Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC L8DjNBnhkDhBzTmsGLhnP7R S0066-782X2020000100100 S0066-782X2019005002002 10.5935/abc.20190223 Original Article Effects of Physical Training on the Myocardium of Oxariectomized LDLr Knockout Mice: MMP 2/9, Collagen I/III, Inflammation and Oxidative Stress Brianezi Ledimar 1 Ornelas Elisabete 1 0000-0002-2230-8853 Gehrke Flávia de Sousa 2 3 4 Fonseca Fernando Luiz Affonso 4 5 Alves Beatriz da Costa Aguiar 4 Sousa Luiz Vinicius de Alcantara 4 Souza Jessica 1 0000-0002-9456-192X Maifrino Laura Beatriz Mesiano 1 Universidade São Judas Tadeu Laboratório de Estudos Morfoquantitativo e Imunohistoquímico São Paulo SP Brazil Laboratório de Estudos Morfoquantitativo e Imunohistoquímico, Universidade São Judas Tadeu, São Paulo, SP - Brazil Universidade Paulista Departamento de Farmácia São Paulo SP Brazil Departamento de Farmácia, Universidade Paulista, São Paulo, SP - Brazil Hospital do Servidor Público Estadual Pós-Graduação em Ciências da Saúde São Paulo SP Brazil Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Hospital do Servidor Público Estadual, São Paulo, SP - Brazil ABC Faculdade de Medicina Laboratório de Análises Clínicas Santo André SP Brazil Laboratório de Análises Clínicas da Faculdade de Medicina do ABC, Santo André, SP - Brazil Universidade Federal de São Paulo Departamento de Ciências Farmacêuticas Diadema SP Brazil Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de São Paulo, Diadema, SP - Brazil Mailing Address: Flávia de Sousa Gehrke, Universidade Paulista - Farmácia - R. Antônio Macedo, 505. Postal Code 03087-010, São Paulo, SP - Brazil. E-mail: flaviagehrke@hotmail.com,

Author contributions

Conception and design of the research: Brianezi L, Maifrino LBM; Acquisition of data: Brianezi L, Ornelas E, Sousa LVA; Analysis and interpretation of the data: Brianezi L, Ornelas E, Gehrke FS, Fonseca FLA, Sousa LVA, Souza J, Maifrino LBM; Statistical analysis: Brianezi L, Gehrke FS, Fonseca FLA, Souza J; Writing of the manuscript: Brianezi L, Ornelas E, Gehrke FS, Fonseca FLA, Alves BCA, Sousa LVA, Maifrino LBM; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Gehrke FS, Fonseca FLA, Alves BCA, Maifrino LBM.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 21 10 2019 01 2020 114 1 100 105 04 09 2018 30 01 2019 10 03 2019 This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License Abstract Background:

The emergence of coronary heart disease is increased with menopause, physical inactivity and with dyslipidemia. Physical training is known to promote the improvement of cardiovascular functions.

 Objective:

To investigate the effects of aerobic physical training on the left ventricle in ovariectomized LDL knockout mice.

 Methods:

Thirty animals were divided into 6 groups (n = 5): Sedentary non-ovariectomized control; Sedentary ovariectomized control; Trained ovariectomized control; Sedentary non-ovariectomized LDL-knockout, sedentary ovariectomized LDL-knockout and trained ovariectomized LDL-knockout. We analyzed the average parameters of apparent density of collagen fibers types I and III, and metalloproteinase type 2 and type 9, were considered significant p < 0.05.

 Results:

The results showed that the proposed exercise protocol altered the volume of type I collagen fibers, altered collagen remodeling parameters (MMP-2), and also reduced the 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8OHdG) oxidative stress parameter.

 Conclusion:

Moderate intensity aerobic training acts on collagen fiber volume, on collagen remodeling with the reduction of oxidative stress in the left ventricles of ovariectomized LDL-knockout mice.

 Keywords: Coronary Artery Disease Exercise Menopause Dyslipidemias Motor Activity Collagen Oxidative Stress Inflammation Mice Introduction

During the aging process, menopausal women are at increased risk of developing conditions such as dyslipidemia, hypertension, insulin resistance and changes in body composition, where lifestyle and sedentarism are associated with a higher prevalence of the development of cardiovascular disease (CD).1,2

The aging process is associated with increased oxidative stress resulting in damage of several cell macromolecules, partly due to decreased antioxidant capacity as well as reduced repair capacity, resulting in increased susceptibility to apoptosis.3,4 Particularly in menopausal women, neuroendocrine alterations affect the functionality, metabolic capacity and antioxidant activity of numerous organs, especially due to the lack of estrogen, considered a female antioxidant, resulting in an additional increase of oxidative stress.5

Lipid metabolism is also influenced by physiological changes during menopause resulting in an increase in LDL and a decrease in HDL and contributes to the emergence of cardiovascular diseases.6,7 When compared to men of the same age, postmenopausal women are at an increased risk of developing heart disease.8,9 It is one of the main causes of morbidity and mortality in this physiological stage.10

Regular physical activity relieves the effects of aging and menopause and improves aerobic fitness, maintaining body weight index of visceral fat, plasma lipid levels, increased insulin sensitivity, increased baroreflex sensitivity and improved endothelial function, capillary wall shear stress which results in increased blood flow, stimulating nitric oxide release.11-13 These factors promote a better health-related quality of life and prolong survival and can be considered essential non-pharmacological standards in the treatment of postmenopausal effects and other physiological and pathological conditions.14,15

The objective of this study is to analyze the effects of aerobic physical training on the left ventricle in ovariectomized wildtype and LDLr knockout female mice on the following parameters: volume density of types I and III collagen fibers, metalloproteinases type 2 and type 9 expression, in addition to COX2 and 8-OhdG expression.

 Methods Animals

Thirty female mice aged 10 months were used: 15 genetically modified female mice, with knockout of the low-density lipoprotein receptor (LDLr Knockout), and 15 female wildtype mice (C57BL/6J) obtained from the University of São Paulo vivarium. The animals were kept in a USJT vivarium at a controlled temperature (22-24°C) and lighting (12 hours of light cycle and 12 hours of dark) receiving commercial feed (NUVILAB CR1, Nuvital Nutrients LTDA, Curitiba, PR) and water "ad libitum". The animals were divided into 6 groups (n = 5): sedentary non-ovariectomized control (CS), sedentary ovariectomized control (COS); trained ovariectomized control (COT); non-sedentary ovariectomized LDL knockout (LDL-S), sedentary ovariectomized LDL knockout (LDL-OS) and trained ovariectomized LDL knockout (LDL-OT). The division of the animals in the groups was performed by convenicence.

The experimental protocol was approved by the Research Ethics Committee of Universidade São Judas Tadeu (CEP-Protocol: 058/2007) and the research was conducted according to the Principles of Laboratory Animal Care formulated by the National Institutes of Health.

 Ovariectomy

At nine months of age animals underwent the ovariectomy procedure. The animals were anesthetized with a ketamine and xylazine solution (120:20 mg/Kg, im) and placed in supine position and a small incision in the lower third of the abdominal region, parallel to the line of the body, was made. The ovaries, the uterine horns, and the blood vessels were located, sectioned, and removed. After that, the musculature and the skin were sutured. Confirmation of the efficacy of the ovariectomy was determined through colpocytology of the vaginal secretion performed over four consecutive days. On the last day of analysis, euthanasia was performed on these animals.16

Training Protocol Maximal training Test

A maximal training test was performed on all the groups at the beginning and at the end of the exercise training program. The test consists of placing the animal to run on an ergometric treadmill at 0.3 km/h for 3 minutes, and this workload was increased by 0.3 km/h every 3 minutes until the animal reached exhaustion. The time of the test and the speed of the last workload were noted and served to determine the mean value of aerobic capacity of each group.

 Exercise training

Exercise training began 7 days after the ovariectomy surgery; the trained groups were subjected to a physical training protocol on an ergometric treadmill at low-moderate intensity (≈50% to 70% maximal running speed) for 1 hour a day, 5 days a week, for 4 weeks, with a gradual increase in speed from 0.3 to 1.2 km/h. The animals were adapted to the treadmill for 10 minutes on three days prior to beginning the training.

 Euthanasia and tissue preparation

At the end of the training the animals were sacrificed by decapitation. A thoracotomy was performed in which the heart and atria were removed and the right and left ventricles were sectioned. Left ventricle samples were fixed in 10% buffered formalin for 24 hours. Afterwards, the tissue was transferred to a 70% ethyl alcohol solution, dehydrated in increasing ethanol series, diaphanized in xylol and embedded in paraffin. Non-serial, 5 µm thick cuts were performed in which each section received a total of 6 cuts. The sections were stained with the Picrosirius technique, for the analysis of collagen fibers I and III in the left ventricle and visualized by polarized light microscopy.

The volume density of collagen fibers I and III (Vv[fc]) expresses the fraction of the volume occupied by the collagen fibers in relation to the total volume of the analyzed image. For this analysis, the test system was used with a total of 475 points, which corresponds to 100% of the image, using the program Image J. (version 1.47 - National Intitutes of Health-(Collins).

 Immunohistochemistry

For the immunohistochemical techniques, 3 to 4 micrometer thick cuts were made and mounted on slides previously silanized using 4% silane. After the slides were dewaxed, using a heating oven overnight set at 57ºC, after which they were immersed in xylol baths for 30 minutes. Afterwards, they were hydrated in ethyl alcohol with decreasing concentrations of 100%, 80% and 70%, each with a duration of 5 minutes, then washed in running water. In the next step, the antigenic recovery was performed in a water bath at 90°C, the slides were placed in citrate buffer for 30 minutes, then washed in running water. Endogenous peroxidase blockade was performed in H2O2 for 15 minutes, followed by washing in distilled running water and in PBS pH = 7.4. For each slide, a specific antibody was used, table 1, and the antibody was placed overnight in a humid chamber at 4°C. The material was washed with PBS buffer and incubated with a biotinylated secondary antibody for 30 minutes, washed again with PBS and incubated with a streptoavidin-peroxidase antibody for another 30 minutes. A chromogenic substrate, DAB (33-Diaminobenzidine) solution in the ratio of 1:1 were used for five minutes at room temperature to wash with PBS solution and to reveal the reaction. When the presence of a dark brown precipitate was observed the slides were placed in running water, after which they were counterstained with "Hematoxylin Harrys" for 2 minutes. Afterwards, they were submitted to 3 xylol baths to diafieze and to 2 alcohol baths. The slides were mounted with coverslips and Entellan®.

Antibodies used for protein detection
Antibody Dilution Labeling Function Manufacturer
MMP2 1:250 Cytoplasm Collagen remodelling sc-10736, Santa Cruz®
MMP9 1:300 Cytoplasm Collagen remodelling sc-6840, Santa Cruz®
COX 2 1:100 Cytoplasm Inflammation sc-1745 P, Santa Cruz®
8-OHdG 1:100 Cytoplasm Oxidative stress sc-66036, Santa Cruz®

In all the techniques, observing the presence of a dark brown precipitate, the sample was visualized under an optical microscope. A quantitative analysis of the images was performed using the program ImageLab 2000, where the brown markers were selected and the program quantified immunoexpression intensity, figure 1.

Immunoexpression of proteins. CS: sedentary non-ovariectomized control; COS: sedentary ovariectomized control; COT: trained ovariectomized control; LDLr-S non-sedentary ovariectomized knockout; LLr-OS: sedentary ovariectomized LDL knockout; LDLr-OT: trained ovariectomized LDL knockout.

Statistical analysis

Absolute and relative values were used to describe the qualitative variables. For the quantitative variables with normal distribution (Shapiro-Wilk > 0.05), mean, standard deviation, minimum and maximum were used, and for the variables with non-normal distribution (Shapiro-Wilk < 0.05), median and percentiles were used. To study the diferences between the variables with the groups, the Kruskal-Wallis and ANOVA tests were used, complemented by the Dunn test or Bonferroni. For all analyzes, a confidence level of 95% was used. The program utilized for these analyzes was Stata version 11.0. (StataCorp. 2009. Stata Statistical Software: Release 11. College Station, TX: StataCorp LP.)

 Results

Our data show a significant reduction in the volume density of type I collagen fibers in the ovariectomized dyslipidemic group (LDL-OS) (-51%). The LDL-OT group showed a decrease of 100% when compared to the COS group and a significant difference in relation to the COT and LDL-S groups. Table 2 shows the association of COX-2 and MMP9 expression variables and the density of type I collagen fibers in relation to the evaluated animal group.

Comparison of Cyclooxygenase-2, Volume Density of collagen fibers I and Metalloproteinase type 9, with the groups studied. clinical variables with groups
Variables CS COS COT LDL-S LDL-OS LDL-OT p*
COX-2 35.0 (23.9; 46.3) 46.5 (44.2; 79.7) 46.1 (31.3; 47.7) 47.7 (45.8; 63.1) 87.8 (42.5; 92.4) 49.4 (49.1; 50.9) 0.232
Vv [fc I] 0.21 (0.21; 0.43) 0.43 (0.21; 0.43) - - 0.21 (0.0; 0.41)A,B,C 0.0 (0.0; 0.21)A,B,C < 0.001
MMP9 44.7 (40.1; 44.8) 40.9 (39.8; 45.6) 53.9 (48.6; 66.2) 53.0 (38.3; 58.1) 42.2 (27.3; 53.7) 64.1 (45.5; 93.9) 0.169

Kruskal-Wallis. Data expressed as median and 25% and 75% percentiles. COX-2: Cyclooxygenase-2; Vv [fc I]: Volume Density of collagen fibers I; MMP 9: Metalloproteinase type 9; CS: sedentary non-ovariectomized control; COS: sedentary ovariectomized control; COT: trained ovariectomized control; LDL-S: non-sedentary ovariectomized LDL knockout; LDL-OS: sedentary ovariectomized LDL knockout; LDL-OT: trained ovariectomized LDL knockout.

statistically significant difference between the studied group and the COS group;

statistically significant difference between the studied group and the TOC group;

statistically significant difference between the studied group and the LDL-S group.

Regarding metalloproteinase type 2 expression, in the control group (CS) there was a significant increase of 24% in the ovariectomized group (COS), when physical training (COT) was performed there was an increase of 72%, and with dyslipidemia (LDL-S), the increase was 92%. In the dyslipidemic group with ovariectomy (LDL-OS), the values decrease 27% in relation to the LDL-S group and 18% in relation to the COT group, but still above the values of the control groups by 42% in relation to the CS group and 14% in relation to the COS group. When the training was performed in the ovariectomized dyslipidemic group LDL-OT, the results obtained present a 15% increase in relation to the sedentary ovariectomized LDL-OS group and a 15% decrease in relation to the LDL-S group. When compared to the control group, there was an increase of 64% in relation to the CS group, 32% in relation to the COS group and a decrease of 5% in relation to the COT group.

When analyzing the oxidative stress data, evaluating 8OHdG expression, there was a decrease in the indexes for the control group (CS), in which there was a decrease of 33% in the group with ovariectomy (COT) and a 39% decrease in the trained group. When dyslipidemia was present (LDL-S), there was a 51% decrease in relation to the CS group, and in the dyslipidemic group with ovariectomy (LDL-OS) there was a decrease of 85% in relation to the CS group, 78% in relation to the COS group, 76% in relation to the COT group and 70% in relation to the LDL-S group. When training was performed in the dyslipidemic ovariectomized group (LDL-OT), the data presented a 152% increase in relation to the LDL-OS group and a decrease in relation to the control groups, with 63% for the CS group, 45% for the COS group and 40% for the COT group. For the parameters related to volume density of type III collagen fibers, metalloproteinase type 9 and inflammation (COX2), the values obtained for the control and dyslipidemic groups do not present significant differences in any parameter, table 3.

Comparison of the variables Metalloproteinase type 2, Anti-8-Hydroxydeoxyguanosine and Volume Density of collagen fibers III (Vv [fc III]), with the groups studied.
Variables CS COS COT LDL-S LDL-OS LDL-OT p*
MMP 2 28.5 (4.0) 35.3 (9.1)A 49.0 (3.8)A 54.8 (52.0)A 40.5 (9.6)A,B,C,D 46.8 (31.0)A,B,C,E < 0.001
8-OHDg 105.2 (7.6) 70.0 (10.8)A 64.9 (4.7)A 51.7 (0.5)A 15.3 (7.5)A,B,C,D 38.7 (8.4)A,B,C,E < 0.001
Vv[fc III] 0.007 (0.037) 0.003 (0.024) 0.016 (0.067) 0.015 (0.057) 0.013 (0.062) 0.009 (0.043) 0.649

ANOVA. Data expressed as mean and standard deviation.

statistically significant difference between the studied group and the CS group;

statistically significant difference between the studied group and the COS group;

statistically significant difference between the studied group and the TOC group;

statistically significant difference between the studied group and the LDL-S group;

statistically significant difference between the studied group and the LDL-OS group.

MMP2: Metalloproteinase type 2; 8OHdG: Anti-8-Hydroxydeoxyguanosine; Vv [fc III]: Volume Density of collagen fibers III; CS: sedentary non-ovariectomized control; COS: sedentary ovariectomized control; COT: trained ovariectomized control; LDL-S: non-sedentary ovariectomized LDL knockout; LDL-OS: sedentary ovariectomized LDL knockout; LDL-OT: trained ovariectomized LDL knockout.

 Discussion

Physical activity is recognized as an important non-pharmacological treatment for numerous diseases and conditions, including dyslipidemia and menopause. Studies indicate that collagen fibers are present in the process of myocardial remodeling, which occur due to aging and other factors.17,18

Our data show that in the myocardium, the expression of type III collagen fibers did not differ between groups and parameters. In relation to type I collagen, ovariectomy and training brought a decrease in the levels presented in relation to the sedentary ovariectomized control group. Results similar to those found in our study verified the same variable in animals after a period of obesity induced by a diet rich in unsaturated fat.19 Interestingly, the findings reported in this article have similar results only with the proposed physical activity. Another study where acute myocardial infarction was induced in rats, the gradual increase of types I and III collagen was observed at 4 weeks. The kinetics of collagen I/III increase, in combination with the decrease of the elastic fibers in the infarcted area after an MI, provided evidence that impaired cardiac function after an MI was due to healing or infarct scar formation, with increased rigidity and less flexibility of the heart.20

Our results suggest that the aging period in this study does not appear to interfere with the increase in the expression of collagen fibers presented in other studies.21,22 However, when evaluating the LDL-OT groups, there is a clear reduction in the volume of type I collagen fibers. This verification was obtained using the proposed training protocol (intensity or duration).23,24

Metalloproteinase type 2 and type 9 also participate in the remodeling process of cardiac tissue, and are present in several pathologies such as inflammatory and cardiovascular diseases, among other injuries.24-29 The expression of metalloproteinase type 9 did not differ between groups and parameters. Regarding metalloproteinase type 2, an increase was shown in the control group with ovariectomy and physical training even in the presence of dyslipidemia. This process explains the factor with the collagen indexes when these are not elevated, because the degradation of collagen and the extracellular matrix is peformed by the action of the metalloproteinases.25,30-32 The elevated presence of MMPs in patients with dyslipidemias found in some studies suggest their participation in the matrix degradation process in atherosclerotic plaques and in the ruptures of these and with exposure of the nucleus17,33 and are independent predictors for the progression of kidney disease and are independently associated with an increased risk of mortality.34

The expression of COX2 in our study did not present statistical significance, indicating that in all groups and parameters, there were no changes for these data. Thus, in this parameter chosen to verify inflammation, no changes are observed showing that the factors associated with the groups do not interfere in such an evaluation.

Aging, menopause and dyslipidemia are factors that also result in oxidative stress.3-5 In our research, oxidative stress was verified through the expression of 8OHdG, and ovariectomy decreased the values of this parameter in the control and dyslipidemic groups, differing from the results obtained in other studies.5,35 When physical training was performed, the values were decreased in the control group, but in the dyslipidemic group, they presented an increase. Interestingly, this marker seems to have no association with the groups proposed in this experimental model.

 Conclusion

The data of this research indicate that physical exercise beneficially influenced the control and dyslipidemic groups in the volume density parameter of type I collagen fibers and the control group in relation to oxidative stress.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Universidade de São Judas Tadeu under the protocol number 058. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013

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Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42131/tde-30052008-120037/pt-br.php 10.11606/D.42.2008.tde-30052008-120037 Tampelini FS Efeito do exercício físico aeróbio sobre os componentes fibroelástico e colágeno da aorta de ratos normotensos e hipertensos, sedentários e treinados aorta de ratos normotensos e hipertensos Internet 2018 jan 12 Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42131/tde-30052008-120037/pt-br.php 10.11606/D.42.2008.tde-30052008-120037 19 Silva DCT, Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, Campos DHS, Nascimento AF, Oliveira JSA et al. Influência do tempo de exposição à obesidade induzida por dieta hiperlipídica sobre os colágenos Tipo I e III miocárdico. Arq Bras Cardiol. 2014;102(2):157-64. Silva DCT Lima-Leopoldo AP Leopoldo AS Campos DHS Nascimento AF Oliveira JSA Influência do tempo de exposição à obesidade induzida por dieta hiperlipídica sobre os colágenos Tipo I e III miocárdico Arq Bras Cardiol 2014 102 2 157 164 20 Yu Y, Yin G, Bao S, Guo Z. Kinetic alterations of collagen and elastic fibres and their association with cardiac function in acute myocardial infarction. Mol Med Rep. 2018;17(3):3519-26. Yu Y Yin G Bao S Guo Z Kinetic alterations of collagen and elastic fibres and their association with cardiac function in acute myocardial infarction Mol Med Rep 2018 17 3 3519 3526 21 Camelliti P, Borg TK, Kohl P. Structural and functional characterization of cardiac fibroblasts. Cardiovasc Res. 2005;65(1):40-51. Camelliti P Borg TK Kohl P Structural and functional characterization of cardiac fibroblasts Cardiovasc Res 2005 65 1 40 51 22 Masson S, Latinim R, Saliom M, Fiordaliso F. Cardiac fibrosis and aging. In: Razzaque MS. Fibrogenesis: Cellular and Molecular Basis. 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Maifrino LBM Araújo RC Faccini CC Liberti EA Gama EF Ribeiro AACM Efeito do treinamento físico em alterações induzidas pelo envelhecimento no musculo papilar do rato Arq Bras Cardiol 2009 92 5 387 392 25 Polyakova V, Loeffler I, Hein S, Miyagawa S, Piotrowska I, Dammer S, et al. Fibrosis in endstage human heart failure: Severe changes in collagens metabolismo and MMP/TIMP profiles, Int J Cardiol, 2011;151(1):18-33. Polyakova V Loeffler I Hein S Miyagawa S Piotrowska I Dammer S Fibrosis in endstage human heart failure: Severe changes in collagens metabolismo and MMP/TIMP profiles, Int J Cardiol, 2011 151 1 18 33 26 Nagase H, Visse R, Murphy G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiol Res. 2006; 69:562-73 Nagase H Visse R Murphy G Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs Cardiol Res 2006 69 562 573 27 Geurts N, Opdenakker G, Van Den Steen P. Matrix Metalloproteinases as therapeutic targets in protozoan parasitic infections. 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Endogenous aldosterone is involved in vascular calcification in rat. Exp Biol Med. 2012; 237(1): 31-7. Wu SY Yu YR Cai Y Jia LX Wang X Xiao CS Endogenous aldosterone is involved in vascular calcification in rat Exp Biol Med 2012 237 1 31 37 31 Parks WC, Mecham RP. Extracellular matrix degradation. New York: Springer; 2011. Parks WC Mecham RP Extracellular matrix degradation 2011 New York Springer 32 Nascimento DC, Durigan RCM, Tibana RA, Durigan JLQ, Navalta JW, Prestes J. The Response of Matrix Metalloproteinase-9 and -2 to Exercise. Sports Med. 2015; 45(2):269-78. Nascimento DC Durigan RCM Tibana RA Durigan JLQ Navalta JW Prestes J The Response of Matrix Metalloproteinase-9 and -2 to Exercise Sports Med 2015 45 2 269 278 33 Basalyga DM, Simionescu DT, Xiong W, Baxter BT, Starcher BC, Vyavahare NR. Elastin degradation and calcification in an abdominal aorta injury model: Role of matrix metalloproteinases. Circulation. 2004;110(22): 3480-7. Basalyga DM Simionescu DT Xiong W Baxter BT Starcher BC Vyavahare NR Elastin degradation and calcification in an abdominal aorta injury model: Role of matrix metalloproteinases Circulation 2004 110 22 3480 3487 34 Hsu T, Kuo K, Hung S, Huang PH, Chen JW, Tarng DC. Progression of kidney disease in non-diabetic patients with coronary artery disease: predictive role of circulating matrix metalloproteinase-2, -3, and -9. PLoS One. 2013;8(7):e70132. Hsu T Kuo K Hung S Huang PH Chen JW Tarng DC Progression of kidney disease in non-diabetic patients with coronary artery disease: predictive role of circulating matrix metalloproteinase-2, -3, and -9 PLoS One 2013 8 7 e70132 35 Dantas AP, Tostes RC, Forbes ZB, Costa SG, Nigro D, Carvalho MH. In vivo evidence for antioxidant potential of estrogen in microvessels of female spontaneously hypertensive rats. Hypertension. 2002;39(2 Pt 2):405-11. Dantas AP Tostes RC Forbes ZB Costa SG Nigro D Carvalho MH In vivo evidence for antioxidant potential of estrogen in microvessels of female spontaneously hypertensive rats Hypertension 2002 39 2 Pt 2 405 411 Artigo Original Efeitos do Treinamento Físico sobre o Miocárdio de Camundongos LDLr Knockout Ovariectomizadas: MMP-2 e -9, Colágeno I/III, Inflamação e Estresse Oxidativo Brianezi Ledimar 1 Ornelas Elisabete 1 0000-0002-2230-8853 Gehrke Flávia de Sousa 2 3 4 Fonseca Fernando Luiz Affonso 4 5 Alves Beatriz da Costa Aguiar 4 Sousa Luiz Vinicius de Alcantara 4 Souza Jessica 1 0000-0002-9456-192X Maifrino Laura Beatriz Mesiano 1 Laboratório de Estudos Morfoquantitativo e Imunohistoquímico, Universidade São Judas Tadeu, São Paulo, SP - Brazil Departamento de Farmácia, Universidade Paulista, São Paulo, SP - Brazil Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Hospital do Servidor Público Estadual, São Paulo, SP - Brazil Laboratório de Análises Clínicas da Faculdade de Medicina do ABC, Santo André, SP - Brazil Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de São Paulo, Diadema, SP - Brazil Correspondência: Flávia de Sousa Gehrke, Universidade Paulista - Farmácia - R. Antônio Macedo, 505. CEP 03087-010, São Paulo, SP - Brasil. E-mail: flaviagehrke@hotmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Brianezi L, Maifrino LBM; Obtenção de dados: Brianezi L, Ornelas E, Sousa LVA; Análise e interpretação dos dados: Brianezi L, Ornelas E, Gehrke FS, Fonseca FLA, Sousa LVA, Souza J, Maifrino LBM; Análise estatística: Brianezi L, Gehrke FS, Fonseca FLA, Souza J; Redação do manuscrito: Brianezi L, Ornelas E, Gehrke FS, Fonseca FLA, Alves BCA, Sousa LVA, Maifrino LBM; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Gehrke FS, Fonseca FLA, Alves BCA, Maifrino LBM.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

O surgimento da doença cardíaca coronariana aumenta com a menopausa, inatividade física e dislipidemia. Sabe-se que o treinamento físico promove a melhora das funções cardiovasculares

 Objectivo:

Investigar os efeitos do treinamento físico aeróbico sobre o ventrículo esquerdo em camundongos LDL knockout ovariectomizadas.

 Métodos:

Trinta animais foram divididos em 6 grupos (n = 5): controle sedentário não ovariectomizado, controle sedentário ovariectomizado, controle treinado ovariectomizado, sedentário LDL-knockout não ovariectomizado, sedentário LDL-knockout ovariectomizado e treinado LDL-knockout ovariectomizado. Analisamos os parâmetros médios da densidade de volume de fibras colágenas tipo I e III, e metaloproteinases 2 e 9. Valores de p < 0,05 foram considerados significativos.

 Resultados:

Os resultados mostram que o protocolo de exercício proposto alterou o volume de fibras colágenas do tipo I e os parâmetros de remodelamento do colágeno (MMP-2), e ainda reduziu o parâmetro de estresse oxidativo do 8-hidroxi-2’-deoxiganosina (8-OhdG).

 Conclusão:

O treinamento aeróbico de intensidade moderada age sobre o volume das fibras colágenas e sobre o remodelamento de colágeno, com redução do estresse oxidativo em ventrículos esquerdos de camundongos ovariectomizados LDLr Knockout.

 Palavras-chave: Doença da Artéria Coronária Exercício Menopausa Dislipidemia Atividade Física Colágeno Estresse Oxidativo Inflamação Camundongos Introdução

Durante o processo de envelhecimento, as mulheres na menopausa têm maior risco de desenvolver condições como dislipidemia, hipertensão, resistência à insulina e mudanças na composição corporal, uma vez que o estilo de vida e o sedentarismo estão associados a maior prevalência de desenvolvimento de doenças cardiovasculares (DC).1,2

O processo de envelhecimento está associado ao aumento do estresse oxidativo, que dá origem a danos em várias macromoléculas celulares, em parte devido à diminuição da capacidade antioxidante, bem como à redução da capacidade de reparação, que acarretam o aumento da susceptibilidade à apoptose.3,4 Especialmente em mulheres na fase da menopausa, as alterações neuroendócrinas afetam a funcionalidade, a capacidade metabólica e a atividade antioxidante de vários órgãos, principalmente em decorrência da falta de estrogênio, que é considerado um antioxidante feminino, causando aumento adicional do estresse oxidativo.5

O metabolismo lipídico também é influenciado por alterações fisiológicas durante a menopausa, resultando em aumento do LDL e diminuição da HDL, o que contribui para o surgimento de doenças cardiovasculares.6,7 Em relação aos homens da mesma idade, as mulheres pós-menopáusicas apresentam maior risco de desenvolver doença cardíaca,8,9 que constitui uma das principais causas de morbidade e mortalidade neste estágio fisiológico.10

A atividade física regular alivia os efeitos do envelhecimento e da menopausa e melhora a aptidão aeróbica, além de manter o índice de peso corporal de gordura visceral, os níveis plasmáticos de lipídios, o aumento da sensibilidade à insulina, o aumento da sensibilidade barorreflexa, a melhora da função endotelial, o estresse de cisalhamento na parede vascular, resultando no aumento do fluxo sanguíneo e estimulando a liberação de óxido nítrico.11-13 Esses fatores promovem uma melhor qualidade de vida relacionada à saúde, prolongam a sobrevivência e podem ser considerados padrões não farmacológicos essenciais para o tratamento dos efeitos da pós-menopausa e de outras condições fisiológicas e patológicas.14,15

O objetivo deste estudo é analisar os efeitos do treinamento físico aeróbico sobre o ventrículo esquerdo de camundongos fêmeas ovariectomizadas selvagens e LDLr knockout, tendo como base os seguintes parâmetros: densidade de volume de fibras colágenas tipo I e III, expressão das metaloproteinases 2 e 9, além da expressão de COX 2 e 8-OhdG.

 Métodos Animais

Foram utilizados trinta camundongos fêmeas, com 10 meses de idade: 15 camundongos fêmeas geneticamente modificados, com nocaute do receptor de lipoproteínas de baixa densidade (LDLr Knockout), e 15 camundongos fêmeas selvagens (C57BL/6J), obtidos no biotério da Universidade de São Paulo. Os animais foram mantidos no biotério da USJT em temperatura (22-24 °C) e iluminação controlada (12 horas de luz e 12 horas de escuridão) recebendo alimentação comercial ((NUVILAB CR1, Nuvital Nutrients LTDA, Curitiba, PR) e água "ad libitum". Os animais foram divididos em 6 grupos (n=5): controle sedentário não-ovariectomizado (CS), controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT); LDLr Knockout não sedentário ovariectomizado (LDLr-S), LDLr Knockout ovariectomizado sedentário (LDLr-OS) e LDLr Knockout ovariectomizado treinado (LDLr-OT). Os animais foram categorizados por conveniência.

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade São Judas Tadeu (CEP-Protocolo: 058/2007) e a pesquisa foi conduzida como indicado pelos Princípios de cuidados com animais de laboratório publicados pelos Institutos Nacionais de Saúde.

 Ovariectomia

Aos nove meses de idade, os animais foram submetidos ao procedimento da ovariectomia. Eles foram anestesiados com uma solução de ketamina e xilazina (120:20 mg/Kg, im) e colocados em posição supina e uma pequena incisão foi feita no terço inferior da região abdominal, paralelamente à linha do corpo. Os ovários, os cornos uterinos e vasos sanguíneos foram localizados, seccionados e removidos. Em seguida, a musculatura e a pele foram suturadas. A confirmação da eficácia da ovariectomia foi determinada através da colpocitologia da secreção vaginal realizada durante quatro dias consecutivos. No último dia de análise, a eutanásia foi realizada nesses animais.16

Protocolo de Treinamento Teste de treinamento máximo

Um teste de treinamento máximo foi realizado em todos os grupos no início e no final do programa de treinamento de exercícios. O teste consiste em colocar o animal em uma esteira ergométrica a 0,3 km/h por 3 minutos, e essa carga de trabalho era aumentada em 0,3 km/h a cada 3 minutos, até que o animal atingisse o esgotamento. O tempo do teste e a velocidade da última carga de trabalho foram observados e usados para determinar o valor médio da capacidade aeróbica de cada grupo.

 Treinamento de exercícios

O treinamento de exercícios começou 7 dias depois da cirurgia de ovariectomia. Os grupos treinados foram submetidos a um protocolo de treinamento físico em uma esteira ergométrica com baixa intensidade moderada (≈50% a 70% de velocidade máxima) durante 1 hora por dia, 5 dias por semana, por 4 semanas, com aumento gradual da velocidade de 0,3 a 1,2 km/h. Os animais foram adaptados à esteira durante 10 minutos nos três dias que precederam o início dos treinamentos.

 Eutanásia e preparação dos tecidos

No final do treinamento os animais foram sacrificados por decapitação. Uma toracotomia foi realizada, através da qual o coração e os átrios foram removidos, e os ventrículos direito e esquerdo foram seccionados. Amostras do ventrículo esquerdo foram fixadas em formalina tamponada a 10% durante 24 horas. Em seguida, o tecido foi transferido para uma solução de álcool etílico 70%, desidratado em sequência crescente de etanol, diafanizados em xilóis e embebidos em parafina. Foram realizados cortes não seriados de 5µm de espessura, onde cada lâmina recebeu um total de 6 cortes. As lâminas foram coradas pela técnica de Picrosirius, para a análise das fibras colágenas I e III no ventrículo esquerdo e visualizadas através de microscopia de luz polarizada.

A densidade de volume das fibras colágenas I e III (Vv[fc]) expressa a fração do volume ocupado pelas fibras colágenas em relação ao volume total da imagem avaliada. Para essa análise, foi utilizado o sistema teste com um total de 475 pontos, que corresponde a 100% da imagem, usando o programa Image J. (versão 1.47 - National Intitutes of Health; COLLINS, 2007).

 Imunohistoquímica

Para as técnicas de imunohistoquímica, foram feitos cortes com espessura de 3 a 4 micrômetros, que foram montados em lâminas previamente silanizadas a 4%. Depois, as lâminas foram desparafinizadas, utilizando estufa a 57ºC pernoite, sendo então imersas em banhos de xilol com duração de 30 minutos. Em seguida, elas foram hidratadas em álcool etílico nas concentrações decrescentes de 100%, 80% e 70%, cada qual com uma duração de 5 minutos e, depois, lavadas em água corrente. Na etapa seguinte, a recuperação antigênica foi realizada em banho-maria a 90°C. As lâminas foram colocadas em tampão citrato durante 30 minutos e, então, lavadas em água corrente. Foi realizado o bloqueio da peroxidase endógena com H2O2 por 15 minutos, seguindo-se as lavagens em água corrente e destilada e em PBS pH= 7,4. Para cada lâmina, foi utilizado um anticorpo específico (Tabela 1), após o que foram incubadas, em câmara úmida (overnight, a 4ºC). O material foi então lavado com tampão PBS e incubado com anticorpo secundário biotinilado por 30 minutos, lavado de novo com PBS e incubado com um anticorpo streptoavidina-peroxidase por outros 30 minutos. Um substrato cromogênico, solução DAB (33-Diaminobenzidina) na proporção de 1:1, foi utilizado, durante cinco minutos, em temperatura ambiente, para lavar o material com solução PBS e revelar a reação. Ao observar-se a formação de um precipitado castanho escuro, as lâminas foram colocadas em água corrente e, em seguida, contra-coradas com hematoxilina de Harris por 2 minutos. Depois disso, foram submetidas a 3 banhos de xilol para diafinizar e 2 banhos de álcool. As lâminas foram montadas com lamínulas e Entellan®.

Anticorpos utilizados para detecção de proteínas
Anticorpo Diluição Marcação Função Fabricante
MMP2/72KDa 1:250 Citoplasma Remodelamento do colágeno sc-10736, Santa Cruz®
MMP9/KDa 1:300 Citoplasma Remodelamento do colágeno sc-6840, Santa Cruz®
COX 2 1:100 Citoplasma Inflamação sc-1745 P, Santa Cruz®
8-OHdG 1:100 Citoplasma Estresse oxidativo sc-66036, Santa Cruz®

Em todas as técnicas, observando-se a presença de um precipitado castanho escuro, a amostra foi visualizada utilizando-se microscópio de luz. A análise quantitativa das imagens foi realizada através do programa ImageLab 2000, por meio do qual foram selecionadas as marcações em marrom e contabilizadas a intensidade da imunoexpressão, como demonstrado na figura 1.

Imunoexpressão de proteínas. CS: controle sedentário não-ovariectomizado; COS: controle ovariectomizado sedentário; COT: controle ovariectomizado treinado; LDLr-S: LDLr Knockout não sedentário ovariectomizado; LDLr-OS: LDLr Knockout ovariectomizado sedentário; LDLr-OT: LDLr Knockout ovariectomizado treinado.

Análise estatística

Valores absolutos e relativos foram utilizados para descrever as variáveis qualitativas. Para as análises quantitativas com distribuição normal (Shapiro-Wilk > 0,05), utilizou-se média, desvio padrão, mínimo e máximo e, para as variáveis sem distribuição normal (Shapiro-Wil < 0,05), mediana e percentis. Para estudar as diferenças entre variáveis clínicas com os grupos, os testes de Kruskal-Wallis e Anova foram utilizados, complementados pelo teste de Dunn ou Bonferroni. Para todas as análises, um nível de confiança de 95% foi usado. Para a análise estatística, o programa STATA (versão 11.0) foi utilizado.

 Resultados

Nossos dados mostraram redução significativa da densidade de volume de fibras colágenas do tipo I no grupo dislipidêmico ovariectomizados (LDLr-OS) (-51%). O grupo LDLr-OT apresentou uma diminuição de 100% quando comparado com o grupo COS e uma diferença significativa em relação aos grupos COT e LDLr-S. A tabela 2 mostra a associação das variáveis expressão de COX-2 e MMP 9 e densidade de volume de fibras colágenas tipo I, em relação aos grupos de animais estudados.

Comparação da ciclo-oxigenase-2, densidade de volume das fibras colágenas I e metaloproteinase tipo 9, com os grupos estudados
Variáveis CS COS COT LDL-S LDL-OS LDL-OT p*
COX-2 35,0 (23,9; 46,3) 46,5 (44,2; 79,7) 46,1 (31,3; 47,7) 47,7 (45,8; 63,1) 87,8 (42,5; 92,4) 49,4 (49,1; 50,9) 0,232
Vv [fc I] 0,21 (0,21; 0,43) 0,43 (0,21; 0,43) - - 0,21 (0,0; 0,41)A,B,C 0,0 (0,0; 0,21)A,B,C < 0,001
MMP9 44,7 (40,1; 44,8) 40,9 (39,8; 45,6) 53,9 (48,6; 66,2) 53,0 (38,3; 58,1) 42,2 (27,3; 53,7) 64,1 (45,5; 93,9) 0,169

Kruskal-Wallis. Dados expressos em mediana e percentis 25% e 75%. COX-2: ciclo-oxigenase-2; Vv [fc I]: densidade de volume das fibras de colágeno I; MMP 9: Metaloproteinase tipo 9; CS: controle não-ovariectomizado sedentário; COS: controle ovariectomizado sedentário; COT: controle ovariectomizado treinado; LDL-S: nocaute LDL ovariectomizado não sedentário; LDL-OS: nocaute sedimentar ovariectomizado de LDL; LDL-OT: nocaute LDL ovariectomizado treinado.

diferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo COS;

diferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo TOC; C: diferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo LDL-S.

diferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo LDL-S.

Em relação à expressão da metaloproteinase tipo 2, no grupo controle (CS), houve aumento significativo de 24% no grupo ovariectomizado (COS). Quando realizado o treinamento físico (COT), houve um aumento de 72% e, na presença de dislipidemia (LDL-S), o aumento foi de 92%. No grupo dislipidêmico (LDL-OS), com a ovariectomia, os valores caíram 27% em relação do grupo LDLr-S e 18% em relação ao grupo COT, mas os valores ainda permaneceram acima daqueles observados nos grupos controle (42% em relação ao grupo CS e 14% em relação ao grupo COS). Quando realizado o treinamento no grupo dislipidêmico ovariectomizado LDLr-OT, os resultados obtidos demonstraram um aumento de 15% na comparação com o grupo ovariectomizado sedentário LDLr-OS e uma diminuição de 15% em relação ao grupo LDLr-S. Quando comparados com o grupo controle, houve um aumento de 64% em relação ao grupo CS, de 32% em relação ao grupo COS e uma diminuição de 5% em relação ao grupo COT.

Quando os dados do estresse oxidativo foram analisados, em relação à expressão de 8OHDG, houve uma diminuição dos índices para o grupo controle (CS); diminuição de 33% no grupo submetido à ovariectomia (COT) e diminuição de 39% no grupo submetido ao treinamento. Com a presença de dislipidemia (LDLr-S), houve uma diminuição de 51% em relação ao grupo CS, e no grupo dislipidêmico ovariectomizado (LDLrOS), houve diminuição de 85% em relação ao grupo CS, 78% no grupo COS, 76% em relação ao grupo COT e 70% em relação ao grupo LDLr-S.

Quando realizado o treinamento no grupo dislipidêmico ovariectomizado (LDLr-OT), os dados apresentaram um aumento de 152% em relação ao grupo LDLr-OS e uma diminuição nos grupos controle, com 63% para o grupo CS, 45% para o grupo COS e 40% para o grupo COT. Para os parâmetros relacionados à densidade de volume de fibras colágenas do tipo III, metaloproteinase 9 e inflamação (COX2), os valores obtidos para os grupos controles e dislipidêmicos não mostraram diferenças significativas em nenhum parâmetro (Tabela 3).

Comparação das variáveis Metaloproteinase tipo 2, Anti-8-Hydroxydeoxyguanosine e Densidade de Volume das fibras colágenas III (Vv [fc III]), com os grupos estudados
Variáveis CS COS COT LDL-S LDL-OS LDL-OT p*
MMP 2 28,5 (4,0) 35,3 (9,1)A 49,0 (3,8)A 54,8 (52,0)A 40,5 (9,6)A,B,C,D 46,8 (31,0)A,B,C,E < 0,001
8-OHDg 105,2 (7,6) 70,0 (10,8)A 64,9 (4,7)A 51,7 (0,5)A 15,3 (7,5)A,B,C,D 38,7 (8,4)A,B,C,E < 0,001
Vv[fc III] 0,007 (0,037) 0,003 (0,024) 0,016 (0,067) 0,015 (0,057) 0,013 (0,062) 0,009 (0,043) 0,649

ANOVA. Dados expressos em média e desvio padrão.

diferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo CS;

diferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo COS;

diferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo TOC;

diferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo LDL-S;

diferença estatisticamente significante entre o grupo estudado e o grupo LDL-OS.

MMP2: Metaloproteinase tipo 2; 8OHdG: Anti-8-hidroxi-desoxi-guanosina; Vv [fc III]: densidade de volume das fibras de colágeno III; CS: controle não-ovariectomizado sedentário; COS: controle ovariectomizado sedentário; COT: controle ovariectomizado treinado; LDL-S: nocaute LDL ovariectomizado não sedentário; LDL-OS: nocaute sedimentar ovariectomizado de LDL; LDL-OT: nocaute LDL ovariectomizado treinado.

 Discussão

A atividade física é reconhecida como importante tratamento não farmacológico para várias doenças e condições, inclusive para a dislipidemia e a menopausa. Estudos apontam que as fibras colágenas estão presentes no processo de remodelamento do miocárdio, que ocorre devido ao envelhecimento e a outros fatores.17,18

Nossos dados mostram que, no miocárdio, a expressão das fibras colágenas de tipo III não apresentaram diferenças entre os grupos e parâmetros. Em relação ao colágeno tipo I, a ovariectomia e o treinamento trouxeram uma diminuição dos níveis apresentados em relação ao grupo controle ovariectomizado sedentário. Resultados similares aos encontrados neste estudo verificaram a mesma variável em animais após um período de obesidade induzida por uma dieta rica em gordura insaturada.19 Curiosamente, os achados relatados neste artigo possuem resultados semelhantes apenas mediante à atividade física proposta. Outro estudo no qual o infarto agudo do miocárdio foi induzido em ratos, observou-se o aumento gradativo do colágeno tipos I e III no perído de 4 semanas. A cinética do aumento do colágeno I/III, em combinação com a diminuição das fibras elásticas na área infartada após o IAM, ofereceu evidências de que a função cardíaca pejudicada após o IAM foi decorrente da cura ou do processo de cicatrização pós-infarto, com aumento da rigidez e menor flexibilidade do coração.20

Nossos resultados sugerem que o período de envelhecimento neste estudo parece não interferir no aumento da expressão de fibras colágenas apresentadas em outros estudos.21,22 Entretanto, quando os grupos LDLr-OT foram avaliados, houve nítida redução do volume das fibras colágenas tipo I. Essa verificação ocorreu quando da utilização do treinamento proposto (intensidade ou duração).23,24

As metaloproteinases do tipo 2 e 9 também participam do processo de remodelamento do tecido cardíaco, e estão presentes em várias patologias, como as doenças inflamatórias e cardiovasculares, dentre outras lesões.24-29 A expressão da metalloproteinase tipo 9 não apresentou diferenças entre os grupos e parâmetros. Em relação à metalloproteinase tipo 2, um aumento foi observado no grupo controle, com a ovariectomia e com o treinamento físico, até mesmo na presença da dislipidemia. Esse processo explica o fato de os índices de colágeno não estarem elevados, porque a degradação do colágeno e da matriz extracelular é feita através da atuação das metalloproteinases.25,30-32 A elevação das MMPs em pacientes com dislipidemias, encontrada em alguns estudos, sugere a participação das mesmas no processo de degradação da matriz em placas ateroscleróticas e nas suas rupturas, que fazem com que o núcleo fique exposto.17,33 Além disso, as MMPs são preditoras independentes para a progressão de doença renal e estão associadas independentemente com o aumento do risco de mortalidade.34

A expresão de COX2, neste estudo, não apresentou significância estatística, o que indica que, em todos os grupos e parâmetros, não houve mudanças para esses dados. Assim, nesse parâmetro escolhido para verificar a inflamação, não foram observadas mudanças, o que mostra que os fatores associados aos grupos não interferem nessa avaliação.

O envelhecimento, a menopausa e a dislipidemia são fatores que também causam o estresse oxidative.3-5 Nesta pesquisa, o estresse oxidative foi verificado através da expressão de 8OHdG, e a ovariectomia diminuiu os valores deste parâmetro nos grupos dislipidêmico e controle, o que diverge dos resultados encontrados em outros estudos.5,35 Quando o treinamento físico foi realizado, os valores diminuíram no grupo controle mas, no grupo dislipidêmico, eles apresentaram um aumento. Curiosamente, esse marcador parece não estar associado aos grupos propostos neste modelo experimental.

 Conclusão

Os dados desta pesquisa indicam que o exercício físico influenciou positivamente os grupos controle e dislipidêmico no parâmetro de densidade e volume de fibras colágenas do tipo I e o grupo controle em relação ao estresse oxidativo.

Fontes de financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de São Judas Tadeu sob o número de protocolo 058. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.