Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC 6cp8VYYGdw349cQJPNJfWLF S0066-782X2020000100078 S0066-782X2019005022106 10.36660/abc.20180140 Original Article Euterpe Oleracea Mart. (Açaí) Reduces Oxidative Stress and Improves Energetic Metabolism in Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Rats Alegre Patricia 1 Mathias Livia 1 Lourenço Maria Angelica 1 0000-0003-1159-5030 Santos Priscila Portugal dos 1 Gonçalves Andrea 1 Fernandes Ana Angélica 1 Gaiolla Paula Schmidt Azevedo 1 0000-0002-5980-4367 Minicucci Marcos Ferreira 1 0000-0002-9831-8820 Zornoff Leonardo 1 0000-0003-4412-1990 Paiva Sergio Alberto Rupp 1 0000-0002-2875-9532 Polegato Bertha Furlan 1 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho São Paulo SP Brazil Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - UNESP, São Paulo, SP - Brazil Mailing Address: Bertha Furlan Polegato, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - Faculdade de Medicina Campus de Botucatu - Rubiao Jr s/n. Postal Code 18618-970, Botucatu, SP - Brazil. E-mail: bertha.polegato@unesp.br

Author contributions

Conception and design of the research: Zornoff L, Paiva SAR, Polegato BF; Acquisition of data: Alegre P, Mathias L, Lourenço MA, Gonçalves A, Fernandes AA; Analysis and interpretation of the data: Alegre P, Santos PP, Gaiolla PSA, Minicucci MF, Zornoff L, Paiva SAR, Polegato BF; Statistical analysis: Minicucci MF, Paiva SAR, Polegato BF; Writing of the manuscript: Alegre P, Santos PP, Polegato BF; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Alegre P, Mathias L, Lourenço MA, Santos PP, Gonçalves A, Fernandes AA, Gaiolla PSA, Minicucci MF, Zornoff L, Paiva SAR, Polegato BF.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 14 11 2019 01 2020 114 1 78 86 14 08 2018 15 02 2019 10 03 2019 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Euterpe oleracea Mart. (açaí) is a fruit with high antioxidant capacity and could be an adjuvant strategy to attenuate ischemia-reperfusion injury.

 Objective:

To evaluate the influence of açaí in global ischemia-reperfusion model in rats.

 Methods:

Wistar rats were assigned to 2 groups: Control (C: receiving standard chow; n = 9) and Açaí (A: receiving standard chow supplemented with 5% açaí; n = 10). After six weeks, the animals were subjected to the global ischemia-reperfusion protocol and an isolated heart study to evaluate left ventricular function. Level of significance adopted: 5%.

 Results:

There was no difference between the groups in initial body weight, final body weight and daily feed intake. Group A presented lower lipid hydroperoxide myocardial concentration and higher catalase activity, superoxide dismutase and glutathione peroxidase than group C. We also observed increased myocardial activity of b-hydroxyacyl coenzyme-A dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, citrate synthase, complex I, complex II and ATP synthase in the A group as well as lower activity of the lactate dehydrogenase and phosphofructokinase enzymes. The systolic function was similar between the groups, and the A group presented poorer diastolic function than the C group. We did not observe any difference between the groups in relation to myocardial infarction area, total and phosphorylated NF-kB, total and acetylated FOXO1, SIRT1 and Nrf-2 protein expression.

 Conclusion:

despite improving energy metabolism and attenuating oxidative stress, açai supplementation did not decrease the infarcted area or improve left ventricular function in the global ischemia-reperfusion model.

 Keywords: Euterpe Olerácea Oxidative Stress Energy Metabolism Chemical Reactions Myocardial Ischemia Myocardial Reperfusion Injury Rats Introduction

Although the mortality attributed to ischemic heart disease is declining in some countries, it still presents high morbidity, decreasing the quality of life and increasing healthcare spending.1 Cardiac ischemic events may be due to partial or total tissue ischemia, with reversible or irreversible myocardial dysfunction and cell death. Ischemic periods of more than 20 minutes cause irreversible damage of the cardiomyocytes and inability to functionally recover, even with the restoration of blood flow.2,3

During ischemia, to meet the myocardial energy demand, cellular ATP is generated by glycolysis, leading to intracellular pH reduction.1,4 In parallel, reduced ATP levels interrupt important active pumps in ionic homeostasis, which results in overloaded cytosolic Na+ and Ca2+, making cell repolarization unfeasible and leading to myocardial dysfunction. In addition, it is possible to observe elevated Ca2+ levels in cytosol, which activate enzymes (phospholipases, proteases, endonucleases and ATPases) associated with lipid peroxidation, production of reactive oxygen species (ROS), dysfunction of contractile proteins, and loss of cellular function.4

Although necessary to reverse ischemia, the restoration of blood flow may ultimately be more harmful than the ischemic process itself.1,4,5 During reperfusion, ischemia damages are worsened due to an additional discharge of ROS generated in the mitochondria by the restoration of oxygen flow.5,6 To improve myocardial protection during procedures involving reperfusion injury, attention has been focused on the research of drugs and substances that can prevent cardiac cell damage.7 In this context, we observe great interest in the antioxidant action of natural products such as açaí.8

Açaí (Euterpe oleracea Mart.) is a typical northern Brazilian fruit recently made popular for its high antioxidant capacity related to the presence of phenolic acids, flavonoids and anthocyanins.9-12Açaí pulp compounds consist of 31% flavonoids, 23% phenolic compounds, 11% lignoids and 9% anthocyanins.13 The main anthocyanins in açaí pulp are cyanidin-3-O-glucoside and cyanidin-3-O-rutinoside, which are responsible for the purple color of the fruit.13 Ferulic acid, p-hydroxybenzoic, gallic, protocatechuic, ellagic, vanillic, p-coumaric acids, and ellagic acid glycoside are the most abundant phenolic compounds.13,14

In experimental models, açaí supplementation reduced pulmonary9 and cerebral oxidative stress,15 reduced ROS formation in polymorphonuclear cells,11,16 decreased DNA damage, and presented anti-carcinogenic activity in bladder cancer.10 Oral açaí administration was able to attenuate hypertrophy and left ventricle dysfunction in rats subjected to myocardial infarction,17 but no studies on the effect of açaí in the global ischemia model or its effect on reperfusion injury were found.

The aim of our study was to evaluate the infarct area, left ventricle function, oxidative stress and the activity of enzymes involved in myocardial energy metabolism in the global ischemia-reperfusion model in rats after açaí supplementation.

 Method Study design

The experimental protocol of this study was approved by the Ethical Committee on the Use of Animals of the Botucatu Medical School (CEUA 1111/2014), and it is in accordance with the norms established by the National Council of Control of Animal Experimentation.

Twenty two-months-old male Wistar rats weighing 250-300 g were assigned to two groups: control (C; n = 10) and açaí (A; n = 10). Sample size was determined by convenience based on previous studies that used the same experimental model. Animals were kept in an environment with controlled temperature (23°C) and a 12-hour light-dark cycle in individual boxes to control feed intake. Group C received a standard chow, and the group A a standard one supplemented with 5% açaí18 for six weeks. After the supplementation period, all animals were anesthetized with sodium thiopental (80 mg/kg, IP ) to induce the global ischemia-reperfusion protocol, after which the heart was dissected. A sectional cut of the left ventricle was made to determine the infarct area, and the rest was stored in a freezer at -80°C for further analysis. One rat from the control group was lost due to technical problems during the ischemia-reperfusion protocol and the study was concluded with 9 rats in the control group and 10 rats in the açaí one.

 Preparation of the chow supplemented with açaí

Commercialized açaí pulp (Icefruit®) was defrosted and incorporated into crushed Nuvilab chow (Nuvital®). After homogenization, the chow was pelleted again, dried at 32°C and stored in a freezer at -20°C until the moment of use. The dose used in the study was 5%, as proposed by Fragoso et al.18

Induction of global ischemia, reperfusion and evaluation of cardiac function

The rats were anesthetized with thiopental sodium (80 mg/kg, IP), heparinized (2,000 IU, IP) and subjected to positive pressure ventilation with 100% oxygen. Then, median sternotomy was performed, and the ascending aorta was cannulated to start retrograde perfusion with a modified Krebs-Henseleit solution (NaCl 115 mmol/L, KCl 5.4 mmol/L, CaCl2 1.25 mmol/L; MgSO4 1.2 mmol/L, NaH2PO4 1.15 mmol/L, NaHCO3 25 mmol/L, 11 mmol/L glucose, and 8 mmol/L mannitol). The hearts were transferred to a Langendorff apparatus (Model 830 Hugo Sachs Eletronik, Germany) with perfusion pressure at 75 mmHg. The nutrient solution was constantly oxygenated with a gas mixture of 95% O2 and 5% CO2, and the temperature was maintained at 37°C. A pacemaker was used to maintain controlled heart rate (250 bpm).

Left atrium was removed, and a latex balloon was inserted into the left ventricular cavity. The balloon was coupled to a pressure transducer and to a syringe, which allowed variation in the volume of the balloon. After 10 minutes of stabilization, the hearts were subjected to a 30-minute period of global ischemia followed by 30 minutes of reperfusion.3 Global ischemia was induced by completely stopping the flow of Krebs-Henseleit solution to the heart.

After ischemia and reperfusion periods, an evaluation of left ventricular function was performed. The volume inside the balloon was progressively increased to obtain left ventricular diastolic pressure variation of 0 to 25 mmHg. In addition, for each increase in volume to the balloon, the diastolic and systolic pressure, the maximum left ventricular pressure development rate (+dP/dt) and the maximum left ventricular pressure decrease rate (-dP/dt) were recorded. Diastolic pressure-volume curves were constructed.

 Analysis of infarcted myocardial area

A cross-sectional cut of the left ventricle (LV) was made - 5 mm from the apex, with a thickness of 2 mm - and incubated in phosphate buffer with 7.4 pH and 1% triphenyltetrazolium chloride (Sigma Aldrich) for 30 minutes at 37°C. After that, the sections were incubated in a 10% formaldehyde solution overnight. The ventricle sections were positioned between two glass slides and scanned to obtain the images.

Infarct area was measured through the ImageJ program by planimetry and expressed as the percentage of infarcted over total areas. In live cells the dye is reduced by dehydrogenases and appears with a dark red coloration. Dead cells lacking the enzymes are not stained and remain pale in color.19

Analysis of antioxidant enzymes and lipid hydroperoxide

Samples of approximately 100 mg of LV tissue were homogenized in a sodium phosphate buffer (0.01 M) with a pH of 7.4 and centrifuged for 30 minutes at -4°C; the total proteins in the samples were quantified by Bradford method. The activities of glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD) and catalase in the cardiac tissue were determined by spectrophotometry according to previously described methods.20,21 Lipid hydroperoxide concentration in the cardiac tissue was measured by the oxidation of ammoniacal ferrous sulfate and determined by spectrophotometry.22

Evaluation of energy metabolism

Samples of approximately 100 mg of LV tissue were homogenized in a sodium phosphate buffer (0.1 M, pH 7.0) and centrifuged. The supernatant was used to determine protein concentration and activity of the enzymes b-hydroxyacyl coenzyme A dehydrogenase, phosphofructokinase, lactate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase and citrate synthase.23 The pellet was re-suspended with sodium phosphate buffer (0.1 M) containing 250 mM sucrose and 2 mM EDTA and used to determine the activity of enzymatic complexes of the electron transport chain (complexes I, II and ATP synthase).24 Readings were performed on a microplate reader with controlGen5 2.0 software, and all reagents were obtained from the Sigma-Aldrich laboratory (Saint Louis, USA).

 Western blot

LV samples (80 mg) were homogenized with 1 ml of radio immune precipitation assay extraction buffer (RIPA), centrifuged, and the supernatant was collected. The protein in the samples was quantified by the Bradford method; and the samples were used to determine total and phosphorylated nuclear factor signaling pathway kB (NF-kB), sirtuin 1 (SIRT1), and forkhead box protein O1 (FOXO1) protein expression. To determine the nuclear factor erithroid 2 (Nrf-2), LV samples were extracted with Nuclear Extraction Buffer.25 All samples were diluted in Laemmli buffer.

Protein electrophoresis was performed at 4°C on an 8 to 10% polyacrylamide gel (Mini-Protean 3 Electrophoresis Cell System, Bio-Rad, Hercules, USA). After electrophoresis, the gels were transferred to nitrocellulose membranes (Mini Trans-Blot system, Bio-Rad, Hercules, USA) in a wet transfer system followed by blocking with 5% skim milk powder solution. The membrane was washed, and primary antibodies were added (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Europe). After overnight incubation, the membrane was washed with basal solution, and secondary antibodies were added (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Europe). After 2 hours, the membrane was washed again in basal solution.

Immunodetection was performed with the chemiluminescence method using the SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Kit (ThermoScientific, USA). Photo documentation by ImageQuant LAS 4000 (General Eletrikcs) was used to generate images, which were analyzed in Gel-Pro 32 (Media Cybernetics, Rockville, USA). The results obtained for the target proteins were normalized by glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) expression, and the same control animal was included in all electrophoreses for standardization between the experiments.

 Statistical analysis

Values obtained are presented as the means ± standard deviation (variables with normal distribution) or median and 25 and 75% quartile (variables with non-normal distribution). Normality was verified by the Kolmogorov-Smirnov test. Comparisons between the groups were performed with a non-pared Student’s t-test (variables with normal distribution) or Mann-Whitney test (variables with non-normal distribution). Statistical analysis was carried out by use of the SigmaStat software, considering significance level at 5% for all analyses.

 Results General features

The animals’ initial and final body weight did not differ between groups. Additionally, the left and right ventricles, liver and lung weights were similar between groups. Daily food intake was approximately 26 g for both groups (Table 1).

Morphological variables and feed intake in rats submitted to global myocardial ischemia-reperfusion
C (n = 9) A (n = 10) p-value
Initial BW (g) 274 ± 15 281 ± 11 0.274
Final BW (g) 468 ± 29 448 ± 40 0.225
LV weight (g) 1.03 ± 0.09 1.02 ± 0.07 0.934
RV weight (g) 0.30 ± 0.03 0.29 ± 0.03 0.431
Liver weight (g) 14.4 ± 1.6 12.9 ± 2.6 0.154
Lung weight (g) 1.62 ± 0.03 1.54 ± 0.18 0.359
Daily chow intake (g) 26.1 ± 2.2 26.6 ± 1.8 0.246

C: control group; A: açaí group; BW: body weight; LV: left ventricle; RV: right ventricle. Values are expressed as the means ± standard deviation; p-value: t test.

 Infarcted myocardial area

We observed no difference in the area of myocardial infarction between groups A and C, as observed in Figure 1.

Myocardial infarcted area after global myocardial ischemia-reperfusion. Figure shows left ventricles sections stained with triphenyltetrazolium chloride 1%. White area represents the infarcted myocardium. C: control group; A: açaí group; There is no difference between groups (p = 0.710).

Oxidative stress and myocardial energy metabolism

Açaí supplementation promoted lower myocardial lipid hydroperoxide concentration, and greater activity of the enzymes catalase, SOD and GSH-Px in the myocardium of these rats was observed (Table 2).

Myocardial oxidative stress marker and antioxidant enzymes activity after global ischemia-reperfusion
C (n = 9) A (n = 10) p-value
LH (nmol/g tissue) 330 ± 33 208 ± 22 < 0.001
CAT (µmol/g of tissue) 58.5 ± 6.4 70.0 ± 8.9 0.005
SOD (nmol/mg of protein) 5.7 ± 0.4 8.1 ± 0.7 < 0.001
GSH-Px (nmol/mg of tissue) 20.2 ± 3.3 32.8 ± 4.7 < 0.001

C: control group; A: açaí group; LH: lipid hydroperoxide; CAT: catalase; SOD superoxide dismutase; GSH-Px: glutathione peroxidase. Values are expressed as the means ± standard deviation; p-value: t test.

Regarding myocardium energy metabolism, açaí pulp supplementation promoted lower activity of the enzymes lactate dehydrogenase and phosphofructokinase and higher activity of the enzymes b-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase, citrate synthase and pyruvate dehydrogenase. In addition, we observed higher activity of complex I, complex II and ATP synthase in the group supplemented with açaí (Table 3).

Myocardial activity of enzymes related to energy metabolism after global ischemia-reperfusion protocol
C (n= 9) A (n=10) p-value
β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (nmoL/mg protein) 19.8 ± 3.3 49.8 ± 7.0 < 0.001
Phosphofructokinase (nmoL/g tissue) 181 (160 - 228) 73 (67 - 82) < 0.001
Lactate dehydrogenase (nmoL/mg protein) 147 (145 - 167) 70 (65 - 77) < 0.001
Pyruvate dehydrogenase (nmoL/g tissue) 114 ± 11 176 ± 19 < 0.001
Citrate synthase (nmol/mg protein) 30 (30 - 37) 100 (81 - 117) < 0.001
Complex I (nmol/mg protein) 3.7 ± 1.0 8.0 ± 1.7 < 0.001
Complex II (nmol/mg protein) 2.1 ± 0.6 3.5 ± 0.5 < 0.001
ATP synthase (nmol/mg protein) 22.0 ± 3.9 44.5 ± 6.6 < 0.001

C: control group; A: açaí group. Values are expressed as the means ± standard deviation or median and 1st and 3rd quartile; p-value: t test or Mann-Whitney test.

 Western blot

The expression of the proteins involved in the regulation of the oxidative stress pathway is shown in Figure 2. There was no difference in the expression of total and phosphorylated NF-kB, total and acetylated FOXO1, SIRT1 and Nrf-2. Also, no differences were observed in the NF-kB phosphorylated/total or the FOXO1 acetylated/total ratios.

Protein expression evaluated by Western blot. C: control group; A: açaí group; SIRT1: silent information regulator 1; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; FOXO1: forkhead protein 1; aFOXO1: acetylated forkhead protein 1; Nrf-2: nuclear factor erythroid 2; NF-kB: nuclear factor kappa B; pNF-kB: phosphorylated nuclear factor kappa B. All proteins expressions were normalized by GAPDH. There are no differences between groups in protein expression (p > 0.05).

Isolated heart study

There was no difference between the groups regarding the initial volume of the balloon, the maximum systolic pressure reached, or +dP/dt, which represents systolic function. Group A presented worse -dP/dt than C, signifying impairment of the diastolic function in the rats that received açaí supplementation. The areas under the curves in the diastolic pressure-volume relationship did not differ between groups (Figure 3).

Isolated heart study after global myocardial ischemia-reperfusion. Panel A: C: control group; A: açaí group. Initial volume represents the volume inside the balloon when diastolic pressure was zero; +dP/dt: left ventricular pressure development rate; -dP/dt: left ventricular pressure decrease rate; *different from group C (p = 0.025). Panel B: Relationship between diastolic pressure and volume. The area under the curve and inclination were similar between the groups.

Discussion

Myocardial ischemia-reperfusion injury is one of the leading causes of death worldwide, and it remains a situation for which current clinical therapies are surprisingly deficient.26 Irreversible myocardial injury progresses with increased duration of ischemia; therefore, rapid restoration of blood flow to the ischemic area is essential to save the viable myocardium.1 Reperfusion, however, can induce death of cardiomyocytes regardless of the ischemic episode by a process known as reperfusion injury.1,5,27 Decreased reperfusion injury is a key target in the battle to preserve cardiac function in patients with acute myocardial infarction.

During ischemia-reperfusion, changes such as the release of cytokines, interaction between leukocytes and endothelial cells and production of reactive nitrogen/oxygen species and free radicals (ERs)27 occur in cellular metabolism, which can lead to oxidative damage. ERs are generated from various sources, and the energetic metabolism, more precisely the mitochondrial electron transport chain (ETC), is one of the most important generators of these radicals.5

The continuous production of ERs during metabolic processes is regulated by an antioxidant defense system, which limits the intracellular levels and controls the occurrence of cellular damage. The antioxidant defense system can be enzymatic and non-enzymatic.6,7,28 Non-enzymatic defense system includes antioxidant compounds of dietary origin, like vitamins, mineral and phenolic compounds. Flavonoids and other compounds present in açaí can act as non-enzymatic antioxidant, inactivating reactive species.29

During ischemia, there is an increase in nicotinamide adenine dinucleotide oxidase, nitric oxide synthase, xanthine oxidase, cytochrome P450 and cyclooxygenase,8,30 which may result in increased ER generation; likewise, ischemia is associated with a decrease in different antioxidant enzymes. All these changes may result in oxidative stress. In this study, group A presented higher antioxidants enzymes activity in addition to lower concentration of myocardial lipid hydroperoxide. Lipid hydroperoxide is a marker of oxidative damage and is originated from the oxidative lesion of membrane lipids. Membrane lesion can lead to disturbances in permeability, alteration of the ionic flow and DNA, and impairment of extracellular matrix components.31

In relation to the proteins involved in the regulation of the oxidative stress pathway, the mechanisms by which phenolic dietary compounds act in the prevention of degenerative pathologies have been partially studied. The complex interactions between these dietary molecules and their molecular targets activate signaling pathways of the cellular response, including the NF-kB, Nrf2, SIRT1, and FOXO1.32-34

NF-kB is considered an important transcriptional factor related to oxidative stress. Açaí treatment inhibited NF-kB activation in astrocytes cell culture,35,36 inhibited NF-kB phosphorylation in microglial cells37 and down-regulated gene expression of NF-kB in colon myofibroblasts cell culture.38 Similarly, Nrf2 is an important regulator of antioxidant enzymes production. In response to oxidative stress, Nrf2 dissociates from the Keap1 protein and migrates to the cell nucleus, where it stimulates the production of antioxidant enzymes.39 Myocardial ischemia promotes increased protein expression of Nrf240 and the effect of açaí on Nrf2 expression was verified in an astrocyte culture study in which the fruit reduced the protein expression of Nrf2.41 However, in another study, also with astrocyte culture, açaí administration increased Nrf2 expression,36 showing that the effects of açaí on Nrf2 are not completely understood.

Another cellular balance regulator is the SIRT1 protein, which can act on apoptosis, mitochondrial biogenesis, inflammation, glucose and lipid metabolism, autophagy and adaptations to cellular stress through the deacetylation of target proteins such as NF-kB and FOXO1. When acetylated by SIRT1, FOXO1 leads to increased expression of gluconeogenic genes.33 Increased transcriptional activity of FOXO1 also increases the gene expression of catalase and superoxide dismutase.34 To the best of our knowledge, there are no studies that evaluated the effect of açai on FOXO1 and SIRT1 protein expression.

In the normal adult heart, approximately 95% of ATP production is derived from mitochondrial oxidative phosphorylation. The adult heart normally obtains 50-70% of its ATP from fatty acid b-oxidation instead of glucose oxidation.42 The flavin adenine dinucleotide and nicotinamide adenine dinucleotide produced during fatty acid oxidation are used in mitochondrial ATP synthesis via oxidative phosphorylation.43 This is critically dependent on the maintenance of an electrochemical proton gradient across the inner mitochondrial membrane generated by the extrusion of protons from the matrix to the intermembrane space by complexes I, III and IV, which form the ETC.44

In our study, açaí supplementation led to higher activity of b-hydroxyacyl CoA-dehydrogenase and citrate synthase enzymes, which can characterize higher fatty acid oxidation. Moreover, there was lower activity of phosphofructokinase, the enzyme for glycolysis. This shows that açai supplementation altered the substrate selection for mitochondrial oxidation in reperfusion from glucose to fatty acids, maintaining energy metabolism closer to a physiological situation, as showed previously in an experimental model of renal ischemia-reperfusion.45 Additionally,açaí supplementation increased the activity of complexes I, II and ATP synthase by protecting the damage to mitochondrial complexes. However, fatty acid oxidation decreases the metabolic efficiency of injured hearts.

Interestingly, açaí pulp is composed predominantly by lipids that correspond to 48%.46 Offering more lipids could contribute to increased b-hydroxyacyl CoA-dehydrogenase activity in the treated açaí group. This pattern was observed in the experimental myocardial infarction model that administered a chow rich in lipids.47

Regarding the infarcted area, as expected for the 30-minute period of ischemia, we observed a large infarcted area in our study, approximately 50% in both groups. Previously, supplementation of a diet rich in anthocyanins in an experimental model of ischemia-reperfusion decreased the myocardial infarcted area.48 However, in the present study, açaí supplementation did not reduce infarct size.

Large infarctions usually present with important left ventricular dysfunction resulting from the impairment of cellular processes and changes in cardiac morphology. Increased oxidative stress compromises the plasma membrane permeability of myocytes, the activity of ionic pumps in the plasma membrane and in the sarcoplasmic reticulum, and intracellular calcium transit, compromising both systole and diastole.7 It would be expected that the attenuation of oxidative stress would be followed by an improvement in left ventricular function, as showed in different myocardial damage models.25,49,50 However, this study evidenced that the administration of açaí worsened the diastolic function after cardiac ischemia-reperfusion. This leads us to infer that the ventricular dysfunction observed in this model depends on mechanisms other than oxidative damage. Curiously, a study performed to investigate the effect of anthocyanin extract in global rat heart ischemia-reperfusion suggests that anthocyanin was cardioprotective in low doses and could be cardiotoxic in high ones.51

Additionally, the change in energetic metabolism that occurs in stress situations has a protective role in the myocardium.42 The fact that açai supplementation prevents the use of glucose and favors the maintenance of myocardial metabolism close to normal may have negatively interfered with this adaptive protective mechanism.

Whereas ischemia induces morphological and functional alterations and reperfusion injury can exacerbate these features, the discovery of new drugs, substances or strategies that can minimize cardiac damage is essential. The quantity of açaí that rats took was equivalent to 600 mg for a 60 kg human,52 which is feasible human açaí ingestion. Therefore, açaí could be a potential strategy to attenuate ischemia-reperfusion injury in clinical scenario.

However, there are some limitations that difficult the translational impact of these results. First, rats share several metabolic pathways with humans, but the organisms are quite different. Second, in this study we evaluated a global myocardial ischemia that is not the routine in clinical practice. The ischemic process in humans is the result of a long inflammatory process that can modulate completely different metabolic pathways from our model.53

Conclusion

Açaí supplementation did not decrease the infarcted area nor improve the left ventricular function in the global ischemia-reperfusion model despite improving cardiac energy metabolism and attenuating myocardial oxidative stress, suggesting that these mechanisms may not be the main determinants of the worsened diastolic left ventricular function observed after ischemia and reperfusion with açaísupplementation.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Patricia Alegre, from pela Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Animal Ethics Committee of the Faculdade de Medicina de Botucatu under the protocol number 1111/2014. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013.

 References 1 Ibanez B, Heusch G, Ovize M, Van de Werf F. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. J Am Coll Cardiol. 2015;65(14):1454-71. Ibanez B Heusch G Ovize M Van de Werf F Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury J Am Coll Cardiol 2015 65 14 1454 1471 2 Kals J, Starkopf J, Zilmer M, Pruler T, Pulges K, Hallaste M, et al. Antioxidant UPF1 attenuates myocardial stunning in isolated rat hearts. Int J Cardiol. 2008;125(1):133-5. Kals J Starkopf J Zilmer M Pruler T Pulges K Hallaste M Antioxidant UPF1 attenuates myocardial stunning in isolated rat hearts Int J Cardiol 2008 125 1 133 135 3 Palmer BS, Hadziahmetovic M, Veci T, Angelos MG. Global ischemic duration and reperfusion function in the isolated perfused rat heart. Resuscitation. 2004;62(1):97-106. Palmer BS Hadziahmetovic M Veci T Angelos MG Global ischemic duration and reperfusion function in the isolated perfused rat heart Resuscitation 2004 62 1 97 106 4 Borges JP, Lessa MA. Mechanisms involved in exercise-induced cardioprotection: a systematic review. Arq Bras Cardiol. 2015;105(1):71-81. Borges JP Lessa MA Mechanisms involved in exercise-induced cardioprotection: a systematic review Arq Bras Cardiol 2015 105 1 71 81 5 Cadenas S. ROS and redox signaling in myocardial ischemia-reperfusion injury and cardioprotection. Free Radic Biol Med. 2018 Mar;117:76-89. Cadenas S ROS and redox signaling in myocardial ischemia-reperfusion injury and cardioprotection Free Radic Biol Med 03 2018 117 76 89 6 Martins GF, Siqueira Filho AG, Santos JB, Assuncao CR, Bottino F, Carvalho KG, et al. Trimetazidine on ischemic injury and reperfusion in coronary artery bypass grafting. Arq Bras Cardiol. 2011;97(3):209-16. Martins GF Siqueira AG Filho Santos JB Assuncao CR Bottino F Carvalho KG Trimetazidine on ischemic injury and reperfusion in coronary artery bypass grafting Arq Bras Cardiol 2011 97 3 209 216 7 Torre-Amione G, Kapadia S, Benedict C, Oral H, Young JB, Mann DL. Proinflammatory cytokine levels in patients with depressed left ventricular ejection fraction: a report from the Studies of Left Ventricular Dysfunction (SOLVD). J Am Coll Cardiol. 1996;27(5):1201-6. Torre-Amione G Kapadia S Benedict C Oral H Young JB Mann DL Proinflammatory cytokine levels in patients with depressed left ventricular ejection fraction: a report from the Studies of Left Ventricular Dysfunction (SOLVD) J Am Coll Cardiol 1996 27 5 1201 1206 8 Mahmoudabady M, Haghshenas M, Niazmand S. Extract from Teucrium polium L. protects rat heart against oxidative stress induced by ischemic-reperfusion injury. Adv Biomed Res. 2018 Jan 30;7:15. Mahmoudabady M Haghshenas M Niazmand S Extract from Teucrium polium L. protects rat heart against oxidative stress induced by ischemic-reperfusion injury Adv Biomed Res 30 01 2018 7 15 15 9 Moura RS, Ferreira TS, Lopes AA, Pires KM, Nesi RT, Resende AC, et al. Effects of Euterpe oleracea Mart. (AÇAÍ) extract in acute lung inflammation induced by cigarette smoke in the mouse. Phytomedicine. 2012;19(3-4):262-9. Moura RS Ferreira TS Lopes AA Pires KM Nesi RT Resende AC Effects of Euterpe oleracea Mart. (AÇAÍ) extract in acute lung inflammation induced by cigarette smoke in the mouse Phytomedicine 2012 19 3-4 262 269 10 Fragoso MF, Prado MG, Barbosa L, Rocha NS, Barbisan LF. Inhibition of mouse urinary bladder carcinogenesis by açaí fruit (Euterpe oleraceae Martius) intake. Plant Foods Hum Nutr. 2012;67(3):235-41. Fragoso MF Prado MG Barbosa L Rocha NS Barbisan LF Inhibition of mouse urinary bladder carcinogenesis by açaí fruit (Euterpe oleraceae Martius) intake Plant Foods Hum Nutr 2012 67 3 235 241 11 Guerra JF, Magalhaes CL, Costa DC, Silva ME, Pedrosa ML. Dietary acai modulates ROS production by neutrophils and gene expression of liver antioxidant enzymes in rats. J Clin Biochem Nutr. 2011;49(3):188-94. Guerra JF Magalhaes CL Costa DC Silva ME Pedrosa ML Dietary acai modulates ROS production by neutrophils and gene expression of liver antioxidant enzymes in rats J Clin Biochem Nutr 2011 49 3 188 194 12 Hassimotto NM, Genovese MI, Lajolo FM. Antioxidant activity of dietary fruits, vegetables, and commercial frozen fruit pulps. J Agric Food Chem. 2005;53(8):2928-35. Hassimotto NM Genovese MI Lajolo FM Antioxidant activity of dietary fruits, vegetables, and commercial frozen fruit pulps J Agric Food Chem 2005 53 8 2928 2935 13 Yamaguchi KK, Pereira LF, Lamarão CV, Lima ES, da Veiga-Junior VF. Amazon acai: chemistry and biological activities: a review. Food Chem. 2015 Jul 15;179:137-51. Yamaguchi KK Pereira LF Lamarão CV Lima ES da VF Veiga-Junior Amazon acai: chemistry and biological activities: a review Food Chem 15 07 2015 179 137 151 14 da Silveira TFF, Godoy HT. Non-anthocyanin phenolic compounds in açaí (Euterpe oleracea Mart.) juice by ultrahigh-performance liquid chromatography-diode array detector (UHPLC-DAD): a multivariate optimization. J Chromatogr Sci. 2019;57(2):139-48. da Silveira TFF Godoy HT Non-anthocyanin phenolic compounds in açaí (Euterpe oleracea Mart.) juice by ultrahigh-performance liquid chromatography-diode array detector (UHPLC-DAD): a multivariate optimization J Chromatogr Sci 2019 57 2 139 148 15 Spada PD, Dani C, Bortolini GV, Funchal C, Henriques JA, Salvador M. Frozen fruit pulp of Euterpe oleraceae Mart. (Acai) prevents hydrogen peroxide-induced damage in the cerebral cortex, cerebellum, and hippocampus of rats. J Med Food. 2009;12(5):1084-8. Spada PD Dani C Bortolini GV Funchal C Henriques JA Salvador M Frozen fruit pulp of Euterpe oleraceae Mart. (Acai) prevents hydrogen peroxide-induced damage in the cerebral cortex, cerebellum, and hippocampus of rats J Med Food 2009 12 5 1084 1088 16 Wu X, Schauss AG. Mitigation of inflammation with foods. J Agric Food Chem. 2012;60(27):6703-17. Wu X Schauss AG Mitigation of inflammation with foods J Agric Food Chem 2012 60 27 6703 6717 17 Zapata-Sudo G, da Silva JS, Pereira SL, Souza PJ, de Moura RS, Sudo RT. Oral treatment with Euterpe oleracea Mart. (acai) extract improves cardiac dysfunction and exercise intolerance in rats subjected to myocardial infarction. BMC Complement Altern Med. 2014 Jul 8;14:227. Zapata-Sudo G da Silva JS Pereira SL Souza PJ de Moura RS Sudo RT Oral treatment with Euterpe oleracea Mart. (acai) extract improves cardiac dysfunction and exercise intolerance in rats subjected to myocardial infarction BMC Complement Altern Med 08 07 2014 14 227 227 18 Fragoso MF, Romualdo GR, Ribeiro DA, Barbisan LF. Acai (Euterpe oleracea Mart.) feeding attenuates dimethylhydrazine-induced rat colon carcinogenesis. Food Chem Toxicol. 2013 Aug;58:68-76. Fragoso MF Romualdo GR Ribeiro DA Barbisan LF Acai (Euterpe oleracea Mart.) feeding attenuates dimethylhydrazine-induced rat colon carcinogenesis Food Chem Toxicol 08 2013 58 68 76 19 Wang X, Yuan B, Cheng B, Liu Y, Zhang B, Lin X, et al. Crocin alleviates myocardial ischemia/reperfusion-induced endoplasmic reticulum stress via regulation of MIR-34A/SIRT1/NRF2 pathway. Shock. 2019;51(1):123-130. Wang X Yuan B Cheng B Liu Y Zhang B Lin X Crocin alleviates myocardial ischemia/reperfusion-induced endoplasmic reticulum stress via regulation of MIR-34A/SIRT1/NRF2 pathway Shock 2019 51 1 123 130 20 Nakamura A, Minakami S. Synthesis of catalase in liver slices from aminotriazole-pretreated rats. J Biochem. 1974;75(6):1373-5. Nakamura A Minakami S Synthesis of catalase in liver slices from aminotriazole-pretreated rats J Biochem 1974 75 6 1373 1375 21 Ewing JF, Janero DR. Microplate superoxide dismutase assay employing a nonenzymatic superoxide generator. Anal Biochem. 1995;232(2):243-8. Ewing JF Janero DR Microplate superoxide dismutase assay employing a nonenzymatic superoxide generator Anal Biochem 1995 232 2 243 248 22 Jiang ZY, Woollard AC, Wolff SP. Lipid hydroperoxide measurement by oxidation of Fe2+ in the presence of xylenol orange. Comparison with the TBA assay and an iodometric method. Lipids. 1991;26(10):853-6. Jiang ZY Woollard AC Wolff SP Lipid hydroperoxide measurement by oxidation of Fe2+ in the presence of xylenol orange. Comparison with the TBA assay and an iodometric method Lipids 1991 26 10 853 856 23 Bass A, Brdiczka D, Eyer P, Hofer S, Pette D. Metabolic differentiation of distinct muscle types at the level of enzymatic organization. Eur J Biochem. 1969;10(2):198-206. Bass A Brdiczka D Eyer P Hofer S Pette D Metabolic differentiation of distinct muscle types at the level of enzymatic organization Eur J Biochem 1969 10 2 198 206 24 Cassina A, Radi R. Differential inhibitory action of nitric oxide and peroxynitrite on mitochondrial electron transport. Arch Biochem Biophys. 1996;328(2):309-16. Cassina A Radi R Differential inhibitory action of nitric oxide and peroxynitrite on mitochondrial electron transport Arch Biochem Biophys 1996 328 2 309 316 25 Lustosa BB, Polegato B, Minicucci M, Rafacho B, Santos PP, Fernandes AA, et al. Green tea (Cammellia sinensis) attenuates ventricular remodeling after experimental myocardial infarction. Int J Cardiol. 2016 Dec 15;225:147-53. Lustosa BB Polegato B Minicucci M Rafacho B Santos PP Fernandes AA Green tea (Cammellia sinensis) attenuates ventricular remodeling after experimental myocardial infarction Int J Cardiol 15 12 2016 225 147 153 26 Lefer DJ, Marbán E. Is cardioprotection dead? Circulation. 2017;136(1):98-109. Lefer DJ Marbán E Is cardioprotection dead? Circulation 2017 136 1 98 109 27 Pell VR, Chouchani ET, Frezza C, Murphy MP, Krieg T. Succinate metabolism: a new therapeutic target for myocardial reperfu Pell VR Chouchani ET Frezza C Murphy MP Krieg T Succinate metabolism: a new therapeutic target for myocardial reperfu 28 Dhalla NS, Elmoselhi AB, Hata T, Makino N. Status of myocardial antioxidants in ischemia-reperfusion injury. Cardiovasc Res. 2000;47(3):446-56. Dhalla NS Elmoselhi AB Hata T Makino N Status of myocardial antioxidants in ischemia-reperfusion injury Cardiovasc Res 2000 47 3 446 456 29 Mertens-Talcott SU, Rios J, Jilma-Stohlawetz P, Pacheco-Palencia LA, Meibohm B, Talcott ST, et al. Pharmacokinetics of anthocyanins and antioxidant effects after the consumption of anthocyanin-rich acai juice and pulp (Euterpe oleracea Mart.) in human healthy volunteers. J Agric Food Chem. 2008;56(17):7796-802. Mertens-Talcott SU Rios J Jilma-Stohlawetz P Pacheco-Palencia LA Meibohm B Talcott ST Pharmacokinetics of anthocyanins and antioxidant effects after the consumption of anthocyanin-rich acai juice and pulp (Euterpe oleracea Mart.) in human healthy volunteers J Agric Food Chem 2008 56 17 7796 7802 30 Raedschelders K, Ansley DM, Chen DD. The cellular and molecular origin of reactive oxygen species generation during myocardial ischemia and reperfusion. Pharmacol Ther. 2012;133(2):230-55. Raedschelders K Ansley DM Chen DD The cellular and molecular origin of reactive oxygen species generation during myocardial ischemia and reperfusion Pharmacol Ther 2012 133 2 230 255 31 Pi J, Bai Y, Reece JM, Williams J, Liu D, Freeman ML, et al. Molecular mechanism of human Nrf2 activation and degradation: role of sequential phosphorylation by protein kinase CK2. Free Radic Biol Med. 2007;42(12):1797-806. Pi J Bai Y Reece JM Williams J Liu D Freeman ML Molecular mechanism of human Nrf2 activation and degradation: role of sequential phosphorylation by protein kinase CK2 Free Radic Biol Med 2007 42 12 1797 1806 32 Crozier A, Jaganath IB, Clifford MN. Dietary phenolics: chemistry, bioavailability and effects on health. Nat Prod Rep. 2009;26(8):1001-43. Crozier A Jaganath IB Clifford MN Dietary phenolics: chemistry, bioavailability and effects on health Nat Prod Rep 2009 26 8 1001 1043 33 Albertoni G, Schor N. Resveratrol plays important role in protective mechanisms in renal disease-mini-review. J Bras Nefrol. 2015;37(1):106-14. Albertoni G Schor N Resveratrol plays important role in protective mechanisms in renal disease-mini-review J Bras Nefrol 2015 37 1 106 114 34 Ma Q. Transcriptional responses to oxidative stress: pathological and toxicological implications. Pharmacol Ther. 2010;125(3):376-93. Ma Q Transcriptional responses to oxidative stress: pathological and toxicological implications Pharmacol Ther 2010 125 3 376 393 35 Noratto GD, Angel-Morales G, Talcott ST, Mertens-Talcott SU. Polyphenolics from açaí (Euterpe oleracea Mart.) and red muscadine grape (Vitis rotundifolia) protect human umbilical vascular Endothelial cells (HUVEC) from glucose- and lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation and target microRNA-126. J Agric Food Chem. 2011;59(14):7999-8012. Noratto GD Angel-Morales G Talcott ST Mertens-Talcott SU Polyphenolics from açaí (Euterpe oleracea Mart.) and red muscadine grape (Vitis rotundifolia) protect human umbilical vascular Endothelial cells (HUVEC) from glucose- and lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation and target microRNA-126 J Agric Food Chem 2011 59 14 7999 8012 36 Ajit D, Simonyi A, Li R, Chen Z, Hannink M, Fritsche KL, et al. Phytochemicals and botanical extracts regulate NF-kB and Nrf2/ARE reporter activities in DI TNC1 astrocytes. Neurochem Int. 2016 Jul;97:49-56. Ajit D Simonyi A Li R Chen Z Hannink M Fritsche KL Phytochemicals and botanical extracts regulate NF-kB and Nrf2/ARE reporter activities in DI TNC1 astrocytes Neurochem Int 07 2016 97 49 56 37 Poulose SM, Fisher DR, Larson J, Bielinski DF, Rimando AM, Carey AN, et al. Anthocyanin-rich açai (Euterpe oleracea Mart.) fruit pulp fractions attenuate inflammatory stress signaling in mouse brain BV-2 microglial cells. J Agric Food Chem. 2012;60(4):1084-93. Poulose SM Fisher DR Larson J Bielinski DF Rimando AM Carey AN Anthocyanin-rich açai (Euterpe oleracea Mart.) fruit pulp fractions attenuate inflammatory stress signaling in mouse brain BV-2 microglial cells J Agric Food Chem 2012 60 4 1084 1093 38 Dias MM, Martino HS, Noratto G, Roque-Andrade A, Stringheta PC, Talcott S, et al. Anti-inflammatory activity of polyphenolics from açai (Euterpe oleracea Martius) in intestinal myofibroblasts CCD-18Co cells. Food Funct. 2015;6(10):3249-56. Dias MM Martino HS Noratto G Roque-Andrade A Stringheta PC Talcott S Anti-inflammatory activity of polyphenolics from açai (Euterpe oleracea Martius) in intestinal myofibroblasts CCD-18Co cells Food Funct 2015 6 10 3249 3256 39 Bai H, Wang Z, Cui J, Yun K, Zhang H, Liu RH, et al. Synergistic radiation protective effect of purified Auricularia auricular-judae polysaccharide (AAP IV) with grape seed procyanidins. Molecules. 2014;19(12):20675-94. Bai H Wang Z Cui J Yun K Zhang H Liu RH Synergistic radiation protective effect of purified Auricularia auricular-judae polysaccharide (AAP IV) with grape seed procyanidins Molecules 2014 19 12 20675 20694 40 Zhang Y, Sano M, Shinmura K, Tamaki K, Katsumata Y, Matsuhashi T, et al. 4-hydroxy-2-nonenal protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via the Nrf2-dependent pathway. J Mol Cell Cardiol. 2010;49(4):576-86. Zhang Y Sano M Shinmura K Tamaki K Katsumata Y Matsuhashi T 4-hydroxy-2-nonenal protects against cardiac ischemia-reperfusion injury via the Nrf2-dependent pathway J Mol Cell Cardiol 2010 49 4 576 586 41 da Silva Santos V, Bisen-Hersh E, Yu Y, Cabral IS, Nardini V, Culbreth M, et al. Anthocyanin-rich açaí (Euterpe oleracea Mart.) extract attenuates manganese-induced oxidative stress in rat primary astrocyte cultures. J Toxicol Environ Health A. 2014;77(7):390-404. da Silva Santos V Bisen-Hersh E Yu Y Cabral IS Nardini V Culbreth M Anthocyanin-rich açaí (Euterpe oleracea Mart.) extract attenuates manganese-induced oxidative stress in rat primary astrocyte cultures J Toxicol Environ Health A 2014 77 7 390 404 42 Azevedo PS, Minicucci MF, Santos PP, Paiva SAR, Zornoff LAM. Energy metabolism in cardiac remodeling and heart failure. Cardiol Rev. 2013;21(3):135-40. Azevedo PS Minicucci MF Santos PP Paiva SAR Zornoff LAM Energy metabolism in cardiac remodeling and heart failure Cardiol Rev 2013 21 3 135 140 43 Lopaschuk GD, Ussher JR, Folmes CD, Jaswal JS, Stanley WC. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiol Rev. 2010;90(1):207-58. Lopaschuk GD Ussher JR Folmes CD Jaswal JS Stanley WC Myocardial fatty acid metabolism in health and disease Physiol Rev 2010 90 1 207 258 44 Hinkle PC. P/O ratios of mitochondrial oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 2005;1706(1-2):1-11. Hinkle PC P/O ratios of mitochondrial oxidative phosphorylation Biochim Biophys Acta 2005 1706 1-2 1 11 45 El Morsy EM, Ahmed MA, Ahmed AA. Attenuation of renal ischemia/reperfusion injury by acai extract preconditioning in a rat model. Life Sci. 2015 Feb 15;123:35-42. El Morsy EM Ahmed MA Ahmed AA Attenuation of renal ischemia/reperfusion injury by acai extract preconditioning in a rat model Life Sci 15 02 2015 123 35 42 46 Alessandra-Perini J, Rodrigues-Baptista KC, Machado DE, Nasciutti LE, Perini JA. Anticancer potential, molecular mechanisms and toxicity of Euterpe oleracea extract (açaí): a systematic review. PLoS One. 2018;13(7):e0200101. Alessandra-Perini J Rodrigues-Baptista KC Machado DE Nasciutti LE Perini JA Anticancer potential, molecular mechanisms and toxicity of Euterpe oleracea extract (açaí): a systematic review PLoS One 2018 13 7 e0200101 47 Ardisson LP, Minicucci MF, Azevedo PS, Chiuso-Minicucci F, Matsubara BB, Matsubara LS, et al. Influence of AIN-93 diet on mortality and cardiac remodeling after myocardial infarction in rats. Int J Cardiol. 2012;156(3):265-9. Ardisson LP Minicucci MF Azevedo PS Chiuso-Minicucci F Matsubara BB Matsubara LS Influence of AIN-93 diet on mortality and cardiac remodeling after myocardial infarction in rats Int J Cardiol 2012 156 3 265 269 48 Toufektsian MC, de Lorgeril M, Nagy N, Salen P, Donati MB, Giordano L, et al. Chronic dietary intake of plant-derived anthocyanins protects the rat heart against ischemia-reperfusion injury. J Nutr. 2008;138(4):747-52. Toufektsian MC de Lorgeril M Nagy N Salen P Donati MB Giordano L Chronic dietary intake of plant-derived anthocyanins protects the rat heart against ischemia-reperfusion injury J Nutr 2008 138 4 747 752 49 Carvalho PB, Gonçalves AF, Alegre PH, Azevedo PS, Roscani MG, Bergamasco CM, et al. Pamidronate attenuates oxidative stress and energetic metabolism changes but worsens functional outcomes in acute doxorubicin-induced cardiotoxicity in rats. Cell Physiol Biochem. 2016;40(3-4):431-42. Carvalho PB Gonçalves AF Alegre PH Azevedo PS Roscani MG Bergamasco CM Pamidronate attenuates oxidative stress and energetic metabolism changes but worsens functional outcomes in acute doxorubicin-induced cardiotoxicity in rats Cell Physiol Biochem 2016 40 3-4 431 442 50 Zornoff LA, Matsubara LS, Matsubara BB, Okoshi MP, Okoshi K, Dal Pai-Silva M, et al. Beta-carotene supplementation attenuates cardiac remodeling induced by one-month tobacco-smoke exposure in rats.Toxicol Sci. 2006;90(1):259-66. Zornoff LA Matsubara LS Matsubara BB Okoshi MP Okoshi K Dal Pai-Silva M Beta-carotene supplementation attenuates cardiac remodeling induced by one-month tobacco-smoke exposure in rats Toxicol Sci 2006 90 1 259 266 51 Ziberna L, Lunder M, Moze S, Vanzo A, Tramer F, Passamonti S, et al. Acute cardioprotective and cardiotoxic effects of bilberry anthocyanins in ischemia-reperfusion injury: beyond concentration-dependent antioxidant activity. Cardiovasc Toxicol. 2010;10(4):283-94. Ziberna L Lunder M Moze S Vanzo A Tramer F Passamonti S Acute cardioprotective and cardiotoxic effects of bilberry anthocyanins in ischemia-reperfusion injury: beyond concentration-dependent antioxidant activity Cardiovasc Toxicol 2010 10 4 283 294 52 Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J. 2008;22(3):659-61. Reagan-Shaw S Nihal M Ahmad N Dose translation from animal to human studies revisited FASEB J 2008 22 3 659 661 53 Garcia LR, Polegato BF, Zornoff LAM. Challenges of translational science. Arq Bras Cardiol. 2017;108(5):388-9. Garcia LR Polegato BF Zornoff LAM Challenges of translational science Arq Bras Cardiol 2017 108 5 388 389 Artigo Original Euterpe Oleracea Mart. (Açaí) Reduz o Estresse Oxidativo e Melhora o Metabolismo Energético da Lesão de Isquemia-Reperfusão Miocárdica Em Ratos Alegre Patricia 1 Mathias Livia 1 Lourenço Maria Angelica 1 0000-0003-1159-5030 Santos Priscila Portugal dos 1 Gonçalves Andrea 1 Fernandes Ana Angélica 1 Gaiolla Paula Schmidt Azevedo 1 0000-0002-5980-4367 Minicucci Marcos Ferreira 1 0000-0002-9831-8820 Zornoff Leonardo 1 0000-0003-4412-1990 Paiva Sergio Alberto Rupp 1 0000-0002-2875-9532 Polegato Bertha Furlan 1 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - UNESP, São Paulo, SP - Brasil Correspondência: Bertha Furlan Polegato, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - Faculdade de Medicina Campus de Botucatu - Rubiao Jr s/n. CEP 18618-970, Botucatu, SP - Brasil. E-mail: bertha.polegato@unesp.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Zornoff L, Paiva SAR, Polegato BF; Obtenção de dados: Alegre P, Mathias L, Lourenço MA, Gonçalves A, Fernandes AA; Análise e interpretação dos dados: Alegre P, Santos PP, Gaiolla PSA, Minicucci MF, Zornoff L, Paiva SAR, Polegato BF; Análise estatística: Minicucci MF, Paiva SAR, Polegato BF; Redação do manuscrito: Alegre P, Santos PP, Polegato BF; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Alegre P, Mathias L, Lourenço MA, Santos PP, Gonçalves A, Fernandes AA, Gaiolla PSA, Minicucci MF, Zornoff L, Paiva SAR, Polegato BF.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

Euterpe oleracea Mart. (açaí) é uma fruta com alta capacidade antioxidante e pode ser uma estratégia adjuvante para atenuar a lesão de isquemia-reperfusão.

 Objetivo:

Avaliar a influência do açaí no modelo global de isquemia-reperfusão em ratos.

Metodologia: Ratos Wistar foram divididos em 2 grupos: Controle (C: recebendo ração padrão; n = 9) e Açaí (A: recebendo ração padrão suplementada com 5% de açaí; n = 10). Após seis semanas, os animais foram submetidos ao protocolo global de isquemia-reperfusão e a estudo do coração isolado para avaliar a função ventricular esquerda. Nível de significância adotado: 5%.

 Resultados:

Não houve diferença entre os grupos quanto ao peso corporal inicial e final, e a ingestão diária de ração. O grupo A apresentou menor concentração miocárdica de hidroperóxido lipídico e maior atividade de catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase do que o grupo C. Também observamos aumento da atividade miocárdica da b-hidroxiacil coenzima-A desidrogenase, piruvato desidrogenase, citrato sintase, complexo I, complexo II e ATP sintase no grupo A, bem como menor atividade das enzimas lactato desidrogenase e fosfofructoquinase. A função sistólica foi semelhante entre os grupos, e o grupo A apresentou função diastólica pior que C. Não foram observadas diferenças entre os grupos em relação à área de infarto do miocárdio, e expressão proteica de NF-kB total e fosforilado, e das proteínas FOXO1, SIRT1 e Nrf-2.

 Conclusão:

apesar de melhorar o metabolismo energético e atenuar o estresse oxidativo, a suplementação de açaí não diminuiu a área infartada nem melhorou a função ventricular esquerda no modelo global de isquemia-reperfusão.

 Palavras-chave: Euterpe oleracea Mart. Estresse Oxidativo Metabolismo Energético Isquemia Miocárdica Injúria de por Reperfusão Miocárdica Ratos Introdução

Embora a mortalidade atribuída à cardiopatia isquêmica esteja diminuindo em alguns países, ela ainda apresenta alta morbidade, diminuindo a qualidade de vida e aumentando os gastos em saúde.1 Os eventos isquêmicos cardíacos podem ser causados por isquemia parcial ou total do tecido, com disfunção miocárdica reversível ou irreversível e morte celular. Períodos isquêmicos superiores a 20 minutos causam danos irreversíveis aos cardiomiócitos e incapacidade de recuperação funcional, mesmo com a restauração do fluxo sanguíneo.2,3

Durante a isquemia, para atender à demanda energética do miocárdio, o ATP celular é gerado pela glicólise, levando à redução do pH intracelular.1,4 Paralelamente, níveis reduzidos de ATP interrompem importantes bombas ativas na homeostase iônica, o que resulta em sobrecarga de Na+ e Ca2+ citosólico, inviabilizando a repolarização celular e levando à disfunção miocárdica. Além disso, é possível observar níveis elevados de Ca2+ no citosol que pode ativar diversas enzimas (fosfolipases, proteases, endonucleases e ATPases) associadas à peroxidação lipídica, à produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), à disfunção de proteínas contráteis e à perda da função celular.4

Embora seja necessário reverter a isquemia, a restauração do fluxo sanguíneo pode ser mais prejudicial do que o próprio processo isquêmico.1,4,5 Durante a reperfusão, os danos isquêmicos são agravados devido a uma descarga adicional de ERO gerada nas mitocôndrias pela restauração do fluxo de oxigênio.5,6 Tem ganhado atenção a pesquisa de drogas e substâncias que possam prevenir danos às células cardíacas em situações e procedimentos que envolvem lesão por reperfusão.7 Nesse contexto, observamos grande interesse na ação antioxidante de produtos naturais como o açaí.8

O açaí (Euterpe oleracea Mart.) é uma fruta típica do norte do Brasil recentemente popularizada por sua alta capacidade antioxidante relacionada à presença de ácidos fenólicos, flavonoides e antocianinas.9-12 Os compostos de polpa de açaí consistem em 31% de flavonoides, 23% de compostos fenólicos, 11% de lignoides e 9% de antocianinas.13 As principais antocianinas na polpa do açaí são a cianidina-3-O-glucosídeo e a cianidina-3-O-rutinosídeo, responsáveis pela cor púrpura da fruta.13 Os compostos fenólicos mais abundantes são o ácido ferúlico, os ácidos p-hidroxibenzóico, gálico, protocatecúico, elágico, vanílico, p-coumarico e o glicosídeo do ácido elágico.13,14

Em modelos experimentais, a suplementação de açaí reduziu o estresse oxidativo pulmonar9 e cerebral,15 reduziu a formação de ERO em células polimorfonucleares,11,16 diminuiu o dano ao DNA e apresentou atividade anticarcinogênica no câncer de bexiga.10 A administração oral de açaí foi capaz de atenuar quadros de hipertrofia e disfunção do ventrículo esquerdo em ratos submetidos a infarto do miocárdio,17 mas não foram encontrados estudos sobre o efeito do açaí no modelo global de isquemia ou seu efeito na lesão de reperfusão.

O objetivo do nosso estudo foi avaliar a área de infarto, a função do ventrículo esquerdo, o estresse oxidativo e a atividade de enzimas envolvidas no metabolismo energético do miocárdio no modelo global de isquemia-reperfusão em ratos após suplementação de açaí.

 Método Desenho do estudo

O protocolo experimental deste estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Uso de Animais da Faculdade de Medicina de Botucatu (CEUA 1111/2014), e está em conformidade com as normas estabelecidas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal.

Vinte ratos Wistar machos com 2 meses de idade, pesando 250-300 g, foram divididos em dois grupos: controle (C; n = 10) e açaí (A; n = 10). O tamanho da amostra foi determinado por conveniência com base em estudos anteriores que utilizaram o mesmo modelo experimental. Os animais foram mantidos em ambiente com temperatura controlada (23°C) e ciclo claro-escuro de 12 horas em caixas individuais para controlar a ingestão de alimentos. O grupo C recebeu ração padrão e o grupo A foi suplementado com 5% de açaí18 por seis semanas. Após o período de suplementação, todos os animais foram anestesiados com tiopental de sódio (80 mg/kg, IP) para induzir o protocolo de isquemia global-reperfusão, após o qual o coração foi dissecado. Foi feito um corte seccional do ventrículo esquerdo para determinar a área de infarto e o restante foi armazenado em um freezer a -80°C para análise posterior. Um rato do grupo controle foi perdido devido a problemas técnicos durante o protocolo de isquemia-reperfusão e o estudo foi concluído com 9 ratos no grupo controle e 10 ratos no grupo açaí.

 Preparação da ração suplementada com açaí

A polpa de açaí comercializada (Icefruit®) foi descongelada e incorporada na ração Nuvilab triturada (Nuvital®). Após a homogeneização, a ração foi novamente peletizada, seca a 32°C e armazenada em freezer a -20°C até o momento do uso. A dose utilizada no estudo foi de 5%, conforme proposto por Fragoso et al.18

Indução de isquemia global, reperfusão e avaliação da função cardíaca

Os ratos foram anestesiados com tiopental de sódio (80 mg/kg, IP), heparinizados (2.000 UI, IP) e submetidos a ventilação com pressão positiva com oxigênio a 100%. Em seguida, foi realizada esternotomia mediana e a aorta ascendente foi canulada para iniciar a perfusão retrógrada com solução de Krebs-Henseleit modificada (NaCl 115 mmol/L, KCl 5,4 mmol/L, CaCl2 1,25 mmol/L; MgSO4 1,2 mmol/L, NaH2PO4 1,15 mmol/L, NaHCO3 25 mmol/L, 11 mmol/L de glicose e 8 mmol/L de manitol). Os corações foram transferidos para aparato de Langendorff (Modelo 830 Hugo Sachs Eletronik, Alemanha) com pressão de perfusão a 75 mmHg. A solução nutritiva foi constantemente oxigenada com uma mistura gasosa de 95% de O2 e 5% de CO2, e a temperatura foi mantida a 37°C. Um marcapasso foi utilizado para manter a frequência cardíaca sob controle (250 bpm).

O átrio esquerdo foi removido e um balão de látex foi inserido na cavidade ventricular esquerda. O balão foi acoplado a um transdutor de pressão e a uma seringa, o que permitiu variação no volume do balão. Após 10 minutos de estabilização, os corações foram submetidos a um período de 30 minutos de isquemia global, seguido de 30 minutos de reperfusão.3 A isquemia global foi induzida pela interrupção completa do fluxo da solução de Krebs-Henseleit para o coração.

Após os períodos de isquemia e reperfusão, foi realizada uma avaliação da função ventricular esquerda. O volume dentro do balão foi aumentado progressivamente para obter variação da pressão diastólica do ventrículo esquerdo de 0 a 25 mmHg. Além disso, para cada aumento de volume no balão, foram registradas as pressões diastólica e sistólica, a taxa máxima de desenvolvimento da pressão ventricular esquerda (+dP/dt) e a taxa máxima de diminuição da pressão ventricular esquerda (-dP/dt). Curvas de pressão-volume diastólica foram construídas.

 Análise da área miocárdica infartada

Foi realizado um corte transversal do ventrículo esquerdo (VE) - 5 mm do ápice, com espessura de 2 mm - e incubado em tampão de fosfato a 7,4 pH e cloreto de trifeniltetrazólio a 1% (Sigma Aldrich) por 30 minutos a 37°C. Depois disso, as seções foram incubadas em uma solução de formaldeído a 10% durante a noite. As seções ventriculares foram posicionadas entre duas lâminas de vidro e digitalizadas para obtenção das imagens.

A área de infarto foi medida através do programa ImageJ por planimetria e expressa como a porcentagem de infarto em relação à área total. Nas células vivas, o corante é reduzido pelas desidrogenases e aparece com uma coloração vermelha escura. As células mortas sem as enzimas não são coradas e permanecem pálidas.19

Análise de enzimas antioxidantes e hidroperóxido lipídico

Amostras de aproximadamente 100 mg de tecido do VE foram homogeneizadas em um tampão de fosfato de sódio (0,01 M) com um pH de 7,4 e centrifugadas por 30 minutos a -4°C; as proteínas totais nas amostras foram quantificadas pelo método de Bradford. As atividades de glutationa peroxidase (GSH-Px), superóxido dismutase (SOD) e catalase no tecido cardíaco foram determinadas por espectrofotometria, de acordo com os métodos descritos anteriormente.20,21 A concentração de hidroperóxido lipídico no tecido cardíaco foi medida pela oxidação do sulfato ferroso amoniacal e determinada por espectrofotometria.22

Avaliação do metabolismo energético

Amostras de aproximadamente 100 mg de tecido do VE foram homogeneizadas em tampão de fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0) e centrifugadas. O sobrenadante foi utilizado para determinar a concentração proteica e a atividade das enzimas b-hidroxiacil coenzima A desidrogenase, fosfofructoquinase, lactato desidrogenase, piruvato desidrogenase e citrato sintase.23 O sedimento foi ressuspenso com tampão de fosfato de sódio (0,1 M) contendo sacarose 250 mM e EDTA 2 mM, e foi utilizado para determinar a atividade de complexos enzimáticos da cadeia de transporte de elétrons (complexos I, II e ATP sintase).24 As leituras foram realizadas em um leitor de microplacas com o software controlGen5 2.0, e todos os reagentes foram obtidos no laboratório Sigma-Aldrich (Saint Louis, EUA).

 <italic>Western blot</italic>

As amostras de VE (80 mg) foram homogeneizadas com 1 ml de tampão de extração do ensaio de precipitação por radioimunidade (RIPA), centrifugadas e o sobrenadante foi coletado. A proteína nas amostras foi quantificada pelo método de Bradford e as amostras foram usadas para determinar a expressão proteica do fator nuclear kB (NF-kB) total e fosforilado, sirtuina 1 (SIRT1) e proteína forkhead box O1 (FOXO1). Para determinar o fator nuclear eritroid 2 (Nrf-2), as amostras de VE foram extraídas com o tampão de extração nuclear.25 Todas as amostras foram diluídas em tampão Laemmli.

A eletroforese de proteínas foi realizada a 4°C em gel de poliacrilamida de 8 a 10% (Mini-Protean 3 Electroforesis Cell System, Bio-Rad, Hercules, EUA). Após eletroforese, os géis foram transferidos para as membranas de nitrocelulose (sistema Mini Trans-Blot, Bio-Rad, Hercules, EUA) em um sistema de transferência úmida seguido de bloqueio com solução de leite em pó desnatado a 5%. A membrana foi lavada e os anticorpos primários foram adicionados (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Europa). Após incubação durante a noite, a membrana foi lavada com solução basal e foram adicionados anticorpos secundários (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Europa). Após 2 horas, a membrana foi lavada novamente em solução basal.

A imunodetecção foi realizada com o método de quimioluminescência usando o Kit SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Kit (ThermoScientific, EUA). O fotodocumentador ImageQuant LAS 4000 (General Eletrikcs) foi utilizado para gerar imagens, que foram analisadas pelo programa Gel-Pro 32 (Media Cybernetics, Rockville, EUA). Os resultados obtidos para as proteínas alvo foram normalizados pela expressão de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), e o mesmo animal controle foi incluído em todas as eletroforeses para padronização entre os experimentos.

 Análise estatística

Os valores obtidos são apresentados como média ± desvio padrão (variáveis com distribuição normal) ou mediana e quartil 25 e 75% (variáveis com distribuição não-normal). A normalidade foi verificada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. As comparações entre os grupos foram realizadas por teste t de Student não pareado (variáveis com distribuição normal) ou de Mann-Whitney (variáveis com distribuição não-normal). A análise estatística foi realizada pelo software SigmaStat, considerando nível de significância de 5% para todas as análises.

 Resultados Características gerais

O peso corporal inicial e final dos animais não diferiu entre os grupos. Além disso, os ventrículos esquerdo e direito, o peso de fígado e o pulmão foram semelhantes entre os grupos. A ingestão diária de ração foi de aproximadamente 26 g para os dois grupos (Tabela 1).

Variáveis morfológicas e consume de ração em ratos submetidos à isquemia-reperfusão miocárdica global
C (n = 9) A (n = 10) Valor de p
PC inicial (g) 274 ± 15 281 ± 11 0,274
PC final (g) 468 ± 29 448 ± 40 0,225
Peso do VE (g) 1,03 ± 0,09 1,02 ± 0,07 0,934
Peso do VD (g) 0,30 ± 0,03 0,29 ± 0,03 0,431
Peso do fígado (g) 14,4 ± 1,6 12,9 ± 2,6 0,154
Peso do pulmão (g) 1,62 ± 0,03 1,54 ± 0,18 0,359
Consumo diário de ração (g) 26,1 ± 2,2 26,6 ± 1,8 0,246

C: grupo controle; A: grupo açaí; PC: peso corporal; VE: ventrículo esquerdo; VD: ventrículo direito. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão; Valor de p: teste t.

 Área miocárdica infartada

Não observamos diferença na área de infarto do miocárdio entre os grupos A e C, conforme observado na Figura 1.

Área miocárdica infartada após isquemia-reperfusão miocárdica global. A figura mostra as secções de ventrículo esquerdo coradas com cloreto de trifeniltetrazólio a 1%. A área branca representa o miocárdio infartado. C: grupo controle; A: grupo açaí. Não há diferença entre os grupos (p = 0,710).

Estresse oxidativo e metabolismo energético do miocárdio

A suplementação de açaí promoveu menor concentração de hidroperóxido lipídico no miocárdio, e foi observada maior atividade das enzimas catalase, SOD e GSH-Px no miocárdio desses ratos (Tabela 2).

Marcador do estresse oxidativo do miocárdio e atividade de enzimas antioxidantes após isquemia-reperfusão global
C (n = 9) A (n = 10) Valor de p
HL (nmol/g de tecido) 330 ± 33 208 ± 22 < 0,001
CAT (µmol/g de tecido) 58,5 ± 6,4 70,0 ± 8,9 0,005
SOD (nmol/mg de proteína) 5,7 ± 0,4 8,1 ± 0,7 < 0,001
GSH-Px (nmol/mg de tecido) 20,2 ± 3,3 32,8 ± 4,7 < 0,001

C: grupo controle; A: grupo açaí; HL: hidroperóxido lipídico; CAT: catalase; SOD: superóxido dismutase; GSH-Px: glutationa peroxidase. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão; valor de p: teste t.

Quanto ao metabolismo energético do miocárdio, a suplementação de polpa de açaí promoveu menor atividade das enzimas lactato desidrogenase e fosfofructoquinase e maior atividade das enzimas b-hidroxiacil-coenzima A desidrogenase, citrato sintase e piruvato desidrogenase. Além disso, observamos maior atividade do complexo I, complexo II e ATP sintase no grupo suplementado com açaí (Tabela 3).

Atividade miocárdica de enzimas relacionadas ao metabolismo energético após protocolo global de isquemia-reperfusão
C (n= 9) A (n=10) Valor de p
β-hidroxiacil-CoA desidrogenase (nmoL/mg de proteína) 19,8 ± 3,3 49,8 ± 7,0 < 0,001
Fosfofructoquinase (nmoL/g de tecido) 181 (160 - 228) 73 (67 - 82) < 0,001
Lactato desidrogenase (nmoL/mg de proteína) 147 (145 - 167) 70 (65 - 77) < 0,001
Piruvirato desidrogenase (nmoL/g de tecido) 114 ± 11 176 ± 19 < 0,001
Citrato sintase (nmol/mg de proteína) 30 (30 - 37) 100 (81 - 117) < 0,001
Complexo I (nmol/mg de proteína) 3,7 ± 1,0 8,0 ± 1,7 < 0,001
Complexo II (nmol/mg de proteína) 2,1 ± 0,6 3,5 ± 0,5 < 0,001
ATP sintase (nmol/mg de proteína) 22,0 ± 3,9 44,5 ± 6,6 < 0,001

C: grupo controle; A: grupo açaí. Os valores são expressos como média ± desvio padrão ou mediana e 1º e 3º quartil; Valor de p: teste t ou de Mann-Whitney.

 <italic>Western blot</italic>

A expressão das proteínas envolvidas na regulação da via do estresse oxidativo é mostrada na Figura 2. Não houve diferença na expressão de NF-kB total e fosforilado, FOXO1 total e acetilado, SIRT1 e Nrf-2. Além disso, não foram observadas diferenças nas razões NF-kB fosforilada/total ou FOXO1 acetilada/total.

Expressão proteica avaliada por Western blot. C: grupo controle; A: grupo açaí; SIRT1: regulador silencioso de informações 1; GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; FOXO1: proteína garfo cabeça 1; aFOXO1: proteína garfo cabeça acetilada 1; Nrf-2: fator nuclear eritróide 2; NF-kB: fator nuclear kappa B; pNF-kB: fator nuclear fosforilado Kappa B. Todas as expressões proteicas foram normalizadas por GAPDH. Não há diferenças entre os grupos na expressão proteica (p > 0,05).

Estudo isolado do coração

Não houve diferença entre os grupos em relação ao volume inicial do balão, à pressão sistólica máxima atingida, ou +dP/dt, que representa a função sistólica. O grupo A apresentou pior -dP/dt que o C, significando comprometimento da função diastólica nos ratos que receberam suplementação de açaí. As áreas sob as curvas na relação pressão diastólica-volume não diferiram entre os grupos (Figura 3).

Estudo cardíaco isolado após isquemia-reperfusão miocárdica global. Painel A: C: grupo controle; A: grupo de açaí. O volume inicial representa o volume dentro do balão quando a pressão diastólica era zero; +dP/dt: taxa de desenvolvimento da pressão ventricular esquerda; -dP/dt: taxa de diminuição da pressão ventricular esquerda; * diferente do grupo C (p = 0,025). Painel B: Relação entre pressão diastólica e volume. A área sob a curva e a inclinação foram semelhantes entre os grupos.

Discussão

A lesão de isquemia-reperfusão do miocárdio é uma das principais causas de morte no mundo, e continua sendo uma situação em que as terapias clínicas atuais são surpreendentemente deficientes.26 A lesão miocárdica irreversível progride com o aumento da duração da isquemia; portanto, a rápida restauração do fluxo sanguíneo para a área isquêmica é essencial para salvar o miocárdio viável.1 A reperfusão, no entanto, pode induzir a morte de cardiomiócitos, independentemente do episódio isquêmico, por um processo conhecido como lesão de reperfusão.1,5,27 A diminuição da lesão por reperfusão é um dos principais alvos na batalha para preservar a função cardíaca em pacientes com infarto agudo do miocárdio.

Durante a isquemia-reperfusão, ocorrem alterações como liberação de citocinas, interação entre leucócitos e células endoteliais, e produção de espécies reativas de nitrogênio/oxigênio e radicais livres (ERs)27 o que pode levar a danos oxidativos. Os ERs são gerados a partir de várias fontes, e o metabolismo energético, mais precisamente a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (CTE), é uma das fontes mais importantes desses radicais.5

A produção contínua de ERs durante processos metabólicos é regulada por um sistema de defesa antioxidante, que limita os níveis intracelulares e controla a ocorrência de danos celulares. O sistema de defesa antioxidante pode ser enzimático e não-enzimático.6,7,28 O sistema de defesa não-enzimático inclui compostos antioxidantes de origem alimentar, como vitaminas, minerais e compostos fenólicos. Os flavonoides e outros compostos presentes no açaí podem atuar como antioxidantes não-enzimáticos, inativando espécies reativas.29

Durante a isquemia, há um aumento da nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidase, óxido nítrico sintase, xantina oxidase, citocromo P450 e ciclooxigenase,8,30 o que pode resultar em aumento de geração de ER; da mesma forma, a isquemia está associada a uma diminuição de diferentes enzimas antioxidantes. Todas essas alterações podem resultar em estresse oxidativo. Neste estudo, o grupo A apresentou maior atividade das enzimas antioxidantes, além de menor concentração de hidroperóxido lipídico do miocárdio. O hidroperóxido lipídico é um marcador de dano oxidativo e é originado da lesão oxidativa dos lipídios da membrana. A lesão de membrana pode levar a distúrbios na permeabilidade, a alterações do fluxo iônico e lesão do DNA além de comprometer a matriz extracelular.31

Em relação às proteínas envolvidas na regulação da via do estresse oxidativo, os mecanismos pelos quais os compostos alimentares fenólicos atuam na prevenção de patologias degenerativas foram parcialmente estudados. As interações complexas entre essas moléculas da dieta e seus alvos moleculares ativam as vias de sinalização da resposta celular, incluindo NF-kB, Nrf2, SIRT1 e FOXO1.32-34

O NF-kB é considerado um importante fator transcricional relacionado ao estresse oxidativo. O tratamento com açaí inibiu a ativação de NF-kB na cultura de células de astrócitos,35,36 inibiu a fosforilação de NF-kB em células microgliais37 e a expressão gênica de NF-kB com regulação negativa em cultura de miofibroblastos de cólon.38 Da mesma forma, o Nrf2 é um importante regulador da produção de enzimas antioxidantes. Em resposta ao estresse oxidativo, o Nrf2 se dissocia da proteína Keap1 e migra para o núcleo celular, onde estimula a produção de enzimas antioxidantes.39 A isquemia miocárdica promove aumento da expressão proteica de Nrf2,40 e o efeito do açaí na expressão de Nrf2 foi verificado em um estudo de cultura de astrócitos em que o fruto reduziu a expressão proteica de Nrf2.41 Entretanto, em outro estudo, também com cultura de astrócitos, a administração de açaí aumentou a expressão de Nrf2,36 mostrando que os efeitos do açaí sobre Nrf2 não são completamente compreendidos.

Outro regulador do equilíbrio celular é a proteína SIRT1, que pode atuar na apoptose, na biogênese mitocondrial, em inflamações, no metabolismo de glicose e lipídios, na autofagia e em adaptações ao estresse celular por meio da desacetilação de proteínas-alvo como NF-kB e FOXO1. Quando acetilado pelo SIRT1, o FOXO1 leva ao aumento da expressão de genes gliconeogênicos.33 O aumento da atividade transcricional do FOXO1 também aumenta a expressão gênica da catalase e superóxido dismutase.34 Até onde sabemos, não existem estudos que tenham avaliado o efeito do açaí na expressão das proteínas FOXO1 e SIRT1.

No coração adulto normal, aproximadamente 95% da produção de ATP é derivada da fosforilação oxidativa mitocondrial. O coração adulto normalmente obtém de 50 a 70% do seu ATP a partir da b-oxidação dos ácidos graxos, em vez da oxidação da glicose.42 O dinucleotídeo de flavina adenina e o dinucleotídeo de nicotinamida adenina produzidos durante a oxidação de ácidos graxos são utilizados na síntese de ATP mitocondrial via fosforilação oxidativa.43 Isso depende criticamente da manutenção de um gradiente eletroquímico de prótons através da membrana mitocondrial interna gerada pela extrusão de prótons da matriz para o espaço intermembranar pelos complexos I, III e IV, que formam o CTE.44

Em nosso estudo, a suplementação de açaí resultou em maior atividade das enzimas b-hidroxiacil CoA-desidrogenase e citrato sintase, que podem caracterizar maior oxidação de ácidos graxos. Além disso, houve menor atividade da fosfofructoquinase, envolvida na glicólise. Isso mostra que a suplementação de açaí alterou a seleção de substratos de glicose para ácidos graxos, mantendo o metabolismo energético mais próximo de uma situação fisiológica, como mostrado anteriormente em um modelo experimental de isquemia-reperfusão renal.45 Além disso, a suplementação de açaí aumentou a atividade dos complexos I, II e ATP sintase, protegendo os danos aos complexos mitocondriais. No entanto, a oxidação de ácidos graxos diminui a eficiência metabólica dos corações lesionados.

Curiosamente, a polpa de açaí é composta predominantemente por lipídios, que correspondem a 48%.46 A oferta de mais lipídios poderia contribuir para o aumento da atividade da b-hidroxiacil CoA-desidrogenase no grupo tratado com açaí. Esse padrão foi observado no modelo experimental de infarto do miocárdio, que administrava dieta rica em lipídios.47

Como esperado para o período de 30 minutos de isquemia, observamos uma grande área de infarto em nosso estudo, de aproximadamente 50% em ambos os grupos. Anteriormente, a suplementação de uma dieta rica em antocianinas em um estudo com modelo experimental de isquemia-reperfusão diminuiu a área miocárdica infartada.48 No entanto, no presente estudo, a suplementação de açaí não reduziu o tamanho do infarto.

Grandes infartos geralmente apresentam importante disfunção ventricular esquerda resultante do comprometimento dos processos celulares e de alterações na morfologia cardíaca. O aumento do estresse oxidativo compromete a permeabilidade da membrana plasmática dos miócitos, a atividade das bombas iônicas na membrana plasmática e no retículo sarcoplasmático e o trânsito intracelular de cálcio, comprometendo tanto a sístole quanto a diástole.7 Seria de esperar que a atenuação do estresse oxidativo fosse seguida por uma melhora na função ventricular esquerda, como demonstrado em diferentes modelos de dano miocárdico.25,49,50 No entanto, este estudo evidenciou que a administração de açaí piorou a função diastólica após isquemia-reperfusão cardíaca. Isso nos leva a inferir que a disfunção ventricular observada neste modelo depende de outros mecanismos além do dano oxidativo. Curiosamente, um estudo realizado para investigar o efeito do extrato de antocianina na isquemia-reperfusão cardíaca global de ratos sugere que a antocianina era cardioprotetora em baixas doses e poderia ser cardiotóxica em altas.51

Além disso, a mudança que ocorre no metabolismo energético em situações de estresse tem papel protetor no miocárdio.42 O fato de a suplementação de açaí impedir o uso de glicose e favorecer a manutenção do metabolismo miocárdico próximo ao normal pode ter interferido negativamente nesse mecanismo protetor adaptativo.

Enquanto a isquemia induz alterações morfológicas e funcionais e a lesão de reperfusão pode exacerbar esses aspectos, a descoberta de novos fármacos, substâncias ou estratégias que minimizem o dano cardíaco é essencial. A quantidade de açaí que os ratos ingeriram foi equivalente a 600 mg para um ser humano de 60 kg,52 quantidade plausível de ser ingerida por um ser humano. Portanto, o açaí pode ser uma estratégia potencial para atenuar a lesão de isquemia-reperfusão no cenário clínico.

No entanto, existem algumas limitações que dificultam o impacto translacional desses resultados. Primeiro, os ratos compartilham várias vias metabólicas com os seres humanos, mas os organismos são bem diferentes. Segundo, neste estudo avaliamos uma isquemia miocárdica global, que não é a rotina na prática clínica. O processo isquêmico em humanos é o resultado de um longo processo inflamatório que pode modular vias metabólicas completamente diferentes do nosso modelo.53

Conclusão

A suplementação de açaí não diminuiu a área infartada nem melhorou a função ventricular esquerda no modelo global de isquemia-reperfusão, apesar de melhorar o metabolismo energético cardíaco e atenuar o estresse oxidativo do miocárdio, sugerindo que esses mecanismos podem não ser os principais determinantes da piora da função ventricular esquerda diastólica observada após isquemia e reperfusão.

Fontes de financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Patricia Alegre pela Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no uso de animais da Faculdade de Medicina de Botucatu sob o número de protocolo CEUA 1111/2014. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.