Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC yB9VPgs6cxVRVsR3n4qMh5b S0066-782X2019001201121 S0066-782X2019005001205 10.5935/abc.20190125 Original Article Nrf2, NF-κB and PPARβ/δ mRNA Expression Profile in Patients with Coronary Artery Disease Barbosa Jaqueline Ermida Stockler-Pinto Milena Barcza 0000-0002-3169-9315 Cruz Beatriz Oliveira da 0000-0002-1527-1407 Silva Ana Carla Tavares da Anjos Juliana Saraiva 0000-0002-1466-9413 Mesquita Claudio Tinoco Mafra Denise 0000-0001-8507-2369 Cardozo Ludmila F. M. F. Universidade Federal Fluminense Programa de Pós-Graduação em Ciências Cardiovasculares Niterói RJ Brazil Universidade Federal Fluminense - Programa de Pós-Graduação em Ciências Cardiovasculares, Niterói, RJ - Brazil Mailing Address: Ludmila F. M. F. Cardozo, Universidade Federal Fluminense - Hospital Universitário Antônio Pedro - Rua Marques do Paraná, 303, 4º andar - prédio da emergência. Postal Code 24033-900, Niterói RJ - Brazil. E-mail: ludmila.cardozo@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research and Analysis and interpretation of the data: Barbosa JE, Stockler-Pinto MB, Cruz BO, Silva ACT, Anjos JS, Mesquita CT, Mafra D, Cardozo LFMF; Acquisition of data and Writing of the manuscript: Barbosa JE, Stockler-Pinto MB, Cruz BO, Silva ACT, Anjos JS, Cardozo LFMF; Statistical analysis and Obtaining financing: Stockler-Pinto MB, Mafra D, Cardozo LFMF; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Barbosa JE, Stockler-Pinto MB, Mesquita CT, Mafra D, Cardozo LFMF.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 18 07 2019 12 2019 113 6 1121 1127 17 10 2018 07 02 2019 13 02 2019 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited Abstract Background:

Oxidative stress and inflammation are present in coronary artery disease (CAD) and are linked to the activation of the transcription nuclear factor kappa B (NF-κB). To attenuate these complications, transcription factors like nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) and peroxisome proliferator-activated receptor-β/δ (PPARβ/δ) can be activated to inhibit NF-κB. However, the available data on expression of NF-κB, Nrf2 and PPARβ/δ in CAD patients are limited.

 Objective:

To evaluate the expression of the transcription factors NF-κB and Nrf2 and PPAR𝛽/𝛿 in CAD patients.

 Methods:

Thirty-five patients (17 men, mean age 62.4 ? 7.55 years) with CAD and twelve patients (5 men, mean age 63.50 ? 11.46 years) without CAD were enrolled. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated and processed for mRNA expression of Nrf2, NF-κB, NADPH: quinone oxidoreductase 1 (NQO1) and PPARβ/δ mRNAs using quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR). p < 0.05 was considered statistically significant.

 Results:

There was no difference in the mRNA expressions of Nrf2 (1.35 ? 0.57), NF-κB (1.08 ? 0.50) or in the antioxidant enzyme NQO1 (1.05 ? 0.88) in the CAD group compared to the group without CAD (1.16 ? 0.76, 0.95 ? 0.33, 0.81 ? 0.55, respectively). However, PPARβ/δ was highest expressed in the CAD group (1.17 ? 0.86 vs. 0.56 ? 0.34, p = 0.008).

 Conclusion:

The main finding of this study was the PPARβ/δ being more expressed in the PBMC of patients with CAD compared to the control group, whereas no differences were observed in Nrf2 or NF-κB mRNA expressions.

 Keywords: Coronary Artery Disease Oxidative Stress Inflammation Obesity Hypertension Dyslipidemias Risk Factors/prevalence Myocardial Infarction Heart Failure CAPES 001 FAPERJ E-26/203.269/2017 E_05/2016E_05/2016 This study was supported by Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Process E-26/203.269/2017) and (Process E_05/2016E_05/2016), and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Introduction

Of all cardiovascular diseases (CVD), coronary artery disease (CAD) is the leading cause of death and high expenditure on medical assistance in the world, and is typically a chronic disease with progression over years or decades.1-3 CAD, also known as coronary arteriosclerotic heart disease or coronary heart disease, is characterized by narrowing of the arteries in the heart that supply blood, oxygen, and nutrients to the cardiac tissue.4

Although there has been a steady decline in the incidence of CVD in recent years, the prevalence of CVD risk factors (hypertension, high cholesterol and obesity) has been increasing. Smoking, obesity, high blood pressure (BP), high total cholesterol and low-density lipoprotein, low high-density lipoprotein, diabetes and advanced age are the main risk factors for CVD5,6 and are directly related to endothelial dysfunction with low bioavailability of nitric oxide, causing vasoconstriction, oxidative stress and inflammation.7,8 Oxidative stress is present in both etiology and progression of myocardial infarction, congestive heart failure, atherosclerosis and hypertension.9

Oxidative stress arises when there is an imbalance between the reactive oxygen species (ROS) production and the capacity of the antioxidant defense systems of the body,10 while inflammation is a biological response to oxidative stress where the cell starts producing proteins, enzymes and other compounds to restore homeostasis.11 Oxidative stress is responsible for inflammation by several mechanisms, one of which is the direct activation of the nuclear transcription factor kappa B (NF-κB) by the ROS. NF-κB regulates the transcription of several genes encoding proinflammatory cytokines, chemokines and adhesion molecules of leukocytes.

In this direction, it is important to evaluate factors that attenuate both inflammation and oxidative stress. Nuclear factor erythroid 2-related to factor 2 (Nrf2) has been associated with cytoprotective effects and its accumulation leads to an increase in the transcription of antioxidant response elements (ARE)-regulated genes encoding antioxidant and phase 2 detoxifying enzymes and can be considered a protective factor against both oxidative stress and inflammation.12-14 Under basal conditions, Nrf2 is inactive in the cytoplasm and is inhibited by its cytosolic repressor protein, Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1), which through the action of certain substances, including the ROS, which alters the conformation, decouples Nrf2 and thereby facilitates accumulation and nuclear translocation of Nrf2. In the nucleus, Nrf2 binds to regulatory sequences called AREs acting on genes that encode antioxidant and phase II detoxifying enzymes, including NADPH: quinone oxidoreductase 1 (NQO1).15 The role of Nrf2 in reducing inflammation is related to the ability to antagonize NF-κB indirectly by removing ROS. In addition, antioxidant enzymes appear to act directly on the reduction of inflammatory mediators.15 Besides Nrf2, another target that has attracted interest and attention from research is the peroxisome proliferator-activated receptor-β/δ (PPARβ/δ). However, the biological functions of PPARβ/δ and its effectiveness as a therapeutic target in the treatment of hypertension and CVD have not been elucidated.16 PPARβ/δ is the predominant subtype in the heart and several lines of evidence suggest a cardioprotective function of PPARβ/δ.17 Preclinical studies suggest that PPARβ/δ activation promotes antihypertensive effects in established animal models18 and the pharmacological activation of PPARβ/δ prevents endothelial dysfunction and downregulates inflammatory responses.19,20 Furthermore, PPARβ/δ suppresses the activities of several transcription factors, including the NF-κB.21 Based on the fact that there are no studies about gene expression of Nrf2, NF-κB and PPARβ/δ and its profile in CAD patients, the objective of this study was to evaluate the transcription factors NF-κB and Nrf2 and PPARβ/δ mRNA expression in patients with CAD.

 Methods Subjects

Forty-seven patients were enrolled in this study through a convenience sample where patients composed each group according to the presence or absence of CAD. Thirty-five patients (17 men and 18 women, mean age 62.4 ± 7.5 years, BMI 28.9 ± 4.9 kg/m2) with CAD and/or abnormal findings of myocardial perfusion scintigraphy comprised the CAD group and twelve patients (5 men and 7 women, mean age 63.5 ± 11.5 years, 26.5 ± 6.2 kg/m2) without CAD comprised the group without CAD. Eligible patients were older than 18 and attended the Nuclear Medicine Section at Hospital Universitário Antônio Pedro (Niterói, Rio de Janeiro, Brazil) to undergo myocardial scintigraphy. Patients with infection, cancer, chronic kidney disease (estimated glomerular filtration rate <60 mL/min), acquired immune deficiency syndrome (AIDS) and autoimmune disease were excluded. The control group consisted of hypertensive, dyslipidemic and/or diabetic patients not diagnosed with CAD, from the same hospital.

 Anthropometric Measures

Anthropometric measurements were made by a trained staff member using standard techniques. Body mass index was calculated as weight in kilograms divided by height in square meters.22

Blood pressure assessment

BP was measured by the indirect method using auscultatory technique with sphygmomanometer and appropriate cuff in accordance with the dimensions of the patient's arm. Aneroid arterial pressure device - AD-2 was used on caster (pedestal), brand UNITEC Hospitalar (INMETRO ML 095 2007/ANVISA 10432300016). To assess BP, the procedure was initially explained to the patient who was resting for more than five minutes. The patient was sitting, feet resting on the floor, back resting on the chair, arm at heart level (mid-point of the sternum), supported, free of clothing, with the palm of the hand facing upwards and the elbow slightly flexed. HA was defined when systolic BP (SBP) values were greater or equal to 140 mmHg.23

Analytic procedures and sample processing

Blood was collected from each participant in the morning, after 12-hour overnight fasting, using a tube containing EDTA anticoagulant (1.0 mg/mL). Plasma was centrifugated and separated (15 min, 3000×g, 4°C) and stored at −80°C until analysis.

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were collected, blood samples with EDTA were diluted in PBS and cells were separated in 5 mL Histopaque (Sigma-Aldrich) by centrifugation at 1800 g for 30 min. PBMCs were collected and washed twice with cold PBS and re-suspended and stored (−80°C) with 1 mL of RecoveryTM cell culture freezing medium (Thermo Fisher Scientific) for RNA isolation.

 Biochemical and inflammation parameters

Total cholesterol, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol, triglyceride, glucose and ultra-sensitive C-reactive protein levels were determined using Bioclin® automatic biochemical analyzer kits (Bioclin BS-120 Chemistry Analyzer). LDL-c was calculated using the Friedewald et al. equation.24

Real-time quantitative PCR analysis

Nrf2, NF-κB, NQO1 and PPARβ/δ mRNA expressions were evaluated using real-time quantitative PCR (qPCR) from PBMCs according to Cardozo et al.25 TaqMan® Gene Expression Assays (Applied Biosystems) were used to detect Nrf2 (Hs00975961_g1), NF-κB (Hs00765730_m1), NQO1 (Hs00168547_m1), PPARβ/δ (Hs00975961_g1) mRNA and the control gene GAPDH (Hs02758991_g1).

 Statistical analysis

Shapiro-Wilk test was applied to test sample distribution. Results were expressed as mean ± SD (age, BMI, SBP, lipidic profile, glucose, Nrf2, NF-B, NQO1, PPARβ/δ), median (interquartile range) (CRP) or percentage (hypertension, dyslipidemia, diabetes), as applicable. Unpaired Student’s t-test was used to compare the variables and groups with normal distribution and the Mann-Whitney-Wilcoxon test was used for nonparametric data. Correlations between variables were assessed by Pearson’s or Spearman coefficient correlation according to the distribution of the sample. A significance level of 5% was accepted. Statistical analyses were performed using the SPSS 19.0 software package (Chicago, IL, USA).

 Results

In the CAD group, 82.8% presented abnormalities on myocardial perfusion scintigraphy (65.5% myocardial ischemia, 27.6% myocardial fibrosis, and 6.9% fibrosis and myocardial ischemia). Regarding the duration of disease, 71.4% were diagnosed with CAD from 1 to 5 years, 17.1% from 6 to 10 years and 11.5% from 10 to 15 years. According to the clinical history of patients with CAD, 54.2% performed some type of procedure before the study: 8.7% cardiac catheterization, 34.3% percutaneous transluminal coronary angioplasty, 5.7% percutaneous transluminal coronary angioplasty and cardiac catheterization and 5.7% percutaneous transluminal coronary angioplasty and coronary artery bypass grafting. Moreover, 62.8% of the CAD patients and 30.8% of the control group were smokers. Considering the use of medication, in the CAD group, 68.5% used β-adrenergic blockers, 17.4% angiotensin-converting enzyme inhibitor, 77.1% statins, 28.5% calcium channel blockers, 51.4% diuretic, 37.2% nitrate, 54.3% acetyl salicylic acid, 62.8% losartan potassium, 34.8% oral hypoglycemic agents and 11.43% insulin. In the control group, 53.8% used β-adrenergic blocker, 15.4% angiotensin-converting enzyme inhibitor, 46.2% statins, 30.8% calcium channel blocker, 53.8% diuretic, 7.7% nitrate, 61.5% acetyl salicylic acid, 69.2% losartan potassium, 38.5% oral hypoglycemic agents and 7.7% insulin. No statistical differences were found between groups related to the use of medication or smoking.

Clinical profile and biochemical parameters are shown in Table 1. Also, the CAD group presented lower total cholesterol, LDL-cholesterol and HDL-cholesterol compared to the group without CAD (Table 1).

Clinical profile and biochemical of the patients of the study
Parameters Group without CAD (n = 12) CAD Group (n = 35) p value
Men/women (n) 5/7 17/18 0.99
Age (years) 63.5 ± 11.5 62.4 ± 7.5 0.70
Hypertension (%) 91.7 97.1 0.81
Dyslipidemia (%) 75 74.2 0.67
Diabetes (%) 16.7 37.1 0.84
BMI (kg/m2) 26.5 ± 6.2 28.9 ± 4.9 0.17
SBP (mmhg) 137.5 ± 23.0 138.0 ± 18.6 0.69
DBP (mmhg) 82.5 ± 9.6 82.8 ± 8.2 0.90
Total cholesterol (mg/dL) 200 ± 59.4 163.3 ± 46.7 0.03
LDL-cholesterol (mg/dL) 109.3 ± 53.3 79.9 ± 33.3 0.03
HDL-cholesterol (mg/dL) 65.1 ± 21.3 45.3 ± 9.9 0.002
Triglyceride (mg/dL) 128.2 ± 57.3 130.6 ± 71.8 0.79
Glucose (mg/dL) 115.2 ± 44.6 103.7 ± 36.4 0.13
CRP (mg/L) 0.6 (0.4-4.0) 2.0 (0.12-8.7) 0.25

CAD: coronary artery disease; BMI: body mass index; SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure CRP: C-reactive protein. Parametric data expressed as mean±SD and nonparametric data expressed with median, 15th and 75th quartiles.

No differences were found in the transcription factors Nrf2 and NF-κB or in the NQO1 mRNA expression comparing the CAD group with the group without CAD. In contrast, the PPARβ/δ was more expressed in the CAD group (Table 2). We considered that the inclusion of diabetic patients did not interfere with the results. No correlations were found.

mRNA expression levels in the group without CAD and the CAD Group
Parameters Group without CAD CAD Group p value
Nrf2 1.16 ± 0.76 1.35 ± 0.57 0.35
NF-B 0.95 ± 0.33 1.08 ± 0.50 0.58
NQO1 0.81 ± 0.55 1.05 ± 0.88 0.37
PPARβ/δ 0.56 ± 0.34 1.17 ± 0.86 0.008

Nrf2, NF-kB, NOQ1 and PPAR β/δ mRNA expression was performed in PBMC by real-time quantitative PCR. Data were expressed as mean ± SD. CAD: coronary artery disease.

 Discussion

Studies have evaluated systemic inflammation through PBMC gene expression.26,27 The importance of studying PBMCs as a strategy to evaluate targets of inflammation-related metabolic pathways to explore CVD for a better understanding of the architecture of these diseases was emphasized. The hypothesis would be that the PBMCs could reflect inflammatory mechanisms in a more specific way compared to serum/plasma.28 Thus, the present study investigates the transcription factors NF-κB and Nrf2 and PPARβ/δ mRNA expression in PBMCs of CAD patients. CVD patients are usually exposed to inflammation and oxidative stress. Nrf2 protects the body against these conditions because it is related to the synthesis of antioxidant enzymes and is capable of antagonizing NF-κB involved in inflammatory induction.

Several studies have shown that NF-κB plays an important role in the development of CVD.29-31 It was demonstrated that ischemia rapidly induced NF-κB activation in the myocardium of rats.29 Wilson et al.30 showed that NF-κB was increased in the coronary atheromatous plaque in humans and its expression was predominantly associated with macrophages, foam cells and vascular smooth muscle cells. In addition, its expression was increased in acute coronary syndromes and associated with the intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1).30 NF-κB inhibition in endothelial cells resulted in reduced development of atherosclerosis and was correlated with reduced expression of pro-inflammatory cytokines, chemokines and adhesion molecules in the aortas of mice fed with cholesterol-rich diet.31

Some studies demonstrate that, as a protection mechanism, in an early stage of diseases, Nrf2 has its activity increased in order to avoid damage induced by ROS. In the final stage, due to the chronicity and/or severity of the disease, this protection mechanism may become saturated by the excess of EROs leading to the reduction of Nrf232,33 or the Nrf2 appears to be insufficiently capable of antagonizing NF-κB and it remains high.26

Despite this, the effects of CAD on the Nrf2-Keap1 system are not well established. However, patients with CAD had lower gene expression of Nrf2/ARE and glutathione (GSH).27

An important phase of atherosclerotic plaque formation is endothelial infiltration well established by macrophages and formation of foam cells. In rats, Nrf2 is an important component in this process, as macrophages exposed to oxidized LDL promoted increased expression of Nrf2, which indirectly protected macrophages from oxi-LDL mediated lesions through phase II antioxidant enzymes.34 In addition, the absence of Nrf2 in macrophages from mice consuming a high-fat diet increased the formation of foam cells and the progression of atherosclerosis, suggesting that Nrf2 is important in resistance to atherosclerosis.35 Increased expression of Nrf2 at this stage of development of atherosclerosis is important because the effects on heme oxygenase-1 (HO-1) expression, which produces antiatherogenic effects as a reduction in the formation of foam cells36 and NQO1 also proved to be important in the protection against atherosclerosis.37

In the present study, there were no differences in the Nrf2 or NF-κB mRNA expression between patients in the CAD group and the group without CAD possibly due to the fact that the patients in the two groups were elderly, hypertensive and/or diabetic, demonstrating that both groups did not include healthy patients. In addition, all the patients used several medications with potential antioxidant effect.38,39 With age, expression of several Nrf2 downstream targets declined.40 It is still important to emphasize that both hypertension and diabetes are related to increased oxidative stress, accumulation of reactive oxygen species and inflammation.9,41

In the present study, the PPARβ/δ was high compared to the patients without CAD. It seems to be protective since it has been shown that the adequate balance of PPARβ/δ activation in the different cardiac cell types may be important for potential cardioprotective effects of PPARβ/δ.42 Anin vivo study showed that cardiac specific overexpression of PPARβ/δ led to increased myocardial glucose utilization and did not alter cardiac function but exerted a protective effect on ischemia/reperfusion-induced myocardial injury.43 In addition, cardiac PPARβ/δ deletion in mice resulted in cardiac dysfunction, hypertrophy and congestive heart failure.17 Additionally, PPARβ/δ has been described in several biological functions, including cell survival.44,45 Studies show that inflammation, ROS and oxidized LDLs induce endothelial cell apoptosis, representing the beginning of the development of atherosclerotic lesions.45 Thus, assays performed on keratinocytes have shown that increased production of proinflammatory cytokines is capable of elevating PPARβ/δ expression, which in turn regulates the expression of apoptosis-related genes, resulting in increased resistance to cell death.44

Given the importance of PPARβ/δ and the transcription factors NF-κB and Nrf2 effects for the CAD patients - the Nrf2 orchestrating the production of antioxidant and phase 2 detoxifying enzymes being considered a protective factor against both oxidative stress and inflammation,46 PPARβ/δ promoting cardioprotection42 and NF-κB regulating inflammation12 - a better understanding of how they are expressed in CAD patients is useful so that strategies can be used in an attempt to modulate these transcription factors. Some studies proposed that nutrients containing plant-based Nrf2 inducers may help to improve the Nrf2-Keap1 system.25,47

This study presented a range of limitations that warrant consideration. Firstly, this study should have a healthy control group for comparison. Secondly, it would be interesting to stratify the results by risk factor and scintigraphy results, but the sample was not large enough for this. Thirdly, unfortunately, we did not perform another Nrf2, NF-κB and PPARβ/δ target genes that encode antioxidant enzymes and proinflammatory cytokines to confirm the Nrf2, NF-κB and PPARβ/δ expression network. Furthermore, it was not possible to calculate non-HDL cholesterol. Further studies should be encouraged to explore this issue. Considering these limitations, this was a very well-controlled protocol, which allowed us to conclude that the results are considerably relevant.

 Conclusion

The present study revealed increased expression of PPARβ/δ in the PBMC of CAD patients while no differences were observed in Nrf2 or NF-κB mRNA expressions. These findings may lead to possible therapies, targets and future research for treatment in these patients.

Sources of Funding

This study was supported by Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Process E-26/203.269/2017) and (Process E_05/2016E_05/2016), and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Jaqueline Ermida Barbosa, from Universidade Federal Fluminense.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Universidade Federal Fluminense under the protocol number 826.041 CAAE 35035414.8.0000.5243. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.

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Zarzuelo MJ Jiménez R Galindo P Sánchez M Nieto A Romero M Antihypertensive effects of peroxisome proliferator-activated receptor-? activation in spontaneously hypertensive rats Hypertension 2011 58 4 733 743 19 Quintela AM, Jiménez R, Gómez-Guzmán M, Zarzuelo MJ, Galindo P, Sánchez M, et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-?/-? (PPAR?/?) prevents endothelial dysfunction in type 1 diabetic rats. Free Radic Biol Med. 2012;53(4):730-41. Quintela AM Jiménez R Gómez-Guzmán M Zarzuelo MJ Galindo P Sánchez M Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-?/-? (PPAR?/?) prevents endothelial dysfunction in type 1 diabetic rats Free Radic Biol Med 2012 53 4 730 741 20 Toral M, Gómez-Guzmán M, Jiménez R, Romero M, Zarzuelo MJ, Utrilla MP, et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor?/? agonist GW0742 prevents hypertension, vascular inflammatory and oxidative status, and endothelial dysfunction in diet-induced obesity. 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Keys A Fidanza F Karvonen MJ Kimura N Taylor HL Indices of relative weight and obesity J Chronic Dis 1972 25 6 329 343 23 Malachias MV, Plavnik FL, Machado CA, Malta D, Scala LC, Fuchs S, et al. 7th Brazilian Guideline of Arterial Hypertension: Chapter 1 - Concept, Epidemiology and Primary Prevention. Arq Bras Cardiol. 2016;107(3):1-6. Malachias MV Plavnik FL Machado CA Malta D Scala LC Fuchs S 7th Brazilian Guideline of Arterial Hypertension: Chapter 1 - Concept, Epidemiology and Primary Prevention Arq Bras Cardiol 2016 107 3 1 6 24 Friedewald WT, Levy RI, Fredrickson DS. Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge. Clin Chem. 1972;18(6):499-502. Friedewald WT Levy RI Fredrickson DS Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge Clin Chem 1972 18 6 499 502 25 Cardozo LFMF, Stockler-Pinto MB, Mafra D. 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Li C Browder W Kao RL Early activation of transcription factor NF-kappaB during ischemia in perfused rat heart Am J Physiol 1999 276 2 Pt 2 H543 H552 30 Wilson SH, Best PJM, Edwards WD, Holmes DR, Carlson PJ, Celermajer DS, et al. Nuclear factor-kappaB immunoreactivity is present in human coronary plaque and enhanced in patients with unstable angina pectoris. Atherosclerosis. 2002;160(1):147-53. Wilson SH Best PJM Edwards WD Holmes DR Carlson PJ Celermajer DS Nuclear factor-kappaB immunoreactivity is present in human coronary plaque and enhanced in patients with unstable angina pectoris Atherosclerosis 2002 160 1 147 153 31 Gareus R, Kotsaki E, Xanthoulea S, van der Made I, Gijbels MJJ, Kardakaris R, et al. Endothelial cell-specific NF-kappaB inhibition protects mice from atherosclerosis. Cell Metab. 2008;8(5):372-83. Gareus R Kotsaki E Xanthoulea S van der Made I Gijbels MJJ Kardakaris R Endothelial cell-specific NF-kappaB inhibition protects mice from atherosclerosis Cell Metab 2008 8 5 372 383 32 Malhotra D, Thimmulappa R, Navas-Acien A, Sandford A, Elliott M, Singh A, et al. Decline in NRF2-regulated antioxidants in chronic obstructive pulmonary disease lungs due to loss of its positive regulator, DJ-1. Am J Respir Crit Care Med. 2008;178(6):592-604. Malhotra D Thimmulappa R Navas-Acien A Sandford A Elliott M Singh A Decline in NRF2-regulated antioxidants in chronic obstructive pulmonary disease lungs due to loss of its positive regulator, DJ-1 Am J Respir Crit Care Med 2008 178 6 592 604 33 Suzuki M, Betsuyaku T, Ito Y, Nagai K, Nasuhara Y, Kaga K, et al. Down-regulated NF-E2-related factor 2 in pulmonary macrophages of aged smokers and patients with chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 2008;39(6):673-82. Suzuki M Betsuyaku T Ito Y Nagai K Nasuhara Y Kaga K Down-regulated NF-E2-related factor 2 in pulmonary macrophages of aged smokers and patients with chronic obstructive pulmonary disease Am J Respir Cell Mol Biol 2008 39 6 673 682 34 Zhu H, Jia Z, Zhang L, Yamamoto M, Misra HP, Trush MA, et al. Antioxidants and phase 2 enzymes in macrophages: regulation by Nrf2 signaling and protection against oxidative and electrophilic stress. Exp Biol Med (Maywood). 2008;233(4):463-74. Zhu H Jia Z Zhang L Yamamoto M Misra HP Trush MA Antioxidants and phase 2 enzymes in macrophages: regulation by Nrf2 signaling and protection against oxidative and electrophilic stress Exp Biol Med (Maywood) 2008 233 4 463 474 35 Collins AJ, Foley RN, Chavers B, Gilbertson D, Herzog C, Johansen K, et al. 'United States Renal Data System 2011 Annual Data Report: Atlas of chronic kidney disease & end-stage renal disease in the United States. Am J Kidney Dis. 2012;59(1 Suppl 1):A7, e1-420. 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Jyrkkänen H-K Kansanen E Inkala M Kivelä AM Hurttila H Heinonen SE Nrf2 regulates antioxidant gene expression evoked by oxidized phospholipids in endothelial cells and murine arteries in vivo Circ Res 2008 103 1 e1 e9 38 Moon GJ, Kim SJ, Cho YH, Ryoo S, Bang OY. Antioxidant effects of statins in patients with atherosclerotic cerebrovascular disease. J Clin Neurol. 2014;10(2):140-7. Moon GJ Kim SJ Cho YH Ryoo S Bang OY Antioxidant effects of statins in patients with atherosclerotic cerebrovascular disease J Clin Neurol 2014 10 2 140 147 39 Ivanov M, Mihailovic-Stanojevic N, Grujic Milanovic J, Jovovic Ð, Markovic-Lipkovski J, Cirovic S, et al. Losartan improved antioxidant defense, renal function and structure of postischemic hypertensive kidney. PloS One. 2014;9(5):e96353. Ivanov M Mihailovic-Stanojevic N Grujic Milanovic J Jovovic Ð Markovic-Lipkovski J Cirovic S Losartan improved antioxidant defense, renal function and structure of postischemic hypertensive kidney PloS One 2014 9 5 e96353 40 Suh JH, Shenvi SV, Dixon BM, Liu H, Jaiswal AK, Liu R-M, et al. Decline in transcriptional activity of Nrf2 causes age-related loss of glutathione synthesis, which is reversible with lipoic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(10):3381-6. Suh JH Shenvi SV Dixon BM Liu H Jaiswal AK Liu R-M Decline in transcriptional activity of Nrf2 causes age-related loss of glutathione synthesis, which is reversible with lipoic acid Proc Natl Acad Sci U S A 2004 101 10 3381 3386 41 Fiorentino TV, Prioletta A, Zuo P, Folli F. Hyperglycemia-induced oxidative stress and its role in diabetes mellitus related cardiovascular diseases. Curr Pharm Des. 2013;19(32):5695-703. Fiorentino TV Prioletta A Zuo P Folli F Hyperglycemia-induced oxidative stress and its role in diabetes mellitus related cardiovascular diseases Curr Pharm Des 2013 19 32 5695 5703 42 Wagner KD, Vukolic A, Baudouy D, Michiels JF, Wagner N. Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy. PPAR Res. 2016;2016:7631085. Wagner KD Vukolic A Baudouy D Michiels JF Wagner N Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy PPAR Res 2016 2016 7631085 7631085 43 Burkart EM, Sambandam N, Han X, Gross RW, Courtois M, Gierasch CM, et al. Nuclear receptors PPARbeta/delta and PPARalpha direct distinct metabolic regulatory programs in the mouse heart. J Clin Invest. 2007;117(12):3930-9. Burkart EM Sambandam N Han X Gross RW Courtois M Gierasch CM Nuclear receptors PPARbeta/delta and PPARalpha direct distinct metabolic regulatory programs in the mouse heart J Clin Invest 2007 117 12 3930 3939 44 Tan NS, Michalik L, Noy N, Yasmin R, Pacot C, Heim M, et al. Critical roles of PPAR beta/delta in keratinocyte response to inflammation. Genes Dev. 2001;15(24):3263-77. Tan NS Michalik L Noy N Yasmin R Pacot C Heim M Critical roles of PPAR beta/delta in keratinocyte response to inflammation Genes Dev 2001 15 24 3263 3277 45 Jiang B, Liang P, Zhang B, Huang X, Xiao X. Enhancement of PPAR-beta activity by repetitive low-grade H(2)O(2) stress protects human umbilical vein endothelial cells from subsequent oxidative stress-induced apoptosis. Free Radic Biol Med. 2009;46(5):555-63. Jiang B Liang P Zhang B Huang X Xiao X Enhancement of PPAR-beta activity by repetitive low-grade H(2)O(2) stress protects human umbilical vein endothelial cells from subsequent oxidative stress-induced apoptosis Free Radic Biol Med 2009 46 5 555 563 46 Reuland DJ, McCord JM, Hamilton KL. The role of Nrf2 in the attenuation of cardiovascular disease. Exerc Sport Sci Rev. 2013;41(3):162-8. Reuland DJ McCord JM Hamilton KL The role of Nrf2 in the attenuation of cardiovascular disease Exerc Sport Sci Rev 2013 41 3 162 168 47 Cardozo LF, Pedruzzi LM, Stenvinkel P, Stockler-Pinto MB, Daleprane JB, Leite M, et al. Nutritional strategies to modulate inflammation and oxidative stress pathways via activation of the master antioxidant switch Nrf2. Biochimie. 2013;95(8):1525-33. Cardozo LF Pedruzzi LM Stenvinkel P Stockler-Pinto MB Daleprane JB Leite M Nutritional strategies to modulate inflammation and oxidative stress pathways via activation of the master antioxidant switch Nrf2 Biochimie 2013 95 8 1525 1533 Artigo Original Perfil da Expressão do mRNA do Nrf2, NF-κB e PPARβ/δ em Pacientes com Doença Arterial Coronariana Barbosa Jaqueline Ermida Stockler-Pinto Milena Barcza 0000-0002-3169-9315 Cruz Beatriz Oliveira da 0000-0002-1527-1407 Silva Ana Carla Tavares da Anjos Juliana Saraiva 0000-0002-1466-9413 Mesquita Claudio Tinoco Mafra Denise 0000-0001-8507-2369 Cardozo Ludmila F. M. F. Universidade Federal Fluminense - Programa de Pós-Graduação em Ciências Cardiovasculares, Niterói, RJ - Brazil Correspondência: Ludmila F. M. F. Cardozo, Universidade Federal Fluminense - Hospital Universitário Antônio Pedro - Rua Marques do Paraná, 303, 4º andar - prédio da emergência. CEP 24033-900, Niterói RJ - Brasil. E-mail: ludmila.cardozo@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa e Análise e interpretação dos dados: Barbosa JE, Stockler-Pinto MB, Cruz BO, Silva ACT, Anjos JS, Mesquita CT, Mafra D, Cardozo LFMF; Obtenção de dados e Redação do manuscrito: Barbosa JE, Stockler-Pinto MB, Cruz BO, Silva ACT, Anjos JS, Cardozo LFMF; Análise estatística e Obtenção de financiamento: Stockler-Pinto MB, Mafra D, Cardozo LFMF; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Barbosa JE, Stockler-Pinto MB, Mesquita CT, Mafra D, Cardozo LFMF.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamentos:

O estresse oxidativo e a inflamação estão presentes na doença arterial coronariana (DAC) e estão ligados à ativação do fator de transcrição nuclear kappa B (NF-κB). Para atenuar essas complicações, fatores de transcrição como o fator nuclear eritroide 2-relacionado ao fator 2 (Nrf2) e o receptor ativado por proliferador de peroxissoma β/δ (PPARβ/δ) podem ser ativados para inibir o NF-κB. No entanto, os dados disponíveis sobre a expressão de NF-κB, Nrf2 e PPARβ/δ em pacientes com DAC são limitados.

 Objetivo:

Avaliar a expressão dos fatores transcricionais NF-κB e Nrf2 e o PPARβ/δ em pacientes com DAC.

 Métodos:

Trinta e cinco pacientes (17 homens, idade média de 62,4 ± 7,55 anos) com DAC e doze pacientes (5 homens, com idade média de 63,50 ± 11,46 anos) sem DAC foram incluídos. Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas e processadas para a expressão de mRNA do Nrf2, NF-κB, NADPH: quinona oxidoredutase 1 (NQO1) e mRNAs do PPARβ/δ por meio de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR). Valores de p < 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos.

 Resultados:

Não houve diferença nas expressões de mRNA do Nrf2 (1,35 ± 0,57), NF-κB (1,08 ± 0,50) ou na enzima antioxidante NQO1 (1,05 ± 0,88) no grupo DAC em comparação com o grupo sem DAC (1,16 ± 0,76, 0,95 ± 0,33, 0,81 ± 0,55, respectivamente). Entretanto, o PPARβ/δ apresentou maior expressão no grupo com DAC (1,17 ± 0,86 vs. 0,56 ± 0,34, p = 0,008).

 Conclusão:

O principal achado do presente estudo foi o PPARβ/δ apresentar maior expressão nas PBMCs de pacientes com DAC comparados ao grupo controle, ao passo que não foram observadas diferenças nas expressões de mRNA do Nrf2 ou NF-κB.

 Palavras-chave: Doença Arterial Coronariana Estresse Oxidativo Inflamação Obesidade Hipertensão Dislipidemias Fatores de Risco/prevalência Infarto do Miocárdio Insuficiência Cardíaca CAPES 001 FAPERJ E-26 / 203.269 / 2017 E_05 / 2016E_05 / 2016 Este estudo foi financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Código Financeiro 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Processo E-26 / 203.269 / 2017) e (Processo E_05 / 2016E_05 / 2016) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Introdução

Entre as doenças cardiovasculares (DCVs), a Doença Arterial Coronariana (DAC) é a principal causa de morte e altos custos com assistência médica no mundo, sendo tipicamente uma doença crônica com progressão ao longo de anos ou décadas.1-3 A DAC, também conhecida como doença coronariana arteriosclerótica do coração ou doença coronariana, é caracterizada pelo estreitamento das artérias do coração que fornecem sangue, oxigênio e nutrientes ao tecido cardíaco.4

Embora tenha ocorrido um declínio constante na incidência das DCVs nos últimos anos, a prevalência de fatores de risco para DCVs (hipertensão, colesterol elevado e obesidade) tem aumentado. Tabagismo, obesidade, hipertensão arterial, níveis elevados de colesterol total e de lipoproteína de baixa densidade, baixos níveis de lipoproteína de alta densidade, diabetes e idade avançada são os principais fatores de risco para DCV,5,6 estando diretamente relacionados à disfunção endotelial com baixa biodisponibilidade de óxido nítrico, causando vasoconstrição, estresse oxidativo e inflamação.7,8 O estresse oxidativo está presente tanto na etiologia quanto na progressão do infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, aterosclerose e hipertensão.9

O estresse oxidativo surge quando há um desequilíbrio entre a produção de espécies reativas do oxigênio (EROs) e a capacidade dos sistemas antioxidantes de defesa do corpo,10 sendo que a inflamação é uma resposta biológica ao estresse oxidativo onde a célula começa a produzir proteínas, enzimas e outros compostos para restaurar a homeostase.11 O estresse oxidativo é responsável pela inflamação por meio de diversos mecanismos, um dos quais sendo a ativação direta do fator de transcrição nuclear kappa B (NF-κB) pelas EROs. O NF-κB regula a transcrição de diversos genes que codificam citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e moléculas de adesão leucocitária.

Nesse sentido, é importante avaliar fatores que atenuam tanto a inflamação quanto o estresse oxidativo. O fator Nuclear eritroide 2-relacionado ao fator 2 (Nrf2) tem sido associado a efeitos citoprotetores e seu acúmulo leva a um aumento na transcrição de genes regulados por elementos de resposta antioxidante (ARE) que codificam enzimas antioxidantes e desintoxicantes de fase II, podendo ser considerado um fator protetor contra o estresse oxidativo e a inflamação.12-14 Em condições basais, o fator Nrf2 é inativo no citoplasma, sendo inibido por sua proteína repressora citosólica, proteína 1 associada a ECH semelhante a Kelch, que por meio da ação de certas substâncias, incluindo as EROs, que alteram a conformação, dissocia o fator Nrf2, facilitando, assim, a acumulação e a translocação nuclear do Nrf2. No núcleo, o Nrf2 se liga a sequências regulatórias chamadas AREs, que atuam em genes que codificam enzimas antioxidantes e desintoxicantes de fase II, incluindo a NADPH: quinona oxidoredutase 1 (NQO1).15 O papel do Nrf2 na redução da inflamação está relacionado à capacidade de antagonizar indiretamente o NF-κB pela remoção de EROs. Além disso, enzimas antioxidantes parecem agir diretamente na redução de mediadores inflamatórios.15 Além do Nrf2, outro alvo que atraiu o interesse e a atenção dos pesquisadores é o receptor ativado por proliferador de peroxissomaβ/δ (PPARβ/δ). No entanto, as funções biológicas do PPARβ/δ e sua eficácia como alvo terapêutico no tratamento da hipertensão e DCV ainda não foram elucidadas.16 O PPARβ/δ é o subtipo predominante no coração e várias linhas de evidência sugerem uma função cardioprotetora do PPARβ/δ.17 Estudos pré-clínicos sugerem que a ativação do PPARβ/δ promove efeitos anti-hipertensivos em modelos animais estabelecidos18 e a ativação farmacológica do PPARβ/δ previne a disfunção endotelial e regula negativamente as respostas inflamatórias.19,20 Além disso, o PPARβ/δ suprime as atividades de vários fatores de transcrição, incluindo o NF-κB.21 Tendo em vista que não há estudos sobre a expressão gênica de Nrf2, NF-κB e PPARβ/δ e seu perfil em pacientes com DAC, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão de mRNA dos fatores de transcrição NF-κB e Nrf2 e do receptor PPARβ/δ em pacientes com DAC.

 Métodos Indivíduos

Quarenta e sete pacientes foram incluídos neste estudo através de uma amostra por conveniência, onde os pacientes compuseram cada grupo de acordo com a presença ou ausência de doença arterial coronariana. Trinta e cinco pacientes (17 homens e 18 mulheres, idade média de 62,4 ± 7,5 anos, IMC 28,9 ± 4,9 kg/m2) com DAC e/ou alterações na cintilografia de perfusão miocárdica compuseram o grupo DAC e doze pacientes (5 homens e 7 mulheres, idade média de 63,5 ± 11,5 anos, 26,5 ± 6,2 kg/m2) sem DAC compuseram o grupo sem DAC. Os pacientes elegíveis tinham mais de 18 anos e compareceram ao Setor de Medicina Nuclear do Hospital Universitário Antônio Pedro (Niterói, Rio de Janeiro, Brasil) para realizar a cintilografia miocárdica. Pacientes com infecção, câncer, doença renal crônica (taxa de filtração glomerular estimada <60 mL/min), síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) e doença autoimune foram excluídos. O grupo controle era composto por pacientes hipertensos, dislipidêmicos e/ou diabéticos não diagnosticados com DAC, do mesmo hospital.

 Medidas antropométricas

As medidas antropométricas foram feitas por um membro da equipe treinado, que utilizou as técnicas padrão. O índice de massa corporal foi calculado pelo peso em quilogramas dividido pela altura em metros quadrados.22

Avaliação da pressão arterial

A pressão arterial (PA) foi medida pelo método indireto utilizando-se técnica auscultatória com esfigmomanômetro e manguito apropriado de acordo com as dimensões do braço do paciente. Utilizou-se aparelho de PA aneroide - AD-2 sobre rodízio (pedestal), marca UNITEC Hospitalar (INMETRO ML 095 2007/ANVISA 10432300016). Para avaliar a PA, o procedimento foi inicialmente explicado ao paciente, que era mantido em repouso por mais de cinco minutos, sentado, com os pés apoiados no chão, encostado na cadeira, braço no nível do coração (ponto médio do esterno), apoiado, despido, com a palma da mão voltada para cima e o cotovelo ligeiramente fletido. Definiu-se hipertensão arterial quando os valores da PA sistólica (PAS) eram maiores ou iguais a 140 mmHg.23

Procedimentos analíticos e processamento de amostras

Coletou-se sangue de cada participante pela manhã, após 12 horas de jejum noturno, sendo acondicionado em tubo com anticoagulante EDTA (1,0 mg/mL). O plasma foi centrifugado e separado (15 min, 3000xg, 4°C) e armazenado a -80°C até a análise.

Foram coletadas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), diluindo-se as amostras de sangue com EDTA em PBS e as células foram separadas em 5 mL de Histopaque (Sigma-Aldrich) por centrifugação a 1800 g por 30 minutos. As PBMCs foram coletadas e lavadas duas vezes com PBS frio e ressuspensas e armazenadas (−80°C) com 1 mL de meio de congelamento para cultivo celular RecoveryTM (Thermo Fisher Scientific) para isolamento de RNA.

 Parâmetros bioquímicos e inflamatórios

Os níveis de colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL, triglicerídeos, glicose e proteína C-reativa ultrassensível foram determinados usando analisadores bioquímicos automáticos da marca Bioclin® (Bioclin BS-120 Chemistry Analyzer). Calculou-se o colesterol LDL pela equação de Friedewald et al.,24

Análise da PCR quantitativa em tempo real

As expressões de mRNA dos fatores de transcrição NF-κB, NQO1 e PPARβ/δ foram avaliadas pela PCR quantitativa em tempo real (qPCR) de PBMCs de acordo com Cardozo et al. 2016.25 Foram utilizados os ensaios de expressão gênica TaqMan® (Applied Biosystems) para detectar a expressão de mRNA dos fatores Nrf2 (Hs00975961_g1), NF-κB (Hs00765730_m1), NQO1 (Hs00168547_m1), PPARβ/δ (Hs00975961_g1) e o gene de controle GAPDH (Hs02758991_g1).

 Análise estatística

O teste Shapiro-Wilk foi aplicado para testar a distribuição das amostras. Os resultados foram expressos em média ± DP (idade, IMC, PAS, perfil lipídico, glicose, Nrf2, NF-κB, NQO1, PPARβ/δ), mediana (intervalo interquartil) (PCR) ou porcentagem (hipertensão, dislipidemia, diabetes), conforme aplicável. Utilizou-se o teste t de Student não pareado para comparar as variáveis e grupos com distribuição normal e o teste de Mann-Whitney-Wilcoxon para dados não paramétricos. As correlações entre as variáveis foram avaliadas pela correlação dos coeficientes de Pearson ou Spearman de acordo com a distribuição da amostra. Aceitou-se 5% como nível de significância. As análises estatísticas foram realizadas com software SPSS 19.0 (Chicago, IL, EUA).

 Resultados

No grupo com DAC, 82,8% apresentaram alterações na cintilografia de perfusão miocárdica (65,5% isquemia miocárdica, 27,6% fibrose miocárdica, e 6,9% de fibrose e isquemia miocárdica). Quanto à duração da doença, 71,4% foram diagnosticados com DAC de 1 a 5 anos, 17,1% de 6 a 10 anos e 11,5% de 10 a 15 anos. De acordo com a história clínica dos pacientes com DAC, 54,2% realizaram algum tipo de procedimento antes do estudo: 8,7% realizaram cateterismo cardíaco, 34,3% angioplastia coronariana transluminal percutânea, 5,7% angioplastia coronariana transluminal percutânea e cateterismo cardíaco e 5,7% angioplastia coronariana transluminal percutânea e cirurgia de revascularização miocárdica. Além disso, 62,8% dos pacientes com DAC e 30,8% do grupo controle eram fumantes. Considerando o uso de medicamentos, no grupo com DAC, 68,5% usavam bloqueadores β-adrenérgicos, 17,4% inibidores da enzima conversora de angiotensina, 77,1% estatinas, 28,5% bloqueadores dos canais de cálcio, 51,4% diuréticos, 37,2% nitratos, 54,3% ácido acetilsalicílico, 62,8% losartana potássica, 34,8% hipoglicemiantes orais e 11,43% insulina. No grupo controle, 53,8% usavam bloqueadores β-adrenérgicos, 15,4% inibidores da enzima conversora de angiotensina, 46,2% estatinas, 30,8% bloqueadores dos canais de cálcio, 53,8% diuréticos, 7,7% nitratos, 61,5% ácido acetilsalicílico, 69,2% losartana potássica, 38,5% hipoglicemiantes orais e 7,7% insulina. Não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos com relação ao uso de medicamentos ou tabagismo.

A Tabela 1 apresenta o perfil clínico e os parâmetros bioquímicos. Além disso, o grupo com DAC apresentou menores níveis de colesterol total, colesterol LDL e colesterol HDL quando comparado ao grupo sem DAC (Tabela 1).

Perfil clínico e bioquímico dos pacientes do estudo
Parâmetros Grupo sem DAC (n = 12) Grupo com DAC (n = 35) Valor de p
Homens/mulheres (n) 5/7 17/18 0.99
Idade (anos) 63,5 ± 11,5 62,4 ± 7,5 0,70
Hipertensão (%) 91,7 97,1 0,81
Dislipidemia (%) 75 74,2 0,67
Diabetes (%) 16,7 37,1 0,84
IMC (kg/m2) 26,5 ± 6,2 28,9 ± 4,9 0,17
PAS (mmHg) 137,5 ± 23,0 138,0 ± 18,6 0,69
PAD (mmHg) 82,5 ± 9,6 82,8 ± 8,2 0,90
Colesterol total (mg/dL) 200 ± 59,4 163,3 ± 46,7 0,03
Colesterol LDL (mg/dL) 109,3 ± 53,3 79,9 ± 33,3 0,03
Colesterol HDL (mg/dL) 65,1 ± 21,3 45,3 ± 9,9 0,002
Triglicerídeos (mg/dL) 128,2 ± 57,3 130,6 ± 71,8 0,79
Glicose (mg/dL) 115,2 ± 44,6 103,7 ± 36,4 0,13
PCR (mg/L) 0,6 (0,4-4,0) 2,0 (0,12-8,7) 0,25

DAC: doença arterial coronariana; IMC: índice de massa corporal; PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; PCR: proteína C-reativa. Dados paramétricos expressos em média ± DP e dados não paramétricos expressos em mediana, 15° e 75° quartis.

Não foram encontradas diferenças nos fatores transcricionais Nrf2 e NF-κB ou na expressão de mRNA do gene NQO1, comparando-se o grupo DAC com o grupo sem DAC. Em contrapartida, houve maior expressão do receptor PPARβ/δ no grupo com DAC (Tabela 2). Consideramos que a inclusão de pacientes diabéticos não interferiu nos resultados. Nenhuma correlação foi encontrada.

Níveis de expressão de mRNA no grupo sem DAC e no grupo com DAC
Parâmetros Grupo sem DAC Grupo com DAC Valor de p
Nrf2 1,16 ± 0,76 1,35 ± 0,57 0,35
NF-κB 0,95 ± 0,33 1,08 ± 0,50 0,58
NQO1 0,81 ± 0,55 1,05 ± 0,88 0,37
PPARβ/δ 0,56 ± 0,34 1,17 ± 0,86 0,008

As expressões de mRNA dos fatores Nrf2, NF-kB, NOQ1 e PPARβ/δ foram realizadas em PBMCs por PCR quantitativa em tempo real. Os dados foram expressos como média ± DP. Os dados foram expressos como média ± DP. DAC: doença arterial coronariana.

 Discussão

Alguns estudos avaliaram a inflamação sistêmica através da expressão gênica das PBMCs.26,27 Salientou-se a importância de estudar as PBMCs como uma estratégia para avaliar alvos de vias metabólicas relacionadas à inflamação para explorar as DCV para uma melhor compreensão da arquitetura dessas doenças. A hipótese contemplada seria a de que os PBMCs poderiam refletir mecanismos inflamatórios de uma maneira mais específica em comparação com o soro/plasma.28 Assim, o presente estudo investiga a expressão de mRNA dos fatores transcricionais NF-κB e Nrf2 e do receptor PPARβ/δ nas PBMCs de pacientes com DAC. Os pacientes com DCV geralmente estão expostos a inflamação e estresse oxidativo. O fator Nrf2 protege o organismo contra essas alterações, pois está relacionado à síntese de enzimas antioxidantes e é capaz de antagonizar o NF-κB envolvido na indução inflamatória.

Diversos estudos mostraram que o fator NF-κB desempenha um papel importante no desenvolvimento de DCV.29-31 Demonstrou-se que a isquemia induziu rapidamente a ativação do NF-κB no miocárdio de ratos.29 Wilson et al.,30 mostraram que o NF-κB encontrava-se aumentado na placa ateromatosa coronariana em humanos e sua expressão estava predominantemente associada a macrófagos, células espumosas e células musculares lisas vasculares. Além disso, sua expressão mostrou-se aumentada nas síndromes coronarianas agudas e associada à molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1).30 A inibição do fator NF-κB nas células endoteliais resultou em redução do desenvolvimento de aterosclerose e mostrou-se correlacionada à redução da expressão de citocinas pro-inflamatórias, quimiocinas e moléculas de adesão nas aortas de camundongos alimentados com dieta rica em colesterol.31

Alguns estudos demonstram que, como mecanismo de proteção, no estágio inicial de doenças, o fator Nrf2 tem sua atividade aumentada para evitar danos induzidos por EROs. No estágio final, devido à cronicidade e/ou gravidade da doença, esse mecanismo de proteção pode se tornar saturado pelo excesso de EROs, levando à redução de Nrf232,33 ou o Nrf2 parece ser insuficientemente capaz de antagonizar o NF-κB, permanecendo elevado.26

Apesar disso, os efeitos da DAC no sistema Nrf2-Keap1 não estão bem estabelecidos. No entanto, pacientes com DAC apresentaram menor expressão gênica de Nrf2/ARE e glutationa (GSH).27

Uma fase importante da formação da placa aterosclerótica é a infiltração endotelial bem estabelecida pelos macrófagos e a formação de células espumosas. Em ratos, o fator Nrf2 é um componente importante nesse processo, uma vez que macrófagos expostos à LDL oxidada promoveram aumento da expressão de Nrf2, que protegeu indiretamente os macrófagos de lesões mediadas por LDL oxidada através de enzimas antioxidantes de fase II.34 Além disso, a ausência de Nrf2 em macrófagos de camundongos que consomem uma dieta rica em gordura aumentou a formação de células espumosas e a progressão da aterosclerose, sugerindo que o fator Nrf2 é importante na resistência à aterosclerose.35 O aumento da expressão de Nrf2 nesse estágio do desenvolvimento da aterosclerose é importante porque os efeitos sobre a expressão da heme oxigenase-1 (HO-1), que produz efeitos antiaterogênicos como redução na formação de células espumosas36 e NQO1, também se mostraram importantes na proteção contra a aterosclerose.37

No presente estudo, não houve diferenças na expressão de mRNA do fator Nrf2 ou NF-kB entre pacientes do grupo com DAC e do grupo sem DAC, possivelmente devido ao fato de os pacientes nos dois grupos serem idosos, hipertensos e/ou diabéticos, demonstrando que nenhum dos grupos era composto por pacientes saudáveis. Além disso, todos os pacientes estavam em uso de diversos medicamentos com possível efeito antioxidante.38,39 Com a idade, a expressão de diversos alvos downstream do fator Nrf2 diminuem.40 Ainda é importante ressaltar que tanto a hipertensão quanto o diabetes estão relacionados ao aumento do estresse oxidativo, acúmulo de espécies reativas de oxigênio e inflamação.9,41

No presente estudo, o receptor PPARβ/δ mostrou-se elevado quando comparado aos pacientes sem DAC. Parece ser um fator protetor, uma vez que foi demonstrado que o equilíbrio adequado da ativação de PPARβ/δ nos diferentes tipos de células cardíacas pode ser importante para os possíveis efeitos cardioprotetores do PPARβ/δ.42 Um estudo in vivo mostrou que a superexpressão cardíaca específica do PPARβ/δ levou ao aumento da utilização de glicose miocárdica e não alterou a função cardíaca, mas exerceu um efeito protetor na lesão miocárdica induzida por isquemia/reperfusão.43 Além disso, a deleção do gene PPARβ/δ em camundongos resultou em disfunção cardíaca, hipertrofia e insuficiência cardíaca congestiva.17 Além disso, o PPARβ/δ foi descrito em várias funções biológicas, incluindo a sobrevivência celular.44,45 Estudos mostram que a inflamação, as EROs e as LDLs oxidadas induzem a apoptose de células endoteliais, representando o início do desenvolvimento de lesões ateroscleróticas.45 Assim, ensaios realizados em queratinócitos mostraram que o aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias é capaz de elevar a expressão de PPARβ/δ, que por sua vez regula a expressão de genes relacionados à apoptose, resultando em aumento da resistência à morte celular.44

Dada a importância do PPARβ/δ e dos efeitos dos fatores de transcrição NF-κB e Nrf2 nos pacientes com DAC - o Nrf2 orquestrando a produção de enzimas antioxidantes e desintoxicantes de fase 2 sendo considerado um fator protetor contra o estresse oxidativo e a inflamação,46 com o PPARβ/δ promovendo a cardioproteção42 e o NF-κB regulando a inflamação12 - uma melhor compreensão de como eles são expressos em pacientes com DAC mostra-se útil para que se possa utilizar estratégias na tentativa de modular esses fatores de transcrição. Alguns estudos propuseram que nutrientes contendo indutores de Nrf2 de de fontes naturais podem ajudar a melhorar o sistema Nrf2-Keap1.25,47

Este estudo apresentou uma série de limitações que merecem ser consideradas. Primeiramente, o estudo deveria ter um grupo controle saudável para comparação. Em segundo lugar, seria interessante estratificar os resultados por fator de risco e resultados de cintilografia, mas a amostra não era grande o suficiente para isso. Em terceiro lugar, infelizmente, não realizamos outros genes-alvo dos fatores Nrf2, NF-κB e PPARβ/δ que codificam enzimas antioxidantes e citocinas pró-inflamatórias para confirmar a rede de expressão dos fatores Nrf2, NF-κB e PPARβ/δ. Além disso, não foi possível calcular o colesterol não HDL. Novos estudos devem ser estimulados para explorar esta questão. Considerando essas limitações, este foi um protocolo muito bem controlado, o que nos permitiu concluir que os resultados são consideravelmente relevantes.

 Conclusão

O presente estudo revelou aumento da expressão de PPARβ/δ nas PBMCs de pacientes com DAC, embora não tenham sido observadas diferenças nas expressões de mRNA dos fatores Nrf2 ou NF-κB. Esses achados podem levar a possíveis terapias, alvos e futuras pesquisas para o tratamento desses pacientes.

Fontes de financiamento

Este estudo foi financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Código Financeiro 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Processo E-26 / 203.269 / 2017) e (Processo E_05 / 2016E_05 / 2016) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte da dissertação de Mestrado de Jaqueline Ermida Barbosa pela Universidade Federal Fluminense.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal Fluminense sob o número de protocolo 826.041 CAAE 35035414.8.0000.5243. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.