Arq Bras CardiolabcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCJwmKfQDd6NW63Y3smNHFzPRS0066-782X2019001100925S0066-782X201900501610310.5935/abc.20190173Original ArticleBradycardic and Antiarrhythmic Effects of the D-Limonene in Rats0000-0002-8736-7117NascimentoGildenisson Araújo do10000-0002-3508-9776SouzaDiego Santos de1LimaBruno Santos10000-0002-7197-0261VasconcelosCarla Maria Lins de1AraújoAdriano Antunes de Souza1DurçoAimée Obolari1Quintans-JuniorLucindo José1AlmeidaJackson Roberto Guedes da Silva2OliveiraAldeída Pereira30000-0003-1488-0259Santana-FilhoValter Joviniano de1BarretoAndré Sales10000-0002-9458-0370SantosMárcio Roberto Viana dos1Universidade Federal de SergipeSão CristóvãoSEBrazilUniversidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, SE - BrazilUniversidade Federal do Vale do São FransciscoPetrolinaPEBrazilUniversidade Federal do Vale do São Franscisco, Petrolina, PE - BrazilUniversidade Federal do PiauíTeresinaPIBrazilUniversidade Federal do Piauí, Teresina, PI - BrazilMailing Address: Carla Maria Lins de Vasconcelos • Universidade Federal de Sergipe - Fisiologia - Av. Marechal Rondon, s/n. Postal Code: 49000-100, Rosa Elze, São Cristóvão, SE - Brazil E-mail: carlamlv@hotmail.com
Author contributions
Conception and design of the research: Vasconcelos CML, Souza DS, Lima BS, Araujo AAS, Quintans-Junior LJ, Almeida JRGS, Oliveira AP, Santana-Filho VJ, Barreto AS, Santos MRV; Acquisition of data: Vasconcelos CML, Nascimento G, Souza DS, Lima BS, Durço A; Analysis and interpretation of the data: Vasconcelos CML, Nascimento G, Souza DS, Lima BS, Araujo AAS, Durço A, Oliveira AP, Santana-Filho VJ, Barreto AS, Santos MRV; Statistical analysis: Vasconcelos CML, Nascimento G, Souza DS, Araujo AAS, Santos MRV; Obtaining financing: Vasconcelos CML, Araujo AAS, Quintans-Junior LJ, Almeida JRGS, Santana-Filho VJ, Santos MRV; Writing of the manuscript: Vasconcelos CML, Nascimento G, Souza DS, Durço A, Quintans-Junior LJ, Barreto A, Santos MRV; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Vasconcelos CML, Araujo AAS, Quintans-Junior LJ, Almeida JRGS, Oliveira AP, Santana-Filho VJ, Barreto AS, Santos MRV.
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
020920191120191135925932280920182112201813022019This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.AbstractBackground:
D-limonene (DL) is a monoterpene and is the major component in the essential oil of citrus fruit. It presents antihyperglycemic and vasodilatation activities.
Objectives:
This study evaluated the cardiovascular effects and potential antiarrhythmic of DL in rats.
Methods:
Hemodynamic and electrocardiographic (ECG) parameters were measured in male Wistar rats, which under anesthesia had been cannulated in the abdominal aorta and lower vena cava and had electrodes subcutaneously implanted. In the in vitro approach, the heart was removed and perfused using the Langendorff technique. The significance level adopted was 5% (p < 0.05).
Results:
DL, in doses of 10, 20, and 40 mg/kg (i.v), produced intense and persistent bradycardia associated with hypotension. Bradycardia with prolonged QTc was observed in the ECG in vivo recording. In the in vivo model of arrhythmia induced by Bay K8644, DL (10 mg/kg) decreased the arrhythmia score from 15.33 ± 3.52 to 4.0 ± 2.64 u.a (p < 0.05, n = 4). In isolated perfused hearts, DL (10-3 M) promoted significant reductions in heart rate (from 228.6 ± 8.5 ms to 196.0 ± 9.3 bpm; p < 0.05) and left ventricular development pressure (from 25.2 ± 3.4 to 5.9 ± 1.8 mmHg; n = 5, p < 0.05).
Conclusions:
DL produces bradycardia and antiarrhythmic activity in rat heart.
Despite the extensive research carried out on cardiac arrhythmias over the past decades, only a small number of antiarrhythmic drugs have emerged to add to the current therapeutic arsenal for this condition. Furthermore, "classical" antiarrhythmic drugs have serious efficacy and safety limitations and present several side effects.1,2
In the search for therapeutic alternatives for arrhythmias, recent studies have screened naturally occurring chemical compounds aiming to evaluate their effects on cardiac parameters. For example, studies with the monoterpenes pulegone and geraniol showed a negative inotropism in the mammalian myocardium through blockage of the Ca2+ and K+ currents.3-5 Most recently, Vasconcelos et al.6 verified that citronellol and nerol present negative inotropism on the left atrium of guinea-pigs.
D-limonene (DL) (Figure 1), is an alcoholic monoterpene and the major constituent of the essential oil extracted from citrus species such as lemon, lime and orange.7 Previous studies have demonstrated that DL has low toxicity and presents antioxidant,8,9 vasodilatation,10,11 and antihypertensive proprieties.12 The effect of DL on the heart has not yet been elucidated and investigations into its action mechanism can provide new insights about DL and the cardiovascular system. The current study, therefore, aimed to evaluate the potential antiarrhythmic effect de DL using both in vivo and ex vivo approaches.
Chemical structures of the d-limonene (DL) (FW: 136.24).
MethodsChemicals
The chemicals used were: d-limonene (DL: purity: 97%), and S-(−)-Bay K8644, both purchased from Sigma Aldrich (Chemical CO, USA), and ketamine and xylazine (purchased from Sespo, São Paulo, Brazil). The DL stock solution was prepared using a saline/cremophor mixture (0.15% v/v), the S-(−)-Bay K8644 was diluted in methanol and the DL solution in distilled water. Stock solutions were preserved at 0ºC and diluted with distilled water, if necessary. The vehicles (methanol or saline+cremophor) revealed no effect on the control preparations.
Animals
Thirty-six healthy rats (Rattus norvegicus), weighing between 250 and 350 g were obtained from colonies from the Physiology Department of the Federal University of Sergipe, Brazil. They were maintained under standard temperature conditions (22 ± 2ºC) on a 12-hour light/dark schedule (lights on at 06 am) and were fed a standard diet (Labina®) with water ad libitum.
In each set of experiments, rats were divided into two groups: control with 4 or 6 animals, and DL treated, with 4 or 6 animals. All experimental protocols were previously approved by the Animal Care and Ethics Committee of the Universidade Federal de Sergipe.
Effects of DL on Hemodynamic parameters in vivo
Rats were anesthetized with ketamine and xylazine (80 mg/Kg and 10 mg/Kg; i.p., respectively), and polyethylene catheters were implanted in the abdominal aorta and inferior vena cava via left femoral artery and vein, respectively. After insertion and fixation by cotton threads, the catheters were tunneled subcutaneously and exteriorized through an incision in the posterior cervical region of the animal. The incisions were closed and the animals were allowed a 24-hour post-operative recovery period. Mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR) were recorded through a pressure transducer (Edwards LifeSciences, Irvine, CA, EUA) coupled to an amplifier (FE221, Bridge Amp; ADInstruments, Bella Vista, NSW, Australia)
After post-operative recovery period, MAP and HR were recorded before (baseline values) and after IV bolus administration of DL (1, 5, 10, 20, and 40 mg/kg, i.v.) or vehicle to obtain dose-response curves. The DL curve (n = 6) was compared with the vehicle curve (n = 6).
In vivo electrocardiographic measurements
Animals from both groups, control (n = 4) and DL treated (n = 4), were heparinized (200 I.U, i.p.), anesthetized with an i.p. injection of ketamine (80 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg), and the vena cava was cannulated as previously described. The rats were kept in the supine position with spontaneous breathing and were administrated vehicle or DL (10 mg/kg). The volume injected through the cannula was the same for all concentrations (200 µL). To record the electrocardiographic signal, the electrodes were placed under the skin in the DII lead arrangement. The electrocardiographic parameters observed were the PR interval, QT interval, duration of QRS complex and HR. The QT interval was corrected by Bazett's formula modified for rats.13
Animals, from both groups, control (n = 4) and DL treated (n = 4), were heparinized (200 I.U., i.p.) and after 15 min the heart was removed and mounted in an aortic perfusion system of the Langendorff type, on a constant flow (10 mL/min).14 The hearts were continuously perfused with Krebs-Henseleit solution (in mM: 120 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 MgCl2, 1.25 CaCl2, 2 NaH2PO4, 27 NaHCO3, 11 glucose), previously filtered through a cellulose acetate membrane (0.45 µm), pH was adjusted to 7.4 and oxygenated (95% O2 + 5% CO2) and maintained at 37 ± 0.1ºC (Haake F3, Berlin, Germany). Electrocardiographic (ECG) heart signals were captured using three electrodes (Ag/AgCl/NaCl, 1 M) that were placed inside the chamber close to the heart. The signals were amplified, digitalized (PowerLab 4/35 ADInstruments, USA) and stored in a computer. Left ventricular development pressure (LVDP, mmHg) and HR (bpm) were measured using a water-filled balloon introduced into the cavity of the left ventricle. This device was coupled to a pressure transducer (FE221, Bridge Amp, ADInstruments, USA) and an amplifier (PowerLab 4/35, ADInstruments). The system was calibrated using a column of mercury. Time of peak (ms), which is defined as the time necessary to achieve the peak of maximal ventricular contraction, and relaxation time, were also analysed.
Evaluation of the antiarrhythmic effect of DL
The antiarrhythmic effect of DL was determined the in vivo animal model using (S)-(−)-Bay K8644, an L-type calcium channel (LTCC) agonist. Arrhythmia was induced by administration of (S)-(−)-Bay K8644 (1 mg/kg, i.v.) in the femoral vein of both groups, control (n = 4) and DL treated (n = 4).
DL (10 mg/kg) was administered 10 min prior to (S)-(−)-Bay K8644.15 Cardiac arrhythmias were observed for 20 min by analysis of the ECG recording. For a better analysis, the total time was divided into 10, 3 min intervals for classification of arrhythmia. Arrhythmias were determined through a modified scoring system previously validated by Curtis and Walker.16 The arrhythmias observed were ventricular premature beats (VPB), ventricular tachycardia (VT) and ventricular fibrillation (VF). VPBs < 10/3 min period were recorded as 0; VPB’s > 10/3 min were recorded as 1; VT episodes of 1-5/3 min were recorded as 2; > 5/3 min episodes of VT and/or any number of episodes of VF and/or 1 episode of VF with a duration < 40 s period was recorded as 3; 2-5/3 min episodes of VF or a VT and VF with a total combined with duration < 80 s period was recorded as 4; 5/3 min episodes of VF or VT and VF combined with a duration < 160 s was recorded as 5; VT or VF or both/3 min with a total combined duration < 300 s were recorded as 6, and VT or VF or both/3 min with a total combined duration > 300 s were recorded as 7.
Statistical analysis
The normality of the data was verified by using Shapiro-Wilk normality test. The data were represented as mean ± SD. When appropriate, it was used either unpaired Student T-test or analysis of variance (one or two way ANOVA) and Bonferroni’s post hoc test. The significance level adopted was 5% (p < 0.05). Statistical analyses were performed using GraphPad Prism™ 5.0.
Results
In all rats tested, HR and MAP baseline values were 371 ± 45 bpm and 114 ± 11 mmHg, respectively. Figure 2A shows original traces of the DL effect (1, 5, 10, 20, and 40 mg/kg, i.v.) on the pulsatile signal of arterial pressure of a conscious rat. In these animals, DL, at doses of 1 and 5 mg/kg, produced transitory and non-significant hypotension without altering HR (Figure 2B - left graph). On the other hand, DL, at doses of 10, 20, and 40 mg/kg, produced an intense and persistent bradycardia (-33.0 ± 21; -57.0 ± 19, and -53.0 ± 30 %; n = 6; p < 0.05, respectively) (Figure 2B - right graph) which persisted up to 19 ± 12 min after administration. This bradycardia was associated to hypotension only in the doses of 20 and 40 mg/kg (-53.0 ± 6, and -28.0 ± 18 %; n = 6, p < 0.05, respectively).
Effect of DL (1, 5, 10, 20, and 40 mg/kg, i.v.) on heart rate (HR) and mean arterial pressure (MAP) in conscious rats. A) Original traces showing the DL effect (1, 5, 10, 20 and 40 mg/Kg, i.v., randomly) on heart rate (HR) and mean arterial pressure (MAP) from one healthy and conscious rat. The arrows indicate the moment of administration. B) Line graph of DL effect on HR and MAP. Values are mean ± SD from six experiments. Data were analysed by repeated measures two-way ANOVA followed by Bonferroni post-test.
** p < 0.01 and *** p < 0.001 vs vehicle.
Figure 3A shows ECG representative tracings for the vehicle (top) and 10 min after i.v. administration of 10 mg/kg of DL (bottom). As can be seen, DL significantly decreased HR (p < 0.05) and increased the QTc (Figures 3B and E). However, DL did not change the PRi and QRS complex duration (Figures 3C and D).
In vivo effects of DL (10 mg/kg) on electrocardiographic parameters (ECG) before (vehicle) and after DL perfusion. Original traces (A) and bar chart of DL effect on heart rate (B), PR interval (PRi) (C), QRS duration (D), and corrected QT interval (QTc) (E). Data are mean ± SD and were analysed by the unpaired Student T test.
* p < 0.05 vs vehicle, n = 4.
In the experiment on Langendorff system, DL (10-3 M) evoked a significant reduction in LVDP compared to the control (Figure 4A). Average data showed that the LVDP decreased from 25.2 ± 11.4 mmHg to 5.9 ± 6.1 mmHg (n = 5, p < 0.05, Fig 4B). DL also promoted a reduction of HR from 228.6 ± 19.1 to 196.0 ± 20.8 bpm (n = 4, p < 0.05, Figure 4C). Regarding the temporal course of the contraction and relaxation phases, our results showed that DL did not alter the time to peak contraction of the left ventricle (Figure 4D) but increased the relaxation time from 129.0 ± 3.0 to 193.5 ± 37.8 ms (n = 4, p < 0.05, Figure 4E).
Ex vivo effects of DL perfusion (10<sup>-3</sup> M) on cardiac parameters. A) Representative traces of left ventricular development pressure (LVDP) recorded in the control situation (top panel) and after perfusion of 10<sup>-3</sup> M DL (bottom panel); Bar chart graphic of DL effect on LVDP B), heart rate C), Time of peak D), and Relaxation time E). Data are mean ± SD and were analysed by unpaired Student T-test.
* p < 0.05 vs vehicle, n = 4.
In in vivo model of arrhythmias induced by Bay K8644, DL significantly reduced the incidence of ventricular arrhythmias, such as VPB, VT and VF, and the total arrhythmia index from 15.3 ± 6.1 a.u to 4.0 ± 4.5 a.u (n = 4, p < 0.05) (Figure 5B). Furthermore, DL was able to prevent the sinus tachycardia evoked by Bay K8644 (300.0 ± 46.1 for 93.0 ± 17.4 bpm, n = 4, p < 0.05).
In vivo effects of DL (10 mg/kg) on arrhythmias induced by S(−)-Bay K 8644 in anesthetized rats. Original traces A) and bar chart graphic of arrythmia score B) and heart rate C) before and after DL treatment. Data are mean ± SD and were analysed by unpaired Student T-test (B) (* p < 0,05 vs control, n = 4) and ANOVA followed by Bonferroni post-test (C) (* p < 0,05 vs control, # p < 0.05 vs Bay K8644, n = 4).
In conscious rat, the intravenous administration of DL at lower doses (1 and 5 mg/kg) was able to produce a non-significant hypotension, without altering HR. On the other hand, DL at higher doses (10, 20, and 40 mg/kg) produced intense and persistent bradycardia, which persisted up to almost 20 min. Similar effects have been found for other monoterpenes such as 1,8-cineol17 terpinen-4-ol,18 and y(-)-α-bisabolol.19
In order to understand the DL-induced bradycardic effect better, we investigated any changes in the electrocardiographic profile at a dose of 10 mg/kg. This dose was chosen because it was the lowest dose able to produce bradycardia without producing any significant effect on MAP (see Figure 2B). The administration of 10 mg/kg of DL (bottom). significantly decreased HR and increased the QTc. However, DL did not change the PRi and QRS complex duration. Corroborating the data observed in the hemodynamic experiments, we observed in the ECG that DL also promoted bradycardia by increasing QTc. As shown in the literature, calcium channels blockers can reduce cardiac conduction velocity and cause bradycardia.20,21 These effects may or may not be associated with QTc prolongation.22
The direct effect of DL on the cardiac muscle was evaluated in an isolated heart mounted on a Langendorff system. In this experiment, DL or vehicle was perfused through the aorta to record LVDP. The volume of blood in a rat is approximately 7 mL to each 100 g of body weight,23 therefore, the DL concentration after administration of 10 mg/kg in the in vivo experiments is approximately the same as the perfusion with 10-3 M of DL in the ex vivo experiments. As shown, the perfusion with DL evoked a significant reduction in LVDP. Interestingly, these results are very similar to that observed in vivo, where DL also promoted a reduction of HR. Regarding the temporal course of the contraction and relaxation phases, our results showed that DL did not alter the time to peak contraction of the left ventricle (Figure 4D) but increased the relaxation time. As known, the recapture of calcium by sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) is a pivotal step for myocardial relaxation in rats 24. Our data show that DL delayed the relaxation of cardiac muscle, which can be associated to minor recapture of calcium by SERCA, but this assumption will still need to be elucidated.
Our ex vivo results showed that DL decreased pacemaker activity and promoted negative inotropism. It is well known that drugs that block LTCC in cardiac muscle decrease pacemaker activity and result in bradycardia. Furthermore, calcium antagonists decrease myocardial force generation (negative inotropy). These results show that DL presents a similar action to an LTCC blocker. In smooth muscle, De Sousa et al.25 showed that the relaxant effects of DL in guinea pig tracheas and rat aortas were independent of the endothelium and probably caused by direct action on calcium dynamics.
LTCC blockers are classified as class IV antiarrhythmic drugs. The antiarrhythmic properties of LTCC blockers are related to their ability to decrease the firing rate of aberrant pacemaker sites within the heart and to their ability to decrease conduction velocity in the AV node that can help to block reentry mechanisms, which can cause supraventricular tachycardia. Indeed, we decided to investigate the possible antiarrhythmic effect of DL using an in vivo model with arrhythmia induced by Bay K8644, an LTCC agonist. In all the animals tested, Bay K8644 increased HR and inducing arrhythmias such as VPB, VT and VF. As showed, DL significantly reduced the incidence of ventricular arrhythmias and was able to prevent the sinus tachycardia evoked by Bay K8644.15 Similarly to our results, another study showed that verapamil, an LTCC antagonist, was able to prevent the enhancement of total arrhythmia scores induced by Bay K8644. 15 These results provide some pharmacological evidence that DL significantly attenuates cardiac arrhythmias evoked by Bay K8644, probably via inhibition of LTCC, however, further experiments should be performed to clarify this assumption.
Conclusion
The results show that DL has in vivo and in vitro anti-arrhythmic properties. Furthermore, DL induced bradycardia associated with hypotension in healthy rats (in vivo), corroborating the results in an isolated heart (in vitro), which DL promoted bradycardia and reduction of left ventricular pressure. We, therefore, consider this monoterpene to be a promising substance to the development of a new therapeutic agents to treat cardiovascular diseases, such as cardiac arrhythmias.
Sources of Funding
This study was funded by CNPq, CAPES and FAPITEC/SE.
Study Association
This study is not associated with any thesis or dissertation work.
Ethics approval and consent to participate
This study was approved by the Ethics Committee on Animal Experiments of the Universidade Federal de Sergipe under the protocol number 13/2016.
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Marechal Rondon, s/n. CEP: 49000-100, Rosa Elze, São Cristóvão, SE - Brasil E-mail: carlamlv@hotmail.com
Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa: Vasconcelos CML, Souza DS, Lima BS, Araujo AAS, Quintans-Junior LJ, Almeida JRGS, Oliveira AP, Santana-Filho VJ, Barreto AS, Santos MRV; Obtenção de dados: Vasconcelos CML, Nascimento G, Souza DS, Lima BS, Durço A; Análise e interpretação dos dados: Vasconcelos CML, Nascimento G, Souza DS, Lima BS, Araujo AAS, Durço A, Oliveira AP, Santana-Filho VJ, Barreto AS, Santos MRV; Análise estatística: Vasconcelos CML, Nascimento G, Souza DS, Araujo AAS, Santos MRV; Obtenção de financiamento: Vasconcelos CML, Araujo AAS, Quintans-Junior LJ, Almeida JRGS, Santana-Filho VJ, Santos MRV; Redação do manuscrito: Vasconcelos CML, Nascimento G, Souza DS, Durço A, Quintans-Junior LJ, Barreto A, Santos MRV; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Vasconcelos CML, Araujo AAS, Quintans-Junior LJ, Almeida JRGS, Oliveira AP, Santana-Filho VJ, Barreto AS, Santos MRV.
Potencial conflito de interesses
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
ResumoFundamento:
O D-limoneno (DL) é um monoterpeno e o principal componente do óleo essencial de frutas cítricas. Ele apresenta atividades anti-hiperglicêmicas e vasodilatadoras.
Objetivos:
Este estudo avaliou os efeitos cardiovasculares e antiarrítmicos potenciais do DL em ratos.
Métodos:
Os parâmetros hemodinâmicos e eletrocardiográficos (ECG) foram mensurados em ratos Wistar machos que, sob anestesia, tiveram a aorta abdominal e a veia cava inferior canuladas e receberam eletrodos implantados subcutaneamente. Na abordagem in vitro, o coração foi removido e perfundido utilizando a técnica de Langendorff. O nível de significância adotado foi de 5% (p < 0,05).
Resultados:
DL, nas doses de 10, 20 e 40 mg/kg (i.v), produziu bradicardia intensa e persistente associada à hipotensão. A bradicardia com QTc prolongado foi observada no registro in vivo do ECG. No modelo in vivo de arritmia induzida por Bay K8644, DL (10 mg / kg) houve diminuição do escore da arritmia de 15,33 ± 3,52 para 4,0 ± 2,64 u.a (p < 0,05, n = 4). Em corações perfundidos isolados, o DL (10-3 M) promoveu reduções significativas na frequência cardíaca (de 228,6 ± 8,5 ms para 196,0 ± 9,3 bpm; p < 0,05) e na pressão desenvolvida do ventrículo esquerdo (de 25,2 ± 3,4 para 5,9 ± 1,8 mmHg; n = 5, p < 0,05).
Conclusões:
O DL produz bradicardia e atividade antiarrítmica no coração de ratos.
Apesar das pesquisas extensas realizada sobre arritmias cardíacas nas últimas décadas, apenas um pequeno número de drogas antiarrítmicas surgiu para serem adicionadas ao atual arsenal terapêutico para essa condição. Além disso, os antiarrítmicos “clássicos” apresentam sérias limitações de eficácia e segurança e apresentam vários efeitos colaterais.1,2
Na busca de alternativas terapêuticas para arritmias, estudos recentes examinaram compostos químicos de ocorrência natural, com o objetivo de avaliar seus efeitos nos parâmetros cardíacos. Por exemplo, estudos com os monoterpenos pulegona e geraniol mostraram um inotropismo negativo no miocárdio de mamíferos através do bloqueio das correntes de Ca2+ e K+.3-5 Mais recentemente, Vasconcelos et al.,6 verificaram que o citronelol e o nerol apresentam inotropismo negativo no átrio esquerdo de cobaias.
O D-limoneno (DL) (Figura 1), é um monoterpeno alcoólico e o principal componente do óleo essencial extraído de espécies cítricas, como limão, lima e laranja.7 Estudos anteriores demonstraram que o DL possui baixa toxicidade e apresenta propriedades antioxidantes,8,9 vasodilatadoras,10,11 e anti-hipertensivas.12
Estruturas químicas do d-limoneno (DL) (FW: 136.24).
O efeito do DL no coração ainda não foi elucidado e as investigações sobre seu mecanismo de ação podem fornecer novos insights sobre o DL e o sistema cardiovascular. O presente estudo, portanto, objetivou avaliar o potencial efeito antiarrítmico do DL utilizando abordagens in vivo e ex vivo.
MétodosProdutos químicos
Os produtos químicos utilizados foram: d-limoneno (DL: pureza: 97%) e S-(−)-Bay K8644, ambos adquiridos de Sigma Aldrich (Chemical CO, EUA), e cetamina e xilazina (adquiridos de Sespo, São Paulo), Brasil). A solução estoque de DL foi preparada utilizando uma mistura de solução salina/Cremophor® (0,15% v/v); o S-(−)-Bay K8644 foi diluído em metanol e a solução de DL em água destilada.
As soluções estoque foram preservadas a 0 ºC e diluídas com água destilada, se necessário. Os veículos (metanol ou solução salina + Cremophor®) não demonstraram nenhum efeito nas preparações de controle.
Animais
Trinta e seis ratos sadios (Rattus norvegicus), pesando entre 250 e 350 g, foram obtidos de colônias do Departamento de Fisiologia da Universidade Federal de Sergipe, Brasil. Eles foram mantidos sob condições de temperatura padrão (22 ± 2ºC) em um ciclo claro/escuro de 12 horas (luzes acesas às 06h00) e foram alimentados com uma dieta padrão (Labina®) com água ad libitum.
Em cada conjunto de experimentos, os ratos foram divididos em dois grupos: controle com 4 ou 6 animais e grupo tratado com DL, com 4 ou 6 animais. Todos os protocolos experimentais foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética e Cuidados Animais da Universidade Federal de Sergipe.
Efeitos do DL nos parâmetros hemodinâmicos <italic>in vivo</italic>
Os ratos foram anestesiados com cetamina e xilazina (80 mg/kg e 10 mg/kg; por via intraperitoneal, respectivamente) e cateteres de polietileno foram implantados na aorta abdominal e na veia cava inferior através da artéria e da veia femoral esquerda, respectivamente. Após a inserção e fixação por fios de algodão, os cateteres foram tunelizados subcutaneamente e exteriorizados através de uma incisão na região cervical posterior do animal.
As incisões foram fechadas e foi permitido aos animais um período de recuperação pós-operatório de 24 horas. A pressão arterial média (PAM) e a frequência cardíaca (FC) foram registradas por meio de um transdutor de pressão (Edwards LifeSciences, Irvine, CA, EUA) acoplado a um amplificador (FE221, Bridge Amp; ADInstruments, Bella Vista, NSW, Austrália).
Após o período de recuperação pós-operatório, PAM e FC foram registrados antes (valores basais) e após a administração in bolus de DL (1, 5, 10, 20 e 40 mg/kg, i.v.) ou veículo para obter curvas dose-resposta. A curva do DL (n = 6) foi comparada com a curva do veículo (n = 6).
Os animais de ambos os grupos, controle (n = 4) e tratados com DL (n = 4), foram heparinizados (200 I.U, i.p.), anestesiados com uma injeção i.p. de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), e a veia cava foi canulada como descrito anteriormente. Os ratos foram mantidos em decúbito dorsal com respiração espontânea e veículo ou DL foi administrado (10 mg/kg). O volume injetado através da cânula foi o mesmo para todas as concentrações (200 µL). Para registrar o sinal eletrocardiográfico, os eletrodos foram colocados sob a pele na disposição do eletrodo DII. Os parâmetros eletrocardiográficos observados foram o intervalo PR, intervalo QT, duração do complexo QRS e FC. O intervalo QT foi corrigido pela fórmula de Bazett modificada para ratos.13
Experimentos no coração isolado perfundido (técnica de Langendorff)
Os animais, de ambos os grupos, controle (n = 4) e tratados com DL (n = 4), foram heparinizados (200 UI, i.p.) e após 15 min o coração foi retirado e montado em um sistema de perfusão aórtica do tipo Langendorff, em um fluxo constante (10 mL/min).14 Os corações foram continuamente perfundidos com solução de Krebs-Henseleit (em mM: 120 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 MgCl2, 1,25 CaCl2, 2 NaH2PO4, 27 NaHCO3, 11 glicose), previamente filtrados através de uma membrana de acetato de celulose (0,45 µm). O pH foi ajustado para 7,4 e oxigenado (95% O2 + 5% CO2) e mantido a 37 ± 0,1ºC (Haake F3, Berlim, Alemanha). Os sinais cardíacos do eletrocardiograma (ECG) foram capturados utilizando-se três eletrodos (Ag/AgCl/NaCl, 1 M) que foram colocados dentro da câmara próxima ao coração. Os sinais foram amplificados, digitalizados (PowerLab 4/35 ADInstruments, EUA) e armazenados em um computador. A pressão desenvolvida do ventricular esquerdo (PDVE, mmHg) e a FC (bpm) foram medidas utilizando-se um balão cheio de água introduzido na cavidade do ventrículo esquerdo. Este dispositivo foi acoplado a um transdutor de pressão (FE221, Bridge Amp, ADInstruments, EUA) e um amplificador (PowerLab 4/35, ADInstruments). O sistema foi calibrado utilizando uma coluna de mercúrio. O tempo de pico (ms), que é definido como o tempo necessário para atingir o pico de contração ventricular máxima, e tempo de relaxamento, também foram analisados.
Avaliação do efeito antiarrítmico do DL
O efeito antiarrítmico de DL foi determinado no modelo animal in vivo utilizando (S)-(−)-Bay K8644, um agonista do canal de cálcio do tipo L (LTCC). A arritmia foi induzida pela administração de (S)-(−)-Bay K8644, (1 mg/kg, i.v.) na veia femoral de ambos os grupos, controle (n = 4) e tratamento com DL (n = 4).
DL (10 mg/kg) foi administrado 10 minutos antes do (S)-(−)-Bay K864415 Arritmias cardíacas foram observadas por 20 minutos através da análise do registro do ECG. Para uma melhor análise, o tempo total foi dividido em 10 intervalos de 3 min para classificação da arritmia.
As arritmias foram determinadas por meio de um sistema de escore modificado previamente validado por Curtis e Walker.16 As arritmias observadas foram batimentos prematuros ventriculares (BPV), taquicardia ventricular (TV) e fibrilação ventricular (FV). BPVs < 10/período de 3 min foram registrados como 0; BPVs > 10/3 min foram registrados como 1; Episódios de TV de 1 a 5/ período de 3 min foram registrados como 2; > 5 episódios de TV/3 min e /ou qualquer número de episódios de FV e/ou 1 episódio de FV com um período de duração <40 s foi registrado como 3; 2-5 episódios de FV/3 min ou TV e FV com um total combinado com duração < período de 80 s foi registrado como 4; 5 episódios de FV ou TV e FV combinados /3 min com uma duração < 160 s foram registrados como 5; TV ou FV ou ambos/3 min com duração total combinada <300 s foram registrados como 6, e TV ou FV ou ambos/3 min com duração total combinada >300 s foram registrados como 7.
Análise estatística
A normalidade dos dados foi verificada pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Os dados foram representados como média ± DP. Quando apropriado, utilizou-se o teste t de Student não-pareado ou a análise de variância (ANOVA unidirecional, bidirecional) e o teste post hoc de Bonferroni. O nível de significância adotado foi de 5% (p < 0,05). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o software GraphPad Prism™ 5.0.
Resultados
Em todos os ratos testados, os valores basais de FC e PAM foram de 371 ± 45 bpm e 114 ± 11 mmHg, respectivamente. A Figura 2A mostra os traçados originais do efeito do DL (1, 5, 10, 20 e 40 mg/kg, i.v.) no sinal pulsátil da pressão arterial de um rato consciente. Nestes animais, o DL, nas doses de 1 e 5 mg/kg, produziu hipotensão transitória e não significativa sem alterar a FC (Figura 2B - gráfico à esquerda). Por outro lado, o DL, nas doses de 10, 20 e 40 mg/kg, produziu bradicardia intensa e persistente (-33,0 ± 21; -57,0 ± 19 e -53,0 ± 30%; n = 6; p < 0,05, respectivamente) (Figura 2B - gráfico à direita) que persistiu por 19 ± 12 min após a administração. Esta bradicardia foi associada à hipotensão apenas nas doses de 20 e 40 mg/kg (-53,0 ± 6 e -28,0 ± 18%; n = 6, p < 0,05, respectivamente).
Efeito do DL (1, 5, 10, 20 e 40 mg/kg, i.v.) na frequência cardíaca (FC) e pressão arterial média (PAM) em ratos conscientes. A) Traçados originais mostrando o efeito do DL (1, 5, 10, 20 e 40 mg/Kg, i.v., aleatoriamente) na frequência cardíaca (FC) e pressão arterial média (PAM) de um rato saudável e consciente. As setas indicam o momento da administração. B) Gráfico de linhas do efeito DL na FC e PAM. Os valores são expressos em média ± DP de seis experimentos. Os dados foram analisados através de ANOVA bidirecional com medidas repetidas, seguido por pós-teste de Bonferroni.
** p < 0,01 e *** p < 0,001 vs. veículo.
A figura 3A mostra os traçados representativos do ECG para o veículo (parte superior) e 10 min depois da administração i.v. de 10 mg/kg de DL (parte inferior). Como pode ser visto, o DL diminuiu significativamente a FC (p < 0,05) e aumentou o QTc (Figuras 3B e E). Entretanto, o DL não alterou a duração do iPR e do complexo QRS (Figuras 3C e D).
Efeitos in vivo do DL (10 mg/kg) nos parâmetros eletrocardiográficos (ECG) antes (veículo) e após a perfusão do DL. Traçados originais (A) e gráfico de barras do efeito do DL na frequência cardíaca (B), intervalo PR (iPR) (C), duração do QRS (D) e intervalo QT corrigido (QTc) (E). Os dados são apresentados como média ± DP e foram analisados pelo teste t de Student não pareado.
*p < 0,05 vs. veículo, n = 4.
No experimento com a técnica de Langendorff, o DL (10-3 M) causou uma redução significativa na PDVE comparado ao controle (Figura 4A). Os dados médios mostraram que a PDVE diminuiu de 25,2 ± 11,4 mmHg para 5,9 ± 6,1 mmHg (n = 5, p < 0,05, Fig. 4B). O DL também promoveu redução da FC de 228,6 ± 19,1 para 196,0 ± 20,8 bpm (n = 4, p < 0,05, Figura 4C). Em relação ao curso temporal das fases de contração e relaxamento, nossos resultados mostraram que o DL não alterou o tempo até o pico da contração do ventrículo esquerdo (Figura 4D), mas aumentou o tempo de relaxamento de 129,0 ± 3,0 para 193,5 ± 37,8 ms (n = 4, p < 0,05, Figura 4E).
Efeitos ex vivo da perfusão com DL (10<sup>-3</sup> M) nos parâmetros cardíacos. A) traços representativos da pressão desenvolvida do ventrículo esquerdo (PDVE) registrados na situação de controle (painel superior) e após a perfusão de 10<sup>-3</sup> M de DL (painel inferior); Gráfico de barras do efeito do DL na PDVE B), frequência cardíaca; C), tempo de pico; D) e tempo de relaxamento E). Os dados são expressos em média ± DP e foram analisados pelo teste t de Student não pareado.
* p < 0,05 vs. veículo, n = 4.
No modelo in vivo de arritmias induzidas por Bay K8644, o DL reduziu significativamente a incidência de arritmias ventriculares, tais como BPV, TV e FV, e o índice de arritmia total de 15,3 ± 6,1 a.u para 4,0 ± 4,5 a.u (n = 4, p < 0,05) (Figura 5B). Além disso, o DL foi capaz de evitar a taquicardia sinusal evocada por Bay K8644 (300,0 ± 46,1 para 93,0± 17,4 bpm, n = 4, p < 0,05).
Efeitos in vivo do DL (10 mg/kg) em arritmias induzidas por S(−)-Bay K 8644 em ratos anestesiados. Traçados originais A) e gráfico de barras do escore de arritmia B) e da frequência cardíaca C) antes e após o tratamento com DL. Os dados são expressos em média ± DP e foram analisados pelo teste t de Student não pareado (B) (*p < 0,05 vs. controle, n = 4) e ANOVA seguido pelo pós-teste de Bonferroni (C) (*p < 0,05 vs. controle, #p < 0,05 vs. Bay K8644, n = 4).
Em ratos conscientes, a administração intravenosa de DL em doses mais baixas (1 e 5 mg/kg) foi capaz de produzir uma hipotensão não significativa, sem alterar a FC. Por outro lado, o DL em doses mais elevadas (10, 20 e 40 mg/kg) produziu bradicardia intensa e persistente, que persistiu por quase 20 min. Efeitos semelhantes foram encontrados para outros monoterpenos, tais como 1,8-cineol17 terpinen-4-ol,18 e y(-)-α-bisabolol.19
Para entender melhor o efeito bradicárdico induzido pelo DL, investigamos quaisquer alterações no perfil eletrocardiográfico na dose de 10 mg/kg. Essa dose foi escolhida porque foi a dose mais baixa capaz de produzir bradicardia sem produzir qualquer efeito significativo na PAM (ver Figura 2B). A administração de 10 mg/kg de DL (parte inferior) diminuiu significativamente a FC e aumentou o QTc. Entretanto, o DL não alterou a duração do iPR e do complexo QRS.
Corroborando os dados observados nos experimentos hemodinâmicos, observamos no ECG que o DL também promoveu bradicardia ao aumentar o QTc. Como mostrado na literatura, os bloqueadores dos canais de cálcio podem reduzir a velocidade de condução cardíaca e causar bradicardia.20,21 Esses efeitos podem ou não estar associados ao prolongamento do QTc.22
O efeito direto do DL no músculo cardíaco foi avaliado em um coração isolado, montado em um sistema de Langendorff. Neste experimento, o DL ou veículo foi perfundido através da aorta para registrar a PDVE. O volume de sangue em um rato é de aproximadamente 7 mL para cada 100 g de peso corporal,23 portanto, a concentração de DL após a administração de 10 mg/kg nos experimentos in vivo é aproximadamente a mesma que a perfusão com 10-3 M de DL nas experiências ex vivo. Como demonstrado, a perfusão com DL causou uma redução significativa na PDVE. Curiosamente, esses resultados são muito semelhantes aos observados in vivo, onde o DL também promoveu redução da FC. Em relação ao curso temporal das fases de contração e relaxamento, nossos resultados mostraram que o DL não alterou o tempo até o pico de contração do ventrículo esquerdo (Figura 4D), mas aumentou o tempo de relaxamento. Como se sabe, a recaptura de cálcio pela Ca-ATPase do retículo sarco/endoplasmático (SERCA) é um passo fundamental para o relaxamento miocárdico em ratos.24 Nossos dados mostram que o DL retardou o relaxamento do músculo cardíaco, o que pode estar associado a menor recaptura do cálcio pela SERCA, mas esta suposição ainda precisa ser elucidada.
Nossos resultados ex vivo mostraram que o DL diminuiu a atividade de marcapasso e promoveu inotropismo negativo. Sabe-se que as drogas que bloqueiam o LTCC no músculo cardíaco diminuem a atividade de marcapasso e resultam em bradicardia. Além disso, os antagonistas do cálcio diminuem a geração da força miocárdica (inotropia negativa). Estes resultados mostram que o DL apresenta uma ação similar a um bloqueador de LTCC. No músculo liso, De Sousa et al.,25 mostraram que os efeitos relaxantes do DL em traqueias de porquinhos-da-índia e aortas de ratos foram independentes do endotélio e provavelmente causados por ação direta na dinâmica do cálcio.
Os bloqueadores de LTCC são classificados como drogas antiarrítmicas de classe IV. As propriedades antiarrítmicas dos bloqueadores de LTCC estão relacionadas à sua capacidade de diminuir a taxa de disparo aberrantes em sítios de marcapasso dentro do coração e à sua capacidade de diminuir a velocidade de condução no nó atrioventricular (AV) que pode ajudar a bloquear os mecanismos de reentrada, o que pode causar taquicardia supraventricular. De fato, decidimos investigar o possível efeito antiarrítmico do DL utilizando um modelo in vivo com arritmia induzida por Bay K8644, um agonista de LTCC. Em todos os animais testados, o Bay K8644 aumentou a FC e induziu arritmias como batimentos prematuros ventriculares (BPV), taquicardia ventricular (TV) e fibrilação ventricular (FV).
Como demonstrado, o DL reduziu significativamente a incidência de arritmias ventriculares e foi capaz de evitar a taquicardia sinusal causada por Bay K8644. De maneira similar aos nossos resultados, outro estudo mostrou que o verapamil, um antagonista do LTCC, foi capaz de evitar o aumento dos escores de arritmia total induzidos por Bay K8644.15 Estes resultados fornecem evidências farmacológicas de que o DL atenua significativamente as arritmias cardíacas causadas por Bay K8644, provavelmente através da inibição do LTCC; entretanto, outros estudos devem ser realizados para esclarecer esta suposição.
Conclusão
Os resultados mostram que o DL possui propriedades antiarrítmicas in vivo e in vitro. Além disso, o DL induziu bradicardia associada à hipotensão em ratos sadios (in vivo), corroborando os resultados em um coração isolado (in vitro), em que o DL promoveu bradicardia e redução da pressão ventricular esquerda. Consideramos, portanto, que este monoterpeno é uma substância promissora para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para o tratamento de doenças cardiovasculares, como as arritmias cardíacas.
Fontes de financiamento
O presente estudo foi financiado pelo CNPq, CAPES e FAPITEC/SE.
Vinculação acadêmica
Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.
Aprovação ética e consentimento informado
Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Sergipe sob o número de protocolo 13/2016.