Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC xV7SrLndTyR5VrKq89qLDgG S0066-782X2020000800061 abc.20180143 10.36660/abc.20180143 Artigo Original A Redução do Colágeno Tipo I está Associada ao Aumento da Atividade da Metaloproteinase-2 e da Expressão Proteica de Leptina no Miocárdio de Ratos Obesos 0000-0003-2385-6058 Silva-Bertani Danielle Cristina Tomaz da 1 Vileigas Danielle Fernandes 1 Mota Gustavo Augusto Ferreira 1 Souza Sérgio Luiz Borges de 1 Tomasi Loreta Casquel De 1 0000-0002-4933-0604 Campos Dijon Henrique Salomé de 1 0000-0002-8185-4299 Deus Adriana Fernandes de 1 0000-0003-0649-8279 Freire Paula Paccielli 2 Alves Carlos Augusto Barnabe 2 Padovani Carlos Roberto 2 0000-0002-4402-6523 Cicogna Antonio Carlos 1 Faculdade de Medicina de Botucatu Universidade Estadual Paulista Botucatu SP Brasil Faculdade de Medicina de Botucatu - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP - Brasil Instituto de Biociências Universidade Estadual Paulista Botucatu SP Brasil Instituto de Biociências - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP - Brasil Correspondência: Antonio Carlos Cicogna •Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual de São Paulo (UNESP) - Avenida Prof. Mário Rubens Guimarães Montenegro, s/n. CEP 18618687, Botucatu, SP – Brasil E-mail: ac.cicogna@unesp.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Silva-Bertani DCT, Padovani CR, Cicogna AC; Obtenção de dados: Silva-Bertani DCT, Vileigas DF, De Tomasi LC, Campos DHS, Deus AF, Freire PP, Alves CAB; Análise e interpretação dos dados: Silva-Bertani DCT, Vileigas DF, Mota GAF, Souza SLB, De Tomasi LC, Campos DHS, Deus AF, Freire PP, Alves CAB, Cicogna AC; Análise estatística: Silva-Bertani DCT, Padovani CR, Cicogna AC; Obtenção de financiamento: Silva-Bertani DCT, Cicogna AC; Redação do manuscrito: Silva-Bertani DCT, Vileigas DF, Mota GAF, Souza SLB, Cicogna AC; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Silva-Bertani DCT, Vileigas DF, Mota GAF, Souza SLB, Cicogna AC.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 07 08 2020 07 2020 115 1 61 70 13 08 2018 27 06 2019 17 07 2019 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License, which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Resumo Fundamento

A obesidade é um fator de risco para complicações médicas, incluindo o sistema cardiovascular. Há informações limitadas sobre o colágeno no coração obeso. Nosso estudo anterior demonstrou uma redução dos níveis proteicos de colágeno miocárdico tipo I em ratos obesos alimentados com uma dieta com alto teor de gordura durante 34 semanas. No entanto, os mecanismos responsáveis pelos níveis baixos não estão completamente elucidados.

 Objetivo

O objetivo deste estudo foi testar a hipótese de que a redução do colágeno tipo I está associada ao aumento da atividade da metaloproteinase-2 (MMP-2), a qual está ligada à elevação de leptina no miocárdio de ratos obesos.

 Métodos

Ratos Wistar machos com 30 dias de idade foram randomizados em dois grupos: controle (dieta padrão) e obeso (dieta com alto teor de gordura), e alimentados durante 34 semanas. Foram avaliados as características gerais dos animais e os perfis metabólicos e endócrinos. Foram avaliados as expressões proteicas miocárdicas de colágeno tipo I, leptina e inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMP), bem como a atividade da MMP-2. O teste de correlação de Pearson foi aplicado para determinar as associações entre variáveis. O nível de significância foi de 5%.

 Resultados

Os animais obesos apresentaram índice de adiposidade mais elevado em comparação ao controle. Foram observadas comorbidades como intolerância à glicose, hiperinsulinemia, resistência à insulina, hiperleptinemia e hipertensão nos ratos obesos. A obesidade reduziu o colágeno tipo I, TIMP-1 e TIMP-2, e aumentou a leptina e a MMP-2 no miocárdio. Houve uma correlação negativa entre o colágeno tipo I e a MMP-2 e uma correlação positiva entre a leptina e a MMP-2.

 Conclusão

Foi confirmada a hipótese de que a redução do colágeno tipo I está associada ao aumento da atividade da MMP-2 e da expressão de leptina no miocárdio de ratos obesos. (Arq Bras Cardiol. 2020; 115(1):61-70)

 Doenças Cardiovasculares/fisiopatologia Obesidade Colágeno Tipo 1 Ratos Leptina Adiposidade Inibidores Teciduais de Metaloproteinases Metaloproteinase-2 FAPESP 2010/14208-4 FAPESP 2011/12165-9 Fontes de financiamento Introdução

A obesidade é uma doença metabólica crônica caracterizada pelo acúmulo excessivo de tecido adiposo. A prevalência da obesidade tem aumentado mundialmente, representando um problema grave de saúde pública que afeta tanto países desenvolvidos quanto países em desenvolvimento.1 , 2

Os adipócitos são influenciados por várias substâncias, e secretam numerosos peptídeos que atuam no sistema cardiovascular de maneira direta ou indireta. Portanto, o tecido adiposo não é simplesmente um depósito de energia, mas também um órgão endócrino, parácrino e autócrino ativo com múltiplas funções, incluindo a capacidade de sintetizar e liberar mediadores, como a leptina, que participa de múltiplos processos biológicos, incluindo aqueles que ocorrem no coração.3

O coração é composto por miócitos, nervos, vasos e a matriz extracelular (MEC). O componente principal da MEC é o colágeno, predominantemente do tipo I e III, sendo o tipo I o mais abundante, correspondendo a aproximadamente 80% do colágeno miocárdico total.4 Esta proteína é produzida por fibroblastos e degradada pela família das metaloproteinases de matriz (MMP).5 Em uma condição estável, o colágeno contribui para a manutenção da arquitetura e função cardíaca.6 Vários mecanismos atuam para garantir que os componentes da degradação da matriz por MMP sejam precisamente controlados, incluindo os inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMP).7 O colágeno cardíaco muda em resposta a estímulos neuro-hormonais e mecânicos,6 , 8 devido a síntese elevada e degradação diminuída ou vice versa.

Vários estudos têm analisado a expressão do colágeno tipo I em diferentes tecidos em modelos experimentais de obesidade.9 - 11 Há informações limitadas sobre o comportamento desse tipo de colágeno no coração de animais obesos. Embora Carroll et al.12 tenham demonstrado uma elevação em colágeno miocárdico tipo I em coelhos obesos que receberam uma dieta com alto teor de gordura durante 12 semanas, um estudo prévio do nosso grupo, Silva et al.,13 encontrou uma redução do colágeno miocárdico tipo I em ratos obesos que receberam uma dieta com alto teor de gorduras insaturadas durante 30 semanas.13 No entanto, não foram estudados os mecanismos responsáveis pela redução desse colágeno.

Um dos possíveis mecanismos envolvidos na regulação do colágeno miocárdico tipo I é o aumento do hormônio leptina.5 , 14 - 16 Apoiando tal hipótese, a maioria dos estudos in vitro tem demonstrado que a leptina aumenta a atividade da MMP-2,5 , 15 , 16 que está envolvida na degradação do colágeno tipo I. Portanto, o objetivo do presente estudo foi testar a hipótese de que a redução do colágeno miocárdico tipo I, associada com o aumento da atividade da MMP-2, está ligada à elevação de leptina em ratos obesos.

 Materiais e métodos Animais e protocolo experimental

Após uma semana de aclimatação, ratos Wistar machos com 30 dias de idade foram aleatoriamente designados, por sorteio, para um dos dois grupos: controle (n = 20) e obeso (n = 21). O tamanho da amostra utilizada neste estudo foi baseado na literatura e nos nossos estudos prévios.13 , 17 - 19 O grupo controle foi alimentado com ração de ratos padrão (RC Focus 1765, Agroceres®, Rio Claro, SP, Brasil) contendo 12,3% de quilocalorias de gordura, 57,9% de carboidratos e 29,8% de proteína, enquanto o grupo obeso foi alimentado com uma das quatro alternantes dietas com alto teor de gordura (RC Focus 2413, 2414, 2415 e 2416, Agroceres®, Rio Claro, SP, Brasil) contendo 49,2% de quilocalorias de gordura, 28,9% de carboidratos e 21,9% de proteína. As quatro dietas com alto teor de gordura tinham a mesma composição nutricional, exceto aditivos aromatizantes, a saber, queijo, bacon, chocolate ou baunilha. Cada dieta foi alternada diariamente, e os ratos mantiveram suas respectivas dietas durante 34 semanas consecutivas. A dieta com alto teor de gordura foi caloricamente rica em comparação com a dieta padrão (3,65 kcal/g vs. 2,95 kcal/g) devido à maior composição de gordura. A dieta com alto teor de gordura consistia em ácidos graxos saturados e insaturados, que forneciam 20% e 80% das calorias derivadas de gordura, respectivamente.

Os ratos foram alojados em gaiolas individuais em uma sala de ar limpo com controle ambiental a 23 (± 3)ºC com um ciclo claro/escuro de 12 horas e umidade relativa de 60% (± 5%). Todos os experimentos e procedimentos foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, publicado pelo Conselho Nacional de Pesquisa (1996),20 e foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de Botucatu (UNESP, Botucatu, SP, Brasil, Protocolo: 861-2011).

 Características gerais dos animais e perfis metabólicos e endócrinos

As características gerais dos animais e os perfis metabólicos e endócrinos foram avaliados de acordo com os seguintes parâmetros: peso corporal, gordura corporal (GC), índice de adiposidade (IA), consumo alimentar, ingestão de calorias, eficiência alimentar, tolerância à glicose, resistência à insulina, perfil lipídico sérico e concentrações séricas de leptina e insulina. Foi aplicado um critério baseado no IA para determinar a obesidade. O IA é um método fácil e consistente utilizado por vários autores para avaliar a quantidade de GC em roedores.21 - 23

O consumo alimentar e peso corporal foram medidos semanalmente. Foi determinada a ingestão calórica multiplicando o valor energético de cada dieta (g × kcal) e consumo alimentar semanal. Para analisar a capacidade dos animais de converter energia alimentar consumida em peso corporal, foi calculada a eficiência alimentar, dividindo o ganho total de peso corporal (g) pela ingestão energética total (Kcal).

Foi avaliada a tolerância à glicose pelo teste oral de tolerância à glicose uma semana antes da eutanásia. Após um jejum de seis horas, foram coletadas amostras de sangue por punção da ponta da cauda na linha de base e após administração intraperitoneal de solução de glicose a 30% (Sigma-Aldrich®, St Louis, MO, EUA), equivalente a 2,0 g/kg de peso corporal. Foram analisadas as concentrações de glicose no sangue a 0 minutos (linha de base) e aos 15, 30, 60, 90 e 120 minutos de infusão de glicose, utilizando um glicosímetro portátil (Accu-chek Advantage; Roche Diagnostics Co., Indianápolis, IN, EUA). Foi avaliada a intolerância à glicose pela área sob a curva (AUC) para glicose.

Ao final do protocolo experimental, após jejum de 12 horas, os animais foram anestesiados (pentobarbital sódico 50 mg/kg, injeção intraperitoneal), decapitados e toracotomizados; os diferentes depósitos de gordura do tecido adiposo foram dissecadas e pesadas. Foi calculada a GC como a soma do peso dos depósitos de gordura individuais da seguinte maneira: GC = gordura epididimal + gordura retroperitoneal + gordura visceral. Foi calculado o IA com a seguinte fórmula: IA = (GC/peso corporal final) × 100. As amostras de sangue foram coletadas em tubos heparinizados, centrifugados a 3.000 × g por 10 minutos a 4°C e armazenados a −80°C para análise subsequente. Foram determinados triacilglicerol, colesterol total, concentrações de lipoproteína de alta (HDL) e baixa densidade (LDL) utilizando kits específicos (BIOCLIN®, Belo Horizonte, MG, Brasil). Os níveis hormonais de leptina e insulina foram determinados por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), utilizando kits comercialmente disponíveis (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA).

Foi usado o modelo de avaliação da homeostase da resistência à insulina (HOMA-IR) como um índice de resistência à insulina, calculado de acordo com a fórmula: HOMA-IR = [glicose em jejum (mmol/L) × insulina em jejum (μU/mL)]/22,5.24

 Perfil cardiovascular

Foi avaliado também o perfil cardiovascular dos animais de acordo com os seguintes parâmetros: pressão arterial sistólica (PAS); morfologia do tecido cardíaco; expressão proteica miocárdica de colágeno tipo I, TIMP-1, TIMP-2 e leptina; e atividade da MMP-2.

 Pressão arterial sistólica

Ao final do experimento, uma semana antes da eutanásia, foi medida a PAS em ratos conscientes utilizando o método não invasivo de manguito de cauda com um eletro- esfigmomanômetro, Narco BioSystems® (International Biomedical, Austin, TX, EUA).25 As pulsações arteriais foram registradas em um sistema computadorizado de aquisição de dados (Biopac Systems Inc., CA, EUA). Foi registrada a média de duas leituras para cada medida.

 Estudo morfológico

Os corações foram removidos e dissecados após a eutanásia e a toracotomia. O peso dos átrios e do ventrículos esquerdo e direito e as suas respectivas relações com o peso corporal final foram determinados com a finalidade de avaliar a presença de remodelação cardíaca (i.e., a presença ou ausência de hipertrofia).

 Níveis proteicos miocárdicos de colágeno tipo I, TIMP-1, TIMP-2 e leptina

O tecido do ventrículo esquerdo foi analisado por western blot para quantificar os níveis proteicos de colágeno tipo I, TIMP-1, TIMP-2 e leptina. Foram utilizadas seis amostras em cada grupo para garantir que todas as amostras fossem analisadas na mesma corrida de eletroforese com a finalidade de evitar variações entre géis. Resumidamente, amostras congeladas do ventrículo esquerdo foram homogeneizadas usando um dispositivo Polytron (Ika Ultra TurraxTM T25 Basic, Wilmington, EUA) em tampão de lise contendo 10 mM de Tris pH 7,4, 100 Mm de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 Mm de EGTA, 1% Triton X-100, 10% glicerol, 0,1% dodecil de sódio sulfato de sódio (SDS), desoxicolato a 0,5% e inibidores da fosfatase e protease (Sigma-Aldrich). O homogenato foi centrifugado a 4ºC durante 20 minutos a 12.000 rpm. Foi coletado o sobrenadante e o conteúdo total de proteínas foi determinado pelo método de Bradford. As amostras (50 µg) foram submetidas a eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) em géis de poliacrilamida (6% ou 10%, dependendo do peso molecular da proteína). Após eletroforese, as proteínas foram eletro-transferidas para uma membrana de nitrocelulose (BioRad Biosciences; NJ, EUA). A membrana foi subsequentemente bloqueada (5% leite em pó desnatado, 10 mmol/L de Tris-HCl pH 7,6, 150 mmol/L de NaCl, e 0,1% Tween 20) durante 2 horas à temperatura ambiente e incubada com anticorpos específicos durante a noite a 4ºC. Após isso, a membrana foi incubada durante 1,5 horas à temperatura ambiente com anticorpo secundário anti-coelho ou anti-camundongo conjugado com peroxidase (diluição 1:10.000) e subsequentemente incubada com quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, NJ, USA) e detectado por autoradiografia. Foi realizada a análise de quantificação dos blots utilizando Scion Image software (Scion, baseado em NIH Image). Foram obtidos anticorpos monoclonais de camundongo para colágeno tipo I (1:10.000), TIMP-2 (1:1.000) e leptina (1:1.000) e anticorpos monoclonais de coelho para TIMP-1 (1:1.000) e β-actina (1:1.000) de Abcam (Cambridge, USA) e Cell Signaling (Danvers, USA), respectivamente. As bandas alvo foram normalizadas para a expressão da β-actina cardíaca.

 Atividade da metaloproteinase-2 miocárdica

A atividade da MMP-2 miocárdica foi determinada conforme descrito por Tyagi et al.26 Foram usadas seis amostras em cada grupo para garantir que todas as amostras fossem analisadas na mesma corrida de eletroforese para evitar variações entre géis. Resumidamente, os tecidos do ventrículo esquerdo foram homogeneizados em um tampão contendo: Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 0,2 M, Triton-X 0,1% e CaCl2 10 mM. O homogenato foi centrifugado a 4°C durante 20 minutos a 12.000 rpm. O sobrenadante foi coletado, e o conteúdo total de proteínas foi determinado pelo método de Bradford (Bradford 1976). As amostras foram diluídas em um tampão de aplicação contendo: 0,5 M Tris, pH 6,8, 100% glicerol e 0.05% azul de bromofenol. As amostras foram carregadas em poços de SDS-poliacrilamida a 8% contendo gelatina a 1%. Foi realizada a eletroforese em um dispositivo Bio-Rad a 80 V durante duas horas. O gel foi removido e lavado duas vezes com Triton-X-100 a 2,5% e subsequentemente lavado com 50 mM de Tris, pH 8,4. O gel foi subsequentemente incubado a 37°C durante a noite em uma solução de ativação contendo 50 mM de Tris, pH 8,4, 5 mM de CaCl2 e ZnCl2. A coloração foi realizada durante 2 horas com azul de Coomassie a 0,5%, e a descoloração foi realizada com metanol a 30% e ácido acético a 10% até que bandas claras fossem observadas sobre um fundo escuro. Os géis foram fotografados, e a intensidade da ação gelatinolítica (bandas claras) foi analisada em UVP, UV e um analisador de imagem White Darkhon.

 Análise estatística

Antes da análise estatística, todos os dados foram testados quanto à normalidade usando o teste Shapiro-Wilk. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão e submetidos ao teste t de Student para amostras independentes. O teste de correlação de Pearson foi utilizado para avaliar a associação entre as variáveis colágeno I, MMP-2, TIMP e leptina. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando SigmaStat para Windows (Versão 3,5). O nível de significância considerado foi de 5 % (α = 0,05).

 Resultados Características gerais dos animais

As características gerais dos animais encontram-se na Tabela 1 . O peso corporal final; os depósitos de gordura epididimal, retroperitoneal e visceral; a GC total; e o IA foram significativamente mais altos no grupo obeso do que no grupo controle. Durante o período experimental, os animais no grupo obeso consumiram menos comida e calorias do que os animais do grupo controle; no entanto, a eficiência alimentar foi maior nos animais obesos.

– Características gerais dos animais
Variáveis Grupos
Controle (n = 20) Obeso (n = 21) Valor de p
PCI (g) 151 ± 11 151 ± 11 0,290
PCF (g) 480 ± 51 534 ± 58 0,009
Gordura epididimal (g) 9,3 ± 2,3 14,2 ± 3,4 < 0,001
Gordura epididimal/100g PCF 1,9 ± 0,5 2,7 ± 0,6 < 0,001
Gordura retroperitoneal (g) 10,5 ± 3,3 21,7 ± 5,9 < 0,001
Gordura retroperitoneal/100g PCF 2,2 ± 0,7 4,1 ± 1,1 < 0,001
Gordura visceral (g) 6,3 ± 1,4 11,2 ± 4,2 < 0,001
Gordura visceral/100g PCF 1,3 ± 0,3 2,1 ± 0,8 < 0,001
GC (g) 26,1 ± 6,2 47,2 ± 12,3 < 0,001
Índice de adiposidade 5,6 ± 0,9 8,8 ± 1,6 < 0,001
Consumo alimentar (g/dia) 22,8 ± 2,1 17,0 ± 2,3 < 0,001
Ingestão calórica (kcal) 67,4 ± 6,3 62,1 ± 8,2 0,03
Eficiência alimentar (%) 2,1 ± 0,2 2,7 ± 0,2 < 0,001

Valores são média ± desvio padrão. GC: gordura corporal; PCF: peso corporal final; PCI: peso corporal inicial. Teste t de Student.

Perfis metabólicos e endócrinos

Os perfis metabólicos e endócrinos estão resumidos na Figura 1 . A obesidade a longo prazo induzida por alto teor de gordura levou a alterações metabólicas e hormonais significativas. Houve um aumento significativo na AUC de glicose, bem como nos níveis de insulina e leptina no grupo obeso, em comparação com o controle. Os animais obesos apresentaram um aumento da AUC, insulina sérica e HOMA-IR. As medidas séricas de glicose, triacilglicerol, colesterol total, HDL e LDL foram semelhantes entre os grupos.

– <italic>Perfil metabólico e endócrino. (A) Glicose em jejum, (B) Área sob a curva (AUC) do teste intraperitoneal de tolerância à glicose, (C) insulina, (D) modelo de avaliação da homeostase da resistência à insulina (HOMA-IR), (E) triacilglicerol, (F) colesterol total, (G) lipoproteina de alta densidade (HDL), (H) lipoproteina de baixa densidade (LDL) e (I) leptina em ratos controles e obesos. (n = 15 – 21 por grupo). Dados são apresentados como média ± desvio padrão; teste t de Student. *: p < 0,05.</italic>

Pressão arterial sistólica e perfil morfológico cardíaco

A Tabela 2 demonstra que a PAS foi mais alta nos animais obesos, e não houve diferenças significativas entre os grupos para quaisquer parâmetros estudados em relação ao perfil morfológico, exceto no ventrículo direito, sugerindo que a obesidade não desencadeou hipertrofia do ventrículo esquerdo.

– Pressão arterial sistólica e perfil morfológico cardíaco
Variáveis Grupos
Controle (n = 20) Obeso (n = 21) Valor de p
PAS 127 ± 11,0 134 ± 12,0 0,04
Coração (g) 1,10 ± 0,10 1,17 ± 0,13 0,06
PA (g) 0,093 ± 0,018 0,094 ± 0,021 0,80
PVE (g) 0,81 ± 0,09 0,82 ± 0,10 0,62
PVD (g) 0,22 ± 0,03 0,24 ± 0,03 0,04
PA/PCF. 10-3 0,20 ± 0,03 0,18 ± 0,03 0,14
PVE /PCF. 10-3 1,72 ± 0,11 1,71 ± 0,12 0,44
PVD/PCF. 10-3 0,48 ± 0,09 0,47 ± 0,05 0,64

Valores são médias ± desvio padrão. PA: peso atrial; PAS: pressão arterial sistólica; PCF: peso corporal final; PVD: peso do ventrículo direito; PVE: peso do ventrículo esquerdo; relações PA/PCF; PVE/PCF; PVD/PCF; 10-3 = 0,001. Teste t de Student.

Níveis proteicos miocárdicos de colágeno tipo I, TIMP-1, TIMP-2 e leptina

A Figura 2 demonstra que a obesidade promoveu uma redução dos níveis proteicos do colágeno tipo I, TIMP-1 e TIMP-2; no entanto, houve um aumento dos níveis proteicos de leptina no grupo obeso em comparação ao grupo controle.

– <italic>Western blots representativos e quantificação de colágeno miocárdico tipo I, TIMP-1, TIMP-2 e leptina de ratos controles e obesos (n = 6 por grupo). As bandas dos western blot foram normalizados para β-actina. Dados são apresentados como média ± desvio padrão; teste t de Student. *: p < 0,05.</italic>

Atividade de MMP-2 miocárdica

A Figura 3 mostra a identificação de duas bandas fracas de degradação correspondentes à MMP-2 no gel de eletroforese: a MMP-2 inativa (pró-MMP-2) com um peso molecular de aproximadamente 72 kDa e MMP-2 ativa com um peso molecular de aproximadamente 64 kDa. Entre as duas bandas mencionadas, foi possível identificar a banda forte da degradação intermediária da MMP-2. Houve um aumento significativo na MMP-2 nos animais obesos.

– <italic>Relação entre MMP-2 ativa (ativa e ativa intermediária) e inativa em ratos controles e obesos (n = 6 por grupo). MMP-2 inativa = 72 kDa e MMP-2 ativa = 64 kDa. Dados são apresentados como média ± desvio padrão; teste t de Student. *: p < 0,05.</italic>

Associação linear entre variáveis cardíacas

A Tabela 3 demonstra que houve uma correlação significativa entre a redução do colágeno tipo I e o aumento da atividade da MMP-2, bem como entre a elevação da atividade da MMP-2 e a leptina. Além disso, foi observada uma correlação entre o aumento da MMP-2 e a redução do TIMP-1 e -2, bem como entre a redução do TIMP-1 e o aumento dos níveis proteicos de leptina.

– Associação linear entre variáveis cardíacas
Associação Coeficiente de correlação Valor de p
Colágeno I × MMP-2 −0,723 0,008
MMP-2 × Leptina 0,766 0,004
MMP-2 × TIMP-1 −0,815 0,001
MMP-2 × TIMP-2 −0,597 0,040
TIMP-1 × Leptina −0,656 0,020
TIMP-2 × Leptina −0,273 0,390

Valores são médias ± desvio padrão. PA: peso atrial; PAS: pressão arterial sistólica; PCF: peso corporal final; PVD: peso do ventrículo direito; PVE: peso do ventrículo esquerdo; relações PA/PCF; PVE/PCF; PVD/PCF; 10-3 = 0,001. Teste t de Student.

Discussão

O presente estudo visou investigar se a redução do colágeno tipo I está associada ao aumento da atividade da MMP-2 e a níveis elevados de leptina no miocárdio de ratos obesos. Os resultados principais confirmaram esta hipótese.

A alimentação contínua com uma dieta com alto teor de gordura foi eficaz para promover a obesidade em 34 semanas, uma vez que os ratos apresentaram níveis mais elevados de peso corporal, gordura e IA em comparação aos ratos alimentados com uma dieta padrão; tais dados corroboram outros estudos.27 , 28

As principais causas da obesidade são: o suprimento mais abundante de alimentos, a maior ingestão de alimentos palatáveis e densos em energia e a redução do gasto energético. A dieta com alto teor de gordura utilizada no presente estudo era rica em ácidos graxos mono e poliinsaturados com um conteúdo energético de 3,65 kcal/g, enquanto a dieta padrão dada ao grupo controle consistia em 2,95 kcal/g, gerando uma diferença de 24% em conteúdo calórico. Outros autores têm demonstrado que o consumo de uma dieta com alto teor de gordura promove menos saciedade e assim aumenta a ingestão de alimentos.29

Esses dados diferem dos nossos resultados, visto que os animais obesos ingeriram uma quantidade menor de alimentos e calorias em comparação ao controle. No entanto, a eficiência alimentar era mais alta nos ratos obesos, provavelmente devido ao efeito térmico do alimento. A gordura alimentar requer menos energia (2% – 3%) para ser metabolizada, e a gordura excessiva é, portanto, facilmente depositada na forma de triglicerídeos nos adipócitos, resultando em obesidade.30

Vários estudos têm relatado algumas comorbidades relacionadas à obesidade29 , 31 , 32 tais como intolerância à glicose, resistência à insulina, dislipidemia, hiperinsulinemia, hiperleptinemia e hipertensão arterial. No presente estudo, os animais obesos apresentaram maior AUC no teste oral de tolerância à glicose e maiores níveis séricos de insulina que os controles, indicando que a obesidade promoveu intolerância à glicose e hiperinsulinemia. A intolerância à glicose, associada ao aumento da insulina sérica, indicou que os ratos obesos apresentaram resistência à ação da insulina. Estes resultados são ainda corroborados pelo aumento do HOMA-IR nos ratos obesos. Todos estes achados estão de acordo com relatos prévios que utilizaram ratos alimentados com uma dieta com alto teor de gordura insaturada.13 , 27 , 28 , 33 Diversos estudos têm mostrado que a obesidade induzida por uma dieta com alto teor de gordura leva à dislipidemia,19 , 34 , 35 devido a mudanças em triacilglicerol, LDL ou HDL. Em nosso estudo, foi observada a redução dos níveis séricos de HDL. A leptina é um hormônio produzido pelo tecido adiposo, que participa do balanço energético, por meio da regulação da ingestão de alimentos e da oxidação de lipídios,36 e da biologia dos colágenos.5 , 14 - 16

Em relação aos efeitos da obesidade no sistema cardiovascular, a obesidade não promoveu remodelação cardíaca do ventrículo esquerdo. No entanto, a PAS aumentou nos animais obesos. Visto que o controle da PAS envolve o sistema neuro-humoral, como o sistema nervoso simpático e o sistema renina-angiotensina-aldosterona, os quais são aumentados na obesidade,37 pode-se inferir que o sistema neuro-humoral é ativado em animais obesos. Este achado está em acordo com alguns pesquisadores anteriores que investigaram a PAS em animais obesos alimentados com uma dieta com alto teor de gordura38 e em desacordo com outros.27

O objetivo principal deste estudo foi investigar se o aumento da atividade da MMP-2 pela leptina é responsável pela redução do colágeno miocárdico tipo I em ratos obesos. Os resultados desta investigação indicaram que houve uma redução dos níveis proteicos do colágeno tipo I acompanhada por um aumento da atividade da MMP-2 e dos níveis proteicos da leptina e uma redução dos níveis proteicos de TIMP-1 e TIMP-2 no coração. Como previamente referido, poucos estudos têm avaliado o comportamento do colágeno tipo I no miocárdio de animais com obesidade induzida por uma dieta com alto teor de gordura; enquanto Carroll e Tyaggi12 e Martínez-Martínez39 verificaram um aumento, Silva et al.,13 verificou uma redução do colágeno miocárdico tipo I.

As alterações no colágeno miocárdico podem resultar de uma elevação da síntese ou uma diminuição da degradação. Os dados deste estudo demonstraram que a degradação do colágeno tipo I pode ter prevalecido em ratos obesos, considerando que houve uma associação significativa entre o colágeno tipo I reduzido e o aumento da atividade da MMP-2. Embora alguns estudos indiquem que o aumento da atividade da MMP-2 melhora a síntese de colágeno,40 a maioria das informações na literatura indica o comportamento oposto, i.e., o aumento da atividade da MMP-2 promove a degradação do colágeno tipo I.5 , 39 , 41 Embora Martínez-Martínez et al.,39 e Zibadi et al.,14 tenham verificado que a leptina reduziu a atividade da MMP-2 in vitro , outros estudos têm demonstrado que a leptina aumenta a atividade da MMP-2 5 , 15 , 16 e os nossos resultados corroboram ainda mais este último achado. Portanto, a elevação da MMP-2 pode ter sido consequente ao aumento da leptina cardíaca, porque houve uma estreita associação entre estas duas variáveis, embora esses achados não necessariamente reflitam uma relação de causa e efeito. Apesar disso, vários estudos têm relatado uma relação direta entre a leptina e a atividade da MMP-2 em cardiomiócitos.5 , 15 , 16

Apesar do fato que o aumento da atividade da MMP está associado à elevação da leptina cardíaca, outro fator modificante dessa enzima é o comportamento dos TIMP. Os resultados do presente estudo demonstraram uma redução dos níveis proteicos de TIMP-1 e TIMP-2 em animais obesos, que pode ter influenciado o aumento da MMP-2, uma vez que houve uma associação significativa entre MMP-2 e TIMP-1 e TIMP-2. A redução do TIMP-1 pode estar relacionada ao aumento da leptina, uma vez que houve uma associação significativa entre estas variáveis. Este achado é consistente com Schram et al., que verificaram uma redução substancial na expressão do mRNA de TIMP-1 após a elevação das concentrações da leptina em células cardíacas cultivadas.15 Até onde sabemos, este é o primeiro estudo que avalia a associação entre colágeno tipo I, leptina, MMP-2 e TIMP-1 e TIMP-2 no miocárdio de animais obesos alimentados com uma dieta com alto teor de gordura insaturada. No entanto, outras análises são necessárias para confirmar a relação de causa e efeito.

 Conclusão

Os achados confirmaram a hipótese de que a redução do colágeno tipo I está associada ao aumento da atividade da MMP-2, que está, por sua vez, ligada à elevação da leptina no miocárdio de ratos obesos. Este estudo permitiu a avaliação de mediadores envolvidos na remodelação cardíaca, os quais podem desencadear a função cardíaca comprometida na obesidade. A identificação desses fatores deletérios pode facilitar possíveis alvos terapêuticos.

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Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Danielle Cristina Tomaz da Silva-Bertani pela Faculdade de Medicina de Botucatu (UNESP).

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de Botucatu sob o número de protocolo 861-2011. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela FAPESP (2010/14208-4 e 2011/12165-9).

 Original Article Decreased Collagen Type I is Associated with Increased Metalloproteinase-2 Activity and Protein Expression of Leptin in the Myocardium of Obese Rats 0000-0003-2385-6058 Silva-Bertani Danielle Cristina Tomaz da 1 Vileigas Danielle Fernandes 1 Mota Gustavo Augusto Ferreira 1 Souza Sérgio Luiz Borges de 1 Tomasi Loreta Casquel De 1 0000-0002-4933-0604 Campos Dijon Henrique Salomé de 1 0000-0002-8185-4299 Deus Adriana Fernandes de 1 0000-0003-0649-8279 Freire Paula Paccielli 2 Alves Carlos Augusto Barnabe 2 Padovani Carlos Roberto 2 0000-0002-4402-6523 Cicogna Antonio Carlos 1 Brazil Faculdade de Medicina de Botucatu - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP - Brazil Brazil Instituto de Biociências - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP - Brazil Mailing Address: Antonio Carlos Cicogna • Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual de São Paulo (UNESP) - Avenue Prof. Mário Rubens Guimarães Montenegro, s/n. Postal Code 18618687, Botucatu, SP – Brazil E-mail: ac.cicogna@unesp.br

Author contributions

Conception and design of the research: Silva-Bertani DCT, Padovani CR, Cicogna AC; Acquisition of data: Silva-Bertani DCT, Vileigas DF, De Tomasi LC, Campos DHS, Deus AF, Freire PP, Alves CAB; Analysis and interpretation of the data: Silva-Bertani DCT, Vileigas DF, Mota GAF, Souza SLB, De Tomasi LC, Campos DHS, Deus AF, Freire PP, Alves CAB, Cicogna AC; Statistical analysis: Silva-Bertani DCT, Padovani CR, Cicogna AC; Obtaining financing: Silva-Bertani DCT, Cicogna AC; Writing of the manuscript: Silva-Bertani DCT, Vileigas DF, Mota GAF, Souza SLB, Cicogna AC; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Silva-Bertani DCT, Vileigas DF, Mota GAF, Souza SLB, Cicogna AC.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Abstract Background

Obesity is a risk factor for medical complications, including the cardiovascular system. There is limited information on collagen in the heart in obesity. Our previous study showed decreased protein levels of myocardial collagen type I in obese rats fed a high-fat diet for 34 weeks. However, the mechanisms responsible for low levels are not fully elucidated.

 Objective

The purpose of this study was to test the hypothesis that the reduction in collagen type I is associated with increased metalloproteinase-2 (MMP-2) activity, which is linked to elevated leptin in the myocardium of obese rats.

 Methods

Thirty-day-old male Wistar rats were randomized into two groups, control (standard diet) and obese (high-fat diet), and fed for 34 weeks. The general animal characteristics and metabolic and endocrine profiles were evaluated. Myocardial protein expressions of collagen I, leptin, tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP), and MMP-2 activity were assessed. Pearson correlation was employed to determine the associations between variables. The level of significance was 5%.

 Results

The obese animals had increased adiposity index compared to control. Comorbidities such as glucose intolerance, hyperinsulinemia, insulin resistance, hyperleptinemia, and hypertension were observed in obese rats. Obesity reduced collagen I, TIMP-1, and TIMP-2, and it increased leptin and MMP-2 in the myocardium. There was a negative correlation between collagen I and MMP-2 and a positive correlation between leptin and MMP-2.

 Conclusion

The hypothesis was confirmed; the reduction in collagen type I is associated with increased MMP-2 activity and leptin expression in the myocardium of obese rats. (Arq Bras Cardiol. 2020; 115(1):61-70)

 Cardiovascular Diseases/physiopathology Obesity Collagen Type 1 Rats Leptin Adiposity Tissue Inhibitor of Metalloproteinases Metaloproteinase-2 Introduction

Obesity is a chronic metabolic disorder characterized by excessive accumulation of adipose tissue. The prevalence of obesity has increased worldwide, representing a major public health problem that affects both developed and developing countries.1 , 2

The adipocytes are influenced by several substances, and they secrete numerous peptides that act directly or indirectly on the cardiovascular system. Therefore, adipose tissue is not simply an energy deposit, but also an active endocrine, paracrine and autocrine organ with multiple functions, including the ability to synthesize and release mediators, like leptin, that participate in multiple biological processes, including those that occur in the heart.3

The heart is composed of myocytes, nerves, vessels, and the extracellular matrix (ECM). The main component of the ECM is collagen, predominantly type I and III, with type I being the most abundant, corresponding to approximately 80% of total myocardial collagen.4 This protein is produced by fibroblasts and degraded by the family of matrix metalloproteinases (MMP).5 In a stable condition, it contributes to the maintenance of cardiac architecture and function.6 Several mechanisms act to ensure that the components of matrix degradation by MMP are precisely controlled, including tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP).7 Cardiac collagen changes in response to neuro-hormonal and mechanical stimuli,6 , 8 due to elevated synthesis and decreased degradation or vice versa.

Several studies have analyzed the expression of collagen type I in different tissues in experimental models of obesity.9 - 11 There is limited information on the behavior of this type of collagen in the heart in obese animals. Although Carroll et al.12 have shown elevated myocardial collagen type I in obese rabbits fed a high-fat diet for 12 weeks, a previous study by our group, Silva et al.,13 found decreased cardiac collagen type I in obese rats fed an unsaturated high-fat diet for 30 weeks.13 The mechanisms responsible for the decreased myocardial collagen type I, however, were not studied.

One of the possible mechanisms involved in myocardial type I collagen regulation is the increased leptin hormone.5 , 14 - 16 Supporting this hypothesis, most studies in vitro have shown that leptin increases MMP-2 activity,5 , 15 , 16 which is involved in the degradation of collagen type I. Therefore, the purpose of this study was to test the hypothesis that the reduction in myocardial collagen type I, associated with increased activity of MMP-2, is linked to elevation of leptin in obese rats.

 Materials and methods Animals and Experimental Protocol

After one week for acclimatization, 30-day-old male Wistar rats were randomly assigned, by lottery, to one of two groups: control (n = 20) and obese (n = 21). The sample size used in this study was based on the literature and on our previous studies.13 , 17 - 19 The control group was fed standard rat chow (RC Focus 1765, Agroceres®, Rio Claro, SP, Brazil) containing 12.3% of kilocalories from fat, 57.9% from carbohydrates, and 29.8% from protein, whereas the obese group was fed one of four alternating high-fat diets (RC Focus 2413, 2414, 2415, and 2416, Agroceres®, Rio Claro, SP, Brazil) containing 49.2% of kilocalories from fat, 28.9% from carbohydrates, and 21.9% from protein. The four high-fat diets had the same nutritional composition, except flavoring additives, namely, cheese, bacon, chocolate, or vanilla. Each diet was changed daily, and the rats were maintained on their respective diets for 34 consecutive weeks. The high-fat diet was calorically rich compared to the standard diet (3.65 kcal/g vs. 2.95 kcal/g) due to the higher fat composition. The high-fat diet consisted of saturated and unsaturated fatty acids, which provided 20% and 80% of the fat-derived calories, respectively.

Rats were housed in individual cages in an environmentally controlled clean-air room at 23 (± 3)ºC with a 12-hour light/dark cycle and 60% (± 5%) relative humidity. All experiments and procedures were conducted according to the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, published by the National Research Council (1996),20 and they received approval from the Botucatu Medical School Ethics Committee (UNESP, Botucatu, SP, Brazil, Protocol: 861-2011).

 Animal general characteristics and metabolic and endocrine profiles

Animal general characteristics and metabolic and endocrine profiles were evaluated according to the following parameters: body weight, body fat (BF), adiposity index (AI), food consumption, caloric intake, feed efficiency, glucose tolerance, insulin resistance, serum lipid profile, and serum leptin and insulin concentrations. A criterion based on the AI was used to determine obesity. The AI is an easy and consistent method used by several authors to evaluate the amount of BF in rodents.21 - 23

The animals’ food intake and body weight were measured weekly. Caloric intake was determined by multiplying the energy value of each diet (g × kcal) and weekly food intake. To analyze the animals’ capacity to convert consumed food energy to body weight, feed efficiency was calculated, dividing the total body weight gain (g) by total energy intake (Kcal).

Glucose tolerance was evaluated by the oral glucose tolerance test one week before euthanasia. After a 6-hour fast, blood samples were collected by puncture from the tail tip at baseline and after intraperitoneal administration of 30% glucose solution (Sigma-Aldrich®, St Louis, MO, USA), equivalent to 2.0 g/kg body weight. Blood glucose concentrations were analyzed at 0 minutes (baseline) and after 15, 30, 60, 90, and 120 minutes of glucose infusion, using a handheld glucometer (Accu-chek Advantage; Roche Diagnostics Co., Indianapolis, IN, USA). Glucose intolerance was assessed by the area under the curve (AUC) for glucose.

At the end of the experimental protocol, after fasting for 12 hours, animals were anesthetized (sodium pentobarbital 50 mg/kg, intraperitoneal injection), decapitated, and thoracotomized; the adipose tissue fat pads were dissected and weighed. BF was calculated as the sum the weight of the individual fat pads as follows: BF = epididymal fat + retroperitoneal fat + visceral fat. AI was calculated by the following formula: AI = (BF/final body weight) × 100. Blood samples were collected in heparinized tubes, centrifuged at 3,000 × g for 10 minutes at 4°C, and stored at −80°C for later analysis. Triacylglycerol, total cholesterol, and high- (HDL) and low-density lipoprotein (LDL) concentrations were determined using specific kits (BIOCLIN®, Belo Horizonte, MG, Brazil). Hormone levels of leptin and insulin were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), using commercially available kits (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA).

The homeostatic model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) was used as an insulin resistance index, calculated according to the formula: HOMA-IR = [fasting glucose (mmol/L) × fasting insulin (μU/mL)]/22.5.24

 Cardiovascular profile

The cardiovascular profile of the animals was also assessed according to the following parameters: systolic blood pressure (SBP); cardiac tissue morphology; myocardial protein expression of collagen type I, TIMP-1, TIMP-2, and leptin; and MMP-2 activity.

 Systolic blood pressure

At the end of the experiment, one week before euthanasia, SBP was measured in conscious rats using the non-invasive tail-cuff method with an electro-sphygmomanometer, Narco BioSystems®(International Biomedical, Austin, TX, USA).25 Arterial pulsations were recorded in a computerized data acquisition system (Biopac Systems Inc., CA, USA). The average of two readings was recorded for each measurement.

 Morphological study

The hearts were removed and dissected following euthanasia and thoracotomy. Atria, left and right ventricles weights, and their respective relations with final body weight were determined to evaluate the presence of cardiac remodeling (i.e., presence or absence of hypertrophy).

 Myocardial protein levels of collagen type I, TIMP-1, TIMP-2, and leptin

Left ventricular tissue was analyzed by Western Blot to quantify protein levels of collagen type I, TIMP-1, TIMP-2, and leptin. Six samples were used in each group to ensure that all samples were analyzed in the same electrophoresis run in order to avoid inter-gel variations. Briefly, frozen left ventricle samples were homogenized using a Polytron device (Ika Ultra TurraxTM T25 Basic, Wilmington, USA) in a lysis buffer containing 10 mM Tris, pH 7.4, 100 Mm NaCl, 1 mM EDTA, 1 Mm EGTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.5% deoxycholate, and phosphatase and protease inhibitors (Sigma-Aldrich). The homogenate was centrifuged at 4ºC for 20 minutes at 12,000 rpm. The supernatant was collected, and total protein content was determined by the Bradford Method. Samples (50 µg) were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in polyacrylamide gels (6% or 10% depending on molecular protein weight). After electrophoresis, proteins were electro-transferred to nitrocellulose membrane (BioRad Biosciences; NJ, USA). The blotted membrane was then blocked (5% nonfat dry milk, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.6, 150 mmol/L NaCl, and 0.1% Tween 20) for 2 hours at room temperature and incubated with specific antibodies overnight at 4ºC. Subsequently, the blotted membrane was incubated for 1.5 hours at room temperature with peroxidase-conjugated anti-rabbit or anti-mouse secondary antibody (1:10,000 dilution), and then incubated with enhanced chemiluminescence (Amersham Biosciences, NJ, USA) and detected by autoradiography. Quantification analysis of the blots was performed using Scion Image software (Scion, based on NIH Image). Mouse monoclonal antibodies to collagen type I (1:10,000), TIMP-2 (1:1,000), and leptin (1:1,000) and rabbit monoclonal antibodies to TIMP-1 (1:1,000) and β-actin (1:1,000) were obtained from Abcam (Cambridge, USA) and Cell Signaling (Danvers, USA), respectively. Targeted bands were normalized to the expression of cardiac β-actin.

 Myocardial metalloproteinase-2 activity

Myocardial MMP-2 activity was determined as reported by Tyagi et al.26 . Six samples were used in each group to ensure that all samples were analyzed in the same electrophoresis run in order to avoid inter-gel variations. In brief, left ventricular tissues were homogenized in a buffer containing the following: Tris 50 mM, pH 7.4, NaCl 0.2 M, Triton-X 0.1% and CaCl2 10 mM. The homogenate was centrifuged at 4ºC for 20 minutes at 12,000 rpm. The supernatant was collected, and total protein content was determined by the Bradford Method (Bradford 1976). Samples were diluted in application sample buffer consisting of 0.5 M Tris, pH 6.8, 100% glycerol, and 0.05% bromophenol blue. The samples were loaded into the wells of 8% SDS-polyacrylamide containing 1% gelatin. Electrophoresis was carried out in a Bio-Rad apparatus at 80 V for 2 hours. The gel was removed and washed two times with 2.5% Triton-X-100 and then washed with 50 mM Tris pH 8.4. The gel was then incubated at 37°C overnight in an activation solution consisting of 50 mM Tris, pH 8.4, 5 mM CaCl2 and ZnCl2. Staining was performed for 2 hours with 0.5% Coomassie blue, and destaining was performed in 30% methanol and 10% acetic acid until clear bands were observed over a dark background. The gels were photographed, and the intensity of gelatinolytic action (clear bands) was analyzed in UVP, UV, and a White Darkhon image analyzer.

 Statistical analysis

Prior to statistical analysis, all data were tested for normality using the Shapiro-Wilk test. Results were expressed as mean ± standard deviation and submitted to Student’s t-test for independent samples. Pearson correlation was used to evaluate the association between the variables collagen I, MMP-2, TIMP, and leptin. All statistical analyses were performed using SigmaStat for Windows (Version 3.5). The level of significance considered was 5 % (α = 0.05).

 Results Animal general characteristics

The general animal characteristics are displayed in Table 1 . Final body weight; deposits of epididymal, retroperitoneal, and visceral fat; total BF; and AI were significantly higher in the obese group than in the control group. During the experimental period, animals in the obese group ate less food and calories than those in the control group; however, the feed efficiency was higher in obese animals.

– Animal general characteristics
Variables Groups
Control (n = 20) Obese (n = 21) p value
IBW (g) 151 ± 11 151 ± 11 0.290
FBW (g) 480 ± 51 534 ± 58 0.009
Epididymal fat (g) 9.3 ± 2.3 14.2 ± 3.4 < 0.001
Epididymal fat/100gFBW 1.9 ± 0.5 2.7 ± 0.6 < 0.001
Retroperitoneal fat (g) 10.5 ± 3.3 21.7 ± 5.9 < 0.001
Retroperitoneal fat/100gFBW 2.2 ± 0.7 4.1 ± 1.1 < 0.001
Visceral fat (g) 6.3 ± 1.4 11.2 ± 4.2 < 0.001
Visceral fat/100gFBW 1.3 ± 0.3 2.1 ± 0.8 < 0.001
BF (g) 26.1 ± 6.2 47.2 ± 12.3 < 0.001
Adiposity index 5.6 ± 0.9 8.8 ± 1.6 < 0.001
Food consumption (g/day) 22.8 ± 2.1 17.0 ± 2.3 < 0.001
Caloric intake (kcal) 67.4 ± 6.3 62.1 ± 8.2 0.03
Feeding efficiency (%) 2.1 ± 0.2 2.7 ± 0.2 < 0.001

Metabolic and endocrine profiles

The metabolic and endocrine profiles are summarized in Figure 1 . Long-term obesity induced by high fat led to significant metabolic and hormonal changes. There was a significant increase in the glucose AUC, as well as in insulin and leptin levels in the obese group, compared to control. The obese animals presented increased AUC, serum insulin, and HOMA-IR. The serum measurements of glucose, triacylglycerol, total cholesterol, HDL, and LDL were similar between groups.

– <italic>Metabolic and hormonal profile. (A) Fasting glucose, (B) Area under curve (AUC) of intraperitoneal glucose tolerance test, (C) insulin, (D) homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR), (E) triacylglycerol, (F) total cholesterol, (G) high-density lipoprotein (HDL), (H) low-density lipoprotein (LDL) and (I) leptin in control and obese rats. (n= 15 – 21 per group). Data are presented as mean ± SD; Student’s t-test. *: p < 0.05.</italic>

Systolic blood pressure and cardiac morphological profile

Table 2 shows that SBP was higher in the obese animals, and there were no significant differences between the groups for any of the studied parameters concerning morphological profile, except for the right ventricle, suggesting that obesity did not trigger left ventricular hypertrophy.

<italic>Values are means ± SD. IBW: initial body weight; FBW: final body weight; BF: body fat. Student’s t-test.</italic>

– Systolic blood pressure and cardiac morphological profile

Variables Groups
Control (n = 20) Obese (n = 21) p value
SBP 127 ± 11.0 134 ± 12.0 0.04
Heart (g) 1.10 ± 0.10 1.17 ± 0.13 0.06
ATW (g) 0.093 ± 0.018 0.094 ± 0.021 0.80
LVW (g) 0.81 ± 0.09 0.82 ± 0.10 0.62
RVW (g) 0.22 ± 0.03 0.24 ± 0.03 0.04
ATW/FBW.10-3 0.20 ± 0.03 0.18 ± 0.03 0.14
LVW/FBW.10-3 1.72 ± 0.11 1.71 ± 0.12 0.44
RVW/FBW.10-3 0.48 ± 0.09 0.47 ± 0.05 0.64

Values are means ± SD. SBP: systolic blood pressure; LVW: left ventricle weight; RVW: right ventricle weight; ATW: atrial weight; FBW: final body weight; ATW/FBW; LVW/FBW; RVW/FBW ratio; 10-3= 0.001. Student’s t-test.

Myocardial protein levels of collagen type I, TIMP-1, TIMP-2, and leptin

Figure 2 reveals that obesity promoted a reduction in protein levels of collagen type I, TIMP-1 and TIMP-2; however, there was an increase in leptin protein levels in the obese group compared to the control group.

– <italic>Representative western blots and quantification of myocardial collagen type I, TIMP-1, TIMP-2, and leptin from control and obese rats (n = 6 per group). Western blot bands were normalized to β-actin. Data are presented as mean ± SD. Student’s t-test. *: p < 0.05.</italic>

Myocardial MMP-2 activity

Figure 3 shows the identification of two weak bands of degradation corresponding to MMP-2 in electrophoresis gel: inactive MMP-2 (pro-MMP-2) with a molecular weight of approximately 72 kDa and active MMP-2 with a molecular weight of approximately 64 kDa. Between the two bands mentioned, it was possible to identify the strong band of MMP-2 intermediate degradation. There was a significant increase in MMP-2 in the obese animals.

– <italic>Relation between active (active and intermediate active) and inactive MMP-2 in control and obese rats (n = 6 per group). Inactive MMP-2 = 72 kDa and active MMP-2 = 64 kDa. Data expressed as mean ± standard deviation. Student’s t test. *: p < 0.05.</italic>

Linear association between cardiac variables

Table 3 reveals that there was a significant correlation between the decrease in collagen type I and increased MMP-2 activity, as well as between the elevation of MMP-2 activity and leptin. Moreover, a correlation was observed between the increase in MMP-2 and the decrease in TIMP-1 and -2, as well as between decreased TIMP-1 and increased leptin protein levels. There was no significant correlation between decreased TIMP-2 and increased leptin.

– Linear association between cardiac variables
Association Coefficient of correlation p value
Collagen I × MMP-2 −0.723 0.008
MMP-2 × Leptin 0.766 0.004
MMP-2 × TIMP-1 −0.815 0.001
MMP-2 × TIMP-2 −0.597 0.040
TIMP-1 × Leptin −0.656 0.020
TIMP-2 × Leptin −0.273 0.390

MMP: metalloproteinase; TIMP: tissue inhibitor of metalloproteinases. Pearson’s correlation test. Control, n = 6 and obese, n = 6.

Discussion

This study aimed to investigate whether a reduction in collagen type I is associated with increased MMP-2 activity and elevated levels of leptin in the myocardium of obese rats. The main results confirmed this hypothesis.

The continuous feeding of a high-fat diet was effective to promote obesity in 34 weeks, given that the rats showed higher levels of body and fat weight and AI compared to rats fed a standard diet; these data are in agreement with other studies.27 , 28

The major causes of obesity are a more abundant supply of food, higher intake of energy-dense, palatable food, and reduction in energy expenditure. The high-fat diet used in the current study was rich in mono- and polyunsaturated fatty acids with an energy content of 3.65 kcal/g, while the standard diet fed to the control group consisted of 2.95 kcal/g, generating a difference of 24% in caloric content. Authors have shown that consumption of a high-fat diet promotes less satiety and thus increased food intake.29

These data differ from our results since the obese animals ate a lower amount of food and calories compared to control. However, feed efficiency was higher in obese rats, likely due to the thermic effect of food. Dietary fat requires less energy (2% – 3%) to be metabolized, and the excessive fat is thus easily deposited in the form of triglycerides in adipocytes, resulting in obesity.30

Several studies have reported some comorbidities related to experimental obesity,29 , 31 , 32 such as glucose intolerance, insulin resistance, dyslipidemia, hyperinsulinemia, hyperleptinemia, and arterial hypertension. In the present study, the obese animals exhibited higher AUC in the oral glucose tolerance test and higher serum insulin levels than controls, indicating that obesity promoted glucose intolerance and hyperinsulinemia. Glucose intolerance, associated with increased serum insulin, indicated that obese rats presented resistance to the action of insulin. These results are further supported by the increased HOMA-IR in obese rats. All these findings are in accordance with previous reports that used rats fed a high unsaturated fat diet.13 , 27 , 28 , 33 Different studies have shown that high-fat diet-induced obesity leads to dyslipidemia,19 , 34 , 35 whether due to changes in triacylglycerol, LDL, or HDL, in agreement with our study, which observed decreased serum HDL levels. Leptin is a hormone produced by adipose tissue, which participates in energy balance, by regulating food intake and the oxidation of lipids,36 and in the biology of collagens.5 , 14 - 16

Concerning the effects of obesity on the cardiovascular system, obesity did not promote left ventricular cardiac remodeling. However, SBP increased in obese animals. As SBP control involves the neurohumoral system, such as the sympathetic nervous system and the renin-angiotensin-aldosterone system, which are increased in obesity,37 it may be inferred that the neurohumoral system is activated in obese animals. This finding is consistent with some previous researchers who investigated SBP in obese animals fed a high-fat diet38 and in disagreement with others.27

The main objective of this study was to investigate whether increased MMP-2 activity by leptin is responsible for the reduction in myocardial collagen type I in obese rats. The results of this investigation indicated that there was a reduction of protein levels of collagen type I accompanied by an increase in MMP-2 activity and leptin protein levels and a decrease in TIMP-1 and TIMP-2 protein levels in the heart. As previously stated, few studies have evaluated the behavior of collagen type I in the myocardium of animals with obesity induced by a high-fat diet; while Carroll12 and Martínez-Martínez39 found an increase, Silva et al.13 found a decrease in myocardial type I collagen.

The changes in myocardial collagen may result from an elevation of the synthesis or decreased degradation. The data from this study showed that the degradation of collagen type I may have prevailed in obese rats, as there was a significant association between reduced collagen type I and increased MMP-2 activity. Although some studies show that the increase in MMP-2 activity enhances collagen synthesis,40 most information in the literature indicates the opposite behavior, i.e., the increase in MMP-2 activity promotes the degradation of collagen type I.5 , 39 , 41 Although Martínez-Martínez et al.39 and Zibadi et al.14 have found that leptin reduced the MMP-2 activity in vitro , other studies have shown that leptin increases MMP-2 activity,5 , 15 , 16 and our results further support this latest finding. Thus, the elevation of MMP-2 may have been consequent to increased cardiac leptin, because there was a close association between these two variables, although these findings do not necessarily reflect a cause-and-effect relationship. Nevertheless, several studies have reported a direct relation between leptin and MMP-2 activity in cardiomyocytes.5 , 15 , 16

Despite the fact that increased MMP activity is associated with elevated cardiac leptin, another modifying factor of this enzyme is the behavior of TIMP. The results of the present study showed a decrease in TIMP-1 and TIMP-2 protein levels in obese animals, which may have influenced the increase of MMP-2, given that there was a significant association between MMP-2 and TIMP-1 and TIMP-2. The reduced TIMP-1 may be related to the increase in leptin, as there was a significant association between these variables. This finding is consistent with Schram et al., who found a substantial reduction in TIMP-1 mRNA expression after the elevation of leptin concentrations in cultured cardiac cells.15 To our knowledge, this is the first study that evaluated the association between collagen type I, leptin, MMP-2, and TIMP-1 and TIMP-2 in the myocardium of obese animals fed an unsaturated high-fat diet. However, further analyses are required to confirm the cause-and-effect relationship.

 Conclusion

The findings confirmed the hypothesis that the reduction in collagen type I is associated with increased MMP-2 activity, which is in turn linked to an elevation of leptin in the myocardium of obese rats. This study allowed for evaluation of mediators involved in cardiac remodeling, which can trigger impaired heart function in obesity. The identification of these deleterious factors may enable possible therapeutic targets.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Danielle Cristina Tomaz da Silva-Bertani, from Faculdade de Medicina de Botucatu (UNESP).

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Faculdade de Medicina de Botucatu under the protocol number 861-2011. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013.

Sources of Funding

This study was funded by FAPESP (2010/14208-4 and 2011/12165-9).