Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC JkVFyx4kJxcTTYZVthvn3hk S0066-782X2019001100896 S0066-782X2019005015101 10.5935/abc.20190149 Original Article High-Lard and High-Cholesterol Diet, but not High-Lard Diet, Leads to Metabolic Disorders in a Modified Dyslipidemia Model Muniz Lidiane B. Alves-Santos Aline M. Camargo Fabricio Martins Danieli Brolo 0000-0002-4733-007X Celes Mara Rubia N. 0000-0003-4332-6206 Naves Maria Margareth V. Universidade Federal de Goiás Goiania GO Brazil Universidade Federal de Goiás, Goiania, GO - Brazil Mailing Address: Maria Margareth V. Naves, Universidade Federal de Goiás - Faculdade de Nutrição - Laboratório de Nutrição Experimental - Rua 227, quadra 68, Setor Leste Universitário, Postal Code 74605-080, Goiânia, GO - Brazil. E-mail: mmvnaves@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research and Obtaining financing: Naves MMV; Acquisition of data: Muniz LB, Alves-Santos AM, Camargo F, Martins DB, Celes MRN; Analysis and interpretation of the data, Statistical analysis and Writing of the manuscript: Muniz LB, Alves-Santos AM; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Martins DB, Celes MRN, Naves MMV.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 29 08 2019 11 2019 113 5 896 902 27 08 2018 03 12 2018 23 01 2019 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited Abstract Background:

In view of the increased global prevalence of cardiovascular and hepatic diseases, the diet lipid content and its relationship with the accumulation of fat in hepatocytes have been investigated as key factors in preventing these diseases.

 Objective:

To evaluate the metabolic effects of a high-lard diet supplemented or not with cholesterol on a modified dyslipidemia model.

 Methods:

We divided 24 adult male Wistar rats into three groups: standard diet (STD - 4% lipids), high-lard diet (HLD - 21% lard), and high-lard and high-cholesterol diet (HL/HCD - 20% lard, 1% cholesterol, 0.1% cholic acid). After six weeks of treatment, blood and liver were collected for biochemical (serum lipid profile and liver enzymes) and morphological analyses. Statistical analysis included one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey test for mean comparisons, and a 5% probability was considered statistically significant.

 Results:

Animals fed HL/HCD showed increased total cholesterol, triacylglycerol, LDL-c, non-HDL-c, alanine aminotransferase (ALT), and aspartate aminotransferase (AST) serum levels compared to those fed STD. In addition, the HL/HCD animals presented higher relative liver weight, with moderate macrovesicular hepatic steatosis and inflammatory infiltrate.

 Conclusion:

A high-fat diet with lard (20%) and cholesterol (1%) triggered dyslipidemia with severe liver damage in rats in a shorter experimental time than the previously reported models. The high-lard diet without supplementation of cholesterol led to body weight gain, but not to dyslipidemia.

 Keywords Dietary Fats Cholesterol Lipid Metabolism Fatty Liver Inflammation Rats Introduction

The worldwide prevalence of metabolic diseases and associated health complications have increased in recent decades. Excess body fat, insulin resistance, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and dyslipidemia lead to metabolic disorders related to higher risks of developing cardiovascular diseases.1 NAFLD ranges from a minor hepatocyte fat accumulation to more severe stages of inflammatory necrosis, with or without fibrosis. Studies indicate an association between NAFLD and insulin resistance, hepatocyte inflammation, and lipid metabolism impairment,2,3 as most NAFLD patients present dyslipidemia.4

Dyslipidemia is characterized by increased levels of triacylglycerol (TG) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-c) and decreased high-density lipoprotein cholesterol (HDL-c).5 Hypercholesterolemia (isolated LDL-c increase) and hypertriglyceridemia (isolated TG increase) are the most common forms of dyslipidemia.6 In general, lipid metabolism imbalance results from the interaction between genetics and environmental factors, such as eating habits, especially lipid consumption. Therefore, diet lipid content has been investigated as a key factor in preventing cardiovascular and hepatic diseases.7

Experimental studies with high-fat diets have used very high contents of dietary fat (about 50% of the diet composition), in short-period (four weeks) protocols, without finding serum lipid impairment.8,9 On the other hand, studies testing lipid concentrations closer to human consumption have been performed during a relatively long experimental time, as in previous reports with rats (21% fat for 9 weeks)10 and with mice (15% to 20% fat for 12 to 16 weeks).11,12

In this context, this study aimed to evaluate the metabolic effects of a high-lard diet supplemented or not with cholesterol on a modified dyslipidemia model, with shorter experimentation time and lower diet lipid concentration compared to previous reports.

 Methods Animals, diets, and experimental design

The experiment was carried out with adult male Wistar rats provided by the University of São Paulo (Ribeirão Preto, Brazil). The rats were kept in plastic cages (2 animals/cage) for seven weeks (one week of acclimation and six weeks of assay), under controlled environmental conditions (12 h light, 12 h dark cycle, and temperature at 22 ± 2ºC). In the experiment, we randomly divided 24 rats into 3 groups of 8 animals, according to a randomized block design based on their body weight. The sample size was defined considering previous studies on experimental dyslipidemia. Each group received one of the following diets: standard diet (STD; RH19521, Rhoster, Brazil) prepared according to AIN-93M,13 high-lard diet (HLD; RH195143, Rhoster, Brazil), and high-lard and high-cholesterol diet (HL/HCD; RH195142, Rhoster, Brazil). Soybean oil (STD) and lard were used as lipid sources; cholesterol, to induce hypercholesterolemia; and cholic acid, to increase the hypercholesterolemic effect of supplemented cholesterol14 (Table 1). The diets and filtered water were provided ad libitum. Dietary intake and body weight of the animals were monitored three times a week.

Composition of the experimental diets
Component (g/100g of diet) Diet1
STD HLD HL/HCD
Casein (82.93 g of protein) 16.47 16.47 16.47
L-cystine 0.18 0.18 0.18
Soybean oil 4.00 0.00 0.00
Lard2 0.00 21.00 20.00
Cholesterol2 0.00 0.00 1.00
Cholic acid2 0.00 0.00 0.10
Sucrose 10.00 10.00 10.00
Cellulose 5.00 5.00 5.00
Mineral mix 3.50 3.50 3.50
Choline bitartrate 0.25 0.25 0.25
Vitamin mix 1.00 1.00 1.00
tert-Butylhydroquinone (TBHQ) 0.008 0.008 0.008
Dextrinized cornstarch 15.50 15.50 15.50
Corn starch 44.09 27.09 26.99
Lipids (g/100g)3 4.1 ± 0.1 19.7 ± 1.4 20.8 ± 1.6
Energy from lipids4 36 189 189
Diet energy (kcal/g)4 3.41 4.26 4.26
(Energy from lipids x 100)/diet energy (%) 11 44 44

Reeves et al.13; STD: standard diet; HLD: high-lard diet; HL/HCD: high-lard and high-cholesterol diet;

Fernandes et al.10;

Result of diet chemical analysis;

Diet energy value: 4, 4, and 9 kcal/g for protein, carbohydrate, and lipid, respectively.

After six weeks of experimentation, the animals were euthanized (xylazine + ketamine/ 10 mg/kg + 100 mg/kg). Next, we collected blood samples by abdominal puncture (about 5 mL) for biochemical analyses (serum lipid profile and liver enzymes). After the euthanasia by abdominal aorta exsanguination, we extracted, weighed, and prepared the liver of the animals for morphological evaluation. All procedures complied with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals15 and were approved by the Animal Care and Use Ethics Committee of the Federal University of Goiás (protocol number 039/15).

 Biochemical analyses

Blood samples were collected in heparin tubes and centrifuged at 4000 rpm for 10 min to separate the serum, which was immediately stored at -80°C for analyses of lipid profile and liver enzymes. Total cholesterol (TC), TG, LDL-c, HDL-c, alanine aminotransferase (ALT), and aspartate aminotransferase (AST) levels were determined by commercially available kits (Labtest Diagnóstica S.A., Lagoa Santa, Brazil). Very low-density lipoprotein cholesterol (VLDL-c) was estimated by the Friedewald equation, and non-HDL-c fraction was obtained by the difference between TC and HDL-c levels. The importance of non-HDL-c fraction has been highlighted in cardiovascular disease (CVD) risk prediction. Boekholdt et al.16 revealed that non-HDL-c concentrations had a stronger direct association with CVD risk than LDL-c and apolipoprotein B (Apo B).

 Liver morphological evaluation

We rinsed the liver lobes in ice-cold 0.9% physiological solution and fixed them by immersion in phosphate-buffered 10% formalin for 24 h. Subsequently, the lobes were cut into 4 to 5 mm thick fragments, dehydrated in increasing alcohol concentrations (80%, 95%, and 100%), clarified in xylol (3 baths of 30 min each), and embedded in paraffin. Five-micrometer-thick serial sections were obtained and stained with hematoxylin and eosin (HE). We used the HE-stained sections to analyze the alterations in the arrangement of hepatic parenchyma and the presence of inflammatory infiltrates with a Leica Las V4 Software (Leica Imaging Systems Ltd., Cambridge, UK), a Leica DM2000 microscope (Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Wetzlar, Switzerland), a Leica DC230 video camera (Leica Microsystems AG, Heerbrugg, Switzerland), and an online computer. Twenty fields of hepatic parenchyma of each animal were randomly selected and analyzed, at 100x and 400x magnification.

 Statistical analysis

Data were expressed as mean ± standard deviation. The literature considers body weight and biochemical parameters obtained in animal models as parametric data.8-12 Thus, we determined statistical significance using the one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey test for mean comparisons (p < 0.05). STATISTICA software, version 7.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA) was used for statistical analyses.

 Results

The lard used in the formulation of diets contained 39 g/100 g of saturated fat and 72 mg/100 g of cholesterol. In high-fat diets (HLD and HL/HCD), lard contributed with approximately 15 mg of cholesterol/100 g of diet, besides the cholesterol added to the HL/HCD. Forty-four percent (44%) of the HLD and HL/HCD energy derived from lipids, a value four times higher than that of STD (11%).

The initial body weight of the animals did not differ among the groups, ensuring the homogeneity of group repetitions. Animals fed HLD showed higher body weight gain than those from the STD group. Liver weight and relative liver weight of animals fed HL/HCD were higher (p < 0.05) than those of other groups (Table 2).

Body and liver weight and biochemical parameters of Wistar rats after six weeks of treatment with standard and high-fat diets
Parameter Diet
STD HLD HL/HCD
Body weight (g)
Initial 249.05 ± 21.44a 243.85 ± 15.09a 242.35 ± 16.78a
Final 499.58 ± 65.32a 564.08 ± 39.73a 508.58 ± 47.68a
Gain 250.53 ± 48.40b 320.23 ± 44.50a 266.23 ± 38.21a,b
Liver
Weight (g) 14.90 ± 2.33b 15.92 ± 1.65b 27.10 ± 5.94a
Relative weight (g/100g body weight) 2.98 ± 0.24b 2.82 ± 0.14b 5.28 ± 0.80a
Serum lipid profile (mg/dL)
TC 59.83 ± 15.99b 64.58 ± 14.13b 87.75 ± 8.54a
LDL-c 4.23 ± 0.71b 6.98 ± 2.09b 23.63 ± 4.55a
HDL-c 30.74 ± 4.11a 34.42 ± 7.77a 26.74 ± 4.23a
non-HDL-c 29.09 ± 12.13b 30.17 ± 10.84b 61.01 ± 6.95a
VLDL-c 10.68 ± 1.58b 16.77 ± 4.58a,b 18.52 ± 7.51a
TG 53.42 ± 7.91b 83.83 ± 22.90a,b 92.58 ± 37.55a
Liver enzymes (U/L)
ALT 48.72 ± 15.91b 28.16 ± 6.00b 210.30 ± 137.78a
AST 154.67 ± 22.42b 117.00 ± 29.84b 300.63 ± 60.26a

Data are expressed as mean ± standard deviation. a,bValues in the same row with different superscript letters are significantly different (Tukey test, p < 0.05). STD: standard diet; HLD: high-lard diet; HL/HCD: high-lard and high-cholesterol diet; Relative liver weight = (liver weight/body weight) x 100; TC: total cholesterol; LDL-c: low-density lipoprotein cholesterol; HDL-c: high-density lipoprotein cholesterol; VLDL-c: very low-density lipoprotein cholesterol; TG: triacylglycerol; non-HDL-c: non-high-density lipoprotein cholesterol; ALT: alanine aminotransferase; AST: aspartate aminotransferase.

Animals fed HL/HCD showed higher TC, TG, LDL-c, VLDL-c, non-HDL-c, ALT, and AST serum levels than those from STD and HLD groups. Serum lipid profile and liver enzymes of animals fed HLD were not different from those of the STD group (Table 2).

We found microscopic changes (Figure 1) in the liver of animals fed HL/HCD, as the hepatic tissue architecture was not preserved, with hepatocyte ballooning (characterized by swelling and/or vacuolation), alterations in sinusoidal blood capillaries, and passive hyperemia (capillaries and veins engorged with blood). In addition, rats fed HL/HCD presented moderate macrovesicular hepatic steatosis associated with a marked infiltration by lymphomononuclear cells. On the other hand, animals fed HLD had their hepatic tissue architecture preserved, containing hepatocytes with usual morphological aspect, and preserved vascular distribution, centrilobular vein, and portal triad. Furthermore, the HLD group showed mild microvesicular hepatic steatosis associated with lower infiltration by lymphomononuclear cells. The hepatic tissue architecture of the STD group was maintained with typical hepatocytes, preserved hepatic sinusoid, and capillary strands; conserved vascular distribution, intact portal triads, with portal vein branches, hepatic artery, and bile duct.

Morphological evaluation of the liver of Wistar rats fed high-fat diets for six weeks. STD (standard diet): preserved hepatic tissue architecture with conserved vascular distribution. HLD (high-lard diet): preserved hepatic tissue architecture with mild and uniform hepatic steatosis (black arrows), mild inflammatory infiltrate (white arrows), and mild passive hyperemia (arrowheads). HL/HCD (high-lard and high-cholesterol diet): altered tissue architecture with moderate hepatic steatosis, fat microvesicles and macrovesicles (black arrows), and marked inflammatory infiltrate (white arrows). The bars indicate 100 μm at 100x magnification (left panel) and 20 μm at 400x magnification (right panel).

Discussion

Dyslipidemia was triggered in rats fed a diet with 20% lard and 1% cholesterol, in six weeks, with increased liver weight, liver injury, and inflammatory infiltrate.

In the present study, lipids contributed with 44% of high-fat diet energy, a percentage close to that reported for high-fat diet consumed by overweight or obese individuals (43% to 55%).17-19 In previous animal studies, lipid contribution ranged from 67% to 75% of high-fat diet energy.8,9 Therefore, these diets with very high contents of lipids do not reproduce, realistically, the high-fat diets consumed by humans. The daily recommendation for human adults is 20% to 35% energy from lipids, according to the AMDR (Acceptable Macronutrient Distribution Ranges), considering that high lipid intake indicates a greater risk of obesity and associated disorders.20

Higher body weight gain in the HLD group can be explained by its higher food consumption (17.6 g/day/rat) compared to the HL/HCD group (13.8 g/day/rat) since the energy density of the diets was similar (4.26 kcal/g). Higher weight gain was reported in a previous study with mice fed a high-fat and high-cholesterol diet (energy density = 4.27 kcal/g) for 12 weeks, compared to the control group.12

Despite the higher body weight gain, the HLD group did not differ from the STD group regarding liver weight (Table 2). The relative liver weight in the HL/HCD group was very high, above 5% of the body weight of these animals. The increased liver weight in the HL/HCD group is related to the strong presence of fat vesicles in hepatocytes, as observed in the liver morphological evaluation (Figure 1). A previous study with mice on a high-fat and high-cholesterol diet, without cholic acid, for 16 weeks presented similar results regarding liver weight and hepatic tissue lipid accumulation.11 In our study, the cholic acid probably accelerated the dyslipidemic effects of cholesterol in the HL/HCD group, given that we identified metabolic disorders in only 6 weeks, whereas the study by Jung et al.11 reached the same effects in 16 weeks. The serum lipid impairment observed in animals fed HL/HCD is characteristic of dyslipidemia, and the marked increase in LDL-c may be related to the reduction in LDL-c receptor activity in hepatocytes. Previous studies revealed changes in TC and TG serum levels of rats and mice fed a high-fat and high-cholesterol diet.10,12 However, the experimentation periods of the reported studies (9 and 12 weeks, respectively) were longer than that used in the present study.

The serum lipid profile of the animals fed HLD did not differ from those fed STD. Studies with Wistar rats on 50% to 55% lard diets (67% to 75% of the diet energy) for four weeks showed similar results.8,9 The harmful effect of very high intake of saturated fatty acids and its relation to dyslipidemia have been questioned.1 Siri et al.21 highlighted that the effects of saturated fat on serum lipid profile could be modulated by the content and/or availability of polyunsaturated fatty acids, so that saturated fat would only increase LDL-c if the polyunsaturated fat intake is below a threshold level (5% of the diet energy).22 Our results confirmed that the excessive intake of saturated fatty acids explains only part of the changes in serum lipid profile. Other factors influence these changes, such as dietary cholesterol, obesity, insulin resistance, and hypertriglyceridemia.23,24

High ALT and AST serum levels are characteristic of NAFLD and are associated with insulin resistance. In this study, increased ALT and AST serum levels were compatible with the hepatic damages observed in the animals fed HL/HCD. Other studies also found increased ALT and AST serum levels in mice fed a high-fat and high-cholesterol diet.11,12

The morphological evaluation showed marked changes in the hepatic tissue of animals fed HL/HCD, such as fatty macrovesicles and inflammatory infiltrates, characterizing a moderate hepatic steatosis,25 which was confirmed by the results of the hepatic enzymes (ALT and AST). Fat accumulation in the liver of these animals is related to high cholesterol consumption, as this overload in the cells alters the cholesterol homeostasis.26 In addition, the accumulation of intermediate lipid metabolites, such as diacylglycerol and acylcarnitines, is associated with inflammation and insulin resistance.27,28 A previous study suggested that high dietary cholesterol is a critical factor for the progression of hepatic steatosis and inflammation in animal models. However, features of NAFLD are more evident when the supplemented cholesterol is associated with cholic acid in a high-fat diet, as observed in our study.

The presence of inflammatory infiltrate in the hepatic tissue promotes cytokine and chemokine secretion, such as tumor necrosis factor a (TNF-a) and interleukin 6 (IL-6), which induce insulin resistance. In this metabolic disorder, the increased lipolysis of TG stored in the adipose tissue raises fatty acid production. The fatty acids released in the circulation, in turn, inhibit the anti-lipolytic action of insulin and promote higher lipid absorption by the liver, leading to dyslipidemia and hepatic steatosis.3,32,33 Hamsters on a 10-week hyperlipidemic diet containing cholesterol (0.2%) developed dyslipidemia and hepatic steatosis, with impaired TC, TG, LDL-c, ALT, and AST serum concentrations.34 Liver histopathological analysis of Sprague-Dawley rats fed a high-cholesterol diet (1.5%) also revealed hepatic steatosis and inflammation.35

One limitation of our study was the impossibility to use more accurate methods to evaluate liver fat macro- and microvesicles and foam cells, such as Oil Red and immunohistochemistry, respectively, which could allow us to analyze liver damages quantitatively. Moreover, we recommend further studies, including a treatment with lard and cholic acid, to investigate whether cholic acid can enhance the metabolic effects of lard cholesterol.

 Conclusion

A high-fat diet with lard (20%) and cholesterol (1%) triggered dyslipidemia with severe liver damage in rats in a shorter experimental time than the previously reported models. The high-lard diet without supplementation of cholesterol led to body weight gain, but not to dyslipidemia. This model may be useful to investigate metabolic disorders in different experimental designs related to dyslipidemia and its comorbidities.

Sources of Funding

This study was funded by FAPEG.

Study Association

This article is part of the project of Post-Doctoral of Lidiane B. Muniz, conducted at Universidade Federal de Goiás.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Animal Care and Use Ethics Committee of the Universidade Federal de Goiás under the protocol number 039/15.

 Acknowledgments

The authors thank the FAPEG (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás, Brazil) for the research funding and scholarship, and Professor Maria Aderuza Horst, Ph.D., for assistance with animal procedures.

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Beneficial effect of a weight-stable, low-fat/low-saturated fat/low-glycaemic index diet to reduce liver fat in older subjects. Br J Nutr. 2013;109(6):1096-104. Utzschneider KM Bayer-Carter JL Arbuckle MD Tidwell JM Richards TL Craft S Beneficial effect of a weight-stable, low-fat/low-saturated fat/low-glycaemic index diet to reduce liver fat in older subjects Br J Nutr 2013 109 6 1096 1104 20 Institute of Medicine. Dietary Reference Intakes for energy, carbohydrate, fiber, fat, fatty acids, cholesterol, protein, and amino acids, Washington, DC: The National Academies Press, 2005. Institute of Medicine Dietary Reference Intakes for energy, carbohydrate, fiber, fat, fatty acids, cholesterol, protein, and amino acids 2005 Washington, DC The National Academies Press 21 Zárate A, Manuel-Apolinar L, Saucedo R, Hernández-Valencia M, Basurto L. Hypercholesterolemia as a risk factor for cardiovascular disease: current controversial therapeutic management. Arch Med Res. 2016;47(7):491-5. Zárate A Manuel-Apolinar L Saucedo R Hernández-Valencia M Basurto L Hypercholesterolemia as a risk factor for cardiovascular disease: current controversial therapeutic management Arch Med Res 2016 47 7 491 495 22 Siri-Tarino PW, Sun Q, Hu FB, Krauss RM. Saturated fat, carbohydrate, and cardiovascular disease. Am J Clin Nutr. 2010;91(3):502-9. Siri-Tarino PW Sun Q Hu FB Krauss RM Saturated fat, carbohydrate, and cardiovascular disease Am J Clin Nutr 2010 91 3 502 509 23 Kuipers RS, Graaf DJ, Luxwolda MF, Muskiet MH, Dijck-Brouwer DA, Muskiet FA. Saturated fat, carbohydrates and cardiovascular disease. Neth J Med. 2011;69(9):372-8. Kuipers RS Graaf DJ Luxwolda MF Muskiet MH Dijck-Brouwer DA Muskiet FA Saturated fat, carbohydrates and cardiovascular disease Neth J Med 2011 69 9 372 378 24 Siri-Tarino PW, Sun Q, Hu FB, Krauss RM. Meta-analysis of prospective cohort studies evaluating the association of saturated fat with cardiovascular disease. Am J Clin Nutr. 2010;91(3):535-46. Siri-Tarino PW Sun Q Hu FB Krauss RM Meta-analysis of prospective cohort studies evaluating the association of saturated fat with cardiovascular disease Am J Clin Nutr 2010 91 3 535 546 25 Vetelainen R, van Vliet AK, van Gulik TM. Severe steatosis increases hepatocellular injury and impairs liver regeneration in a rat model of partial hepatectomy. Ann Surg. 2007;245(1):44-50. Vetelainen R van Vliet AK van Gulik TM Severe steatosis increases hepatocellular injury and impairs liver regeneration in a rat model of partial hepatectomy Ann Surg 2007 245 1 44 50 26 Musso G, Gambino R, Cassader M. Cholesterol metabolism and the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis. Prog Lipid Res. 2013;52(1):175-91. Musso G Gambino R Cassader M Cholesterol metabolism and the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis Prog Lipid Res 2013 52 1 175 191 27 Birkenfeld AL, Shulman GI. Nonalcoholic fatty liver disease, hepatic insulin resistance, and type 2 diabetes. Hepatology. 2014;59(2):713-23. 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Matsuzawa N Takamura T Kurita S Misu H Ota T Ando H Lipid-induced oxidative stress causes steatohepatitis in mice fed an atherogenic diet Hepatology 2007 46 5 1392 1403 31 Vergnes L, Phan J, Strauss M, Tafuri S, Reue K. Cholesterol and cholate components of an atherogenic diet induce distinct stages of hepatic inflammatory gene expression. J Biol Chem. 2003;278(44):42774-784. Vergnes L Phan J Strauss M Tafuri S Reue K Cholesterol and cholate components of an atherogenic diet induce distinct stages of hepatic inflammatory gene expression J Biol Chem 2003 278 44 42774 42784 32 Asrih M, Jornayvaz FR. Diets and nonalcoholic fatty liver disease: the good and the bad. Clin Nutr. 2014;33(2):186-190. Asrih M Jornayvaz FR Diets and nonalcoholic fatty liver disease: the good and the bad Clin Nutr 2014 33 2 186 190 33 Polyzos SA, Kountouras J, Mantzoros CS. Adipokines in nonalcoholic fatty liver disease. Metabolism. 2016;65(8):1062-79. Polyzos SA Kountouras J Mantzoros CS Adipokines in nonalcoholic fatty liver disease Metabolism 2016 65 8 1062 1079 34 Cui CX, Deng JN, Yan L, Liu YY, Fan JY, Um HN, et al. Silibinin capsules improves high fat diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in hamsters through modifying hepatic de novo lipogenesis and fatty acid oxidation. J Ethnopharmacol. 2017 Aug;208:24-35. Cui CX Deng JN Yan L Liu YY Fan JY Um HN Silibinin capsules improves high fat diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in hamsters through modifying hepatic de novo lipogenesis and fatty acid oxidation J Ethnopharmacol 2017 08 208 24 35 35 Hu X, Wang T, Liang S, Li W, Wu X, Jin F. Antibiotic-induced imbalances in gut microbiota aggravates cholesterol accumulation and liver injuries in rats fed a high-cholesterol diet. Appl Microbiol Biotechnol. 2015;99(21):9111-22. Hu X Wang T Liang S Li W Wu X Jin F Antibiotic-induced imbalances in gut microbiota aggravates cholesterol accumulation and liver injuries in rats fed a high-cholesterol diet Appl Microbiol Biotechnol 2015 99 21 9111 9122 Artigo Original Dieta Rica em Banha e Colesterol, mas não Dieta Rica em Banha, Leva a Distúrbios Metabólicos em um Modelo Modificado de Dislipidemia Muniz Lidiane B. Alves-Santos Aline M. Camargo Fabricio Martins Danieli Brolo 0000-0002-4733-007X Celes Mara Rubia N. 0000-0003-4332-6206 Naves Maria Margareth V. Universidade Federal de Goiás, Goiania, GO - Brasil Correspondência: Maria Margareth V. Naves, Universidade Federal de Goiás - Faculdade de Nutrição - Laboratório de Nutrição Experimental - Rua 227, quadra 68, Setor Leste Universitário, CEP 74605-080, Goiânia, GO - Brasil. E-mail: mmvnaves@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa e Obtenção de financiamento: Naves MMV; Obtenção de dados: Muniz LB, Alves-Santos AM, Camargo F, Martins DB, Celes MRN; Análise e interpretação dos dados, Análise estatística e Redação do manuscrito: Muniz LB, Alves-Santos AM; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual: Martins DB, Celes MRN, Naves MMV.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

Tendo em vista o aumento da prevalência global de doenças cardiovasculares e hepáticas, o conteúdo lipídico da dieta e sua relação com o acúmulo de gordura nos hepatócitos têm sido investigados como fatores-chave na prevenção dessas doenças.

 Objetivo:

Avaliar os efeitos metabólicos de uma dieta rica em banha suplementada com colesterol ou não, em um modelo modificado de dislipidemia.

 Métodos:

Foram divididos 24 ratos Wistar machos adultos em três grupos: dieta padrão (DP - 4% de lipídios), dieta rica em banha (DRB - 21% de banha) e dieta rica em banha e colesterol (DRB/RC - 20% de banha, 1% de colesterol e 0,1% de ácido cólico). Após seis semanas de tratamento, o sangue e o fígado foram coletados para análises bioquímicas (perfil lipídico sérico e enzimas hepáticas) e morfológicas. A análise estatística incluiu análise de variância unidirecional (ANOVA), seguida do teste de Tukey para comparações de médias. Uma probabilidade de 5% foi considerada estatisticamente significativa.

 Resultados:

Animais alimentados com DRB/RC apresentaram um aumento nos níveis séricos de colesterol total, triacilglicerol, LDL-c, não-HDL-c, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) em comparação com aqueles alimentados com DP. Além disso, os animais tratados com DRB/RC apresentaram um peso relativo do fígado maior, com esteatose hepática macrovesicular moderada e infiltrado inflamatório.

 Conclusão:

Uma dieta rica em gordura com banha (20%) e colesterol (1%) desencadeou dislipidemia com danos graves ao fígado em ratos em um tempo experimental menor do que os modelos previamente relatados. A dieta rica em banha sem suplementação de colesterol levou ao ganho de peso corporal, mas não à dislipidemia.

 Palavras-chave Gorduras da dieta Colesterol Metabolismo lipídico Fígado Gorduroso Inflamação Ratos Introdução

A prevalência mundial de doenças metabólicas e complicações de saúde associadas aumentou nas últimas décadas. Excesso de gordura corporal, resistência à insulina, doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) e dislipidemia levam a distúrbios metabólicos relacionados ao maior risco de desenvolver doenças cardiovasculares.1 A DHGNA varia desde um pequeno acúmulo de gordura no hepatócito até estágios mais graves de necrose inflamatória, com ou sem fibrose. Estudos indicam uma associação entre DHGNA e resistência à insulina, inflamação de hepatócitos e comprometimento do metabolismo lipídico,2,3 já que a maioria dos pacientes com DHGNA apresenta dislipidemia.4

A dislipidemia é caracterizada por níveis aumentados de triacilglicerol (TG) e colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-c), e diminuição do colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-c).5 Hipercolesterolemia (aumento isolado do LDL-c) e hipertrigliceridemia (aumento isolado do TG) são as formas mais comuns de dislipidemia.6 Em geral, o desequilíbrio do metabolismo lipídico resulta da interação entre fatores genéticos e ambientais, como hábitos alimentares, especialmente o consumo de lipídios. Portanto, o conteúdo lipídico da dieta tem sido investigado como um fator chave na prevenção de doenças cardiovasculares e hepáticas.7

Estudos experimentais com dietas hiperlipídicas usaram teores muito altos de gordura dietética (cerca de 50% da composição da dieta), em protocolos de curto período (quatro semanas), sem constatar um comprometimento lipídico sérico.8,9 Por outro lado, estudos testando concentrações lipídicas mais próximas do consumo humano têm sido realizados durante um período experimental relativamente longo, como em relatos anteriores com ratos (21% de gordura por 9 semanas)10 e com camundongos (15% a 20% de gordura durante 12 a 16 semanas).11,12

Nesse contexto, este estudo teve por objetivo avaliar os efeitos metabólicos de uma dieta rica em banha suplementada com colesterol ou não, num modelo modificado de dislipidemia, com tempo de experimentação e concentração lipídica da dieta menores em relação aos relatos anteriores.

 Métodos Animais, dietas e desenho experimental

O experimento foi conduzido com ratos Wistar machos adultos fornecidos pela Universidade de São Paulo (Ribeirão Preto, Brasil). Os ratos foram mantidos em gaiolas plásticas (2 animais/gaiola) por sete semanas (uma semana de aclimatação e seis semanas de ensaio), sob condições ambientais controladas (ciclo claro-escuro de 12 h e temperatura de 22 ± 2°C). No experimento, dividimos aleatoriamente 24 ratos em 3 grupos de 8 animais, de acordo com um delineamento de blocos casualizados, com base no peso corporal. O tamanho da amostra foi definido com base em estudos prévios sobre dislipidemia experimental. Cada grupo recebeu uma das seguintes dietas: dieta padrão (DP; RH19521, Rhoster, Brasil) preparada de acordo com AIN-93M,13 uma dieta rica em banha (DRB; RH195143, Rhoster, Brasil), e dieta rica em banha e colesterol (DRB/RC; RH195142, Rhoster, Brasil). Óleo de soja e banha foram utilizados como fontes lipídicas; colesterol, para induzir hipercolesterolemia; e ácido cólico, para aumentar o efeito hipercolesterolêmico do colesterol suplementado14 (Tabela 1). As dietas e água filtrada foram fornecidas ad libitum. A ingestão dietética e o peso corporal dos animais foram monitorados três vezes por semana.

Composição das dietas experimentais
Componente (g/100g de dieta) Dieta1
DP DRB DRB/RC
Caseína (82,93 g de proteína) 16,47 16,47 16,47
L-cistina 0,18 0,18 0,18
Óleo de soja 4,00 0,00 0,00
Banha2 0,00 21,00 20,00
Colesterol2 0,00 0,00 1,00
Ácido cólico2 0,00 0,00 0,10
Sacarose 10,00 10,00 10,00
Celulose 5,00 5,00 5,00
Mistura de minerais 3,50 3,50 3,50
Bitartrato de colina 0,25 0,25 0,25
Mistura de vitaminas 1,00 1,00 1,00
tert-Butilhidroquinona (TBHQ) 0,008 0,008 0,008
Amido de milho dextrinizado 15,50 15,50 15,50
Amido de milho 14,09 27,09 26,99
Lipídios (g/100g)3 4,1 ± 0,1 19,7 ± 1,4 20,8 ± 1,6
Energia dos lipídios4 36 189 189
Energia da dieta (kcal/g)4 3,41 4,26 4,26
(Energia dos lipídios x 100)/energia da dieta (%) 11 44 44

Reeves et al.13; DP: dieta padrão; DRB: dieta rica em banha; DRB/RC: dieta rica em banha e colesterol;

Fernandes et al.10;

Resultado da análise química da dieta;

Valor energético da dieta: 4, 4 e 9 kcal/g para proteína, carboidrato e lipídio, respectivamente.

Após seis semanas de experimentação, os animais foram eutanasiados (xilazina + cetamina /10 mg/kg + 100 mg/kg). Em seguida, coletamos amostras de sangue por punção abdominal (cerca de 5 mL) para análises bioquímicas (perfil lipídico sérico e enzimas hepáticas). Após a eutanásia por exsanguinação da aorta abdominal, extraímos, pesamos e preparamos o fígado dos animais para avaliação morfológica. Todos os procedimentos estavam de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório15 e foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Goiás (protocolo número 039/15).

 Análises bioquímicas

Amostras de sangue foram coletadas em tubos de heparina e centrifugadas a 4.000 rpm por 10 min para separar o soro, que foi imediatamente armazenado a -80°C para as análises de perfil lipídico e enzimas hepáticas. Os níveis de colesterol total (CT), TG, LDL-c, HDL-c, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) foram determinados por kits comercialmente disponíveis (Labtest Diagnóstica SA, Lagoa Santa, Brasil). O colesterol da lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL-c) foi estimado pela equação de Friedewald. A fração não-HDL-c foi obtida pela diferença entre os níveis de CT e HDL-c. A importância da fração não-HDL-c tem sido destacada na predição do risco de doença cardiovascular. Boekholdt et al.16 revelaram que as concentrações de não-HDL-c tiveram uma associação direta mais forte com o risco de DCV que o LDL-c e a apolipoproteína B (Apo B).

 Avaliação morfológica do fígado

Os lóbulos do fígado foram lavados em solução fisiológica gelada a 0,9% e fixados por imersão em formalina a 10% tamponada com fosfato por 24 h. Posteriormente, os lobos foram cortados em fragmentos de 4 a 5 mm de espessura, desidratados em concentrações crescentes de álcool (80%, 95% e 100%), clarificados em xilol (3 banhos de 30 min cada) e embebidos em parafina. Secções seriadas de 5 µm de espessura foram obtidas e coradas com hematoxilina e eosina (HE). Usamos as secções coradas com HE para analisar as alterações no arranjo do parênquima hepático e a presença de infiltrados inflamatórios com um Leica Las V4 Software (Leica Imaging Systems Ltd., Cambridge, Reino Unido), um microscópio Leica DM2000 (Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Wetzlar, Suíça), uma câmera de vídeo Leica DC230 (Leica Microsystems AG, Heerbrugg, Suíça) e um computador com internet. Vinte campos de parênquima hepático de cada animal foram selecionados aleatoriamente e analisados, com aumentos de 100x e 400x.

 Análise estatística

Dados foram expressos em média ± desvio padrão. A literatura considera o peso corporal e parâmetros bioquímicos obtidos em modelos animais como dados paramétricos.8-12 Assim, determinamos a significância estatística usando a análise de variância unidirecional (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey para comparações das médias (p < 0,05). O software STATISTICA, versão 7.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA) foi utilizado para análises estatísticas.

 Resultados

A banha utilizada na formulação das dietas continha 39 g/100 g de gordura saturada e 72 mg/100 g de colesterol. Nas dietas ricas em gordura (DRB e DRB/RC), a banha contribuiu com aproximadamente 15 mg de colesterol/100 g de dieta, além do colesterol adicionado à DRB/RC. Quarenta e quatro por cento (44%) da energia da DRB e DRB/RC derivaram de lipídios, um valor quatro vezes maior que o da DP (11%).

O peso corporal inicial dos animais não diferiu entre os grupos, o que garantiu a homogeneidade das repetições do grupo. Os animais alimentados com DRB apresentaram maior ganho de peso corporal do que os do grupo DP. O peso do fígado e o peso relativo do fígado dos animais alimentados com DRB/RC foram maiores (p < 0,05) que os dos demais grupos (Tabela 2).

Peso corporal e do fígado e parâmetros bioquímicos de ratos Wistar após seis semanas de tratamento com dietas padrão e hiperlipídicas
Parâmetro Dieta
DP DRB DRB/RC
Peso corporal (g)
Inicial 249,05 ± 21,44a 243,85 ± 15,09a 242,35 ± 16,78a
Final 499,58 ± 65,32a 564,08 ± 39,73a 508,58 ± 47,68a
Ganho 250,53 ± 48,40b 320,23 ± 44,50a 266,23 ± 38,21a, b
Fígado
Peso (g) 14,90 ± 2,33b 15,92 ± 1,65b 27,10 ± 5,94a
Peso relativo (g/100g de peso corporal) 2,98 ± 0,24b 2,82 ± 0,14b 5,28 ± 0,80a
Perfil lipídico sérico (mg/dL)
CT 59,83 ± 15,99b 64,58 ± 14,13b 87,75 ± 8,54a
LDL-c 4,23 ± 0,71b 6,98 ± 2,09b 23,63 ± 4,55a
HDL-c 30,74 ± 4,11a 34,42 ± 7,77a 26,74 ± 4,23a
não-HDL-c 29,09 ± 12,13b 30,17 ± 10,84b 61,01 ± 6,95a
VLDL-c 10,68 ± 1,58b 16,77 ± 4,58a, b 18,52 ± 7,51a
TG 53,42 ± 7,91b 83,83 ± 22,90a, b 92,58 ± 37,55a
Enzimas hepáticas (U/L)
ALT 48,72 ± 15,91b 28,16 ± 6,00b 210,30 ± 137,78a
AST 154,67 ± 22,42b 117,00 ± 29,84b 300,63 ± 60,26a

Os dados são expressos como média ± desvio padrão. a, bValores na mesma linha com letras sobrescritos diferentes são significativamente diferentes (teste de Tukey, p < 0,05). DP: dieta padrão; DRB: dieta rica em banha; DRB/RC: dieta rica em banha e colesterol; Peso relativo do fígado = (peso do fígado / peso corporal) x 100; CT: colesterol total; LDL-c: colesterol de lipoproteína de baixa densidade; HDL-c: colesterol de lipoproteína de alta densidade; VLDL-c: colesterol de lipoproteína de densidade muito baixa; TG: triacilglicerol; não-HDL-c: colesterol da lipoproteína de alta densidade; ALT: alanina aminotransferase; AST: aspartato aminotransferase.

Animais alimentados com DRB/RC apresentaram maiores níveis séricos de CT, TG, LDL-c, VLDL-c, não-HDL-c, ALT e AST do que aqueles tratados com DP e com DRB. O perfil lipídico sérico e as enzimas hepáticas de animais alimentados com a DRB não foram diferentes daqueles do grupo DP (Tabela 2).

Alterações microscópicas foram encontradas no fígado dos animais alimentados com DRB/RC (Figura 1), pois a arquitetura do tecido hepático não estava preservada, com balonamento dos hepatócitos (caracterizado por inchaço e/ou vacuolização), alterações nos capilares sanguíneos sinusoidais e hiperemia passiva (capilares e veias ingurgitadas com sangue). Além disso, ratos alimentados com DRB/RC apresentaram esteatose hepática macrovesicular moderada, associada a uma infiltração acentuada por células linfomononucleares. Por outro lado, animais alimentados com DRB tiveram sua arquitetura de tecido hepático preservada, com hepatócitos de aspecto morfológico normal, e distribuição vascular, veia centrolobular e tríade portal preservadas. Ainda o grupo tratado com DRB mostrou esteatose hepática microvesicular leve, associada a menor infiltração por células linfomononucleares. A arquitetura do tecido hepático do grupo tratado com DP foi mantida com hepatócitos típicos, sinusóides hepáticos preservados e cadeias capilares; distribuição vascular conservada, tríades portais intactas, com ramos da veia porta, artéria hepática e ducto biliar.

Avaliação morfológica do fígado de ratos Wistar alimentados com dietas hiperlipídicas por seis semanas. DP (dieta padrão): arquitetura preservada do tecido hepático com distribuição vascular conservada. DRB (dieta rica em banha): arquitetura de tecido hepático preservada com esteatose hepática leve e uniforme (setas pretas), infiltrado inflamatório leve (setas brancas) e hiperemia passiva leve (cabeças de setas). DRB/RC (dieta rica em banha e colesterol): arquitetura tecidual alterada com esteatose hepática moderada, microvesículas e macrovesículas de gordura (setas pretas) e infiltrado inflamatório acentuado (setas brancas). As barras indicam 100 μm a uma ampliação de 100x (painel esquerdo) e 20 μm a uma ampliação de 400x (painel direito).

Discussão

A dislipidemia foi desencadeada em ratos alimentados com uma dieta com 20% de banha e 1% de colesterol, em seis semanas, com aumento do peso do fígado, lesão hepática e infiltrado inflamatório.

No presente estudo, os lipídios contribuíram com 44% da energia da dieta rica em gordura, um percentual próximo ao relatado para dieta hiperlipídica consumida por indivíduos com sobrepeso ou obesos (43% a 55%).17-19 Em estudos prévios com animais, a contribuição lipídica variou de 67% a 75% da energia da dieta rica em gordura.8,9 Portanto, estas dietas com alto teor de lipídios não reproduzem, realisticamente, as dietas ricas em gordura consumidas pelos seres humanos. A recomendação diária para adultos humanos é de 20% a 35% de energia a partir de lipídeos, de acordo com o AMDR (Acceptable Macronutrient Distribution Ranges), considerando que a alta ingestão lipídica indica um maior risco de obesidade e distúrbios associados.20

O maior ganho de peso corporal no grupo DRB pode ser explicado pelo maior consumo de dieta (17,6 g/dia/rato) em relação ao grupo DRB/RC (13,8 g/dia/rato), pois a densidade energética das dietas foi semelhante (4,26 kcal/g). Um maior ganho de peso foi relatado em estudo anterior com ratos alimentados com uma dieta rica em gordura e colesterol (densidade energética = 4,27 kcal/g) por 12 semanas, em comparação ao grupo controle.12

Apesar do maior ganho de peso corporal, o grupo DRB não diferiu do grupo DP em relação ao peso do fígado (Tabela 2). O peso relativo do fígado no grupo DRB/RC foi muito elevado, representando mais de 5% do peso corporal destes animais. O aumento do peso do fígado no grupo DRB/RC está relacionado à forte presença de vesículas de gordura nos hepatócitos, como observado na avaliação morfológica do fígado (Figura 1). Um estudo anterior com ratos em uma dieta rica em gordura e colesterol, sem ácido cólico, por 16 semanas apresentou resultados semelhantes em relação ao peso do fígado e acúmulo de lipídios no tecido hepático.11 Em nosso estudo, o ácido cólico provavelmente acelerou os efeitos dislipidêmicos do colesterol no grupo DRB/RC, uma vez que identificamos distúrbios metabólicos em apenas 6 semanas, enquanto o estudo de Jung et al.11 alcançou os mesmos efeitos em 16 semanas. O comprometimento lipídico sérico observado em animais alimentados com DRB/RC é característico de dislipidemia, e o aumento acentuado do LDL-c pode estar relacionado à redução na atividade do receptor de LDL-c nos hepatócitos. Estudos prévios revelaram mudanças nos níveis séricos de CT e TG de ratos e camundongos alimentados com dieta em gordura e rica em colesterol.10,12 No entanto, os períodos de experimentação dos estudos relatados (9 e 12 semanas, respectivamente) foram maiores do que o usado no presente estudo.

O perfil lipídico sérico dos animais alimentados com DRB não diferiu daqueles alimentados com DP. Estudos com ratos Wistar tratados com dietas contendo 50% a 55% de banha (67% a 75% da energia da dieta) por quatro semanas mostraram resultados semelhantes.8,9 O efeito deletério do consumo muito alto de ácidos graxos saturados e sua relação com a dislipidemia têm sido questionados.1 Siri et al.21 destacaram que os efeitos da gordura saturada no perfil lipídico sérico poderiam ser modulados pelo conteúdo e/ou disponibilidade de ácidos graxos polinsaturados, de modo que a gordura saturada aumentaria apenas o LDL-c se a ingestão de gordura polinsaturada estivesse abaixo de um nível limiar (5% da energia da dieta).22 Nossos resultados confirmaram que a ingestão excessiva de ácidos graxos saturados explica apenas parte das alterações no perfil lipídico sérico. Outros fatores influenciam essas alterações, como colesterol na dieta, obesidade, resistência à insulina e hipertrigliceridemia.23,24

Altos níveis séricos de ALT e AST são característicos da DHGNA e estão associados à resistência à insulina. Neste estudo, os níveis séricos aumentados de ALT e AST foram compatíveis com os danos hepáticos observados nos animais alimentados com a DRB/RC. Outros estudos também encontraram aumento dos níveis séricos de ALT e AST em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura e colesterol.11,12

A avaliação morfológica mostrou alterações marcantes no tecido hepático de animais alimentados com DRB/RC, como macrovesículas gordurosas e infiltrados inflamatórios, caracterizando uma esteatose hepática moderada,25 que foi confirmada pelos resultados das enzimas hepáticas (ALT e AST). O acúmulo de gordura no fígado desses animais está relacionado ao alto consumo de colesterol, pois essa sobrecarga nas células altera a homeostase do colesterol.26 Além disso, o acúmulo de metabólitos lipídicos intermediários, como diacilglicerol e acilcarnitinas, está associado à inflamação e resistência à insulina.27,28 Um estudo anterior sugeriu que o colesterol elevado na dieta é um fator crítico para a progressão da esteatose hepática e da inflamação em modelos animais. No entanto, características da DHGNA são mais evidentes quando o colesterol suplementado é associado ao ácido cólico em uma dieta rica em gordura, como observado em nosso estudo.

A presença de infiltrado inflamatório no tecido hepático promove a secreção de citocinas e quimiocinas, como o fator de necrose tumoral a (TNF-a) e a interleucina 6 (IL-6), que induzem a resistência à insulina. Neste distúrbio metabólico, a lipólise aumentada de TG armazenada no tecido adiposo eleva a produção de ácidos graxos. Os ácidos graxos liberados na circulação, por sua vez, inibem a ação anti-lipolítica da insulina e promovem maior absorção lipídica pelo fígado, levando à dislipidemia e à esteatose hepática.3,32,33 Hamsters alimentados com dieta hiperlipidêmica contendo colesterol (0,2%), por 10 semanas, desenvolveram dislipidemia e esteatose hepática, com concentrações séricas aumentadas de CT, TG, LDL-c, ALT e AST.34 Análise histopatológica do fígado de ratos Sprague-Dawley alimentados com dieta rica em colesterol (1,5%) também revelou esteatose hepática e inflamação.35

Uma limitação do nosso estudo foi a impossibilidade de usar métodos mais precisos para avaliar macro- e micro-vesículas de gordura hepática e células espumosas, como Oil Red e imuno-histoquímica, respectivamente, o que poderia nos permitir analisar quantitativamente os danos hepáticos. Além disso, recomendamos estudos adicionais, incluindo um tratamento com banha e ácido cólico, para investigar se o ácido cólico pode aumentar os efeitos metabólicos do colesterol presente na banha.

 Conclusão

Uma dieta rica em gordura com banha (20%) e colesterol (1%) desencadeou dislipidemia com danos graves ao fígado de ratos, em um tempo experimental menor do que os modelos previamente relatados. A dieta rica em banha sem suplementação de colesterol levou ao ganho de peso corporal, mas não à dislipidemia. Este modelo pode ser útil para investigar distúrbios metabólicos em diferentes delineamentos experimentais relacionados à dislipidemia e suas comorbidades.

Fontes de financiamento O presente estudo foi financiado pela FAPEG

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte do projeto de Pós-doutorado de Lidiane B. Muniz, realizado na Universidade Federal de Goiás.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais, da Universidade Federal de Goiás, sob o número de protocolo 039/15.

 Agradecimentos

Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG) pelo financiamento da pesquisa e concessão de bolsa de estudo, e à professora Maria Aderuza Horst, Ph.D., pela assistência nos procedimentos com animais.