Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC RCJVBpdRXFNkVDSQSJxBzqK S0066-782X2019001100905 S0066-782X2019005016101 10.5935/abc.20190166 Original Article Environmental Enrichment Promotes Antioxidant Effect in the Ventrolateral Medulla and Kidney of Renovascular Hypertensive Rats 0000-0002-3601-5517 Sousa Luiz Eduardo Favero Iuri Ferrari Del 0000-0002-0804-5196 Bezerra Frank Silva 0000-0001-5226-6378 Souza Ana Beatriz Farias de Alzamora Andreia Carvalho Universidade Federal de Ouro Preto Ouro Preto MG Brazil Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, MG - Brazil Mailing Address: Luiz Eduardo Sousa • Laboratório de Fisiopatologia Experimental (LAFEx), Instituto de Ciências Exatas e Biológicas, Departamento de Ciências Biológicas - Universidade Federal de Ouro Preto Campus Universitário s/n, Postal Code 35400-000. Morro do Cruzeiro, Ouro Preto, MG - Brasil Email: luizeduardo@ufop.edu.br

Author contributions

Conception and design of the research, Analysis and interpretation of the data, Statistical analysis and Writing of the manuscript: Sousa LE; Acquisition of data: Del Favero IF, Souza ABF; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Bezerra FS, Souza ABF, Alzamora AC.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 02 09 2019 11 2019 113 5 905 912 31 08 2018 14 12 2018 13 02 2019 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Arterial hypertension is a precursor to the development of heart and renal failure, furthermore is associated with elevated oxidative markers. Environmental enrichment of rodents increases performance in memory tasks, also appears to exert an antioxidant effect in the hippocampus of normotensive rats.

 Objectives:

Evaluate the effect of environmental enrichment on oxidative stress in the ventrolateral medulla, heart, and kidneys of renovascular hypertensive rats.

 Methods:

Forty male Fischer rats (6 weeks old) were divided into four groups: normotensive standard condition (Sham-St), normotensive enriched environment (Sham-EE), hypertensive standard condition (2K1C-St), and hypertensive enriched environment (2K1C-EE). Animals were kept in enriched or standard cages for four weeks after all animals were euthanized. The level of significance was at p < 0.05.

 Results:

2K1C-St group presented higher mean arterial pressure (mmHg) 147.0 (122.0; 187.0) compared to Sham-St 101.0 (94.0; 109.0) and Sham-EE 106.0 (90.8; 117.8). Ventrolateral medulla from 2K1C-EE had higher superoxide dismutase (SOD) (49.1 ± 7.9 U/mg ptn) and catalase activity (0.8 ± 0.4 U/mg ptn) compared to SOD (24.1 ± 9.8 U/mg ptn) and catalase activity (0.3 ± 0.1 U/mg ptn) in 2K1C-St. 2K1C-EE presented lower lipid oxidation (0.39 ± 0.06 nmol/mg ptn) than 2K1C-St (0.53 ± 0.22 nmol/mg ptn) in ventrolateral medulla. Furthermore, the kidneys of 2K1C-EE (11.9 ± 2.3 U/mg ptn) animals presented higher superoxide-dismutase activity than those of 2K1C-St animals (9.1 ± 2.3 U/mg ptn).

 Conclusion:

Environmental enrichment induced an antioxidant effect in the ventrolateral medulla and kidneys that contributes to reducing oxidative damage among hypertensive rats.

 Keywords: Renovascular Hypertension Oxidative Stress Enviromental Enrichment Ventrolateral Medulla Kidney CAPES 88881.172437/2018-01 PVEX 88881.172437/2018-01 Introduction

Arterial hypertension is a key precursor to the development of stroke, renal failure, heart failure, endothelial dysfunction and cardiovascular disease. Oxidative stress has been implicated in the pathogenesis of arterial hypertension and other cardiovascular diseases.1,2 Imbalance from excessive oxidative compounds coupled with lowered antioxidant defences induces cellular damage.1 In hypertensive rats, oxidative stress is linked to heart, kidney, and brain dysfunction.3-5 Furthermore, reactive oxygen species [ROS] in the ventrolateral medulla are major contributors to sympathetic hyperactivity and arterial hypertension.4,6

The brainstem contains complex structures that control blood pressure and cardiovascular reflex.7,8 These regions include the caudal pressor area, caudal ventrolateral medulla (CVLM), and medullocervical pressor area.7,9 Inhibition and activation of these nuclei cause depressor and pressor responses, respectively. The rostral ventrolateral medulla (RVLM) is an important area of basal sympathetic tone, under regulation by CVLM neurons via tonic and phasic inhibition.9 Rat studies show that hypertension is associated with lower antioxidant defences and elevated oxidative markers in both CVLM and RVLM.3,4,6,10

Besides the central nervous system, heart and kidneys are also involved in cardiovascular control.5 When arterial hypertension develops in renovascular hypertensive rats, both organs experience redox imbalance, along with the increased inflammatory-cell count, lipid peroxidation, and reduced antioxidant defences.5

A sedentary lifestyle is a risk factor for cardiovascular disease, including arterial hypertension.11 Physical exercise improves antioxidant defence in the ventrolateral medulla, thus reducing oxidative damage and hypertension.3,12,13 One way to raise motor activity in laboratory animals is with environmental enrichment. Animals in enriched housing experience neuroanatomical, chemical, and behavioural changes that heighten memory, motor function, sensorial and cognitive activity.14-16 In turn, neuroplasticity is increased while neurodegenerative disorders and cognitive decline are mitigated. Environmental enrichment of rodents reliably increases performance in learning and memory tasks, and improves overall health and well-being, compared with standardly housed conspecifics.14,17,18 Such enrichment typically involves introducing stimuli such as toys, tubes, balls, igloos, running wheels, or any items that provoke exploration, social interaction, sensorial and motor activity.

Non-motor environmental enrichment (e.g. without wheel running) also appears to exert an antioxidant effect in the hippocampus and cerebral cortex of normotensive rats.15,16 Thus, environmental enrichment may reduce oxidative stress in the ventrolateral medulla and contribute to hypertension control. Yet despite noted effects on cognitive activity, no consistent data are available regarding exactly how enrichment influences oxidative stress in the ventrolateral medulla of hypertensive animals. The aim of this study is to evaluate the effect of environmental enrichment on oxidative stress in the ventrolateral medulla, heart, and kidneys of renovascular hypertensive rats.

 Methods Animal experiments

All animal experiments in the study were approved by the Ethics Committee on Animal Use of the Universidade Federal de Ouro Preto by protocol number 2016/24. Subjects were forty adult Fischer male rats (6 weeks old; 140-170 g). Renovascular hypertension was induced as previously described.19 Briefly, animals were anaesthetized with 50 mg/kg of ketamine and 10 mg/kg of xylazine (i.p.). Next, a silver clip (2K1C; inner diameter, 0.2 mm) was placed around the left renal artery through a midline incision. Normotensive groups (Sham) were subjected to similar procedures but without clips. Four groups were formed: standardly housed hypertensive (2K1C-St) (n = 12), enriched hypertensive (2K1C-EE) (n = 8), standardly housed normotensive (Sham-St) (n = 7), and enriched normotensive (Sham-EE) (n = 13). The sample size was defined by convenience.

 Environmental enrichment and standard condition protocol

Immediately post-surgery, rats were housed in enriched (EE) or standard (St) cages (Figure 1). The former contained six different objects (plastic coloured balls, igloo, wooden chew sticks, curved tubes, straight tubes); cages were organised with four rats in each cage. Eight different objects combinations were used, with one weekly change to encourage exploration. The control environment consisted of standard cages (St) identical to those used for housing subjects during non-experimental periods. All groups were kept in the same room, on different racks, to control for lighting (12-12 h light-dark cycle), temperature (24 ± 1ºC), humidity, and ambient noise. Rat chow and tap water were provided ad libitum. The enrichment procedure lasted for four weeks. At the end of that time, cardiovascular measurements were performed.

Representation of the environments that rats were exposed (A) standard cage (B) enriched cage.

Cardiovascular measurements

Within 2 days of experiment end, rats were anaesthetised with urethane (1.2 g/kg body weight, ip; Sigma-Aldrich, USA). Polyethylene catheters (PE-10 connected to PE-50, Clay Adams, Parsippany, NJ, USA) filled with heparinized saline (400 IU/mL) were inserted into the right femoral artery for measuring pulsatile arterial pressure. Blood pressure was recorded at 1000 Hz sampling rate and 20 mV range digitizing window. Heart rate and mean arterial pressure (MAP) were derived on-line from the pulsatile arterial pressure signal with LabChart for Windows software (ADInstruments Pty Ltd, Australia). Experimental protocols were carried out in anaesthetized rats. After cardiovascular measurements, rats were decapitated and the left ventricle was perfused with saline solution to remove blood from tissues. Brain, hearts, kidneys and the ventrolateral medulla was dissected, and all samples were frozen in liquid nitrogen before storage at -80ºC.

 Antioxidant defences and oxidative stress biomarkers

Superoxide dismutase (SOD) activity was evaluated via the enzyme’s capacity to inhibit pyrogallol autoxidation (absorbance of 570 nm).20 Catalase activity was determined through the speed of H2O2 reduction (absorbance of 240 nm).21 Carbonyl protein determination methods (absorbance of 370 nm) were based on a previous publication.22,23 Lipid peroxidation was evaluated with the thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) assay (absorbance of 535 nm).24 Total protein was quantified with the Bradford method.25

Statistical analysis

Results are reported as means ± SD or median, minimum and maximum value. Normality was checked using Kolmogorov-Smirnov. Data were then analysed with one-way ANOVA test, followed by a post-hoc Newman-Keuls test or Kruskal-Wallis test, followed by Dunn’s post-test. Statistical analyses were performed in GraphPad Prism. Significance was set at p < 0.05.

 Results Effects of environmental enrichment on mean arterial pressure

To evaluate if environmental enrichment reduces blood pressure in hypertensive rats, we compared MAP across our four experimental groups. The 2K1C-St group had significantly higher MAP 147.0 (122.0; 187.0) mmHg, p < 0.05, than Sham-St 101.0 (94.0; 109.0) mmHg and Sham-EE 106.0 (90.8; 117.8) mmHg. The four groups did not differ significantly in heart rate (Figure 2).

Baseline levels of mean arterial blood pressure (MAP, mmHg) in hypertensive (2K1C) and normotensive rats (Sham) subjected to environmental enrichment (EE) and standard condition (St). Direct measurements of MAP were performed on the 4th weeks after 2K1C surgery. Letters (above the bars) indicate significant differences. (a) The difference in relation to the Sham-St; (b) Difference in relation to the Sham-EE analysed by Kruskal-Wallis test, followed by Dunn’s post-test a (p < 0.05) (n = 7 in each group). Data are expressed as median, minimum and maximum value.

Effects of environmental enrichment on oxidative stress marker in the ventrolateral medulla

Superoxide dismutase activity in the ventrolateral medulla was higher for 2K1C-EE than for 2K1C-St. Additionally, catalase activity was higher in 2K1C-EE than in all other groups. We observed increased TBARS value in 2K1C-St compared with Sham groups, but reduced activity in 2K1C-EE compared with 2K1C-St (Table 1).

Effects of environmental enrichment or standard conditions on the activity of antioxidant enzymes and biomarkers of oxidative damage in the ventrolateral medulla
SOD (U/mg ptn) Catalase (U/mg ptn) Carbonyl protein (nmol/mg ptn) TBARS (nmol/mg ptn)
Sham-St (n = 7) 32.9 ± 7.1 0.3 ± 0.04 22.1 ± 12.1 0.29 ± 0.12
Sham-EE (n = 13) 41.8 ± 11 0.4 ± 0.2 28.6 ± 11.9 0.36 ± 0.1
2K1C-St (n = 12) 24.1 ± 9.8 0.3 ± 0.1 44.6 ± 15.1 0.53 ± 0.22a,b
2K1C-EE (n = 8) 49.1 ± 7.9c 0.8 ± 0.4a,b,c 57.1 ± 12.5a,b 0.39 ± 0.06c

represents a significant difference between groups when compared to Sham-St;

represents a significant difference between groups when compared to Sham-EE;

represents a significant difference between groups when compared to 2K1C-St.

Analysed by one-way ANOVA, followed by Newman Keuls post-test (p < 0.05). Data are expressed as the mean ± SD (n = 7-13 in each group). Sham-St: normotensive group exposed to standard condition; Sham-EE: normotensive group exposed to environmental enrichment; 2K1C-St: hypertensive group exposed to standard condition; 2K1C-EE: hypertensive group exposed to environmental enrichment. SOD: superoxide dismutase; TBARS: thiobarbituric acid-reactive substances.

Effects of environmental enrichment on oxidative stress marker in the left ventricle

Overall, TBARS concentration was higher in both hypertensive groups than in Sham groups. Catalase activity was lower in 2K1C-St than in Sham-EE. Carbonyl protein and SOD were similar across all experimental groups (Table 2).

Effects of environmental enrichment or standard conditions on the activity of antioxidant enzymes and biomarkers of oxidative damage in the left ventricle
SOD (U/mg ptn) Catalase (U/mg ptn) Carbonyl protein (nmol/mg ptn) TBARS (nmol/mg ptn)
Sham-St (n = 7) 12.0 ± 2.9 0.3 ± 0.1 30.1 ± 18.1 0.3 ± 0.17
Sham-EE (n = 13) 12.6 ± 3.8 0.4 ± 0.14 30.1 ± 10.7 0.2 ± 0.14
2K1C-St (n = 12) 9.9 ± 1.4 0.2 ± 0.09b 37.2 ± 12.8 0.8 ± 0.07a,b
2K1C-EE (n = 8) 12.1 ± 4.2 0.3 ± 0.11 48.2 ± 19 1.1 ± 0.2a,b

represents a significant difference between groups when compared to Sham-St;

represents a significant difference between groups when compared to Sham-EE.

Analysed by one-way ANOVA, followed by Newman Keuls post-test (p < 0.05). Data are expressed as the mean ± SD (n = 7-13 in each group). Sham-St: normotensive group exposed to standard condition; Sham-EE: normotensive group exposed to environmental enrichment; 2K1C-St: hypertensive group exposed to standard condition; 2K1C-EE: hypertensive group exposed to environmental enrichment. SOD: superoxide dismutase; TBARS: thiobarbituric acid-reactive substances.

Effects of environmental enrichment on oxidative stress marker in the right kidney

We observed increased SOD activity in environmentally enriched groups (2K1C-EE, Sham-EE) compared with standard groups (2K1C-St, Sham-St). The 2K1C-EE group had higher carbonyl protein and lower TBARS concentration than the 2K1C-St group (Table 3).

Effects of environmental enrichment or standard conditions on the activity of antioxidant enzymes and biomarkers of oxidative damage in the right kidney
SOD (U/mg ptn) Catalase (U/mg ptn) Carbonyl protein (nmol/mg ptn) TBARS (nM/mg ptn)
Sham-St (n = 7) 8.1 ± 2.5 1.8 ± 0.7 5.6 ± 2.1 0.3 ± 0.13
Sham-EE (n = 13) 12 ± 3.5a 1.9 ± 0.8 4.4 ± 1.9 0.3 ± 0.09
2K1C-St (n = 12) 9.1 ± 2.3 1.5 ± 0.34 3.1 ± 2 0.4 ± 0.18
2K1C-EE (n = 8) 11.9 ± 2.3c 2.4 ± 1.1 7.2 ± 2.9c 0.1 ± 0.07c

represents a significant difference between groups when compared to Sham-St;

represents a significant difference between groups when compared to 2K1C-St.

Analysed by one-way ANOVA, followed by Newman Keuls post-test (p < 0.05). Data are expressed as the mean ± SD (n = 7-13 in each group). Sham-St: normotensive group exposed to standard condition; Sham-EE: normotensive group exposed to environmental enrichment; 2K1C-St: hypertensive group exposed to standard condition; 2K1C-EE: hypertensive group exposed to environmental enrichment. SOD: superoxide dismutase; TBARS: thiobarbituric acid-reactive substances.

Effects of environmental enrichment on oxidative stress marker in the left kidney

Furthermore, SOD activity was higher among 2K1C-EE than 2K1C-St animals. Catalase activity was lower in hypertensive groups (2K1C-St and 2K1C-EE) than Sham groups (Sham-St and Sham-EE). Carbonyl protein activity and TBARS concentration did not differ significantly across experimental groups (Table 4).

Effects of environmental enrichment or standard conditions on the activity of enzymes and biomarkers of oxidative damage in the left kidney
SOD (U/mg ptn) Catalase (U/mg ptn) Carbonyl protein (nmol/mg ptn) TBARS (nM/mg ptn)
Sham-St (n = 7) 14.1 ± 5.9 1.4 ± 0.5 24.9 ± 8.8 0.5 ± 0.19
Sham-EE (n = 13) 17.4 ± 8.7 1.5 ± 0.8 31.9 ± 11.9 0.4 ± 0.2
2K1C-St (n = 12) 11.3 ± 2.2 0.1 ± 0.06a,b 25.9 ± 9.3 0.7 ± 0.3
2K1C-EE (n = 8) 23.5 ± 6.2c 0.4 ± 0.2a,b 30.1 ± 8.1 0.4 ± 0.19

represents a significant difference between groups when compared to Sham-St;

represents a significant difference between groups when compared to Sham-EE;

represents a significant difference between groups when compared to 2K1C-St.

Analysed by one-way ANOVA, followed by Newman Keuls post-test (p < 0.05). Data are expressed as the mean ± SD (n = 7-13 in each group). Sham-St: normotensive group exposed to standard condition; Sham-EE: normotensive group exposed to environmental enrichment; 2K1C-St: hypertensive group exposed to standard condition; 2K1C-EE: hypertensive group exposed to environmental enrichment. SOD: superoxide dismutase; TBARS: thiobarbituric acid-reactive substances.

Discussion

As found in other studies, standardly housed hypertensive rats exhibited MAP values different than standardly housed normotensive controls. Importantly, this study is the first to demonstrate similar MAP values between normotensive and enriched hypertensive rats. This outcome is likely due to the antioxidant effect of enrichment on the ventrolateral medulla and kidneys. The finding that hypertensive rats (2K1C-St) showed higher values of MAP than control animals (Sham-St) is consistent with obtained by other studies.3,5

The two-kidney, one-clip (2k1c) Goldblatt hypertensive model is characterized by hyperactivity of the renin-angiotensin system, especially by angiotensin II. Angiotensin II has actions at AT1 receptors to elevate blood pressure via numerous mechanisms including vasoconstriction, oxidative stress and increases sympathetic neural discharge. In addition to this classical circulating system, components of the renin-angiotensin system are found locally in the brain. Angiotensin II AT1 receptors are abundant in the autonomic nervous system and regulatory brain regions, to influence neurotransmission and blood pressure. The actions of angiotensin II in the ventrolateral medulla contribute to sympathoexcitation and hypertension in animals, in part by stimulating oxidative stress.26

The present study showed that the enrichment was effective in making MAP of 2K1C-EE rats similar to that of sham rats. Additionally, the enrichment restored the ROS components in ventrolateral medulla, kidney and left ventricle. Previous studies have showed a hyperactivity of Ang II in both RVLM27,28 and CVLM9,29 areas of ventrolateral medulla on 2K1C rats. In addition, Ang II has been correlated with ROS in these brain areas.30 On the other hand, Ang II is a strong inductor of ROS generation in the ventricle and kidney.31,32

Antioxidant compounds are essential to protecting against cardiovascular and nervous systems. Here, the ventrolateral medulla of 2K1C-EE rats had higher SOD and catalase activity in relation to 2K1C-St rats. Thus, environmental enrichment appears to protect against oxidative stress through increasing antioxidant defence, thereby reducing MAP in hypertensive rats. Study shows that increase of antioxidants defences in the ventrolateral medulla reduces the MAP of hypertensive rats.6 Likewise, previous research found that spontaneously hypertensive rats experienced a decrease in RVLM SOD activity, but also decreased MAP and sympathetic nerve activity when SOD was overexpressed.33

Carbonyl protein concentration was higher in the ventrolateral medulla of 2K1C-EE rats compared with control groups (Sham-St and Sham-EE). This surprising result suggests that environmental enrichment was either detrimental to hypertensive rats, or the ventrolateral medulla is simply less capable of dealing with protein oxidation, even under advantageous conditions. Similarly, a previous study found that environmental enrichment does not reduce protein oxidation in the cortex of male normotensive rats.16 However, we also demonstrated that enrichment lowered the TBARS concentration in the ventrolateral medulla of 2K1C rats, indicating that endogenous antioxidants were successfully triggered to neutralise lipid peroxidation. These results corroborate previous research in normotensive rats.16 Oxidative stress in the ventrolateral medulla increases sympathetic nerve activity, suggesting that this brain region is important to modulating ROS-induced elevation.28

Overall, environmental enrichment appears to exert a neuroprotective effect through ameliorating oxidative stress, the mechanism of neuroprotection has not been established. Oxidative stress is involved in the pathogenesis of acute and chronic neurological diseases. This is because the nervous tissue is uniquely sensitive to oxidative stress, due to the great quantity of sources of ROS.1 The synthesis of trophic factors has been suggested to play a role in mediating the neuroprotective effects of enrichment. Environmental enrichment has been found to cause increased brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the glial cell, striatum and substantia nigra.34 Thus, we suggest that environmental enrichment is not only relevant to brain aging, dementia and neurodegenerative diseases, but also to other neurological disorders and cardiovascular diseases.

Oxidative stress in the heart is an essential causal agent of hypertension, activating intracellular signalling that induces heart dysfunction through apoptosis or cell overgrowth.10,35 We found higher left-ventricle TBARS levels and lower catalase activity in 2K1C-St rats than in Sham (St and EE) rats. Consistent with our results, sedentary 2K1C rats had higher TBARS levels in the left ventricle. In general, renovascular hypertension is expected to increase relative heart weights, cardiomyocyte diameter, myocardial inflammatory cell count, and collagen deposition in the left ventricle.5

Environmental enrichment did not seem to alter MAP, TBARS, and overall antioxidant defence in the left ventricle of hypertensive rats. Environmental enrichment did not seem to alter MAP, TBARS, and overall antioxidant defence in the left ventricle of hypertensive rats.36,37 We hypothesize that environmental enrichment should include physical activity (e.g. wheel running) for antioxidant effects to be observable in the heart of hypertensive rats. Multiple studies examining hypertension and cardiovascular diseases have illustrated that physical activity confers antioxidant effects in the heart.5,38,39

We also observed elevated SOD activity in both kidneys of environmentally enriched hypertensive and normotensive rats. Additionally, left-kidney catalase activity decreased in hypertensive rats (2K1C-St and 2K1C-EE) compared with control, probably because it is the clipped kidney. These data suggest that oxidative stress increased in the kidneys of hypertensive animals.5 Activation of the renin-angiotensin-aldosterone system causes ROS to increase in the kidney via multiple pathways, including elevation of NADPH oxidase, mitochondrial dysfunction, decreased NO availability, and decreased antioxidant enzymes. Accordingly, high angiotensin II-related ROS generation is implicated in hypertension development among several animal models, including 2K1C rats.40,41

Catalase and SOD activity is reduced in clipped and nonclipped renal cortices of 2K1C pigs. Relatedly, 8-isoprostane PGF2 and malondialdehyde excretion are elevated in the kidneys of 2K1C rats.40,42 Increased ROS production, induced by angiotensin II infusion, in kidneys can initiate hypertension. SOD protects the kidney against stress by attenuating renal p22phox expression, NADPH oxidase activation.43 Moreover, SOD overexpression of in the kidney mitigates oxidative stress and hypertension. Adenoviral gene transfer of human SOD-3 in spontaneously hypertensive rats increased SOD-3 expression in kidneys and blood vessels, thereby reducing vascular O2•- while improving endothelial function and vascular reactivity.44

Modifications to the standard caging to create enriched environments that allow improved motor activity, visual activity, exploration and social interactions have been associated with significant behavioural changes and improvements in overall health and well-being.45 Overall health and well-being are related to lower levels of cortisol and blood pressure; however few studies show its effects on redox system in the hypertensive animals.46

Conclusion

The physiological effects of environmental enrichment are varied, but improved animal welfare and cognitive properties appear to be clear benefits.15,47 Our study presents limitations since the laboratory environment places several physical and operational restrictions on the methods and the extent of the enrichment offered to the research mice. These limitations stimulate our ability to use different methods and produce maximum environmental enrichment. Despite the limitations collectively, our results suggested that environmental enrichment conferred antioxidant effects on the ventrolateral medulla and kidneys, probably contributing to MAP reduction and minimizing oxidative damage in renovascular hypertensive rats. We suppose that the enrichment may have made MAP of 2K1C-EE rats similar to SHAM rats by reducing levels of oxidative stress in the ventrolateral medulla, kidneys and heart probably because it reduced Ang II levels in those tissues. However, the effect of environmental enrichment on the renin-angiotensin system is still unknown. No studies were found that show the relationship between enriched environment and the renin-angiotensin system in hypertensive rats. Certainly, new studies should be conducted to clarify this issue.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee on Animal Experiments of the Universidade Federal de Ouro Preto under the protocol number 2016/24.

 Acknowledgements

Frank Silva Bezerra would like to express their gratitude to CAPES for your Post-Doctoral fellowship (CAPES-PVEX-Process # 88881.172437/2018-01) in the Interdepartmental Division of Critical Care Medicine, St. Michael’s Hospital, University of Toronto, Toronto, ON, Canada.

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Laboratory animal welfare: cage enrichment and mouse behaviour. Nature. 2004;432(7019):821-2. Wolfer DP Litvin O Morf S Nitsch RM Lipp HP Wurbel H Laboratory animal welfare: cage enrichment and mouse behaviour Nature 2004 432 7019 821 822 Artigo Original O Enriquecimento Ambiental Promove Efeito Antioxidante no Bulbo Ventrolateral e Rins de Roedores com Hipertensão Renovascular 0000-0002-3601-5517 Sousa Luiz Eduardo Favero Iuri Ferrari Del 0000-0002-0804-5196 Bezerra Frank Silva 0000-0001-5226-6378 Souza Ana Beatriz Farias de Alzamora Andreia Carvalho Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, MG - Brasil Correspondência: Luiz Eduardo Sousa • Laboratório de Fisiopatologia Experimental (LAFEx), Instituto de Ciências Exatas e Biológicas, Departamento de Ciências Biológicas - Universidade Federal de Ouro Preto Campus Universitário s/n, CEP 35400-000. Morro do Cruzeiro, Ouro Preto, MG - Brasil Email: luizeduardo@ufop.edu.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa, Análise e interpretação dos dados, Análise estatística e Redação do manuscrito: Sousa LE; Obtenção de dados: Del Favero IF, Souza ABF; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Bezerra FS, Souza ABF, Alzamora AC.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

A hipertensão arterial é um precursor para o desenvolvimento da insuficiência cardíaca e renal e, além disso, está associada com o aumento dos marcadores oxidativos. O enriquecimento ambiental dos roedores melhora o desempenho em tarefas de memória, e também parece ter um efeito antioxidante sobre o hipocampo dos ratos normotensos.

 Objetivos:

Avaliar o efeito do enriquecimento ambiental sobre o estresse oxidativo no bulbo ventrolateral, coração, e rins de ratos com hipertensão renovascular.

 Métodos:

Quarenta ratos machos, tipo Fischer (6 semanas de idade), foram divididos em quatro grupos: normotensos em condições padrão (Sham-CP), normotensos em ambiente enriquecido (Sham-AE), hipertensos em condições padrão (2R1C-CP), e hipertensos em ambiente enriquecido (2R1C-AE). Os animais foram mantidos em gaiolas enriquecidas ou padrão durante quatro semanas e, por fim, todos os animais foram eutanasiados. O nível de significância foi p < 0,05.

 Resultados:

O grupo 2R1C-CP apresentou pressão arterial média maior (mmHg) 147,0 (122,0; 187,0) quando comparado com os grupos Sham-CP 101,0 (94,0; 109,0) e Sham-AE 106,0 (90,8; 117,8). Observou-se maior atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) (49,1 ± 7,9 U/mg ptn) e da catalase (0,8 ± 0,4 U/mg ptn) no bulbo ventrolateral do grupo 2R1C-AE, em relação à atividade da SOD (24,1 ± 9,8 U/mg ptn) e da catalase (0,3 ± 0,1 U/mg ptn) no grupo 2R1C-CP. No grupo 2R1C-AE, a oxidação lipídica no bulbo ventrolateral foi menor (0,39 ± 0,06 nmol/mg ptn) quando comparado com o grupo 2R1C-CP (0,53 ± 0,22 nmol/mg ptn). Ademais, foi observada maior atividade das enzimas superóxido dismutase nos rins dos animais 2R1C-AE (11,9 ± 2,3 U/mg ptn) em relação aos animais 2R1C-CP (9,1 ± 2,3 U/mg ptn).

 Conclusão:

O enriquecimento ambiental provocou efeito antioxidante no bulbo ventrolateral e nos rins, o que contribuiu para a redução do dano oxidante nos ratos hipertensos.

 Palavras-chave: Ratos hipertensão renovascular estresse oxidativo enriquecimento ambiental medula ventrolateral rins CAPES 88881.172437/2018-01 PVEX 88881.172437/2018-01 Introdução

A hipertensão arterial é um precursor chave para o desenvolvimento de AVC, insuficiência renal, insuficiência cardíaca, disfunção endotelial e doença cardiovascular. O estresse oxidativo tem sido relacionado na patogênese da hipertensão arterial e de outras doenças cardiovasculares.1,2 O desequilíbrio decorrente do excesso de compostos oxidantes, atrelado à diminuição das defesas antioxidantes, resulta em danos celulares.1 Nos ratos hipertensos, o estresse oxidativo está relacionado à disfunção do coração, dos rins, e do cérebro.3-5 Além disso, as espécies reativas de oxigênio (EROs) no bulbo ventrolateral são os principais fatores para a hiperatividade simpática e hipertensão arterial.4,6

O tronco cerebral contém estruturas complexas que controlam a pressão arterial e o reflexo cardiovascular.7,8 Essas regiões incluem a área pressora caudal, o bulbo caudal ventrolateral (CVLM), e a área pressora bulbo-cervical.7,9 A inibição e ativação desses núcleos causam repostas depressoras e pressoras, respectivamente. A face rostroventrolateral do bulbo (RVLM) é uma área importante do tônus simpático basal, sob regulação dos neurônios do CVLM através da inibição tônica e fásica.9 Estudos com ratos mostram que a hipertensão está associada com defesas antioxidantes mais baixas e aumento dos marcadores oxidativos, tanto no CVLM quando na RVLM.3,4,6,10

Além do sistema nervoso central, o coração e os rins também estão envolvidos no controle cardiovascular.5 Quando a hipertensão arterial se desenvolve nos ratos com hipertensão renovascular, observa-se um desequilíbrio redox em ambos os órgãos, acompanhado de um aumento na contagem de células inflamatórias, peroxidação lipídica, e diminuição das defesas antioxidantes.5

O sendentarismo é um fator de risco para as doenças cardiovasculares, incluindo a hipertensão arterial.11 A atividade física melhora as defesas antioxidantes do bulbo ventrolateral e, dessa forma, reduz o dano oxidativo e a hipertensão.3,12,13 Uma maneira de aumentar a atividade motora nos animais de laboratório é através do enriquecimento ambiental. Os animais em ambientes enriquecidos apresentam mudanças neuroanatônicas, químicas, e comportamentais que aumentam a memória, a função motora, as atividades sensoriais e cognitivas.14-16 Consequentemente, a neuroplasticidade aumenta, ao passo que os distúrbios neurodegenerativos e o declínio cognitivo são minimizados. O enriquecimento ambiental de roedores seguramente aumenta seu desempenho no aprendizado e nas tarefas de memória, além de melhorar a saúde e bem-estar gerais, quando comparados com animais da mesma espécie alojados da maneira tradicional.14,17,18 Esse enriquecimento inclui tipicamente a introdução de estímulos, tais como brinquedos, tubos, bolas, iglus, rodas para correr, ou quaisquer itens que estimulem a exploração, a interação social, as atividades sensorial e motora.

Os enriquecimentos ambientais não motores (por exemplo, sem a roda para correr) também parece ter um efeito antioxidante no hipocampo e no córtex cerebral de ratos normotensos.15,16 Assim sendo, o enriquecimento ambiental pode reduzir o estresse oxidativo no bulbo ventrolateral e contribuir para o controle da hipertensão. Todavia, apesar dos efeitos observados sobre a atividade cognitiva, não há dados consistentes disponíveis sobre a maneira exata através da qual o enriquecimento influencia o estresse oxidativo no bulbo ventrolateral dos animais hipertensos. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito do enriquecimento ambiental sobre o estresse oxidativo no bulbo ventrolateral, coração, e rins de ratos com hipertensão renovascular.

 Métodos Experimentos com animais

Todos os experimentos com animais do estudo foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Ouro Preto sob o número de protocolo 2016/24. Serviram como sujeitos quarenta ratos machos adultos, tipo Fischer (6 semanas de idade; 140-170 g). A hipertensão renovascular foi induzida como descrito anteriormente.19 Resumidamente, os animais foram anestesiados com 50 mg/kg de quetamina e 10 mg/kg de xilazina (IP). Em seguida, um clipe de prata (2R1C; diâmetro interno = 0,2mm) foi implantado na artéria renal esquerda através de incisão mediana. Os grupos normotensos (Sham) foram submetidos a procedimentos semelhantes, porém sem implantação do clipe. Quatro grupos foram formados: hipertensos mantidos em condições padrão (2R1C-CP) (n = 12), hipertensos em ambiente enriquecido (2R1C-AE) (n = 8), normotensos mantidos em condições padrão (Sham-CP) (n = 7), e normotensos em ambiente enriquecido (Sham-AE) (n = 13). O tamanho da amostra foi definido por conveniência.

 Protocolo do ambiente enriquecido e condições padrão

Imediatamente após a cirugia, os ratos foram alojados em gaiolas com ambiente enriquecido (AE) ou sob condições padrão (CP) (Figura 1). O primeiro continha seis objetos diferentes (bolas coloridas de plástico, iglu, palitos mastigáveis de madeira, tubos labirinto, tubos retos); as gaiolas foram organizadas com quatro ratos cada. Oito combinações diferentes de objetos foram usadas, com mudanças semanais para estimular a exploração. O ambiente controle consistia de gaiolas padrão (CP) idênticas àquelas usadas para alojar os sujeitos durante o período não-experimental. Todos os grupos foram mantidos na mesma sala, em prateleiras diferentes, para controlar a iluminação (ciclos de 12h de luz e 12h de escuridão), a temperatura (24 ± 1ºC), umidade, e ruído ambiente. Ração e água de torneira foram fornecidas ad libitum. O procedimento de enriquecimento durou quatro semanas. Ao final desse período, as medições cardiovasculares foram realizadas.

Representação dos ambientes aos quais os ratos foram expostos (A) gaiola padrão (B) gaiola enriquecida.

Medições cardiovasculares

Ao longo dos 2 últimos dias do experimento, os ratos foram anestesiados com uretano (1,2 g/kg de peso corporal, ip; Sigma-Aldrich, EUA). Cateteres de polietileno (PE-10 conectados PE-50, Clay Adams, Parsippany, NJ, EUA), preenchidos com solução salina heparinizada (400 UI/mL), foram introduzidos na artéria femoral direita para medir a pressão arterial pulsátil. A pressão arterial foi registrada com frequência de amostragem de 1000 Hz e uma janela de digitalização de 20 mV de amplitude. A frequência cardíaca e a pressão arterial média (PAM) foram derivadas em tempo real a partir do sinal da pressão arterial pulsátil utilizando o software LabChart for Windows (ADInstruments Pty Ltd, Austrália). Os protocolos experimentais foram conduzidos em animais anestesiados. Após as medições cardiovasculares, os ratos foram decapitados e o ventrículo esquerdo foi perfundido com solução salina para remover o sangue dos tecidos. O cérebro, os corações, os rins e o bulbo ventrolateral foram dissecados, e todas as amostras foram congeladas em nitrogênio líquido e estocadas a -80ºC.

 As defesas antioxidantes e os biomarcadores de estresse oxidativo

A atividade da superóxido dismutase (SOD) foi avaliada através da capacidade da enzima em inibir a auto-oxidação do pirogalol (absorbância de 570 nm).20 A atividade da catalase foi determinada através da velocidade com que o H2O2 foi reduzido (absorbância of 240 nm).21 Os métodos de determinação de proteína carbonilada (absorbância de 370 nm) foram baseados em publicações anteriores.22,23 A peroxidação lipídica foi avaliada usando o método de ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (absorbância de 535 nm).24 A proteína total foi quantificada usando o método Bradford.25

Análise estatística

Os dados foram expressos como média ± DP ou mediana (valor mínimo-valor máximo). A normalidade foi testada por One-wat ANOVA seguida pelo pós-teste de Newman-Keuls. Os dados foram então analisados por ANOVA de 1 via seguida pelo teste post hoc Newman-Keuls ou teste Kruskal-Wallis, seguido pelo pós-teste de Dunn. A análise estatística foi realizada no GraphPad Prism. A significância foi estabelecida em p < 0,05.

 Resultados Os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a pressão arterial média

Para avaliar se o enriquecimento ambiental reduz a pressão arterial nos ratos hipertensos, nós comparamos a PAM entre os quatro grupos experimentais. O grupo 2R1C-CP exibiu uma PAM significativamente maior 147,0 (122,0; 187,0) mmHg, p < 0,05, em comparação aos grupos Sham-CP 101,0 (94,0; 109,0) mmHg e Sham-AE 106,0 (90,8; 117,8) mmHg. A frequência cardíaca não foi significativamente diferente entre os quatro grupos (Figura 2).

Níveis basais da pressão arterial média (PAM, mmHg) nos ratos hipertensos (2R1C) e normotensos (Sham) submetidos ao enriquecimento ambiental (AE) e condições padrão (CP). Medidas diretas de PAM foram obtidas nas 4 semanas após a cirurgia 2R1C. As letras (por cima das barras) indicam diferenças significativas. (a) A diferença em relação ao grupo Sham-CP; (b) Differença em relação ao grupo Sham-AE analisada através do teste Kruskal-Wallis, seguido pelo pós-teste de Dunn (p < 0,05) (n = 7 em cada grupo). Os dados foram expressos como mediana (valor mínimo-valor máximo).

Os efeitos do enriquecimento ambiental sobre marcadores de estresse oxidativo no bulbo ventrolateral

A atividade da superóxido dismutase no bulbo ventrolateral foi maior para o grupo 2R1C-AE em relação ao 2R1C-CP. Adicionalmente, a atividade da catalase foi maior no grupo 2R1C-AE do que em todos os outros grupos. Foi observado um aumento no valor de TBARS no grupo 2R1C-CP quando comparado com os grupos Sham, mas houve redução da atividade no grupo 2R1C-AE quando comparado com o 2R1C-CP (Tabela 1).

Efeitos do enriquecimento ambiental ou condições padrão sobre a atividade de enzimas antioxidantes e biomarcadores de dano oxidativo no bulbo ventrolateral.
SOD (U/mg ptn) Catalase (U/mg ptn) Proteína carbonilada (nmol/mg ptn) TBARS (nmol/mg ptn)
Sham-CP (n = 7) 32,9 ± 7,1 0,3 ± 0,04 22,1 ± 12,1 0,29 ± 0,12
Sham-AE (n = 13) 41,8 ± 11 0,4 ± 0,2 28,6 ± 11,9 0,36 ± 0,1
2R1C-CP (n = 12) 24,1 ± 9,8 0,3 ± 0,1 44,6 ± 15,1 0,53 ± 0,22a,b
2R1C-AE (n = 8) 49,1 ± 7,9c 0,8 ± 0,4a,b,c 57,1 ± 12,5a,b 0,39 ± 0,06c

representa uma diferença significativa entre os grupos quando comparados com o grupo Sham-CP;

representa uma diferença significativa entre os grupos quando comparados com o grupo Sham-AE;

representa uma diferença significativa entre os grupos quando comparados com o grupo 2R1C-CP.

Análise feita com ANOVA de 1 via, seguida pelo pós-teste de Newman Keuls (p < 0,05). Os dados foram expressos como média ± DP (n = 7-13 em cada grupo). Sham-CP: grupo de normotensos expostos a condições padrão; Sham-AE: grupo de normotensos expostos ao enriquecimento ambiental; 2R1C-CP: grupo de hipertensos expostos a condições padrão; 2R1C-AE: grupo de hipertensos expostos ao enriquecimento ambiental. SOD: superóxido dismutase; TBARS: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico.

Os efeitos do enriquecimento ambiental sobre marcadores de estresse oxidativo no ventrículo esquerdo

De modo geral, a concentração de TBARS foi maior tanto nos grupos de hipertensos quanto nos grupos Sham. A atividade da catalase foi menor no grupo 2R1C-CP em relação ao Sham-AE. A proteína carbonilada e a SOD foram semelhantes entre todos os grupos experimentais (Tabela 2).

Efeitos do enriquecimento ambiental ou condições padrão sobre a atividade de enzimas antioxidantes e biomarcadores de dano oxidativo no ventrículo esquerdo.
SOD (U/mg ptn) Catalase (U/mg ptn) Proteína carbonilada (nmol/mg ptn) TBARS (nmol/mg ptn)
Sham-CP (n = 7) 12,0 ± 2,9 0,3 ± 0,1 30,1 ± 18,1 0,3 ± 0,17
Sham-AE (n = 13) 12,6 ± 3,8 0,4 ± 0,14 30,1 ± 10,7 0,2 ± 0,14
2R1C-CP (n = 12) 9,9 ± 1,4 0,2 ± 0,09b 37,2 ± 12,8 0,8 ± 0,07a,b
2R1C-AE (n = 8) 12,1 ± 4,2 0,3 ± 0,11 48,2 ± 19 1,1 ± 0,2a,b

representa uma diferença significativa entre os grupos quando comparados com o grupo Sham-CP;

representa uma diferença significativa entre os grupos quando comparados com o grupo Sham-AE.

Análise feita com ANOVA de 1 via, seguida pelo pós-teste de Newman Keuls (p < 0,05). Os dados foram expressos como média ± DP (n = 7-13 em cada grupo). Sham-CP: grupo de normotensos expostos a condições padrão; Sham-AE: grupo de normotensos expostos ao enriquecimento ambiental; 2R1C-CP: grupo de hipertensos expostos a condições padrão; 2R1C-AE: grupo de hipertensos expostos ao enriquecimento ambiental. SOD: superóxido dismutase; TBARS: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico.

Os efeitos do enriquecimento ambiental sobre marcadores de estresse oxidativo no rim direito

Foi obervado um aumento da atividade da SOD nos grupos em ambientes enriquecidos (2R1C-AE, Sham-AE) em comparação aos grupos padrão (2K1C-CP, Sham-CP). Foram observadas maior concentração de proteína carbonilada e menor concentração de TBARS no grupo 2R1C-AE, quando comparado com o 2R1C-CP (Tabela 3).

Efeitos do enriquecimento ambiental ou condições padrão sobre a atividade de enzimas antioxidantes e biomarcadores de dano oxidativo no rim direito.
SOD (U/mg ptn) Catalase (U/mg ptn) Proteína carbonilada (nmol/mg ptn) TBARS (nM/mg ptn)
Sham-CP (n=7) 8,1 ± 2,5 1,8 ± 0,7 5,6 ± 2,1 0,3 ± 0,13
Sham-AE (n=13) 12 ± 3,5a 1,9 ± 0,8 4,4 ± 1,9 0,3 ± 0,09
2R1C-CP (n=12) 9,1 ± 2,3 1,5 ± 0,34 3,1 ± 2 0,4 ± 0,18
2R1C-AE (n=8) 11,9 ± 2,3c 2,4 ± 1,1 7,2 ± 2,9c 0,1 ± 0,07c

representa uma diferença significativa entre os grupos quando comparados com o grupo Sham-CP;

representa uma diferença significativa entre os grupos quando comparados com o grupo 2R1C-CP.

Análise feita com ANOVA de 1 via, seguida pelo pós-teste de Newman Keuls (p < 0,05). Os dados foram expressos como média ± DP (n = 7-13 em cada grupo). Sham-CP: grupo de normotensos expostos a condições padrão; Sham-AE: grupo de normotensos expostos ao enriquecimento ambiental; 2R1C-CP: grupo de hipertensos expostos a condições padrão; 2R1C-AE: grupo de hipertensos expostos ao enriquecimento ambiental. SOD: superóxido dismutase; TBARS: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico.

Os efeitos do enriquecimento ambiental sobre marcadores de estresse oxidativo no rim esquerdo

Além disso, a atividade da SOD foi maior no grupo 2R1C-AE em relação aos animais 2R1C-CP. A atividade da catalase foi menor nos grupos de hipertensos (2R1C-CP e 2R1C-AE) do que nos grupos Sham (Sham-CP e Sham-AE). Não foram observadas diferenças significativas em relação à atividade da proteína carbonilada e à concentração de TBARS entre os grupos experimentais (Tabela 4).

Efeitos do enriquecimento ambiental ou condições padrão sobre a atividade de enzimas antioxidantes e biomarcadores de dano oxidativo no rim esquerdo.
SOD (U/mg ptn) Catalase (U/mg ptn) Proteína carbonilada (nmol/mg ptn) TBARS (nM/mg ptn)
Sham-CP (n = 7) 14,1 ± 5,9 1,4 ± 0,5 24,9 ± 8,8 0,5 ± 0,19
Sham-AE (n = 13) 17,4 ± 8,7 1,5 ± 0,8 31,9 ± 11,9 0,4 ± 0,2
2R1C-CP (n = 12) 11,3 ± 2,2 0,1 ± 0,06a,b 25,9 ± 9,3 0,7 ± 0,3
2R1C-AE (n = 8) 23,5 ± 6,2c 0,4 ± 0,2a,b 30,1 ± 8,1 0,4 ± 0,19

representa uma diferença significativa entre os grupos quando comparados com o grupo Sham-CP;

representa uma diferença significativa entre os grupos quando comparados com o grupo Sham-AE;

representa uma diferença significativa entre os grupos quando comparados com o grupo 2R1C-CP.

Análise feita com ANOVA de 1 via, seguida de pós-teste de Newman Keuls (p < 0,05). Os dados foram expressos como média ± DP (n = 7-13 em cada grupo). Sham-CP: grupo de normotensos expostos a condições padrão; Sham-AE: grupo de normotensos expostos ao enriquecimento ambiental; 2R1C-CP: grupo de hipertensos expostos a condições padrão; 2R1C-AE: grupo de hipertensos expostos ao enriquecimento ambiental. SOD: superóxido dismutase; TBARS: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico.

Discussão

Assim como em outros estudos, foram observadas diferenças nos valores de PAM registrados entre os ratos hipertensos mantidos em gaiolas padrão e os controles normotensos mantidos em gaiolas padrão. É importante destacar que este estudo é o primeiro a demonstrar valores semelhantes de PAM entre ratos normotensos e ratos hipertensos em ambientes enriquecidos. Este resultado provavelmente se deve ao efeito antioxidante do enriquecimento sobre o bulbo ventrolateral e os rins. O fato de maiores valores de PAM terem sido observados em ratos hipertensos (2R1C-CP) em comparação aos animais do grupo controle (Sham-CP) é consistente com dados obtidos em outros estudos.3,5

O modelo experimental de hipertensão de Goldblatt tipo 2 rins 1 clipe (2R1C) é caracterizado pela hiperatividade do sistema renina-angiotensina, principalmente pela angiotensina II. A angiotensina II ativa os receptores AT1 para aumentar a pressão arterial através de vários mecanismos (inclusive a vasoconstrição, o estresse oxidative) e aumenta a descarga simpática neural. Além desse sistema circulatório clássico, os componentes do sistema renina-angiotensina também são encontrados no cérebro. Os receptores AT1 da angiotensina II são abundantes no sistema nervoso autonômico e nas regiões regulatórias do cérebro, a fim de influenciar a neurotransmissão e a pressão arterial. As ações da angiotensina II no bulbo ventrolateral contribuem para a simpatoexcitação e a hipertensão nos animais, em parte, através da estimulação do estresse oxidativo.26

O presente estudo mostrou que o enriquecimento conseguiu aproximar a PAM dos ratos 2R1C-AE e a PAM dos ratos sham. Além disso, o enriquecimento recuperou os componentes das EROs no bulbo ventrolateral, rim e ventrículo esquerdo. Estudos anteriores mostraram uma hiperatividade da Ang II, tanto na RVLM27,28 quanto no CVLM9,29 do bulbo ventrolateral dos ratos 2R1C. Além disso, a Ang II tem sido correlacionada com as EROs nessas áreas do cérebro.30 Por outro lado, a Ang II é um potente indutor da produção de EROs no ventrículo e no rim.31,32

Os compostos antioxidantes são essenciais para a proteção dos sistemas cardiovascular e nervoso. Aqui, foi observada maior atividade da SOD e da catalase no bulbo ventrolateral dos ratos 2R1C-AE em relação aos ratos 2R1C-CP. Dessa forma, o enriquecimento ambiental parece ter um efeito protetor contra o estresse oxidativo através do aumento das defesas antioxidantes, reduzindo assim a PAM nos ratos hipertensos. O estudo mostrou que o aumento das defesas antioxidantes no bulbo ventrolateral diminui a PAM dos ratos hipertensos.6 Do mesmo modo, pesquisas anteriores mostraram que ratos espontaneamente hipertensos tiveram uma diminuição da atividade da SOD no RVLM, mas a PAM e a atividade nervosa simpática também diminuíram quando a SOD foi superexpressada.33

A concentração de proteína carbonilada foi maior no bulbo ventrolateral dos ratos 2R1C-AE em relação aos grupos controle (Sham-CP e Sham-AE). Esse resultado surpreendente sugere que o enriquecimento ambiental ou foi deletério para os ratos hipertensos, ou o bulbo ventrolateral é simplesmente menos capaz de lidar com a oxidação proteica, ainda que sob condições favoráveis. Do mesmo modo, um estudo anterior mostrou que o enriquecimento ambiental não reduz a oxidação proteica no córtex de ratos machos normotensos.16 Contudo, nós também demonstramos que o enriquecimento diminuiu a concentração de TBARS no bulbo ventrolateral dos ratos 2R1C, indicando que antioxidantes endógenos foram satisfatoriamente ativados para neutralizar a peroxidação lipídica. Esses resultados corroboram pesquisas anteriores em ratos normotensos.16 O estresse oxidativo no bulbo ventrolateral aumenta a atividade nervosa simpática, sugerindo que essa região do cérebro é importante para modular a elevação causada pelas EROs.28

De modo geral, o enriquecimento ambiental parece exercer um efeito neuroprotetor através da melhora do estresse oxidativo, mas o mecanismo de neuroproteção ainda não foi estabelecido. O estresse oxidativo está envolvido na patogênese das doenças neurológicas agudas e crônicas. Isso ocorre porque o tecido nervoso é especialmente sensível ao estresse oxidativo, devido à grande quantidade de fontes de EROs.1 Acredita-se que a síntese dos fatores tróficos desempenhem um papel na mediação dos efeitos neuroprotetores do enriquecimento. Constatou-se que o enriquecimento ambiental causa o aumento fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em células gliais, estriado e substância negra.34 Desse modo, nós sugerimos que o enriquecimento ambiental não é relevante apenas para o envelhecimento do cérebro, demência e doenças neurodegenerativas, mas também para outros distúrbios neurológicos e doenças cardiovaculares.

O estresse oxidativo no coração é um agente causal importante de hipertensão, ativando a sinalização intracelular que induz à disfunção cardíaca através da apoptose ou do crescimento celular excessivo.10,35 Nós observamos níveis maiores de TBARS no ventrículo esquerdo e menor atividade da catalase nos ratos 2R1C-CT do que nos ratos Sham (CP e AE). Em consonância com nossos resultados, os ratos sedentários 2R1C mostraram níveis mais altos de TBARS no ventrículo esquerdo. Em geral, espera-se que a hipertensão renovascular aumente o peso relativo do coração, diâmetro de cardiomiócitos, contagem de células inflamatórias do miocárdio, e a deposição de colágeno no ventrículo esquerdo.5

O enriquecimento não pareceu alterar a PAM, TBARS, e as defesas antioxidantes gerais no ventrículo esquerdo dos ratos hipertensos.36,37 Levantamos a hipótese de que o enriquecimento ambiental deveria incluir atividade física (p.e. rodas para correr) para que os efeitos antioxidantes possam ser observados no coração de ratos hipertensos. Vários estudos que examinaram a hipertensão e as doenças cardiovasculares demonstraram que a atividade física confere efeitos antioxidantes ao coração.5,38,39

Nós também observamos o aumento da atividade da SOD nos rins dos ratos hipertensos em ambientes enriquecidos e dos ratos normotensos. Além disso, a atividade da catalase no rim esquerdo diminuiu nos ratos hipertensos (2R1C-CP e 2R1C-AE) em relação ao grupo controle, provavelmente por se tratar do rim clipado. Esses dados sugerem que o estresse oxidativo aumentou nos rins de animais hipertensos.5 A ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona causa o aumento da produção de EROs no rim através de muitas rotas, incluindo o aumento na atividade da NADPH oxidase, disfunção mitocondrial, diminuição da disponibilidade de NO, e redução das enzimas atioxidantes. Assim, a alta produção de EROs em resposta à ANG II está implicada no desenvolvimento da hipertensão entre os vários modelos animais, incluindo os ratos 2R1C.40,41

A atividade da catalase e da superóxido dismutase (SOD) diminui no córtex dos rins clipado e não clipado de porcos 2R1C. De modo semelhante, o PGF2-alfa-8-isoprostano e a excreção de malondialdeído aumentam nos rins dos ratos 2R1C.40,42 O aumento da produção de EROs, induzido por infusão de angiotensina II nos rins, pode desencadear a hipertensão. A atividade da SOD protege o rim contra o estresse através da diminuição da expressão renal de p22phox, ativação da NADPH oxidase.43 Além disso, a superexpressão de SOD no rim minimiza o estresse oxidativo e a hipertensão. A transferência de genes adenovirais da SOD3 humana em ratos espontaneamente hipertensos aumentou a expressão de SOD3 nos rins e vasos sanguíneos, reduzindo, assim, o O2 •- vascular, ao mesmo tempo que melhorou a função endotelial e a reatividade vascular.44

As modificações nos modelos de gaiola-padrão, visando a criação de ambientes que favoreçam a atividade motora, a atividade visual, a exploração e as interações sociais, vêm sendo associadas a mudanças comportamentais significativas e melhora na saúde e bem-estar gerais.45 A saúde e o bem-estar gerais estão associados a níveis mais baixos de cortisol e pressão arterial; entretanto, poucos estudos demonstraram seu efeito sobre o sistema redox nos animais hipertensos.46

Conclusão

Os efeitos fisiológicos do enriquecimento ambiental são muitos, mas a melhora no bem-estar e nas propriedades cognitivas dos animais parece ser um benefício evidente.15,47 Nosso estudo apresenta limitações, uma vez que o ambiente laboratorial impõe várias restrições físicas e operacionais sobre os métodos e a dimensão do enriquecimento oferecido para os ratos incluídos na pesquisa. Essas limitações estimulam nossa capacidade de usar métodos diferentes para favorecer ao máximo o enriquecimento ambiental. Apesar das limitações como um todo, nossos resultados indicam que o enriquecimento ambiental conferiu efeitos antioxidantes ao bulbo ventrolateral e aos rins, e provavelmente contribuiu para a reduzir a PAM e minimizar o dano oxidativo nos ratos com hipertensão renovascular. Nós sugerimos que o enriquecimento ambiental pode ter aproximado a PAM dos ratos 2R1C-AE e dos ratos SHAM através da redução dos níveis de estresse oxidativo no bulbo ventrolateral, rins e coração, provavelmente por ter reduzido os níveis de Ang II naqueles tecidos. No entanto, o efeito do enriquecimento ambiental sobre o sistema renina-angiotensina ainda não é conhecido. Não encontramos estudos que mostrassem a relação entre o ambiente enriquecido e o sistema renina-angiotensina nos ratos hipertensos. Certamente, novos estudos são necessários para esclarecer essa questão.

Fontes de financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Ouro Preto sob o número de protocolo 2016/24.

 Agradecimentos

Frank Silva Bezerra gostaria de agradecer à CAPES, pela bolsa de pós-doutorado recebida (CAPES-PVEX- Processo no 88881.172437/2018-01), na Divisão de Pesquisa Interdepartamental de Medicina Intensiva, Hospital Saint Michael, Universidade de Toronto, Toronto, ON, Canadá.