A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma situação clínica de elevada gravidade, caracterizada pela presença de vasoconstrição pulmonar, trombose in situ e remodelamento vascular.¹O aumento progressivo da resistência vascular pulmonar (RVP) resulta em uma hipertrofia compensatória do ventrículo direito (VD), progredindo para insuficiência cardíaca e morte prematura.²

Na HAP avançada, a proliferação endotelial e a hipertrofia do músculo liso vascular resultam em obstrução do lúmen arterial. Na maioria dos casos, ocorre a formação de lesões neointimais concêntricas e lesões hipercelulares complexas, conhecidas como lesões plexiformes.³As alterações anatomopatológicas da HAP foram primeiramente caracterizadas por Heath & Edwards⁴ em 1958. Posteriormente, Wagenvoort & Wagenvoort⁵ em 1977 descreveram a sequência de alterações vasculares na HAP, definindo-a como Arteriopatia Pulmonar Plexogênica (APP). Essas alterações parecem refletir, em geral, o nível pressórico da artéria pulmonar e, em menor grau, o tempo de HAP.⁶

Como o tecido humano com doença em estágio inicial raramente está disponível, um modelo animal que reproduza as alterações precoces da arteriopatia pulmonar e sua evolução seria desejável para compreender a complexidade da HAP e encontrar novas estratégias terapêuticas.⁷

O modelo animal de HAP induzida por monocrotalina (MCT) é um dos mais realizados pelos pesquisadores, pois oferece simplicidade técnica, fácil reprodutibilidade e baixo custo em comparação com os outros modelos.⁷ Além disso, é capaz de mimetizar vários aspectos-chave da HAP humana, incluindo remodelamento vascular, proliferação de células musculares lisas, disfunção endotelial, aumento da expressão de citocinas inflamatórias e falência do ventrículo direito.^1,8,9 Tipicamente, esse modelo é baseado em uma única injeção de MCT (geralmente 60 mg/kg) aplicada por via intraperitoneal (i.p.) ou subcutânea, resultando no desenvolvimento de HAP após em 3-4 semanas.^7,10

A MCT é um alcaloide pirrolizidínico presente nos caules, folhas e sementes de plantas do gênero Crotalaria sp. (principalmente as espécies spectabilis, retusa e sigma), leguminosas distribuídas principalmente nas regiões de clima tropical.¹⁰ A monocrotalina, ao ser metabolizada no fígado pelo citocromo p-450, é transformada em sua forma ativa, a monocrotalina pirrole, exercendo sua toxicidade no sistema cardiopulmonar.^7,10 Seu uso foi primeiramente descrito há mais de 50 anos por Kay et al.,¹¹ primeiros a reportarem HAP causada pela ingestão de sementes de Crotalaria spectabilis em ratos. Relatos anteriores haviam descrito arterite pulmonar em ratos alimentados com sementes da planta¹² e identificaram o alcaloide pirrolizidínico como o agente causador.¹³

Embora muitas evidências sugiram que a MCT induz disfunção endotelial das arteríolas pulmonares em múltiplos níveis, o modelo de HAP por MCT é caracterizado predominantemente por hipertrofia da camada média. A ausência de lesões complexas, constatadas na HAP moderada-grave, apresenta-se como uma importante limitação desse modelo.^7,14-16

A proposta do presente estudo consiste em reproduzir o modelo experimental de HAP induzida por MCT em ratos Wistar com o objetivo de avaliar a gravidade da arteriopatia pulmonar por meio dos achados anatomopatológicos pulmonares, repercussões cardíacas, evolução clínica e sobrevida em 37 dias.

No presente estudo experimental foram respeitadas as normas estabelecidas no “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” e os Princípios Éticos na Experimentação Animal do Conselho Nacional do Controle de Experimentação Animal (CONCEA). O estudo teve aprovação do Comissão de Ética no Uso de Animais da Faculdade Evangélica Mackenzie do Paraná (CEUA/FEMPAR), registrado sob o protocolo n. 3433/2016.

Cinquenta ratos machos Wistar, da espécie Rattus norvegicus, pesando entre 250 e 300 gramas, foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos (randomização simples): grupo controle (GC) (n=10) – animais que receberam uma injeção intraperitoneal de solução fisiológica (0,9%, 1 mL/kg) no dia de início do experimento (D0); grupos MCT – animais que receberam uma injeção intraperitoneal de MCT (60 mg/kg)¹⁷(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), dissolvida em solução fisiológica (0,9%) no D0. Os animais ficaram sob o efeito da MCT por 15 dias, 30 dias e 37 dias, representando os grupos G15 (n=10), G30 (n=10), G37 (n=20), respectivamente.

Nos dias 15 (G15), 30 (G30) e 37 (G37 e GC) do experimento, após a anestesia com uma combinação de 0,3 mg/kg de cloridrato de xilazina 2% (Xilazin^®; Syntec, São Paulo, Brasil) e 10 mg/kg de cloridrato de cetamina 10% (Cetamin^®; Syntec, São Paulo, Brasil) i.p.,¹⁷ os animais foram pesados e posteriormente sacrificados por meio de exsanguinação por punção cardíaca. Por fim, foi conduzida a retirada de ambos os pulmões e do coração, os quais foram pesados através de balança semi-analítica de precisão (AD200; © Marte Científica, São Paulo, Brasil).

Os órgãos coletados foram processados segundo técnica histológica convencional. Para cada animal foram confeccionadas duas lâminas histológicas de tecido pulmonar, uma com três cortes transversais contendo os lobos pulmonares direitos, e a outra com um corte transversal e um longitudinal contendo os lobos pulmonares esquerdos. As lâminas de pulmão foram coradas com hematoxilina-eosina (HE), tricrômico de Mallory e coloração de Weigert para fibras elásticas.¹⁴As lâminas de coração incluíram duas secções transversais de tecido cardíaco, um ao nível do terço médio dos ventrículos e outro ao nível dos vasos da base, corados com HE.

As lâminas de pulmão foram avaliadas histopatologicamente utilizando um método de pontuação semiquantitativo (0 – sem alteração; 1 – discreto; 2 – moderado/acentuado) de parâmetros de remodelação vascular e alterações parenquimatosas, descritas a seguir: espessamento das paredes alveolares, edema intersticial, exsudato alveolar, hipertrofia da camada média, infiltrado leucocitário e proliferação intimal/neointimal.

As lâminas de tecido pulmonar e cardíaco foram digitalizadas com um scanner (Axio Scan Z1, Zeiss, Jena, Alemanha) (40X) e as imagens foram analisadas pelo software ZEN 2.3 (blue edition) (© Carl Zeiss Microscopy GmbH, 2011), que permite medidas quantitativas geométricas. A quantificação histológica da espessura da parede do ventrículo direito (EPVD) foi realizada em um aumento de 10X, expressa em micrômetros (µm). A região central da parede do VD foi definida como padrão para a análise desse parâmetro em todas as lâminas. A quantificação da área da câmara ventricular direita foi realizada em um aumento de 10X e expressa em micrômetros quadrados (µm²).

Esse é o primeiro relato em que a administração intraperitoneal de MCT (60 mg/kg) foi capaz de deflagrar APP em ratos.

Sinais de doença pulmonar manifestaram-se gradativamente nos animais dos grupos MCT, como já constatado por diversos pesquisadores que reproduziram o modelo.^9,18,19 A dispneia e a perda de peso são, na maioria das vezes, os primeiros sinais de doença pulmonar. A alteração do pH sanguíneo secundária à ineficiência do pulmão em manter uma correta relação ventilação/perfusão (que explica a cianose de extremidades), contribui para a anorexia e baixo ganho de peso. Nos animais do presente estudo, a cianose de extremidades também pode ser secundária à vasoconstrição periférica e ao baixo débito cardíaco. O esforço respiratório (dispneia) contribui para o baixo ganho de peso (ou perda de peso) à medida que aumenta o gasto metabólico. De fato, o sinal mais comum da HAP é a dispneia e a fadiga, decorrentes do baixo débito cardíaco, de carácter progressivo e indicativo de insuficiência ventricular direita secundária.^20,21

O aumento do peso relativo pulmonar e o aumento do peso relativo cardíaco dos animais dos grupos MCT são achados já consolidados na literatura.^9,17,18,22O aumento do peso relativo pulmonar deve-se ao processo de congestão, no qual há uma redução do volume alveolar e um aumento da área ocupada por estruturas extra-alveolares, representadas principalmente pelo exsudato alveolar, espessamento das paredes alveolares e edema intersticial. De maneira análoga, sugere-se que o aumento do PC_R, é decorrente do aumento da massa ventricular direita hipertrofiada dos animais MCT, fato discutido mais adiante.

Com apenas 15 dias, a forma ativa da MCT foi capaz de deflagrar alterações na vasculatura e no parênquima pulmonar, típicas de doença hipertensiva arterial pulmonar, corroborando com os estudos de Martins.⁹Já outros autores constataram que mudanças significativas nas pressões da artéria pulmonar, hipertrofia da camada média das arteríolas pulmonares e hipertrofia ventricular direita, manifestam-se apenas 3-4 semanas após a administração da MCT.^{18, 23,24}

O endotélio ocupa um papel importante na etiopatogênese da HAP, participando de forma expressiva nas alterações do tônus e remodelamento vascular, além do seu envolvimento no processo vaso-oclusivo. Embora exista uma vasta evidência na literatura que sugira a correlação entre MCT e disfunção da barreira endotelial em múltiplos níveis,^8,25,26 de acordo com muitos estudos, esse modelo é caracterizado predominantemente por hipertrofia da camada média das arteríolas pulmonares e não por proliferação endotelial excessiva, a qual está presente na doença humana.^3,17,27Tais considerações estão em desacordo com nossa análise histológica do tecido pulmonar, pois tanto a hipertrofia da camada média quanto a proliferação endotelial ocuparam papel expressivo no processo patológico da arteriopatia pulmonar dos animais MCT, dando origem a lesões vasculares complexas, referidas como plexiforme e do “tipo” plexiforme (plexiform-like).

Embora as lesões plexiformes observadas na HAP grave humana sejam difíceis de serem reproduzidas em modelos animais, pela primeira vez, um modelo isolado de MCT mostrou a presença dessas lesões. Em particular, caracterizam-se por uma estrutura desorganizada, de aspecto glomerulóide, formada por células hipercromáticas e ovais.^3-5Essas características, apesar de únicas, permanecem incertas, presumivelmente porque a lesão apresenta um caráter dinâmico e, mais importante, não se sabe como são formadas. Consensualmente, consiste em uma lesão angioproliferativa complexa, composta de canais revestidos por células endoteliais e separados por células centrais.^28,29Estas lesões complexas, descritas em nosso estudo, apresentam certa semelhança com a morfologia das lesões plexiformes na HAP humana grave.

Como sugerido recentemente por Tuder²⁸ em sua revisão da arteriopatia da HAP em humanos, as lesões denominadas “plexiform-like” podem representar um estágio inicial do padrão intraluminal da lesão plexiforme. Como o nome sugere, a complexidade dessas lesões se assemelha à das plexiformes típicas, porém apresentam uma morfologia distinta. Tais lesões, observadas em nosso estudo, são formadas dentro do lúmen vascular, de modo que o corpo da lesão assemelha-se a uma massa desordenada semelhante a um pedúnculo (“stalk-like”), constituída por células hipercromáticas e ovais, que parece surgir da parede arterial e se estende a jusante no lúmen do vaso, adquirindo canais parecidos com fendas (“slit-like channels”), bem como estruturas semelhantes a brotos (“bud-like”).³⁰

Vários modelos combinados de HAP, descritos na literatura médica, demonstraram que alterações nas condições hemodinâmicas e/ou no grau de saturação de oxigênio em animais submetidos à inoculação de substâncias tóxicas são capazes de intensificar o seu efeito sobre os vasos pulmonares e, dessa forma, desenvolver lesões vasculares complexas. White et al.,³¹ relataram HAP grave em ratos jovens pneumonectomizados submetidos à inoculação de MCT. Coste et al.,³²e Morimatsu et al.,³³ demonstraram o agravamento da HAP por MCT em ratos submetidos à um regime de hipóxia crônica. Ainda, Abe et al.,³⁰ demonstraram o desenvolvimento do HAP e arteriopatia pulmonar severa por meio da associação do bloqueador do receptor do fator de crescimento vascular Sugen 5416 à hipóxia crônica. As lesões neointimais laminares e não-laminares concêntricas, observadas em nosso estudo, assemelham-se àquelas encontradas na HAP humana grave³⁴ e nos modelos experimentais de HAP mencionados acima.

Wagenvoort & Wagenvoort^5,35 foram os primeiros a descrever a sequência das alterações vasculares da HAP e um dos pioneiros em avaliar o grau de reversibilidade dessas lesões, estudos válidos até os dias de hoje. Em nosso estudo, os processos de muscularização, hipertrofia da camada média e proliferação intimal/neointimal caracterizaram as alterações iniciais, sendo, portanto, potencialmente reversíveis sob o ponto de vista anatomopatológico. Contudo, as lesões vasculares complexas, mais presentes no G37, podem ser consideradas alterações geralmente irreversíveis, resultando em repercussões hemodinâmicas mais graves e mortalidade precoce, assim como ocorrido.³¹

A constatação das lesões plexiformes em nosso estudo, pode estar relacionada com o tempo de observação prolongado de 37 dias e à maior amplitude da análise anatomopatológica pulmonar. O surgimento das lesões vasculares complexas em HAP é tempo-dependente, ou seja, quanto maior o tempo dos animais expostos à MCT, maior a chance de evolução para as lesões mais complexas. Além disso, por serem focais, a observação das lesões plexiformes no parênquima pulmonar está na dependência da amplitude da análise histológica.

Com a evolução da HAP, o aumento da resistência vascular pulmonar causa uma hipertrofia ventricular direita secundária, em razão do aumento da sobrecarga do VD.³⁶Com 30 dias sob o efeito da MCT, os animais do nosso estudo já apresentavam hipertrofia ventricular direita.^9,36,37A hipertrofia ventricular miocárdica, por não implicar em um aumento da capacidade de contração cardíaca, evolui com dilatação das câmaras direitas e Cor pumonale.^9,17 Sinais de insuficiência cardíaca como derrame pleural, ascite e congestão hepática foram constatados nos animais do G37, assim como em alguns estudos previamente citados.

A espessura da parede do ventrículo direito foi utilizada como marcador de hipertrofia ventricular direita, embora muitos estudos utilizem a razão entre o peso do VD sobre o peso do conjunto ventrículo esquerdo + septo interventricular.¹⁷ De qualquer forma, ambos os métodos permitiram concluir o desenvolvimento de uma expressiva hipertrofia do VD nos animais MCT. Ainda, a hipertrofia do VD foi evidenciada pelo aumento da espessura e diâmetro dos cardiomiócitos, com preservação da integridade de suas fibras, como constatado por Martins,⁹ Cabrini,¹⁸ Nogueira- Ferreira et al.,³⁸ e Pacagnelli et al.,³⁹ E, por fim, a dilatação progressiva das câmaras direitas corrobora os resultados obtidos por Martins,⁹ que descreve dimensões muito superiores às correspondentes do lado esquerdo.

Apesar das semelhanças, esse modelo não mimetiza de maneira fidedigna a HAP em seres humanos. Isso se deve principalmente pelo fato de que não se sabe como as lesões angioproliferativas complexas são formadas e se elas realmente reproduzem os aspectos fisiopatológicos das lesões humanas.

O experimento demonstrou que uma dose intraperitoneal de 60 mg/kg de MCT foi capaz de gerar arteriopatia pulmonar moderada-grave, com muscularização das arteríolas, hipertrofia da camada média e formação neointimal. O modelo reproduziu múltiplas alterações estruturais no parênquima e nas arteríolas pulmonares, bem como hipertrofia ventricular direita secundária ao aumento da resistência vascular pulmonar. De nosso conhecimento, esse estudo foi o primeiro a constatar a presença de lesões complexas, principalmente as plexiformes, semelhantes às observadas em pacientes com HAP grave em um modelo isolado de MCT.