos 2 6 0000-0003-1488-0259 Santana Valter J. Filho 3 7 Wichi Rogerio Brandão 2 Lauton-Santos Sandra 3 7 Norwegian University of Science and Technology Cardiac Exercise Reserch Group Department of Circulation and Medical Imaging Trondheim Noruega Norwegian University of Science and Technology - Cardiac Exercise Reserch Group, Department of Circulation and Medical Imaging, Trondheim - Noruega Programa de Pós-Graduação em Educação Física Universidade Federal de Sergipe São Cristóvão SE Brasil Programa de Pós-Graduação em Educação Física, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, SE – Brasil Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas Universidade Federal de Sergipe São Cristóvão SE Brasil Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, SE – Brasil Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde Universidade Federal de Alagoas Maceió AL Brasil Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Alagoas,Maceió, AL – Brasil Departamento de Educação Física Centro Universitário Estácio de Sergipe Aracaju SE Brasil Departamento de Educação Física, Centro Universitário Estácio de Sergipe, Aracaju, SE – Brasil Departamento de Morfologia Universidade Federal de Sergipe São Cristóvão SE Brasil Departamento de Morfologia da Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, SE – Brasil Programa de Pós-Graduação em Medicina Universidade Federal de Sergipe São Cristóvão SE Brasil Programa de Pós-Graduação em Medicina, Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, SE – Brasil Correspondência: Rodrigo Miguel dos Santos • Norwegian University of Science and Technology - Cardiac Exercise Reserch Group, Department of Circulation and Medical Imaging Prinsesse Kristinas gate 3 Trondheim 7030 – Noruega E-mail: rms.edf@hotmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Miguel-dos-Santos R, Santana-Filho VJ, Wichi RB, Lauton-Santos S; Obtenção de dados: Miguel-dos-Santos R, Santos JF, Macedo FN; Análise e interpretação dos dados: Miguel-dos-Santos R, Santos JF, Macedo FN, Wichi RB, Lauton-Santos S; Análise estatística e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Miguel-dos-Santos R, Santos JF, Macedo FN, Marçal AC, Santana-Filho VJ, Wichi RB, Lauton-Santos S; Obtenção de financiamento: Lauton-Santos S; Redação do manuscrito: Miguel-dos-Santos R.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 03 02 2021 01 2021 116 1 4 11 14 06 2019 23 09 2019 26 11 2019 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

O treino de força tem efeitos benéficos em doenças renais, além de ajudar a melhorar a defesa antioxidante em animais saudáveis.

 Objetivo

Verificar se o treino de força reduz o dano oxidativo ao coração e rim contralateral para cirurgia de indução de hipertensão renovascular, bem como avaliar as alterações na atividade das enzimas antioxidantes endógenas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx).

 Métodos

Dezoito ratos machos foram divididos em três grupos (n=6/grupo): placebo, hipertenso e hipertenso treinado. Os animais foram induzidos a hipertensão renovascular através da ligação da artéria renal esquerda. O treino de força foi iniciado quatro semanas após a indução da hipertensão renovascular, teve 12 semanas de duração e foi realizada a 70% de 1RM. Depois do período de treino, os animais foram submetidos a eutanásia e o rim esquerdo e o coração foram retirados para realizar a quantificação de peróxidos de hidrogênio, malondialdeído e grupos sulfidrílicos, que são marcadores de danos oxidativos. Além disso, foram medidas as atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase. O nível de significância adotado foi de 5% (p < 0,05).

 Resultados

Depois do treino de força, houve redução de danos oxidativos a lipídios e proteínas, como pode-se observar pela redução de peróxidos de hidrogênio e níveis sulfidrílicos totais, respectivamente. Além disso, houve um aumento nas atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase.

 Conclusão

O treino de força tem o potencial de reduzir danos oxidativos, aumentando a atividades de enzimas antioxidantes. (Arq Bras Cardiol. 2021; 116(1):4-11)

 Hipertensão Renovascular Treinamento de Resistência Antioxidantes Estresse Oxidativo Obstrução da Artéria Real Oxidação-Redução Introdução

A hipertensão renovascular, um tipo de hipertensão causada por estenose arterial renal total ou parcial devido a fatores genéticos ou aterosclerose, é uma causa importante de hipertensão secundária.1 Nesse tipo de hipertensão, o aumento da pressão arterial (PA) é iniciado por uma maior liberação de renina pelo rim isquêmico resultante do fluxo sanguíneo para esse órgão, devido à estenose da artéria renal.1,2

A renina é responsável pela conversão de angiotensinogênio em angiotensina I, que é clivada pela enzima conversora da angiotensina (ECA) produzindo angiotensina II (Ang II).3,4 Portanto, a elevação da renina acarreta um aumento na liberação de Ang II. A Ang II, por sua vez, ativa as enzimas NADPH oxidase3 e xantina oxidase,4 aumentando a produção de ânion superóxido (O2-), uma molécula sinalizadora de pró-oxidante altamente reativa que pode causar danos oxidativos a lipídios, proteínas e DNA, e foi descrita na hipertensão renovascular.5,6 O aumento dos danos oxidativos no rim e no coração pode levar ao amento de fibrose do tecido, causando a redução de sua função,2 e, acabando por resultar em falência do rim que não foi afetado por estenose e disfunção cardíaca.

Está relatada, na literatura, a ação protetora do treino de força no tratamento de várias doenças, entre as quais está a hipertensão arterial.7,8 Entre os benefícios gerados pelo treino de força, já se observou que ela promove a melhoria da função cardíaca,9 bem como o aumento da atividade e/ou expressão das enzimas envolvidas na síntese de óxido nítrico.10,11 Essas mudanças causam o aumento da liberação de óxido nítrico, melhoria do tônus vascular,10,11 e redução da PA em animais normotensos12 e hipertensos.13

Além disso, também foi descrita a ação protetora do treino de força no stress oxidativo, melhorando a defesa antioxidante no fígado14 e no músculo esquelético.15 Entretanto, os efeitos do treino de força no coração e no rim contralateral para estenose arterial renal não são conhecidos. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi verificar se o treino de força reduz o dano oxidativo ao coração e rim contralateral para cirurgia de indução de hipertensão renovascular, bem como avaliar as alterações na atividade das enzimas antioxidantes endógenas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx).

 Métodos

O protocolo experimental do presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA - Nº 54/2015) da Universidade Federal de Sergipe, em conformidade com os Princípios Éticos da Experimentação Animal adotados pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).

Amostra

Ratos Wistar machos, com idade de 10 a 12 semanas e massa corporal entre 240 e 270 g, foram obtidos pela instalação de animais da Universidade Federal de Sergipe. Os animais foram alojados em gaiolas coletivas (cinco animais/gaiola), mantidos em condições controladas de temperatura (23 ± 1ºC) e um ciclo claro-escuro de 12 horas, com alimentação e água à vontade.

 Grupos experimentais

Dezoito animais foram divididos aleatoriamente, por meio de um software online, em três grupos experimentais (n = 6 por grupo): placebo, hipertensos e hipertensos treinados. O tamanho da amostra foi definido por conveniência.

 Indução da hipertensão renovascular

A indução da hipertensão foi realizada em animais dos grupos dos hipertensos e dos hipertensos treinados, pelo modelo de clipagem arterial desenvolvido por Goldblatt et al.,16 seguindo as adaptações propostas por Cangiano et al., 17 Assim, com os animais em anestesia profunda (cetamina 90 mg/kg e xilazina 10 mg/kg, intraperitoneal), foi feita uma incisão no flanco esquerdo da traseira do animal para exteriorização do rim esquerdo, e foi feita uma ligação de artéria renal com uma linha cirúrgica de algodão estéril 4,0. Os animais do grupo de placebo passaram por cirurgia apenas para exteriorização do rim esquerdo para reproduzir o stress gerado pela cirurgia nos animais dos grupos dos hipertensos e dos hipertensos treinados. Todos os animais receberam analgésicos (Flunixina meglumina, sc, 1 mg/Kg, a cada 24 horas) por quatro dias depois do pós-cirúrgico.

 Protocolo do treino de força

Três semanas após a cirurgia de indução da hipertensão, os animais dos grupos dos hipertensos e dos hipertensos treinados foram adaptados ao equipamento de treino por cinco dias, mantendo os animais presos aos equipamentos durante 10 minutos por dia. Daí em diante, um teste de repetição máxima (1RM) foi realizado nos animais de ambos os grupos e a cada duas semanas no grupo dos hipertensos treinados, para determinar a carga usada nas sessões de musculação. O teste foi realizado novamente no grupo hipertenso sedentário apenas ao final do protocolo experimental.

Os testes de repetição máxima foram realizados segundo as diretrizes do American College of Sports Medicine (Colégio Americano de Medicina Esportiva)18 para seres humanos, com três tentativas por teste. O primeiro teste 1RM foi realizado com 3x o peso corporal do animal, ajustando para cima ou para baixo para a tentativa seguinte, dependendo do desempenho do animal na tentativa. Os animais puderam descansar por três minutos entre cada tentativa.

O treino de força foi realizado conforme descrito por Tamaki, Uchiyama e Nakano,19 e conforme já usado em outros estudo.20-22 Resumidamente, esse modelo de treino de força é realizado em um aparelho que simula o agachamento onde o torso do rato é equipado com uma jaqueta de lona, que o mantém na posição ereta (Figura 1). A jaqueta de lona é presa a um suporte de alumínio, apoiado no braço de madeira que segura os pesos levantados pelo animal, e um estimulador elétrico foi conectado ao rabo do rato, de forma que ele recebesse um estímulo elétrico (10-15v, 0,3 s duração, 3 s intervalo).12,20-22

– Ilustração representativa do aparelho para treino de força. (Adaptado de Tamaki et al., 1992).

O período de treino durou 12 semanas e foi iniciado 48 horas após o teste 1RM. Cada sessão de treino de força foi realizada com 70% de sobrecarga de 1RM, com quatro sets de 12 repetições e intervalos de noventa segundos. Os animais do grupo de hipertensos somente receberam estímulo elétrico sem realizar o treino de força. O treinamento e a estimulação elétrica sempre foram realizados no início de ciclo ativo/escuro (18-20 horas), já que os animais apresentaram melhor tolerância ao exercício durante o ciclo escuro.23

 Aferição da pressão arterial (PA)

Vinte e quatro horas após o período de treinamento, os animais hipertensos foram testados novamente por 1RM, 48 horas após o teste de 1RM, a PA dos animais foi aferida. A PA dos animais foi medida pela implantação de um cateter na artéria femoral por meio de um transdutor de pressão (Edwards Lifescience, CA, EUA) acoplado a um pré-amplificador (BioData, Model BD-01, PB, Brasil).

Os sinais de PA pulsátil foram registrados por 30 minutos com os animais acordados (Advanced Codas/Windaq, Dataq Instruments Inc., OH, EUA), permitindo a análise de pulso-batimento-a-batimento para identificar a frequência cardíaca (FC), PA sistólica (PAS), e PA diastólica (PAD). A PA média (PAM) foi determinada pela PAS e pela DAP no próprio software de registro.

 Danos oxidativos

Após a avaliação da PA, os animais foram submetidos a eutanásia por decapitação sem anestesia,24 e o coração e o rim foram coletados para os testes de danos oxidativos e atividade de enzima antioxidante.

Para determinar os danos oxidativos a lipídios, os produtos de lipoperoxidação foram medidos por oxidação por xilenol laranja, em que a oxidação de íons ferrosos (Fe2) para íons férricos (Fe3) ocorre em condições ácidas, pelos lipídios de peróxidos de hidrogênio.25 Da mesma forma, o malondialdeído foi medido pela quantificação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico.26

Os grupos sulfidrílicos, que são estruturas associadas a proteínas e altamente suscetíveis a danos oxidativos, também foram medidos. Por meio de sua quantificação, é possível estimar o dano proteico nos tecidos. A determinação dos grupos sulfidrílicos foi feita pela reação entre o reagente de Ellman (DTNB) e sulfidrila livre da cadeia lateral de cisteína.27

 Atividade de enzima antioxidante

A atividade de SOD foi determinada pela habilidade da enzima do tecido de dissociar os ânions superóxidos derivados da auto-oxidação do pirogalol e sua reação reduzindo o 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil )-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT) e formando cristais de formazan.26,28

A atividade da CAT foi estimada pelo índice de degradação do peróxido de hidrogênio (H2O2) conforme o protocolo descrito previamente por Nelson e Kiesow.29 A atividade de GPx foi avaliada pela oxidação de NADPH, conforme descrito por Paglia e Valentine.30

 Determinação da concentração de proteína

A determinação de concentração de proteína nos testes realizados foi feita pela técnica de Lowry et al.,31 quantificando a concentração de proteínas presentes no homogenato das amostras, por comparação com uma curva padrão feita com albumina sérica.

 Análise estatística

A normalidade dos dados foi verificada utilizando-se o teste de normalidade Shapiro-Wilk. Os resultados são expressos em média ± desvio padrão (DP). A análise estatística foi realizada por meio de análise de variância (ANOVA) de um fator, seguida do teste de Bonferroni post-hoc. Um valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Foram realizadas análises estatísticas utilizando GraphPad PrismTM 8.0.

 Resultados

Para validar nosso modelo de indução de hipertensão renovascular, foram avaliados parâmetros hemodinâmicos. Esses parâmetros foram medidos pela PA pulsátil com os animais acordados. A indução da hipertensão renovascular foi bem-sucedida e causou o aumento de PAS, PAD, PAM e FC. Por outro lado, o treino de força conseguiu neutralizar os efeitos da hipertensão renovascular (Tabela 1).

– Alteração na pressão arterial causada por estenose arterial renal
Placebo Hipertenso sedentário Hipertenso treinado
PAS (mmHg) 133±2 187±5*** 150±10##
PAD (mmHg) 92±1 151±6*** 121±5**,##
PAM (mmHg) 114±2 165±5*** 138±8*,#
FC (BPM) 337±4 385±9** 338±4##

Todos os dados representam média de ± EPM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 em comparação com o placebo; #p<0,05, ##p<0,01 comparados com o grupo dos hipertensos sedentários, calculado por ANOVA de um fator seguido do teste de Bonferroni post hoc para comparações em pares. PAS: pressão arterial sistólica, PAD: pressão arterial diastólica, PAM: pressão arterial média, FC: frequência cardíaca, BPM: batimentos por minuto.

Também avaliamos a eficiência do treino de força por uma medição de 1RM, que mede a força máxima dos animais. O treino de força promoveu o aumento na carga suspensa pelos animais hipertensos treinados após 12 semanas de treinamento (p<0,0001; Figura 2). Entretanto, como esperado, não houve mudanças na força dos ratos sedentários hipertensos (p>0,05).

– Valores absolutos do teste de força máxima. Todos os dados representam média de ± EPM. ****p<0,0001 em comparação com antes do treino; ###p<0,001 comparado com o grupo dos hipertensos sedentários, calculado por ANOVA de dois fatores seguido do teste de Bonferroni post hoc para comparações em pares. 1RM: teste de repetição máxima.

O aumento do stress oxidativo é outra marca da hipertensão. Dessa forma, medimos os danos oxidativos a lipídios e proteínas, medindo peróxidos de hidrogênio, malondialdeído, e grupos sulfidrílicos. Novamente foi possível validar nosso modelo de hipertensão, já que esta aumentou os danos a lipídios e proteínas no rim contralateral e no coração (p<0,01; Figura 3A e C), pelo aumento dos peróxidos de hidrogênio e pela redução dos níveis de grupos sulfidrílicos. Entretanto, os animais treinados demonstraram ter proteção contra danos oxidativos com níveis baixos de peróxidos de hidrogênio e preservação dos grupos sulfidrílicos, no rim direito e no coração. Além disso, não se observaram mudanças no nível de malondialdeído (p>0,05; Figura 3B).

– Efeitos da hipertensão renovascular e do treino de força nos marcadores de danos oxidativos no rim contralateral e no coração. Todos os dados representam média de ± EPM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, calculado por ANOVA de um fator seguido do teste de Bonferroni post hoc para comparações em pares. MDA: malondialdeído.

Para melhor identificar os efeitos do treino de força no stress oxidativo em hipertensão renovascular, medimos a atividade das enzimas antioxidantes endógenas. O treino de força aumentou a atividade de SOD no coração e resgatou a atividade de SOD no rim (p<0,01; Figura 4A), bem como a atividade da catalase em ambos os tecidos (p<0,01; Figura 4B), enquanto a atividade da GPx só foi normalizada no coração (p<0,01; Figura 4C).

– Efeitos da hipertensão renovascular e do treino de força na atividade das enzimas antioxidantes. Todos os dados representam média de ± EPM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, calculado por ANOVA de um fator seguido do teste de Bonferroni post hoc para comparações em pares. SOD: superóxido dismutase; Gpx: glutationa peroxidase.

Discussão

Os principais resultados do presente estudo demonstraram que o treino de força de 12 semanas com intensidade moderada reduziu os danos oxidativos ao coração e rim contralateral na hipertensão renovascular, aumentando a atividade das enzimas antioxidantes endógenas, bem como reduzindo a pressão sanguínea.

Os modelos de hipertensão renovascular são conhecidos pela ativação do sistema renina-angiotensina, aumentando os níveis de angiotensina II, e com consequente aumento de PA.16,17,32,33 Como ocorreu no presente estudo, em que os animais passaram por indução de hipertensão tinham valores de PA elevados, demonstrando que o modelo de indução de hipertensão experimental foi realizado com sucesso.

Além disso, havíamos realizado o modelo de treino de força descrito por Tamaki, Uchiyama e Nakano,19 cujos efeitos benéficos semelhantes aos encontrados em seres humanos que praticam esse tipo de treino físico já foram relatados.9,12,19-22,34 No presente trabalho, identificou-se que um treino de força moderado foi eficiente no aumento da força dos animais treinados. Essa demonstração acarretou mudanças benéficas, como se pode ver pela redução da PA. Além disso, os efeitos benéficos também puderam ser observados pela redução de danos a lipídios e preservação dos grupos sulfidrílicos no coração e nos rins. Foi relatado na literatura que o treino de natação aeróbico realizado com intensidade moderada reduz os danos oxidativos no rim contralateral para estenose arterial renal.35

Outros estudos também demonstraram esse efeito protetor do exercício físico no stress oxidativo. Como foi relatado, o treinamento aeróbico em esteira com intensidade que aumenta progressivamente reduz os danos oxidativos renais em outro modelo de hipertensão experimental,36 bem como em outro modelo de doenças renais crônicas.37 Efeitos semelhantes também foram demonstrados em outros modelos de treino de força.38,39 Essa proteção promovida pelo exercício físico é importante para evitar a ocorrência de fibrose, um processo que ocorre pela deposição de colágeno nas áreas que sofreram danos oxidativos.40 Esses danos são aumentados na hipertensão renovascular devido à hiperativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona, gerando stress oxidativo.2,41

Entretanto, o organismo tem mecanismos para evitar a ocorrência desses danos oxidativos, um dos quais sendo a ativação de enzimas antioxidantes endógenas.42,43 Por meio desse mecanismo, a enzima antioxidante SOD catalisa a dismutação de O2- para H2O2. Em seguida, o H2O2 é reduzido para H2O e O2 pelas peroxidases, GPx ou CAT.42,43 Em indivíduos saudáveis, essas enzimas são expressas em diferentes maneiras em órgãos diferentes, dependendo dos processos metabólicos e funcionais que ocorrem neles. Entretanto, essas enzimas antioxidantes são reduzidas durante a hipertensão arterial.44,45

No presente estudo, a atividade reduzida das enzimas antioxidantes foi observada nos animais do grupo dos hipertensos. Outros estudos corroboram esses achados, demonstrando que tanto a atividade,6 quanto a expressão genética dessas enzimas são reduzidas nesse modelo de hipertensão renovascular.5 O treino de natação aeróbico35,46 demonstrou ter aumentado a atividade das enzimas SOD e CAT no coração e no rim contralateral de animais com hipertensão induzida, usando o mesmo modelo de hipertensão renovascular. Embora os efeitos do treino de força no stress oxidativo do rim contralateral ainda não tenham sido estudados, demonstrou-se que o treino de força em subida promove um aumento de enzimas antioxidantes nos músculos esquelético e cardíaco.15,38,39

Nosso estudo tem limitações porque, por motivos técnicos, não pudemos monitorar o decurso temporal da alteração na PA, bem como a medição de linha de base de outros parâmetros para entender melhor a ação terapêutica do treino de força. Apesar das limitações, os resultados demonstram, no modelo renovascular de ratos, que o treino de força tem um efeito protetor, como já foi observado em outras modalidades de exercício físico. O treino de força aumentou a atividade das enzimas SOD e CAT no rim contralateral e no coração, restabelecendo essa atividade antioxidante a valores encontrados em animais saudáveis (grupo placebo), indicando que esse é um mecanismo possível pelo qual o treino de força consegue reduzir danos oxidativos em animais com hipertensão renovascular.

 Conclusão

Os resultados encontrados no presente estudo nos permitem concluir que o treino de força pode neutralizar danos oxidativos produzidos por hipertensão renovascular no rim contralateral e no coração. Essa redução se deve, em parte, ao aumento da atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT promovido pelo treino de força. Portanto, esses resultados sugerem que o treino de força é uma ferramenta não farmacológica importante para o tratamento de hipertensão renovascular, com o potencial de evitar o avanço dos danos ao coração e rim que não tem estenose arterial renal.

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Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Rodrigo Miguel dos Santos pela Universidade Federal de Sergipe.

Fontes de financiamento.O presente estudo foi parcialmente financiado pela CAPES e CNPq.

 Original Article Strength Training Reduces Cardiac and Renal Oxidative Stress in Rats with Renovascular Hypertension 0000-0001-8839-3416 Miguel-dos-Santos Rodrigo 1 2 3 Santos Jucilene Freitas dos 4 Macedo Fabricio Nunes 3 5 0000-0001-7869-2922 Marçal Anderson Carlos 2 6 0000-0003-1488-0259 Santana Valter J. Filho 3 7 Wichi Rogerio Brandão 2 Lauton-Santos Sandra 3 7 Noruega Norwegian University of Science and Technology - Cardiac Exercise Reserch Group, Department of Circulation and Medical Imaging, Trondheim – Noruega Brazil Post-graduate Program of Physical Education, Federal University of Sergipe, São Cristóvão, SE – Brazil Brazil Post-graduate Program of Physiological Sciences, Federal University of Sergipe, São Cristóvão, SE – Brazil Brazil Institute of Biological Sciences and Health, Federal University of Alagoas, Maceió, AL – Brazil Brazil Department of Physical Education, Estacio University Center of Sergipe, Aracaju, SE – Brazil Brazil Department of Morphology, Federal University of Sergipe, São Cristóvão, SE – Brazil Brazil Post-graduate Program of Medicine, Federal University of Sergipe, São Cristóvão, SE – Brazil Mailing Address: Rodrigo Miguel dos Santos • Norwegian University of Science and Technology - Cardiac Exercise Reserch Group, Department of Circulation and Medical Imaging Prinsesse Kristinas gate 3 Trondheim 7030 – Noruega E-mail: rms.edf@hotmail.com

Author contributions

Conception and design of the research: Miguel-dos-Santos R, Santana-Filho VJ, Wichi RB, Lauton-Santos S; Data acquisition: Miguel-dos-Santos R, Santos JF, Macedo FN; Analysis and interpretation of the data: Miguel-dos-Santos R, Santos JF, Macedo FN, Wichi RB, Lauton-Santos S; Statistical analysis and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Miguel-dos-Santos R, Santos JF, Macedo FN, Marçal AC, Santana-Filho VJ, Wichi RB, Lauton-Santos S; Obtaining financing: Lauton-Santos S; Writing of the manuscript: Miguel-dos-Santos R.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background

Strength training has beneficial effects on kidney disease, in addition to helping improve antioxidant defenses in healthy animals.

 Objective

To verify if strength training reduces oxidative damage to the heart and contralateral kidney caused by the renovascular hypertension induction surgery, as well as to evaluate alterations in the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GPx) endogenous antioxidant enzymes.

 Methods

Eighteen male rats were divided into three groups (n=6/group): sham, hypertensive, and trained hypertensive. The animals were induced to renovascular hypertension through left renal artery ligation. Strength training was initiated four weeks after the induction of renovascular hypertension, continued for a 12-weeks period, and was performed at 70% of 1RM. After the training period, the animals were euthanized and the right kidney and heart were removed for quantitation of hydroperoxides, malondialdehyde and sulfhydryl groups, which are markers of oxidative damage. In addition, the activity of SOD, CAT, and GPx antioxidant enzymes was also measured. The adopted significance level was 5% (p < 0.05).

 Results

After strength training, a reduction in oxidative damage to lipids and proteins was observed, as could be seen by reducing hydroperoxides and total sulfhydryl levels, respectively. Furthermore, an increased activity of superoxide dismutase, catalase, and glutathione peroxidase antioxidant enzymes was observed.

 Conclusion

Strength training is able to potentially reduce oxidative damage by increasing the activity of antioxidant enzymes. (Arq Bras Cardiol. 2021; 116(1):4-11)

 Hypertension, Renovascular Resistance Training Antioxidants Oxidative Stress Renal Arterial Obstruction Oxidation-Reduction Introduction

Renovascular hypertension, a type of hypertension caused by total or partial renal artery stenosis due to genetic factors or atherosclerosis, is an important cause of secondary hypertension.1 In this type of hypertension, the increase in arterial pressure (AP) is triggered by the greater release of renin by the ischemic kidney as a result of the reduction of blood flow to this organ, due to the stenosis of the renal artery.1,2

Renin is responsible for the conversion of angiotensinogen to angiotensin I, which is cleaved by the angiotensin-converting enzyme (ACE), producing angiotensin II (Ang II).3,4 Thus, the elevation of renin triggers an increase in Ang II release. Ang II, in turn, activates the NADPH oxidase3 and xanthine oxidase4 enzymes, increasing the production of superoxide anion (O2-), a highly reactive pro-oxidant signaling molecule that can cause oxidative damage to lipids, proteins, and DNA, as has been described in renovascular hypertension.5,6 Increased oxidative damage in the kidney and heart may lead to increased fibrosis of the tissue, leading to a reduction of its function,2 and, eventually, leading to the failure of the kidney that was not affected by stenosis and cardiac dysfunction.

It is reported in the literature the protective action of strength training in the treatment of several diseases, among them arterial hypertension.7,8 Among the benefits generated by strength training, it has already been seen that it promotes the improvement of the cardiac function,9 as well as increased activity and/or expression of the enzymes involved with the synthesis of nitric oxide.10,11 These changes result in an increased release of nitric oxide, an improvement of vascular tone,10,11 and a reduction in AP in normotensive12 and hypertensive animals.13

In addition, reports in the literature have also described the protective action of strength training in oxidative stress, improving the antioxidant defense in the liver14 and skeletal muscle.15 However, the effects of strength training on the heart and contralateral kidney to renal artery stenosis are unknown. Hence, the present study sought to verify if strength training reduces the oxidative damage to the heart and contralateral kidney caused by renovascular hypertension induction surgery, as well as to evaluate the alterations in the activity of the superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GPx) endogenous antioxidant enzymes.

 Methods

The experimental protocol of the present study was approved by the Animal Research Ethics Committee (CEPA - #54/2015) of the Federal University of Sergipe, in compliance with the Ethical Principles of Animal Experimentation adopted by the National Council for Animal Experimentation Control (CONCEA).

Sample

Male Wistar rats aged 10 to 12 weeks and body mass between 240 and 270 g were obtained from the animal facility of the Federal University of Sergipe. The animals were housed in collective cages (five animals/cage), kept under controlled temperature conditions (23 ± 1ºC) and a light-dark cycle of 12 hours, with feed and water ad libitum.

 Experimental groups

Eighteen animals were randomly divided, through an online software, into three experimental groups (n = 6 per group): sham, hypertensive, and trained hypertensive. The sample size was defined by convenience.

 Renovascular hypertension induction

Induction to hypertension was performed in the animals from the hypertensive and trained hypertensive groups, applying the renal artery clipping model, developed by Goldblatt et al.,16 following the adaptations proposed by Cangiano et al.17 Thus, with animals under deep anesthesia (ketamine 90 mg/kg and xylazine 10 mg/kg, intraperitoneal), an incision was made in the left flank of the animals’ back to exteriorize the left kidney, and a ligation of the renal artery was performed with a 4.0 sterile cotton surgical line. The animals of the Sham group underwent surgery only to exteriorize the left kidney so as to mimic the stress generated by the surgery in the animals from the hypertensive and trained hypertensive groups. All animals received painkillers (Flunixin meglumine, sc, 1 mg/Kg, every 24h) for four days following post-surgery.

 Strength training protocol

Three weeks after the hypertension induction surgery, the animals from the hypertensive and trained hypertensive groups were adapted to the training apparatus for five days, keeping the animals attached to the equipment for 10 minutes each day. Thereafter, a maximum repetition test (1RM) was performed in the animals of both groups and every two weeks in the trained hypertensive group, in order to determine the load used in the training sessions. The test was performed again in the sedentary hypertensive group at the end of the experimental protocol only.

The maximum repetition tests were performed following the American College of Sports Medicine guidelines18 for humans, with three attempts per test. The first 1RM test was performed with 3x the animal body weight, adjusting up or down for the next try depending on the animal’s performance in the attempt. The animals were allowed to rest for three minutes between each try.

Strength training was performed as described by Tamaki, Uchiyama, and Nakano,19 and as used in other studies.20-22 Briefly, this strength training model is performed in a squat-mimetic apparatus, where the torso of rats is fitted with a canvas jacket keeping them in an upright position (Figure 1). The canvas jacket was attached to an aluminum bracket, which is held by the wooden arm holding weights for the animals to lift, and an electro-stimulator was connected to their tail in such a way that the animals received an electrical stimulus (10-15v, 0.3s duration, 3s interval).12,20-22

– Representative illustration of strength training apparatus. (Adapted from Tamaki et al., 1992).

The training period lasted 12 weeks and was started 48 hours after the 1RM test. Each strength training session was done with a 70% overload of 1RM, with four sets of 12 repetitions, and ninety-second intervals. The animals of the hypertensive group received only electrical stimulation without performing strength training. Training and electrostimulation were always performed at the beginning of the active/dark cycle (18-20 h), as it is during the dark cycle that the animals presented better tolerance to exercise.23

 Arterial pressure (AP) measurement

Twenty-four hours after the training period, the hypertensive animals were again tested for 1RM and, 48 hours after the test of 1RM, the AP of the animals was measured. The AP of the animals was measured by implantation of a catheter in the femoral artery through a pressure transducer (Edwards Lifescience, CA, USA) attached to a preamplifier (BioData, Model BD-01, PB, Brazil).

The pulsatile AP signals were recorded for 30 minutes with the animals awake (Advanced Codas/Windaq, Dataq Instruments Inc., OH, USA), allowing pulse-beat-to-beat analysis to identify heart rate (HR), systolic AP (SAP), and diastolic AP (DAP). The mean AP (MAP) was determined through SAP and DAP in the recording software itself.

 Oxidative damage

After the AP evaluation, the animals were euthanized by decapitation without anesthesia,24 and the heart and right kidney were harvested for the oxidative damage and antioxidant enzyme activity assays.

To determine oxidative damage to lipids, the products of lipoperoxidation were measured by oxidation of xylenol orange, in which the oxidation of ferrous ions (Fe2) to ferric ions (Fe3) occurs under acidic conditions, by the hydroperoxides lipids.25 In addition, malondialdehyde was measured by the quantification of the thiobarbituric acid reactive substances.26

Sulfhydryl groups, which are structures associated with proteins and are highly susceptible to oxidative damage, have also been measured. Through its quantification, it is possible to estimate the protein damage in the tissues. The determination of sulfhydryl groups was performed by reacting 5’5-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) with free sulfhydryl of the cysteine side chain.27

 Antioxidant enzyme activity

SOD activity was determined by the ability of the tissue enzyme to dissociate the superoxide anions derived from pyrogallol self-oxidation and their reaction reducing 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) and forming formazan crystals.26,28

CAT activity was estimated by the rate of degradation of hydrogen peroxide (H2O2) according to the protocol previously described by Nelson and Kiesow.29 GPx activity was assessed by oxidation of NADPH, as described by Paglia and Valentine.30

 Determination of protein concentration

The protein concentration was determined in this study’s tests by applying the technique set forth by Lowry et al.,31 quantifying the concentration of proteins present in the homogenate of the samples by comparing this to a standard curve made with serum albumin.

 Statistical analysis

The normality of the data was verified by applying the Shapiro-Wilk normality test. Results are expressed as mean ± standard deviation (SD). Statistical analysis was performed through the one-way analysis of variance (ANOVA), followed by the Bonferroni post-hoc test. A value of p<0.05 was considered as statistically significant. Statistical analyses were performed using the GraphPad PrismTM 8.0.

 Results

To validate our model of renovascular hypertension induction, hemodynamic parameters were assessed. These parameters were measured through the pulsatile AP with the animals awake. The induction of renovascular hypertension was successful and caused the increase of SAP, DAP, MAP, and HR, whereas the strength training was able to counteract the effects of renovascular hypertension (Table 1).

– Arterial pressure alteration caused by renal artery stenosis
Sham Hypertensive sedentary Hypertensive trained
SAP (mmHg) 133±2 187±5*** 150±10##
DAP (mmHg) 92±1 151±6*** 121±5**,##
MAP (mmHg) 114±2 165±5*** 138±8*,#
HR (BPM) 337±4 385±9** 338±4##

All data represent mean ± SEM. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with sham; #p<0.05, ##p<0.01 compared with hypertensive sedentary, calculated by one-way ANOVA followed by the post hoc Bonferroni test for pairwise comparisons. SAP: systolic arterial pressure, DAP: diastolic arterial pressure, MAP: mean arterial pressure, HR: heart rate, BPM: beats per minute.

We also evaluated the effectiveness of strength training through the measurement of 1RM, which measures the maximum strength of the animals. Strength training promoted an increase in the load lifted by the trained hypertensive animals after 12 weeks of training (p<0.0001; Figure 2). Nonetheless, as expected, there was no change in the strength of the sedentary hypertensive rats (p>0.05).

– Absolute values of the maximum strength test. All data represent mean ± SEM. ****p<0.0001 compared with before training; ###p<0.001 compared with hypertensive sedentary before, calculated by two-way ANOVA followed by the post hoc Bonferroni test for pairwise comparisons. 1RM: maximum repetition test.

Increased oxidative stress is another hallmark of hypertension. In this light, we measured the oxidative damage to lipids and proteins by measuring hydroperoxides, malondialdehyde, and sulfhydryl groups. Again, it was possible to validate our model of hypertension since hypertension increased the damage to lipids and proteins in the contralateral kidney and heart (p<0.01; Figure 3A and C), through the increase of hydroperoxides and reduction of sulfhydryl group levels. However, trained animals showed protection against oxidative damage with low levels of hydroperoxides and the preservation of sulfhydryl groups in both the right kidney and the heart. In addition, no significant change was observed in the level of malondialdehyde (p>0.05; Figure 3B).

– Effects of renovascular hypertension and strength training on the markers of oxidative damage in the contralateral kidney and heart. All data represent mean ± SEM. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, calculated by one-way ANOVA followed by the post hoc Bonferroni test for pairwise comparisons. MDA: malondialdehyde.

To further identify the effects of strength training on oxidative stress in renovascular hypertension, the activity of the endogenous antioxidant enzymes was measured. Strength training increased SOD activity in the heart and rescued SOD activity in the kidney (p<0,01; Figure 4A), as well as catalase activity in both tissues (p<0,01; Figure 4B), whereas GPx activity was only normalized in the heart (p<0,01; Figure 4C).

– Effects of renovascular hypertension and strength training on the antioxidant enzyme activity. All data represent mean ± SEM. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, calculated by one-way ANOVA followed by the post hoc Bonferroni test for pairwise comparisons. SOD: superoxide dismutase; GPx: glutathione peroxidase.

Discussion

The main results of the present study demonstrated that 12-week strength training with a moderate intensity reduced oxidative damage to the heart and contralateral kidney in renovascular hypertension by increasing the activity of endogenous antioxidant enzymes as well as by reducing blood pressure.

Renovascular hypertension models are well-known for renin-angiotensin system activation, increasing angiotensin II levels and consequent increases in AP.16,17,32,33 As occurred in the present study, the animals that underwent hypertension induction presented elevated AP values, demonstrating that the experimental hypertension induction model was successfully performed.

Furthermore, the strength training model was performed, as described by Tamaki, Uchiyama and Nakano,19 which has been reported to show beneficial effects that are similar to those found in humans who practice this type of physical training.9,12,19-22,34 In the present work, it was found that moderate strength training was efficient in increasing the strength of the trained animals. Demonstrating that triggered beneficial changes, as was also seen by the reduction of AP. In addition, the beneficial effects could also be observed by reducing lipid damage and preserving the sulfhydryl groups in the heart and kidney. It has been reported in the literature that aerobic swimming training performed with moderate intensity reduces oxidative damage in the kidney contralateral to renal artery stenosis.35

Other studies have also demonstrated this protective effect of physical exercise on oxidative stress. As has been reported, aerobic treadmill training with progressively increasing intensity reduces renal oxidative damage in other models of experimental hypertension,36 as well as in another models of chronic kidney diseases.37 Similar effects have been also shown in other strength training models.38,39 This protection promoted by physical exercise is important to prevent the occurrence of fibrosis, a process that occurs through the deposition of collagen in the areas that suffered oxidative damage.40 These damages are increased in renovascular hypertension due to the hyperactivation of the renin angiotensin aldosterone system, generating oxidative stress.2,41

However, the organism has mechanisms to prevent the occurrence of these oxidative damages; one of these mechanisms occurs through the activation of the endogenous antioxidant enzymes.42,43 By means of this mechanism, the antioxidant enzyme SOD catalyzes the dismutation of O2- to H2O2. Subsequently, the H2O2 is reduced to H2O and O2 by the peroxidases, GPx, or CAT.42,43 In healthy individuals, these enzymes are expressed in different ways in different organs, depending on the metabolic and functional processes that occur in them. Nevertheless, these antioxidant enzymes are reduced during arterial hypertension.44,45

In the present study, reduced activity of antioxidant enzymes was observed in the animals from the hypertensive group. Other studies corroborate these findings, showing that both the activity6 and the gene expression of these enzymes are reduced in this model of renovascular hypertension.5 Aerobic swimming training35,46 has been shown to increase the activity of SOD and CAT enzymes in the heart and contralateral kidney of animals with induced hypertension, using the same renovascular hypertension model. Although the effects of strength training on contralateral kidney oxidative stress have not yet been studied, it has been shown that climbing strength training promotes an increase in antioxidant enzymes in skeletal and cardiac muscles.15,38,39

This study presents limitations since, for technical reasons, we were not able to monitor the time-course of change in AP not the baseline measurement of other parameters for a better understanding of the therapeutical action of strength training. Despite the limitations, our results demonstrate, in a rat renovascular model, that strength training has a protective effect, as has already been observed in other modalities of physical exercise. Strength training increased the activity of SOD and CAT enzymes in the contralateral kidney and heart, reestablishing this antioxidant activity to values found in healthy animals (Sham group), indicating that this is a possible mechanism by which strength training is able to reduce oxidative damage in renovascular hypertensive animals.

 Conclusion

The results found in the present study allow us to conclude that strength training is able to counteract oxidative damage produced by renovascular hypertension in the contralateral kidney and heart. This reduction is due, in part, to the increased activity of the antioxidant enzymes SOD and CAT promoted by strength training. Therefore, these results suggest that strength training is an important non-pharmacological tool for the treatment of renovascular hypertension, potentially preventing the progression of damage to the heart and kidney without renal artery stenosis.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Rodrigo Miguel dos Santos, from Universidade Federal de Sergipe.

Sources of Funding.This study was partially funded by CAPES and CNPq.