Arq Bras CardiolabcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC6rxxksctBMxx4R9MQ6g7JjqS0066-782X202000020023410.36660/abc.20180198Original ArticleQuantification of DNA Damage in Different Tissues in Rats with Heart Failure0000-0001-5492-4530StefaniGiuseppe Potrick1NunesRamiro Barcos1RossatoDouglas Dalcin2HentschkeVitor Scotta1DomenicoMarlise Di10000-0001-9907-7689LagoPedro Dal1RhodenCláudia Ramos1Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto AlegrePorto AlegreRSBrazilUniversidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, Porto Alegre, RS - BrazilCentro Universitário FranciscanoSanta MariaRSBrazilCentro Universitário Franciscano, Santa Maria, RS - BrazilMailing Address: Giuseppe Potrick Stefani, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre - Sarmento Leite street, 245. Postal Code 90050-170, Porto Alegre, RS - Brazil. E-mail: gpotrick@gmail.com
Author contributions
Conception and design of the research, Acquisition of data, Analysis and interpretation of the data, Writing of the manuscript and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Stefani GP, Nunes RB, Rossato DD, Hentschke VS, Di Domenico M, Dal Lago P, Rhoden CR; Statistical analysis: Stefani GP, Nunes RB, Rossato DD, Hentschke VS, Dal Lago P.
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
200320200220201142234242030920180604201915052019This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly citedAbstractBackground:
Chronic heart failure (CHF) is a complex syndrome which comprises structural and functional alterations in the heart in maintaining the adequate blood demand to all tissues. Few investigations sought to evaluate oxidative DNA damage in CHF.
Objective:
To quantify the DNA damage using the comet assay in left ventricle (LV), lungs, diaphragm, gastrocnemius and soleus in rats with CHF.
Methods:
Twelve male Wistar rats (300 to 330 g) were selected for the study: Sham (n = 6) and CHF (n = 6). The animals underwent myocardial infarction by the ligation of the left coronary artery. After six weeks, the animals were euthanized. It was performed a cell suspension of the tissues. The comet assay was performed to evaluate single and double strand breaks in DNA. Significance level (p) considered < 0.05.
Results:
The CHF group showed higher values of left ventricle end-diastolic pressure (LVEDP), pulmonary congestion, cardiac hypertrophy and lower values of maximal positive and negative derivatives of LV pressure, LV systolic pressure (p < 0.05). CHF group showed higher DNA damage (% tail DNA, tail moment and Olive tail moment) compared to Sham (p < 0.001). The tissue with the highest damage was the soleus, compared to LV and gastrocnemius in CHF group (p < 0.05).
Conclusion:
Our results indicates that the CHF affects all tissues, both centrally and peripherically, being more affected in skeletal muscle (soleus) and is positively correlated with LV dysfunction.
Heart failure is a complex syndrome which characterizes structural and functional abnormalities in the heart in maintaining adequate blood demand. Chronic heart failure (CHF) affects approximately 1 to 2% of the population in developed countries and its prevalence increases at least 10% in senior adults.1 One of the most common causes to heart failure is myocardial infarction (MI), which induces pathologic cardiac remodeling.2
This syndrome does not affect only the heart, it also affects other organs, such as lungs and skeletal muscles.3 CHF is characterized by changes in ventilatory mechanics which impair the uptake and supply of oxygen to the systems. Hypoperfusion, which is sustained with a ventricular dysfunction in a vicious cycle, induces oxidative stress in the majority of tissues.4 Oxidative stress is a state in which the cell is in an oxidative imbalance, forming more reactive species than its neutralizing capacity.5 It has been proposed elsewhere that oxidative stress biomarkers, such as concentration of malondialdehyde and uric acid, could enlighten the extent of oxidative damage and guide treatment in patients with CHF.6
Since reactive oxygen species (ROS) can damage different biomolecules, such as lipids, proteins and DNA, the damage in nucleic acids has not been consistently investigated in CHF. A biomarker that has already been a target of investigation is the concentration of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG).7 However, its measurement mirrors the oxidative damage in one type of DNA lesion, which does not reflect the total damage in the DNA helix. For that, toxicological assays, such as the comet assay, have never been tested in CHF, aiming to assess global DNA damage in different tissues. This technique is broadly used in toxicological studies and is considered to be consistent, sensitive and highly reproductive.8
The comet assay directly measures the extent of DNA damage, constituted by single and double DNA strand breaks.9 This method allows its measurement in blood and all tissues of interest, expanding the analysis of local damage, and its correlation with physiological and functional parameters.10 In heart failure, it is still not clear how the inability of the failing heart can affect different structures beyond the cardiovascular system, especially on DNA damage. Since in CHF there is a scenario of systemic oxidative damage as a function of the chronicity of the syndrome, the objective of this study was to evaluate DNA damage in different tissues, such as left ventricle, lungs and skeletal muscles (diaphragm, gastrocnemius and soleus) in rats affected by the condition.
MethodsAnimals
There was a selection of 12 male Wistar rats (100 days old, from 300 to 330 g) from the Animal Breeding Unit of Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA, Brazil). The animals were housed in groups of three animals per cage, which received food and water ad libitum in an specific room maintained at 22°C under a 12:12-hour light-dark cycle.
The handling of the animals obeyed Law No. 11.794 of 10/08/2008, Law No. 6.899 of 07/15/2009, and Resolution Nº. 879 of 02/15/2008 (CFMV), as well as other provisions applicable to the use of animals for research. The experiment complied with resolutions of the National Council on Animal Experimentation, the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Washington, D.C., 1996), as well as of the Ethical Principles in Animal Experimentation of the National Animal Experimentation Control Council (CONCEA). This study was approved by CEUA/UFCSPA, under protocol number 114/13.
Induction of Myocardial Infarction (MI)
The animals were anesthetized with xylazine (12 mg/kg ip) and ketamine (90 mg/kg ip), intubated and artificially ventilated. The ligation of the left coronary artery was performed. Sham operations were performed as described elsewhere.11 After the surgeries, the animals received one injection of cetoprophane (5.4 mg/kg ip) every 6 hours - completing 48 hours - and penicillin (70,000 units/ml ip). The surgeries were performed by one surgeon. Post-surgery mortality rate was 15%. After MI induction, 6 weeks of recovery were designated, which was necessary for the animals to develop CHF. In order to document the animals that developed heart failure, we used different variables to characterize this syndrome, such as the presence of left atrial trombi, thoracic effusions, pulmonary congestion, left and right ventricular hypertrophy to body weight.12
Heart Failure Condition
Those animals that presented left ventricular-end diastolic pressure (LVEDP) higher than 15.0 mmHg, as well as increased right ventricle weight to body weight ratio (> 0.8 mg/g) and the presence of pulmonary congestion were considered positive to CHF.12-14
Hemodynamic Evaluation
After the sixth week, the animals were anesthetized with xylazine (12 mg/kg i.p.) and ketamine (90 mg/kg i.p.). A polyethylene catheter (PE-50) was placed into the right carotid artery. Arterial pressure was recorded and the catheter was positioned into the left ventricle to perform ventricular pressure recording. Data were registered by a pressure transducer (strain-gauge, Narco Biosystem Miniature Pulse Transducer RP-155, Houston, Texas, USA), coupled to a pressure amplifier. Pressure analogical signals were digitalized by a data acquisiton system (CODAS-Data Acquisition System, Akron, Ohio, USA) with a sampling rate of 2,000 Hz. These data were used to determine diastolic blood pressure (DBP), systolic blood pressure (SBP), mean blood pressure (MBP), heart rate (HR), left ventricular systolic pressure (LVSP), LVEDP and left ventricular maximum positive and negative dP/dt (+dP/dtmax, -dP/dtmax), as previously described.15 Animals that presented LVEDP higher than 15 mmHg in hemodynamic evaluation were considered with left ventricular dysfunction.13
Tissue Collection
The animals were euthanized through intravenous infusion overdose of the anesthetic pentobarbital (80 mg/kg i.p.).16 After that, the lungs, the diaphragm, the right gastrocnemius, the right soleus and the heart were removed. The left ventricle was separated from the right one for the comet assay. All samples were stored at -80°C for posterior analysis.
Determination of Infarct Size, Cardiac Hypertrophy and Pulmonary and Hepatic Congestion
The hearts were removed and weighted, without blood within the chamber and without atria. The size of the infarct area was determined by planimetry.17 To evaluate cardiac hypertrophy, organ mass was expressed as a proportion of body mass (tissue mass/body mass - mg/g).18 Animals with right ventricle hypertrophy (i.e. right ventricle mass-to-body weight ratio > 0.80 mg/g) were considered as rats that developed heart failure.12 To determine pulmonary and hepatic congestion, the lungs and liver of each animal were removed, weighted and dehydrated (80°C) for 48 hours, and then weighted again to evaluate water percentage.
Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE)
Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) was performed in alkaline conditions (pH > 13.0).19 All procedures were performed avoiding any direct incidence of light. For the assay, a cell suspension of the tissue (left ventricle, lungs, diaphragm, right gastrocnemius and right soleus) was primarily carried out in PBS buffer (pH = 7.40) with standard and gentle manual homogenization. This step required the observation of the density of cells that would be used in each slide. Neubauer’s chamber was used to count approximately 7.3 x 105 cells/slide.
The suspension of cells (40 µl) was added to agarose of low melting point (90 µl). After gently mixed, this material was carefully superimposed over a slide previously covered with a thin agarose gel layer with a coverslip, and kept in a humid chamber at 4°C for 10 minutes, in order to further secure the suspension of tissue cells in the gel. Then, the coverslip was carefully removed and the slide was conditioned in a vertical cuvette containing lysis solution for at least 1 hour at 4°C.
The following step consisted in the unfolding of the cells, for 30 minutes in an alkaline buffer (pH > 10.0). Thereafter, it was followed by the process of electrophoresis, where lysed cells contained in the agarose gel were subjected to a voltage of 25 mV and 300 mA for 15 minutes in alkaline buffer solution (pH > 10.0). Then the plate was neutralized, stained with silver nitrate, rinsed and kept at room temperature to dry for later analysis. The slides of each animal were made in duplicate and a positive control of DNA damage with hydrogen peroxide (30 µl/slide). The analysis was conducted under an optical microscope with a 20x increase by quantifying the size of the comet’s tail in 50 to 100 cells, according to the lengths, diameters, radii and dimensions of individual comets. Percentages of tail DNA, tail moment and Olive tail moment were used as damage quantification parameters.
Quantification of DNA Damage
All the parameters presented in the results session regarding SCGE were calculated by the software CASP (CASP Labs®, Poland).20 The percentage of DNA in the tail, tail moment and Olive tail moment formulas are available for consultation in the supplementary data. Tail moment is characterized as the product of tail length and the percentage of DNA in the tail. The Olive tail moment, which is another parameter for DNA damage, comprises the product of the distance (relative to the x-axis) between the center of gravity of the head with the center of gravity of the tail of the comet and the percentage of tail DNA.
Sample Size and Statistical Analysis
For a minimum difference of 23 arbitrary units of tail moment of ± 4 SD, it was possible to determine minimum statistical difference of two groups with three animals each.21 In our investigation, we decided to use six animals in each group. Data are presented in mean ± SD. The normality test of Shapiro-Wilk was used to assess variables distribution. For comparisons between groups, an unpaired Student’s t test and a two-way analysis of variance were performed among different tissues with a Tukey’s post hoc test. A significance of 5%was considered. Statistical analysis was carried out by using SigmaPlot, version 12.0 for Windows, and graphics were created by GraphPad Prism, version 5.0 for Windows.
ResultsMorphological Parameters
The animals showed no difference regarding neither initial nor final body mass. Animals submitted to MI showed mean infarction area of 36%. It was possible to observe higher ratio of myocardial mass, right ventricle and left ventricle-to-body mass compared to sham group, indicating cardiac remodeling in both ventricles. Regarding the congestion in the lungs and liver, higher rates of the former were only observed in the CHF group (Table 1).
Body mass, morphometric cardiac characteristics, infarcted area and pulmonary and hepatic congestion of sham-operated rats and rats with left ventricular dysfunction
Variables
Sham
CHF
Initial Body Mass (g)
330.25 ± 17.24
328.29 ± 18.12
Final Body Mass (g)
400.50 ± 29.61
356.38 ± 32.23
Infarcted Area (%)
---
36.39 ± 8.11
MM/BM (mg/g)
2.56 ± 0.08
3.29 ± 0.46*
LV/BM (mg/g)
1.88 ± 0.21
2.36 ± 0.47*
RV/BM (mg/g)
0.58 ± 0.12
1.40 ± 1.01*
Pulmonary Congestion (%)
65.67 ± 9.34
87.31 ± 3.36*
Hepatic Congestion (%)
70.46 ± 1.05
71.43 ± 1.07
Values are presented in mean ± SD; n = 6 for all groups. Sham, sham-operated rats; CHF: Chronic heart failure rats; MM/BM: Myocardial mass-to-body mass ratio; LV/BM: left ventricle mass-to-body mass ratio; RV/BM: right ventricle mass-to-body mass ratio.
p < 0.05 compared to the Sham group.
Hemodynamic Parameters
When compared to the sham group, lower mean blood pressure was observed in the CHF group. SBP and DBP, as well as HR showed no difference in relation to the control group (Table 2). Regarding ventricular pressure variables, LVSP and higher LVEDP was observed in the CHF group, when compared to the sham one (Table 2).
Mean, diastolic and systolic blood pressure, left ventricle end diastolic pressure, left ventricle systolic pressure and left ventricular maximum/minimum change over time of sham-operated rats and rats with left ventricular dysfunction
Variables
Sham
CHF
MBP (mmHg)
93.01 ± 14.70
76.78 ± 5.83*
DBP (mmHg)
73.54 ± 16.28
67.54 ± 7.15
SBP (mmHg)
99.75 ± 20.91
85.93 ± 5.51
Heart Rate (bpm)
253.56 ± 70.84
245.19 ± 57.69
LVEDP (mmHg)
5.40 ± 2.26
32.55 ± 5.32*
LVSP (mmHg)
104.24 ± 6.03
89.15 ± 3.15*
+ dP/dtmax (mmHg/s)
6,264.33 ± 1,566.47
4,281.63 ± 708.75*
- dP/dtmax (mmHg/s)
5,209.63 ± 1,274.09
2,823.80 ± 540.65*
Values are presented in mean ± SD; n = 6 for all groups. Sham, sham-operated rats; CHF: Chronic heart failure rats; MBP: Mean blood pressure; DBP: diastolic blood pressure; SBP: systolic blood pressure; LVEDP: left ventricular end-diastolic pressure; LVSP: left ventricular systolic pressure; +dP/dtmax: Maximal positive derivative of ventricular pressure; -dP/dtmax: maximal negative derivative of ventricular pressure.
p < 0.05 compared to the Sham group.
The maximal positive derivative of ventricular pressure (+dP/dtmax) showed alterations in the CHF group, presenting lower values, as well as maximal negative derivative of ventricular pressure (-dP/dtmax), which showed lower values when compared to the control group (Table 2).
DNA Damage Parameters
Higher values of DNA damage were observed in all variables (% tail DNA, tail moment and Olive tail moment) in the CHF group, in all analyzed tissues (Table 3). DNA damage can be observed in the formation and frequency of comets in left ventricle, pulmonary, diaphragmatic, gastrocnemius and soleus cells (Figure 1).
DNA quantification in different tissues of sham-operated animals and rats with chronic heart failure
Sham
CHF
% Tail DNA
Tail Moment
Olive Tail Moment
% Tail DNA
Tail Moment
Olive Tail Moment
Left Ventricle
7.65 ± 3.35
0.77 ± 0.44
1.37 ± 0.59
33.29 ± 7.70*
10.51 ± 3.31*
7.04 ± 1.71*
Lungs
17.86 ± 3.93
6.76 ± 2.59
7.31 ± 2.15
36.20 ± 5.17*
23.30 ± 7.25*
19.10 ± 4.65*
Diaphragm
6.86 ± 2.63
1.40 ± 0.93
1.82 ± 0.79
41.23 ± 13.86*
14.06 ± 6.51*
9.82 ± 3.03*
Gastrocnemius
7.63 ± 4.66
1.04 ± 0.88
1.43 ± 0.70
28.07 ± 15.53*
8.69 ± 5.14*
6.17 ± 3.53*
Soleus
11.54 ± 2.46
1.53 ± 0.96
1.84 ± 0.76
55.79 ± 11.53*
20.90 ± 5.32*
12.83 ± 3.68*
Values are presented in mean ± SD; n = 6 for all groups. Sham, sham-operated rats; CHF: Chronic heart failure rats.
= p < 0.01 versus Sham in relation to the variable and its corresponding tissue.
Image of cells submitted to SCGE (comet assay) of left ventricle, lungs, diaphragm, gastrocnemius and soleus of Sham-operated and rats with CHF. Panel A: Isolated cells of the respective tissue of Sham-operated rat. Panel B: Isolated cells of the respective tissue of rat with MI-induced CHF. Slides stained with silver nitrate. The image shows no formation of comets in Panel A, but in Panel B the image shows the formation of comets with distinct tails. The length of the tail represents the single strand and double strand breaks of nuclear DNA (magnification of 20x, scale bar of 20 μm).
Despite DNA damage being remarkably higher in CHF rats in all tissues when compared to other tissues in the same pathologic condition, it was observed higher damage in soleus compared to gastrocnemius and left ventricle in CHF group. The difference between tissue DNA damage in sham-operated animals and CHF ones can be observed in Figure 2.
DNA damage in different tissues, according to % tail DNA, induced by CHF. Quantification of DNA damage in isolated cells of left ventricle, lungs, diaphragm, gastrocnemius and soleus muscles in Sham-operated rats and rats with CHF. Sham (n = 6), CHF (n = 6). Two-way ANOVA, with post-hoc test of Tukey. * p < 0.05 vs. Soleus.
Discussion
Although there are some investigations using the comet assay in CHF, to the best of our knowledge, this is the first study to report the total extent of DNA damage in different tissues in an experimental model of CHF. The major finding of this investigation is the reproducibility and applicability of SCGE in the MI experimental model. Animals with CHF demonstrated higher extent of DNA damage than the control group in heart, lungs, diaphragm and skeletal muscles. This finding supports the main hypothesis that CHF affects the stability of DNA not locally, but systemically.
Since CHF is a complex syndrome, it is essential to investigate the extent of damage that the hypoperfusion may promote. We showed an in vivo model of CHF whose damage was ranging from two- to six-fold higher than in the absence of heart failure. The animals of this study demonstrated traditional alterations observable in the ligation of the left coronary artery model of heart failure in rats.22,23 Mean LVEDP above 30 mmHg was observed, which characterizes ventricular dysfunction.14 Also, traditional hemodynamic alterations were observed in animals with CHF, such as lower LVSP, and maximum positive and negative derivatives of ventricular pressure. Morphological parameters also showed meaningful alterations in left and right ventricle hypertrophy, as well as pulmonary congestion. All these parameters (hemodynamic and morphological) characterize the presence of CHF.12,24,25
The SCGE method performed in alkaline conditions allows the evaluation of global DNA damage. The damage observed in the comets is formed by single and double strand breaks that are unattached from the chromatin, in DNA fragments.10 The evaluation of 8-OHdG in patients with CHF has been recently proposed. The 8-OHdG is an oxidized purine base, one of the most frequent oxidative products of DNA.26 Most of the lesions in DNA may be manifested in single and double strand breaks, not only in oxidative by-products. Reactive oxygen species may damage DNA and form oxidative bases, such as 8-OHdG, 5-hydroxyuracil, 2-hydroxyadenine and 4,6-diamino-5-formamidopyridine.
Some caveats should be made before comparing results measured by nuclear DNA damage, as in our study, to results obtained in concentrations of oxidized purine base. The DNA damage measured by the comet assay reflects the overall damage, other than the 8-OHdG measurement that cannot assert the same.27
A recent meta-analysis demonstrated that eight studies evaluated the oxidative DNA damage to the specific DNA lesion of 8-OHdG. All investigations demonstrated higher concentrations of 8-OHdG in CHF patients.28 The rationale for higher concentrations of DNA oxidative products indicates that the higher extent of genotoxic damage is highly contributed to the oxidation of mitochondrial DNA.29 Cardiac myocytes present the highest content of mitochondria, which could indicate higher formation of ROS and contribute significantly to mitochondrial dysfunction. This study did not quantify the concentration of 8-OHdG, however we considered DNA damage that is widely used in order to evaluate DNA strand breaks. The study by Jaenisch et al.,30 also developed by our laboratory, used the same method of assessing DNA damage (alkaline version of the comet assay) in animals with CHF submitted to respiratory muscle training. Regarding the extent of DNA damage of Sham rats compared to rats with CHF, the percentage of DNA in the comet tail was relatively similar to the results obtained in the investigation on diaphragm cells.30
One interesting finding of this study was higher DNA damage in soleus cells than in left ventricle ones, which supports the fact that, after MI, the ventricle functionally and morphologically adapts and the peripheral muscle suffers histological and biochemical alterations.31,32 The acute phase of MI is characterized by the necrosis of cardiac myocytes, which expands the area of necrosis of the left ventricle in the following hours, affecting adjacent structures.33 In this phase of MI, the extent of DNA damage is probably higher than in any other tissue, as can be observed in pro-inflammatory cytokines and autophagic mediators.34,35
Since cardiomyocytes have a renewal rate of approximately 1% in young people, and about 0.45% in elderly,36 this fact reinforce our findings regarding the difference of DNA damage among the tissues of CHF rats. The left ventricle shows high adaptability to modify its geometry, and ability to repair major oxidative products of DNA. It has been demonstrated that the main problem of CHF is not the central alterations in the heart, but it also affects, indirectly, all other organs.37 The complexity of the CHF scenario, such as cardiac remodeling, changes in ventilatory mechanics and hemodynamics, and systemic pro-inflammatory state leads to the formation of free radicals of different ways. This critical dysfunctional status establishes an oxidative stress condition in different organs and systems.38,39
We hypothesized that skeletal muscle cells would have higher DNA damage in CHF.40,41 For this reason, we chose to analyze two different skeletal muscles (soleus and gastrocnemius muscles) by their different fiber type proportions in rats with CHF. The skeletal muscle in CHF is highly affected by the hypoperfusion which augments the oxidative damage within, especially in the mitochondria.42 Since the skeletal muscle is target of oxidative damage, it was expected to have higher damage observed in our findings. In CHF, the antioxidant defense system in skeletal muscles might be constantly decreased over time.43 The oxidative damage observed in the soleus muscle is very likely to be explained by its morphological characteristic (e.g. higher number of capillaries per fiber, predominance of type I fibers, greater activity of aerobic metabolism).44,45 On the other hand, the gastrocnemius muscle presents morphology of mixed characteristics with a more balanced percentage distribution in relation to the type of fibers; therefore, less dependence of aerobic metabolism. For this reason, we imagine that it presented less DNA damage than the soleus muscle.
Antioxidant machinery changes over time in the cell cycle (e.g.: myogenic proliferation and differentiation) demonstrating to have more expression of antioxidant enzymes activity in myoblasts than in myotubes, thus increasing the probability of mortality under oxidative stress.5 This phenomenon is interesting, since the disuse of skeletal muscles due to exercise intolerance is common in patients with CHF, in addition to being related to diminished antioxidant-stimulating trigger signaling of muscle contraction.46 Compared to the left ventricle, the soleus muscle does not have the same ability for adaptation, which may explain why the DNA damage was higher.
Limitations
This work shows few limitations, such as the absence of DNA damage evaluation in other tissues (liver, encephalic structures and other skeletal muscles). Another limitation that may enrich our findings is the measurement of mutagenesis. Evaluating the mutagenesis of the CHF, along with the SCGE, might lead to a more robust scenario of DNA damage and its lack of repair of DNA lesions. Our design aims to evaluate the longitudinal damage that the experimental model of CHF might lead to and its differences regarding tissues; thus, the ability of DNA to repair its lesions could not be carried out.
Conclusion
Our results show DNA damage using SCGE in the CHF experimental model by MI. The left ventricle dysfunction clearly affects the cardiac tissue, lungs, diaphragm, gastrocnemius and soleus and was associated with the extent of DNA damage, affecting the soleus muscle more than the left ventricle and the gastrocnemius. The comet assay was proven to be a reliable tool for quantifying DNA damage in different tissues of animals with CHF and the soleus muscle was shown to be more affected by the heart failure than the left ventricle and the gastrocnemius.
Sources of Funding
This study was funded by Capes, CNPq, UFCSPA.
Study Association
This article is part of the thesis of master submitted by Giuseppe Potrick Stefani, from Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre.
Ethics approval and consent to participate
This study was approved by the Ethics Committee of the CEUA/UFCSPA under the protocol number 114/13. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013.
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Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa, Obtenção de dados, Análise e interpretação dos dados, Redação do manuscrito e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Stefani GP, Nunes RB, Rossato DD, Hentschke VS, Di Domenico M, Dal Lago P, Rhoden CR; Análise estatística: Stefani GP, Nunes RB, Rossato DD, Hentschke VS, Dal Lago P, Rhoden CR.
Potencial conflito de interesses
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
ResumoFundamento:
A insuficiência cardíaca crônica (ICC) é uma síndrome complexa que compreende alterações estruturais e funcionais no coração, mantendo demanda sanguínea adequada a todos os tecidos. Poucas investigações procuraram avaliar o dano oxidativo ao DNA na ICC.
Objetivo:
Quantificar o dano ao DNA utilizando o ensaio cometa no ventrículo esquerdo (VE), pulmões, diafragma, gastrocnêmio e sóleo em ratos com ICC.
Métodos:
Doze ratos Wistar machos (300 a 330 g) foram selecionados para o estudo: placebo (n = 6) e ICC (n = 6). Os animais foram submetidos a infarto do miocárdio através de ligadura da artéria coronária esquerda. Após seis semanas, os animais foram sacrificados. Foi realizada uma suspensão celular dos tecidos. O ensaio cometa foi realizado para avaliar as quebras de fita simples e dupla no DNA. Nível de significância (p) < 0,05.
Resultados:
O grupo ICC apresentou maiores valores de pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE), congestão pulmonar, hipertrofia cardíaca e menores valores de derivados máximos positivos e negativos da pressão do VE, pressão sistólica do VE (p < 0,05). O grupo ICC apresentou maior dano ao DNA (% de DNA da cauda, momento da cauda e momento da cauda de Olive) em comparação ao placebo (p < 0,001). O tecido com maior dano foi o sóleo, comparado ao VE e ao gastrocnêmio no grupo ICC (p < 0,05).
Conclusão:
Nossos resultados indicam que a ICC afeta todos os tecidos, de maneira central e periférica, sendo mais afetada no músculo esquelético (sóleo) e está positivamente correlacionada com a disfunção do VE.
Palavras-chave:Insuficiência CardíacaRatosRatos EndogâmicosDistribuição TecidualDano ao DNAEnsaio CometaIntrodução
A insuficiência cardíaca é uma síndrome complexa que caracteriza anomalias estruturais e funcionais do coração na manutenção da demanda sanguínea adequada. A insuficiência cardíaca crônica (ICC) afeta aproximadamente 1 a 2% da população de países desenvolvidos e sua prevalência aumenta pelo menos 10% em adultos idosos.1 Uma das causas mais comuns de insuficiência cardíaca é o infarto do miocárdio (IM), que induz a remodelação cardíaca patológica.2
Essa síndrome não afeta apenas o coração, mas também outros órgãos, como pulmões e músculos esqueléticos.3 A ICC é caracterizada por alterações na mecânica ventilatória que prejudicam a captação e o suprimento de oxigênio aos sistemas. A hipoperfusão, que é sustentada por uma disfunção ventricular em um ciclo vicioso, induz estresse oxidativo na maioria dos tecidos.4 O estresse oxidativo é um estado em que a célula está em desequilíbrio oxidativo, formando espécies mais reativas que sua capacidade neutralizadora.5 Foi proposto em outro estudo que biomarcadores do estresse oxidativo, como a concentração de malondialdeído e ácido úrico, poderiam esclarecer a extensão do dano oxidativo e orientar o tratamento em pacientes com ICC.6
Como as espécies reativas de oxigênio (ERO) podem danificar diferentes biomoléculas, como lipídios, proteínas e DNA, os danos nos ácidos nucléicos não foram consistentemente investigados na ICC. Um biomarcador que já foi alvo de investigação é a concentração de 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OHdG).7 No entanto, sua medição reflete o dano oxidativo em um tipo de lesão de DNA, que não reflete o dano total na hélice do DNA. Para isso, ensaios toxicológicos, como o cometa, nunca foram testados na ICC, com o objetivo de avaliar o dano global ao DNA em diferentes tecidos. Essa técnica é amplamente utilizada em estudos toxicológicos e é considerada consistente, sensível e altamente reproduzível.8
O ensaio do cometa mede diretamente a extensão do dano ao DNA, constituído por quebras de fita simples e dupla do DNA.9 Esse método permite sua medida no sangue e em todos os tecidos de interesse, expandindo a análise de danos locais e sua correlação com parâmetros fisiológicos e funcionais.10 Na insuficiência cardíaca, ainda não está claro como a incapacidade da insuficiência cardíaca pode afetar diferentes estruturas além do sistema cardiovascular, principalmente no dano ao DNA. Como na ICC existe um cenário de dano oxidativo sistêmico em função da cronicidade da síndrome, o objetivo deste estudo foi avaliar o dano ao DNA em diferentes tecidos, como o ventrículo esquerdo, os pulmões e os músculos esqueléticos (diafragma, gastrocnêmio e sóleo) em ratos afetados pela doença.
MétodosAnimais
Foram selecionados 12 ratos machos Wistar (100 dias de idade, de 300 a 330 g) da Unidade de Melhoramento Animal da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA, Brasil). Os animais foram alojados em grupos de três animais por gaiola, que receberam comida e água ad libitum em uma sala específica mantida a 22°C sob um ciclo claro e escuro de 12:12 horas.
O manejo dos animais obedeceu à Lei nº 11.794, de 08/08/2008, Lei nº 6.899, de 15/07/2009, e à Resolução nº 879, de 15/02/2008 (CFMV), além de outras disposições aplicáveis ao uso de animais para pesquisa. O experimento cumpriu as resoluções do Conselho Nacional de Experimentação Animal, o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Instituto de Recursos Animais de Laboratório, Academia Nacional de Ciências, Washington, D.C., 1996), bem como dos Princípios Éticos em Experimentação Animal do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA). Este estudo foi aprovado por CEUA/UFCSPA, sob o número de protocolo 114/13.
Indução de Infarto do Miocárdio (IM)
Os animais foram anestesiados com xilazina (12 mg/kg ip) e cetamina (90 mg/kg ip), intubados e ventilados artificialmente. Foi realizada a ligadura da artéria coronária esquerda. As operações placebo foram realizadas conforme descrito em outro estudo.11 Após as cirurgias, os animais receberam uma injeção de cetoprofano (5,4 mg/kg ip) a cada 6 horas - completando 48 horas - e penicilina (70.000 unidades/ml ip). As cirurgias foram realizadas por um cirurgião. A taxa de mortalidade pós-operatória foi de 15%. Após a indução do IM, foram designadas 6 semanas de recuperação, necessárias para os animais desenvolverem ICC. Foram utilizadas diferentes variáveis para caracterizar e documentar a insuficiência cardíaca desenvolvida por esses animais, como presença de trombos atriais esquerdos, derrames torácicos, congestão pulmonar, hipertrofia ventricular esquerda e direita do peso corporal.12
Insuficiência Cardíaca
Os animais que apresentaram pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE) maior que 15,0 mmHg, aumento da razão peso ventricular direito/peso corporal (> 0,8 mg/g) e presença de congestão pulmonar foram considerados positivos para ICC.12-14
Avaliação Hemodinâmica
Após a sexta semana, os animais foram anestesiados com xilazina (12 mg/kg i.p.) e cetamina (90 mg/kg i.p.). Um cateter de polietileno (PE-50) foi colocado na artéria carótida direita. A pressão arterial foi registrada e o cateter foi posicionado no ventrículo esquerdo para realizar o registro da pressão ventricular. Os dados foram registrados por um transdutor de pressão (strain gauge, Narco Biosystem Miniature Pulse Transducer RP-155, Houston, Texas, EUA), acoplado a um amplificador de pressão. Os sinais analógicos de pressão foram digitalizados por um sistema de aquisição de dados (CODAS-Data Acquisition System, Akron, Ohio, EUA) com uma taxa de amostragem de 2.000 Hz. Esses dados foram utilizados para determinar a pressão arterial diastólica (PAD), a pressão arterial sistólica (PAS), a pressão arterial média (PAM), a frequência cardíaca (FC), a pressão sistólica do ventrículo esquerdo (PSVE), a PDFVE e a dP/dt máxima positiva e negativa do ventrículo esquerdo (+ dP/dtmax, -dP/dtmax), conforme descrito anteriormente. Os animais que apresentaram PDFVE superior a 15 mmHg na avaliação hemodinâmica foram considerados com disfunção ventricular esquerda.13
Coleta de Tecidos
Os animais foram sacrificados por overdose de infusão intravenosa do pentobarbital anestésico (80 mg/kg i.p.).16 Depois disso, foram removidos os pulmões, o diafragma, o gastrocnêmio direito, o sóleo direito e o coração. O ventrículo esquerdo foi separado do ventrículo direito para o ensaio cometa. Todas as amostras foram armazenadas a -80°C para análise posterior.
Determinação de tamanho do infarto, hipertrofia cardíaca e congestão pulmonar e hepática
Os corações foram removidos e pesados, sem sangue dentro da câmara e sem átrios. O tamanho da área de infarto foi determinado por planimetria.17 Para avaliar a hipertrofia cardíaca, a massa de órgãos foi expressa como uma proporção da massa corporal (massa de tecido/massa corporal - mg/g).18 Foram considerados ratos que desenvolveram insuficiência cardíaca os animais com hipertrofia ventricular direita (ou seja, relação massa corporal/peso do ventrículo direito > 0,80 mg/g).12 Para determinar a congestão pulmonar e hepática, os pulmões e o fígado de cada animal foram removidos, pesados e desidratados (80°C) por 48 horas e depois pesados novamente para avaliar a porcentagem de água.
Eletroforese em gel de célula única (SCGE)
A eletroforese em gel de célula única (SCGE) foi realizada em condições alcalinas (pH > 13,0).19 Todos os procedimentos foram realizados evitando qualquer incidência direta de luz. Para o ensaio, uma suspensão celular do tecido (ventrículo esquerdo, pulmões, diafragma, gastrocnêmio direito e sóleo direito) foi realizada em tampão PBS (pH = 7,40) com homogeneização manual padrão e suave. Essa etapa exigiu a observação da densidade das células que seriam usadas em cada lâmina. A câmara de Neubauer foi usada para contar aproximadamente 7,3 x 105 células/lâmina.
A suspensão de células (40 µl) foi adicionada à agarose de baixo ponto de fusão (90 µl). Após ser misturado delicadamente, esse material foi cuidadosamente depositado sobre uma lâmina previamente coberta com uma fina camada de gel de agarose com uma lamela, e mantido em uma câmara úmida a 4°C por 10 minutos, a fim de garantir ainda mais a suspensão das células teciduais no gel. Em seguida, a lamela foi cuidadosamente removida e a lâmina foi condicionada em uma cubeta vertical contendo solução de lise por pelo menos 1 hora a 4°C.
O passo seguinte consistiu no desdobramento das células por 30 minutos em um tampão alcalino (pH > 10,0). Posteriormente, foi iniciado o processo de eletroforese, onde as células lisadas contidas no gel de agarose foram submetidas a uma voltagem de 25 mV e 300 mA por 15 minutos em solução tampão alcalina (pH > 10,0). Em seguida, a placa foi neutralizada, corada com nitrato de prata, lavada e mantida em temperatura ambiente para secagem e análise posterior. As lâminas de cada animal foram feitas em duplicado e um controle positivo de danos ao DNA com peróxido de hidrogênio (30 µl/lâmina). A análise foi realizada sob um microscópio óptico com um aumento de 20x, quantificando o tamanho da cauda do cometa em 50 a 100 células, de acordo com os comprimentos, diâmetros, raios e dimensões de cometas individuais. Porcentagens de DNA da cauda, momento da cauda e momento da cauda de Olive foram utilizadas como parâmetros de quantificação de danos.
Quantificação de danos no DNA
Todos os parâmetros apresentados na sessão de resultados referentes ao SCGE foram calculados pelo software CASP (CASP Labs®, Polônia).20 A porcentagem de DNA na fórmula da cauda, momento da cauda e momento da cauda de Olive está disponível para consulta nos dados complementares. O momento da cauda é caracterizado como o produto do comprimento da cauda e a porcentagem de DNA na cauda. O momento da cauda de Olive, que é outro parâmetro para dano ao DNA, compreende o produto da distância (relativa ao eixo x) entre o centro de gravidade da cabeça e o centro de gravidade da cauda do cometa e a porcentagem de DNA da cauda.
Tamanho da amostra e análise estatística
Para uma diferença mínima de 23 unidades arbitrárias de momento da cauda de ± 4 DP, foi possível determinar a diferença estatística mínima de dois grupos com três animais cada.21 Em nossa investigação, decidimos usar seis animais em cada grupo. Os dados são apresentados em média ± DP. O teste de normalidade de Shapiro-Wilk foi utilizado para avaliar a distribuição das variáveis. Para comparações entre os grupos, um teste t de Student não pareado e uma análise de variância bidirecional foram realizados entre os diferentes tecidos com um teste post hoc de Tukey. Foi considerada uma significância de 5%. A análise estatística foi realizada usando o SigmaPlot, versão 12.0 para Windows, e os gráficos foram criados pelo GraphPad Prism, versão 5.0 para Windows.
ResultadosParâmetros Morfológicos
Os animais não apresentaram diferença em relação à massa corporal inicial nem à final. Aqueles submetidos a IM apresentaram área média de infarto de 36%. Foi possível observar maior proporção de massa miocárdica, massa ventricular direita e esquerda/corpo em relação ao grupo placebo, indicando remodelação cardíaca em ambos os ventrículos. Em relação à congestão pulmonar e hepática, as taxas mais elevadas da primeira foram observadas apenas no grupo ICC (Tabela 1).
Massa corporal, características morfométricas cardíacas, área infartada e congestão pulmonar e hepática de ratos de cirurgia placebo e ratos com disfunção ventricular esquerda
Variáveis
Placebo
ICC
Massa Corporal Inicial (g)
330,25 ± 17,24
328,29 ± 18,12
Massa Corporal Final (g)
400,50 ± 29,61
356,38 ± 32,23
Área Infartada (%)
---
36,39 ± 8,11
MM/BM (mg/g)
2,56 ± 0,08
3,29 ± 0,46*
LV/BM (mg/g)
1,88 ± 0,21
2,36 ± 0,47*
RV/BM (mg/g)
0,58 ± 0,12
1,40 ± 1,01*
Congestão Pulmonar (%)
65,67 ± 9,34
87,31 ± 3,36*
Congestão hepática (%)
70,46 ± 1,05
71,43 ± 1,07
Os valores são apresentados em média ± DP; n = 6 para todos os grupos. Placebo: ratos de cirurgia placebo; ICC: ratos com insuficiência cardíaca crônica; MM/MC: Relação massa miocárdica/massa corporal; VE/MC: relação massa ventricular esquerda/massa corporal; VD/MC: relação massa ventricular direita/massa corporal.
P < 0,05 comparado ao grupo placebo.
Parâmetros Hemodinâmicos
Foi observada menor pressão arterial média no grupo ICC em comparação ao grupo placebo. A PAS e a PAD, bem como a FC, não apresentaram diferença em relação ao grupo controle (Tabela 2). Em relação às variáveis de pressão ventricular, observou-se PSVE e PDFVE maior no grupo ICC, quando comparado ao grupo placebo (Tabela 2).
Pressão arterial média, diastólica e sistólica, pressão diastólica final do ventrículo esquerdo, pressão sistólica do ventrículo esquerdo e alteração máxima/mínima do ventrículo esquerdo ao longo do tempo de ratos de cirurgia placebo e ratos com disfunção ventricular esquerda
Variáveis
Placebo
ICC
PAM (mmHg)
93,01 ± 14,70
76,78 ± 5,83*
PAD (mmHg)
73,54 ± 16,28
67,54 ± 7,15
PAS (mmHg)
99,75 ± 20,91
85,93 ± 5,51
Frequência cardíaca (bpm)
253,56 ± 70,84
245,19 ± 57,69
PDFVE (mmHg)
5,40 ± 2,26
32,55 ± 5,32*
PSVE (mmHg)
104,24 ± 6,03
89,15 ± 3,15*
+ dP/dtmax (mmHg/s)
6.264,33 ± 1.566,47
4.281,63 ± 708,75*
- dP/dtmax (mmHg/s)
5.209,63 ± 1.274,09
2.823,80 ± 540,65*
Os valores são apresentados em média ± DP; n = 6 para todos os grupos. Placebo: ratos de cirurgia placebo; ICC: ratos com insuficiência cardíaca crônica; PAM: pressão arterial média; PAD: pressão arterial diastólica; PAS: pressão arterial sistólica; PDFVE: pressão diastólica final do ventrículo esquerdo; PSVE: pressão sistólica do ventrículo esquerdo; +dP/dtmax: derivada positiva máxima da pressão ventricular; -dP/dtmax: derivada negatica máxima da pressão ventricular.
P < 0,05 comparado ao grupo placebo.
A derivada positiva máxima da pressão ventricular (+dP/dtmáx) apresentou alterações no grupo ICC, apresentando valores mais baixos, assim como a derivada negativa máxima da pressão ventricular (-dP/dtmáx), que apresentou valores mais baixos quando comparados ao grupo controle (Tabela 2).
Parâmetros de dano ao DNA
Valores mais elevados de dano ao DNA foram observados em todas as variáveis (% de DNA da cauda, momento da cauda e momento da cauda de Olive) no grupo ICC, em todos os tecidos analisados (Tabela 3). O dano ao DNA pode ser observado na formação e frequência de cometas nas células do ventrículo esquerdo, do pulmão, do diafragma, do gastrocnêmio e do sóleo (Figura 1).
Quantificação do DNA em diferentes tecidos de animais e ratos de cirurgia placebo e ratos com insuficiência cardíaca crônica
Placebo
ICC
% Cauda DNA
Momento da Cauda
Momento da Cauda de Olive
% Cauda DNA
Momento da Cauda
Momento da Cauda de Olive
Ventrículo esquerdo
7,65 ± 3,35
0,77 ± 0,44
1,37 ± 0,59
33,29 ± 7,70*
10,51 ± 3,31*
7,04 ± 1,71*
Pulmões
17,86 ± 3,93
6,76 ± 2,59
7,31 ± 2,15
36,20 ± 5,17*
23,30 ± 7,25*
19,10 ± 4,65*
Diafragma
6,86 ± 2,63
1,40 ± 0,93
1,82 ± 0,79
41,23 ± 13,86*
14,06 ± 6,51*
9,82 ± 3,03*
Gastrocnêmio
7,63 ± 4,66
1,04 ± 0,88
1,43 ± 0,70
28,07 ± 15,53*
8,69 ± 5,14*
6,17 ± 3,53*
Sóleo
11,54 ± 2,46
1,53 ± 0,96
1,84 ± 0,76
55,79 ± 11,53*
20,90 ± 5,32*
12,83 ± 3,68*
Os valores são apresentados em média ± DP; n = 6 para todos os grupos. Placebo, Ratos de cirurgia placebo; ICC: Ratos com insuficiência cardíaca crônica.
= p < 0,01 versus placebo em relação à variável e seu tecido correspondente.
Imagem das células submetidas à SCGE (ensaio cometa) do ventrículo esquerdo, pulmões, diafragma, gastrocnêmio e sóleo de ratos de cirurgia placebo e ratos com ICC. Painel A: Células isoladas do respectivo tecido de rato de cirurgia de placebo. Painel B: Células isoladas do respectivo tecido de rato com ICC induzido por IM. Lâminas manchadas com nitrato de prata. A imagem não mostra formação de cometas no Painel A, mas no Painel B a imagem mostra a formação de cometas com caudas distintas. O comprimento da cauda representa as quebras de fita simples e dupla de DNA nuclear (ampliação de 20x, barra de escala de 20 μm).
Apesar de o dano no DNA ser notavelmente maior em ratos com ICC em todos os tecidos, quando comparado a outros tecidos na mesma condição patológica, observou-se maior dano no sóleo em relação ao gastrocnêmio e ao ventrículo esquerdo no grupo com ICC. A diferença entre o dano tecidual ao DNA em animais placebo e os de ICC pode ser observada na Figura 2.
Danos ao DNA em diferentes tecidos, de acordo com% de DNA da cauda, induzido por ICC. Quantificação do dano ao DNA em células isoladas dos músculos do ventrículo esquerdo, pulmões, diafragma, gastrocnêmio e sóleo em ratos de cirurgia placebo e ratos com ICC. Placebo (n = 6), ICC (n = 6). ANOVA de duas vias, com teste post-hoc de Tukey. * p < 0,05 vs. Sóleo.
Discussão
Embora existam algumas investigações usando o ensaio cometa na ICC, até onde sabemos, este é o primeiro estudo a relatar a extensão total do dano ao DNA em diferentes tecidos em um modelo experimental de ICC. O principal achado dessa investigação é a reprodutibilidade e aplicabilidade da SCGE no modelo experimental de IM. Animais com ICC demonstraram maior extensão de dano ao DNA do que o grupo controle no coração, pulmões, diafragma e músculos esqueléticos. Esse achado apoia a principal hipótese de que a ICC afeta a estabilidade do DNA, não localmente, mas sistemicamente.
Considerando que a ICC é uma síndrome complexa, é essencial investigar a extensão dos danos que a hipoperfusão pode promover. Foi apresentado um modelo in vivo de ICC cujo dano era de duas a seis vezes maior do que na ausência de insuficiência cardíaca. Os animais deste estudo demonstraram alterações tradicionais observáveis na ligadura do modelo de insuficiência cardíaca da artéria coronária esquerda em ratos.22,23 Observou-se PDFVE média acima de 30 mmHg, caracterizando disfunção ventricular.14 Além disso, alterações hemodinâmicas tradicionais foram observadas em animais com ICC, como menor PSVE e derivados máximos positivos e negativos da pressão ventricular. Os parâmetros morfológicos também mostraram alterações significativas na hipertrofia ventricular esquerda e direita, bem como congestão pulmonar. Todos esses parâmetros (hemodinâmicos e morfológicos) caracterizam a presença de ICC.12,24,25
O método SCGE, realizado em condições alcalinas, permite avaliar os danos no DNA global. O dano observado nos cometas é formado por rupturas de fita simples e dupla não acopladas à cromatina, em fragmentos de DNA.10 A avaliação do 8-OHdG em pacientes com ICC foi recentemente proposta. O 8-OHdG é uma base de purina oxidada, um dos produtos oxidativos mais frequentes do DNA.26 A maioria das lesões no DNA pode se manifestar em quebras de fita simples e dupla, e não apenas em subprodutos oxidativos. As espécies reativas de oxigênio podem danificar o DNA e formar bases oxidativas, como a 8-OHdG, a 5-hidroxiuracil, a 2-hidroxiadenina e a 4,6-diamino-5-formamidopiridina.
Algumas advertências devem ser feitas antes de comparar os resultados medidos por danos no DNA nuclear, como em nosso estudo, aos resultados obtidos nas concentrações de base de purina oxidada. O dano ao DNA medido pelo ensaio do cometa reflete o dano geral, exceto a medição de 8-OHdG que não pode afirmar o mesmo.27
Uma metanálise recente demonstrou que oito estudos avaliaram o dano oxidativo do DNA à lesão específica do 8-OHdG no DNA. Todas as investigações demonstraram maiores concentrações de 8-OHdG em pacientes com ICC.28 A justificativa para concentrações mais altas de produtos oxidantes de DNA indica que a maior extensão de dano genotóxico contribui grandemente para a oxidação do DNA mitocondrial.29 Os miócitos cardíacos apresentam o maior conteúdo de mitocôndrias, o que pode indicar maior formação de ERO e contribuir significativamente para a disfunção mitocondrial. Embora este estudo não tenha quantificado a concentração de 8-OHdG, consideramos os danos ao DNA mais amplamente utilizados para avaliar a quebra das cadeias de DNA. O estudo de Jaenisch et al. 30 também desenvolvido por nosso laboratório, utilizou o mesmo método de avaliação de danos ao DNA (versão alcalina do ensaio cometa) em animais com ICC submetidos a treinamento muscular respiratório. Em relação à extensão do dano ao DNA de ratos placebo em comparação com ratos com ICC, a porcentagem de DNA na cauda do cometa foi relativamente semelhante aos resultados obtidos na investigação em células do diafragma.30
Um achado interessante deste estudo foi o maior dano ao DNA nas células do sóleo do que nas do ventrículo esquerdo, o que corrobora o fato de que, após IM, o ventrículo se adapta funcional e morfologicamente e o músculo periférico sofre alterações histológicas e bioquímicas.31,32 A fase aguda do IM é caracterizada pela necrose dos miócitos cardíacos, que expande a área de necrose do ventrículo esquerdo nas horas seguintes, afetando estruturas adjacentes.33 Nesta fase do IM, a extensão do dano ao DNA é provavelmente maior do que em qualquer outro tecido, como pode ser observado em citocinas pró-inflamatórias e mediadores autofágicos.34,35
O fato de os cardiomiócitos apresentarem uma taxa de renovação de aproximadamente 1% em jovens e cerca de 0,45% em idosos36 reforça nossos achados sobre a diferença de dano ao DNA entre os tecidos de ratos com ICC. O ventrículo esquerdo mostra alta adaptabilidade para modificar sua geometria e capacidade de reparar os principais produtos oxidativos do DNA. Demonstrou-se que o principal problema da ICC não são as alterações centrais do coração, mas sim que esta também afeta, indiretamente, todos os outros órgãos.37 A complexidade do cenário da ICC, como remodelação cardíaca, alterações na mecânica ventilatória e hemodinâmica e estado pró-inflamatório sistêmico, leva à formação de radicais livres de diferentes formas. Esse estado disfuncional crítico estabelece uma condição de estresse oxidativo em diferentes órgãos e sistemas.38,39
Nossa hipótese foi de que as células musculares esqueléticas teriam maior dano ao DNA em ICC.40,41 Por esse motivo, optamos por analisar dois músculos esqueléticos diferentes (músculos sóleo e gastrocnêmio) por suas diferentes proporções de tipo de fibra em ratos com ICC. O músculo esquelético da ICC é altamente afetado pela hipoperfusão que aumenta o dano oxidativo interno, principalmente nas mitocôndrias.42 Como o músculo esquelético é alvo de dano oxidativo, era esperado que houvesse maior dano observado em nossos achados. Na ICC, o sistema de defesa antioxidante nos músculos esqueléticos pode diminuir constantemente ao longo do tempo.43 É provável que o dano oxidativo observado no músculo sóleo seja explicado por sua característica morfológica (por exemplo, maior número de capilares por fibra, predominância de fibras tipo I, maior atividade do metabolismo aeróbico).44,45 Por outro lado, o músculo gastrocnêmio apresenta morfologia de características mistas, com uma distribuição percentual mais equilibrada em relação ao tipo de fibras e portanto menor dependência do metabolismo aeróbico. Por esse motivo, imaginamos que apresentasse menos danos ao DNA que o músculo sóleo.
A maquinaria antioxidante muda ao longo do tempo no ciclo celular (por exemplo: proliferação e diferenciação miogênica), demonstrando maior expressão da atividade de enzimas antioxidantes em mioblastos do que em miotubos, aumentando assim a probabilidade de mortalidade sob estresse oxidativo.5 Esse fenômeno é interessante, uma vez que o desuso dos músculos esqueléticos devido à intolerância ao exercício é comum em pacientes com ICC, além de estar relacionado à diminuição da sinalização do gatilho antioxidante-estimulante da contração muscular.46
O músculo sóleo não possui a mesma capacidade de adaptação que o ventrículo esquerdo, o que pode explicar por que o dano no DNA foi maior.
Limitações
Este trabalho mostra poucas limitações, como a ausência de avaliação de danos ao DNA em outros tecidos (fígado, estruturas encefálicas e outros músculos esqueléticos). Outra limitação que pode enriquecer nossos achados é a mensuração da mutagênese. A avaliação da mutagênese da ICC, juntamente com a SCGE, pode levar a um cenário mais robusto de dano ao DNA e à falta de reparo dessas lesões. Nosso projeto tem como objetivo avaliar os danos longitudinais que o modelo experimental de ICC pode levar e suas diferenças em relação aos tecidos; portanto, a capacidade do DNA de reparar suas lesões não pôde ser levada a diante.
Conclusão
Nossos resultados mostram danos ao DNA usando SCGE no modelo experimental de ICC por IM. A disfunção do ventrículo esquerdo afeta claramente o tecido cardíaco, pulmões, diafragma, gastrocnêmio e sóleo e foi associada à extensão do dano ao DNA, afetando mais o músculo sóleo do que o ventrículo esquerdo e o gastrocnêmio. O teste do cometa demonstrou ser uma ferramenta confiável para quantificar danos ao DNA em diferentes tecidos de animais com ICC e o músculo sóleo demonstrou ser mais afetado pela insuficiência cardíaca do que o ventrículo esquerdo e o gastrocnêmio.
Fontes de financiamento
O presente estudo foi financiado pela Capes, CNPq, UFCSPA.
Vinculação acadêmica
Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Giuseppe Potrick Stefani pela Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre.
Aprovação ética e consentimento informado
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do CEUA/ UFCSPA sob o número de protocolo 114/13. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.