Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC zktzdJHqgygNhbmDcCGc8Fc S0066-782X2019000900401 10.5935/abc.20190189 Original Article Acute Physical Stress Preconditions the Heart Against Ischemia/Reperfusion Injury Through Activation of Sympathetic Nervous System 0000-0001-7852-8786 Imani Alireza 1 2 Parsa Hoda 1 * Chookalaei Leila Gholami 1 * Rakhshan Kamran 3 Golnazari Masoomeh 4 Faghihi Mahdieh 1 Tehran University of Medical Sciences School of Medicine Department of physiology Tehran Iran Department of physiology - School of Medicine - Tehran University of Medical Sciences, Tehran - Iran Tehran University of Medical Sciences Baharloo Hospital Occupational Sleep Research Center Tehran Iran Occupational Sleep Research Center - Baharloo Hospital - Tehran University of Medical Sciences, Tehran - Iran Iran University of Medical Sciences School of Medicine Department of physiology Tehran Iran Department of physiology - School of Medicine - Iran University of Medical Sciences, Tehran - Iran Hamedan Branch of Islamic Azad University Basic Sciences faculty Biology Department Hamedan Iran Biology Department - Basic Sciences faculty - Hamedan Branch of Islamic Azad University, Hamedan - Iran Mailing Address: Alireza Imani, Department of Physiology - School of Medicine - Tehran University of Medical Sciences, Tehran - Iran. E-mail:aimani@tums.ac.ir

Author contributions

Conception and design of the research: Imani A, Faghihi M; Acquisition of data: Rakhshan K, Golnazari M; Analysis and interpretation of the data: Imani A, Parsa H, Chookalaei LG, Faghihi M; Statistical analysis and Writing of the manuscript: Imani A, Parsa H, Chookalaei LG; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Imani A.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 10 10 2019 09 2019 113 3 401 408 26 08 2018 18 11 2018 16 10 2018 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Stress is defined as a complicated state that related to homeostasis disturbances, over-activity of the sympathetic nervous system and hypothalamus-pituitary-adrenal axis responses. Cardiac preconditioning reduces myocardial damages.

 Objective:

This study was designed to assess the cardioprotective effects of acute physical stress against ischemia/reperfusion (I/R) injury through the activation of the sympathetic nervous system.

 Methods:

Thirty-two male Wistar rats were divided into four groups; (1) IR (n = 8): rats underwent I/R, (2) Acute stress (St+IR) (n = 8): physical stress induced 1-hour before I/R, (3) Sympathectomy (Symp+IR) (n = 8): chemical sympathectomy was done 24-hours before I/R and (4) Sympathectomy- physical stress (Symp+St+IR) (n = 8): chemical sympathectomy induced before physical stress and I/R. Chemical sympathectomy was performed using 6-hydroxydopamine (100 mg/kg, sc). Then, the hearts isolated and located in the Langendorff apparatus to induce 30 minutes ischemia followed by 120 minutes reperfusion. The coronary flows, hemodynamic parameters, infarct size, corticosterone level in serum were investigated. P < 0.05 demonstrated significance.

 Results:

Physical stress prior to I/R could improve left ventricular developed pressure (LVDP) and rate product pressure (RPP) of the heart respectively, (63 ± 2 versus 42 ± 1.2, p < 0.05, 70 ± 2 versus 43 ± 2.6, p < 0.05) and reduces infarct size (22.16 ± 1.3 versus 32 ± 1.4, p < 0.05) when compared with the I/R alone. Chemical sympathectomy before physical stress eliminated the protective effect of physical stress on I/R-induced cardiac damages (RPP: 21 ± 6.6 versus 63 ± 2, p < 0.01) (LVDP: 38 ± 4.5 versus 43 ± 2.6, p < 0.01) (infarct size: 35 ± 3.1 versus 22.16 ± 1.3, p < 0.01).

 Conclusion:

Findings indicate that acute physical stress can act as a preconditional stimulator and probably, the presence of sympathetic nervous system is necessary.

 Keywords: Stress, Mechanical Sympathetic Nervous System Hypothalamo-Hypophyseal System Ischemia Sympathectomy Introduction

Ischemic heart disease is the major health problem in the world.1 Although reperfusion, which refers to the rapid reestablishment of blood flow, can be one of the most effective methods against lethal injuries,2 it is associated with additional myocardial damage.3 Many methods have been proposed to diminish the deleterious effect of ischemia/reperfusion (I/R) injuries and increase cardiac endurance. Based on these advances, induction the short-term episodes of I/R or using the pharmacological agents earlier than prolonged I/R period induces cardiac preconditioning which can successfully attenuate cellular necrosis and conserve high levels of energy.4,5

Sympathetic nervous system and hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis are two coordinated defence systems. They can mediate two-way brain-body communication during stressful situations.6 Autonomic system activation contributes to behavioral responses in animals and enables them to regulate homeostasis and improve endurance.7 Stress is characterized as a general HPA axis response against potential and deleterious stimuli.8 In fact, stress through increasing the activity of HPA axis and corticosterone release plays a critical role in coordinating of neuroendocrine, autonomic and behavioral functions and leads to adaptive responses.9,10 The activity of the sympathetic nervous system increases and neurotransmitter secretion alters during the occurrence of stress.11 Several body systems such as nervous, cardiovascular and immune systems are influenced by stress. Moreover, significant changes in hemodynamic parameters such as; heart rate (HR) and blood pressure are observed during stress which ultimately may lead to heart diseases.12 On the other hand, the release of norepinephrine from the sympathetic nervous system is increased during lethal ischemia and it has a role for inducing of I/R injuries through the generation of hydroxyl free radicals. This current study was designed to evaluate the role of the sympathetic nervous system in mediating acute stress-induced cardioprotection against I/R injury in isolated rat heart.

 Methods

A total of 32 male Wistar rats (200-250g) were kept in an air-conditioned room on a 12 hours light-dark cycle, at 22 ± 2˚C, with free access to water and food. The experimental protocols followed in this study conformed to the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals published by the National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, revised 1996) and were further approved by the institutional ethical committee of Tehran University of Medical Sciences (Tehran, Iran).

Stress box apparatus was used for physical stress exposure. It contained stainless bars at the bottom, connected to electroshock device using a connecting cable. Physical stress was induced using electrical foot shock (1mA) for 10 seconds with 50 seconds intervals for one hour. After that, animals were anaesthetized with sodium thiopental (60 mg/kg, i.p),13 put on a surgical board. The chest was opened and the surgical silk suture (6-0) placed under the root of the left anterior descending coronary artery (LAD). Finally, the heart was removed from the chest and connected to Langendorff-perfusion apparatus. Heart was perfused in a retrograde manner using Krebs-Henseleit bicarbonate buffer (in mmol/l): sodium bicarbonate = 25, sodium chloride = 118.5, potassium chloride = 4.7, magnesium sulfate = 1.2, glucose = 11, gassed with 95% O2 and 5% CO2 (pH = 7.3-7.4 at 37˚C). Thereafter, the ends of the suture were passed through a plastic tube to create a snare for ischemia induction. Reperfusion was performed by releasing the snare. Latex fluid- filled balloon was inserted inside the left ventricle and connected to a pressure transducer (Harvard, March-Hugsteten, Germany), the biolab apparatus was used for recording the ventricular pressures. During the surgical procedure, recording was done during three designated periods: 20-30 minutes of the baseline (a period without any manipulation), 30 minutes of the local ischemia and 120 minutes of the reperfusion. After reperfusion, LAD was occluded again; Evans Blue dye (3 mL of 1.5% solution) was administrated to discriminate ischemic zone (the area at risk; [AAR]) from non-ischemic zone.14 After freezing (−20°C for 24 hours), heart tissue was sliced into 2mm transverse sections and kept in 1% 2, 3, 5 triphenyltetrazolium chloride (TTC in 0.1 M phosphate buffer, pH = 7.4 Sigma) solution for 15-20 min at 37°C to delineate ischemic from infarct zone.15 At the end of the experiments, the ratio of AAR and infarcted size (IS) were calculated by the Photoshop program.

Animals were allotted in 4 groups:

IR group (n = 8): Rats were kept in stress box device (without stress exposure) for 1 hour and then, hearts were removed from the chest and subjected to ischemia and reperfusion.

Acute stress (St+IR) group (n=8): Rats were exposed electrical feet shock in the stress box for 1 hour and then, hearts were removed from the chest and subjected to ischemia and reperfusion.

Sympathectomy (Symp+IR) group (n = 8): chemical sympathectomy was done by injection of a 6-hydroxydopamine (6-OHDA, 100 mg/kg, sc) 24 hours prior to I/R induction.(16)

Sympathectomy- physical stress (Symp+St+IR) group (n = 8): chemical sympathectomy was done 24 hours prior to physical stress and I/R induction.

We measured serum corticoesterone levels by ELISA method. Moreover, systolic blood pressure was measured via non-invasive technique (Tail Cuff and power lab) to confirm chemical sympathectomy (n = 4).

Statistical analysis

The sample size and group divisions were defined based on our previous studies.17 All data are reported as means ± S.E.M. Normality was checked using Kolmogorov-Smirnov test, SPSS software version 20. One way ANOVA and Tukey post hoc test was done for comparison of parameters between different groups. Analysis of changes in mean values over three times was done using repeated measurement ANOVA within each group. Sample t-test was used to compare systolic blood pressure before and after sympathectomy. Significant changes were considered as p < 0.05.

 Results Effect of acute physical stress on coronary flow and heart rate

Figure 1 shows coronary flow (CF) at the end of the baseline, ischemia and reperfusion periods. There are significant differences for CF at the end of ischemia and reperfusion when compared to the end of the baseline period within groups (p < 0.01). HR was significantly decreased at the end of both ischemia and reperfusion in comparison with the end of baseline period within groups (p < 0.01), but no significant change were observed between different groups (Figure 2).

Coronary flow (CF) at the end of baseline, ischemia and reperfusion periods. IR: Ischemia/reperfusion; St: Physical stress; Symp: Symapathectomy. ** p < 0.01 vs baseline phase within the same group.

Heart rate (HR) at the end of baseline, ischemia and reperfusion periods. IR: Ischemia/reperfusion; St: Physical stress; Symp: Symapathectomy. ** p < 0.01 vs. baseline phase within the same group.

Effect of acute physical stress on cardiac hemodynamic parameters

The left ventricular developed pressure (LVDP, the difference between intraventricular systolic and diastolic pressures), rate product pressure (RPP, LVDP multiplied by HR) and were diminished at the end of reperfusion in comparison to the end of baseline period among groups,

The amount of RPP and LVDP in acute stress group were extremely increased in comparison to IR group (p < 0.05 in induction of chemical sympathectomy before physical stress were considerably decreased RPP and LVDP in comparison to physical stress group p < 0.05, but there is no marked difference between sympathectomy group when compared to IR group (Figure 3).

Left Ventricular Developed Pressure (LVDP) and rate product pressure (RPP) at the end of reperfusion period. IR: Ischemia/reperfusion; St: Physical stress; Symp: Symapathectomy. * p < 0.05 compared to IR, && p < 0.01 compared to St + IR.

Effect of acute physical stress on infarcts size (%IS/AAR)

Figures 4 shows the size of the infarct (%IS/AAR) in different groups.

The percentage of infracts size (IS/AAR %). IR: Ischemia/reperfusion; St: Physical stress; Symp: Symapathectomy. * p < 0.05 compared to IR, && p < 0.01 compared to St+IR.

Infarct size was greatly deacreased in acute stress group as compared to the IR group (p < 0.05), but there was no considerable change in chemical sympathectomy group as compared to the control group. Chemical sympathectomy prior to acute physical stress represented no extermly change as compared to IR group, while it has been shown significant reduced infarct size as compared with acute physical stress alone (p < 0.01).

 Effect of acute physical stress on corticosterone level in serum

Figure 5 shows the serum level of corticosterone in different groups. Induction of acute physical stress without or with chemical sympathectomy in St and St+Symp+IR groups could increase the amount of serum corticosterone as compared to the IR group, (p < 0.01).

Corticosterone level in serum. IR: Ischemia/reperfusion; St: Physical stress; Symp: Symapathectomy. ** p<0.01 compared to IR.

Effect of chemical sympathectomy on Systolic blood pressure

Figure 6 represents the significant reduction of systolic blood pressure after induction of chemical sympathectomy (p < 0.05).

Systolic blood pressure before and after chemical sympathectomy. *p < 0.05 compared to before sympathectomy.

Discussion

Nowadays daily life is associated with stress that is divided to acute stress and chronic stress, based on exposure duration.18 Acute stress mediates several neurogenic pathways.19 Electrophysiological recordings revealed that acute stress manifests good effects such as favour heightened arousal and increases cognitive flexibility in an attentional set-shifting task.20 In the other view, stress is divided into physical and psychological. A physical stressor such as surgery, trauma and heavy physical activity can trigger many cardiac events.21 Psychological stress can affect the cardiovascular system through metabolic, inflammatory and hormonal factors.22,23 In this study, we evaluated the effects of acute physical stress prior to sympathectomy on ischemia-reperfusion injuries in isolated rat heart.

The effects of stress

Our results showed that induction of acute stress prior to ischemia-reperfusion period led to a decrease in the infarct size, improve hemodynamic parameter and increase in the plasma corticosterone level as compared to IR group and Symp+IR group. Two paradoxical theories have been proposed to explain both advantage and disadvantage effect of stress on the heart. Extremely elevated HR, cardiac contractility and peripheral resistant due to exposure to acute stress can increase the cardiac load and oxygen consumption. In contrast, emerging evidences indicate the opposite effect, for example; cold restraint stress induces cardiac cell protection24 and it can diminish infarct size as a main parameter of cardiac damage.25

In this regard, Abe et al. demonstrated that acute stress attenuates ischemia-reperfusion injury in the kidney through the activation of sympathetic and anti-inflammatory pathway.26

Moreover, exposure to intermediate stress involves in cell protection against subsequent lethal ischemia, as a concept, preconditioning phenomenon.27,28 It seems that acute physical stress exposure as a preconditioning agent protects the heart against I/R. We observed an increase in RPP and LVDP amounts due to acute stress induction in St+IR group as compared with IR group that indicates acute stress would trigger mechanisms to prepare the body for suitable responses to stimuli because the improvement of the cardiac function is important. Therefore, it seems that the effectiveness of stress induction is associated with; 1. nature of the stressor, 2. stress episode duration, 3. intensity of the stimulus and 4. stress predictability or unpredictability. In fact, each of the above factors effects on the neural and hormonal responses to stress. Our results showed that corticosterone is elevated after stress induction, and in Symp+St+IR group is higher than the IR group. It is well established that stress enhances the activity of the HPA axis which results to increase corticosterone secretion22,29 that can be protective as it prepares the organism to deal with challenges. Based on our results sympathectomy did not effect on stress-induced elevated corticosterone possibly because stress affects HPA axis through different mechanisms such as changes in metabolic and inflammatory factors in addition to increased sympathetic nervous system.22 Furthermore, this hormone induces changes in immune cells redistribution that enhance immune function.30 We showed that infarct size is decreased in St+IR group in comparison to the IR group and the hemodynamic parameters are improved in St+IR group in compare to the IR group. Diminished infarct size led to reducing in cardiac arrhythmia occurrence31,32 and also improved cardiac contractility.33 It seems the beneficial effects of acute stress induction may relate to the improvement of immune system function due to elevated corticosterone level encounter inflammatory factors, which trigger I/R injuries.

 The effects of sympathectomy

It has been established that exposure to stressful conditions increase autonomic nervous system activity.30 The cardioprotection of sympathetic activity has been investigated34 and we used chemical sympathectomy after acute stress induction to confirm the protective effects of the sympathetic nervous system. Animals in Symp+IR group were subjected to chemical sympathectomy before induction of I/R and there was no significant change in infarct size in comparison to IR group, indicating that chemical sympathetic denervation has no effect on IR injury. In addition, chemical sympathectomy prior to physical acute stress removed the cardioprotection effect of acute stress on infarct size in Symp+St+IR group that emphasizes the presence of sympathetic system is necessary for cardioprotective effects of acute stress. We found that acute stress induction after chemical sympathectomy could overcome harm effects of deleted sympathetic system on hemodynamic parameters in Symp+St+IR group when compared to Symp+IR group that indicates the essential role of sympathetic system physiological activity in regulating HR, pressure and flow.35 Hara and Abiko declared norepinephrine has two opposite effects on ischemia damages according to the duration of ischemia, means that it could protect the heart with short ischemia and increase the injuries with prolonged ischemia.28 Positive and negative properties of the sympathetic nervous system are associated with the duration of stimulus exposure. At the long term ischemia, large quantities of norepinephrine are released from the sympathetic nervous system, acting as a source of the free radical and subsequent generation of OH free radical.36 Protective effect of norepinephrine can be emerged by producing energy for cardiac muscle in short term ischemia episode.37 Moreover, Yohimbine (as an alpha2 receptor antagonist) administration reduced the incidence of arrhythmia through increasing sympathetic norepinephrine release.37,38 According to our previous studies, pretreatment with alpha receptor agonist such as phenylephrine could protect the cardiomyocytes against I/R damages in isolated HR.39 Activation of protein kinase-C (PKC) signalling pathway40 and NO release41 by norepinephrine, are involved in the opening of mitochondrial KATP channels, which in turn can reduce mitochondrial calcium load42 and will lead to attenuation of norepinephrine beneficial effects. Also, we showed that systolic blood pressure declined after chemical sympathectomy that is compatible with this fact that muscle sympathetic outflow is responsible for the regulation of blood pressure.43 The limitations of this study were the method of induction physical stress does not commonly occur in daily life. Unfortunately, the data of corticosterone level in Symp+IR group were missed so we can’t discuss the effect of sympathectomy on corticosterone level and comparison between St+IR group and Symp+St+IR group is not significant. In consistence with our results, Lowrance et al. showed that stress-induced corticosterone level didn’t change following pharmacological sympathectomy.44

Conclusion

The present study showed that induction of physical acute stress before I/R led to cardioprotection and chemical sympathectomy removed this beneficial effect of physical acute stress.

Contributed equally to this work.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Alireza Imani, from Tehran University of Medical Sciences.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Tehran University of Medical Sciences under the protocol number 30486. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013.

 Acknowledgements

This study was supported by Tehran University of medical sciences.

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Kario K McEwen BS Pickering TG Disasters and the heart: a review of the effects of earthquake-induced stress on cardiovascular disease Hypertens Res 2003 26 5 355 367 34 Abdul-Ghani S, Fleishman AN, Khaliulin I, Meloni M, Angelini GD, Suleiman M. Remote ischemic preconditioning triggers changes in autonomic nervous system activity: implications for cardioprotection. Physiol Rep. 2017;5(3):pii13085. Abdul-Ghani S Fleishman AN Khaliulin I Meloni M Angelini GD Suleiman M Remote ischemic preconditioning triggers changes in autonomic nervous system activity: implications for cardioprotection Physiol Rep 2017 5 3 13085 35 Tobaldini E, Costantino G, Solbiati M, Cogliati C, Kara T, Nobili L, et al. Sleep, sleep deprivation, autonomic nervous system and cardiovascular diseases. Neurosci Biobehav Rev. 2017;74(Pt B):321-9. Tobaldini E Costantino G Solbiati M Cogliati C Kara T Nobili L Sleep, sleep deprivation, autonomic nervous system and cardiovascular diseases Neurosci Biobehav Rev 2017 74 Pt B 321 329 36 Chrousos GP. Stress and disorders of the stress system. Nat Rev Endocrinol. 2009;5(7):374-81. Chrousos GP Stress and disorders of the stress system Nat Rev Endocrinol 2009 5 7 374 381 37 Heyndrickx GR, Vilaine JP, Moerman EJ, Leusen I. Role of prejunctional alpha 2-adrenergic receptors in the regulation of myocardial performance during exercise in conscious dogs. Circ Res. 1984;54(6):683-93. Heyndrickx GR Vilaine JP Moerman EJ Leusen I Role of prejunctional alpha 2-adrenergic receptors in the regulation of myocardial performance during exercise in conscious dogs Circ Res 1984 54 6 683 693 38 Végh Á, Parratt JR. Noradrenaline, infused locally, reduces arrhythmia severity during coronary artery occlusion in anaesthetised dogs. Cardiovasc Res. 2002;55(1):53-63. Végh Á Parratt JR Noradrenaline, infused locally, reduces arrhythmia severity during coronary artery occlusion in anaesthetised dogs Cardiovasc Res 2002 55 1 53 63 39 Naderi R, Imani A, Faghihi M, Moghimian M. Phenylephrine induces early and late cardioprotection through mitochondrial permeability transition pore in the isolated rat heart. J Surg Res. 2010;164(1):e37-42. Naderi R Imani A Faghihi M Moghimian M Phenylephrine induces early and late cardioprotection through mitochondrial permeability transition pore in the isolated rat heart J Surg Res 2010 164 1 e37 e42 40 Tsuchida A, Liu Y, Liu GS, Cohen MV, Downey JM. alpha 1-adrenergic agonists precondition rabbit ischemic myocardium independent of adenosine by direct activation of protein kinase C. Circ Res. 1994;75(3):576-85. Tsuchida A Liu Y Liu GS Cohen MV Downey JM alpha 1-adrenergic agonists precondition rabbit ischemic myocardium independent of adenosine by direct activation of protein kinase C Circ Res 1994 75 3 576 585 41 Imani A, Faghihi M, Sadr SS, Niaraki SS, Alizadeh AM. Noradrenaline protects in vivo rat heart against infarction and ventricular arrhythmias via nitric oxide and reactive oxygen species. J Surg Res. 2011;169(1):9-15. Imani A Faghihi M Sadr SS Niaraki SS Alizadeh AM Noradrenaline protects in vivo rat heart against infarction and ventricular arrhythmias via nitric oxide and reactive oxygen species J Surg Res 2011 169 1 9 15 42 Imani A, Faghihi M, Sadr SS, Keshavarz M and Niaraki SS. Noradrenaline reduces ischemia-induced arrhythmia in anesthetized rats: involvement of a1-adrenoceptors and mitochondrial KATP channels. J Cardiovasc Electrophysiol. 2008;19(3):309-15. Imani A Faghihi M Sadr SS Keshavarz M Niaraki SS Noradrenaline reduces ischemia-induced arrhythmia in anesthetized rats: involvement of a1-adrenoceptors and mitochondrial KATP channels J Cardiovasc Electrophysiol 2008 19 3 309 315 43 Floras JS, Ponikowski P. The sympathetic/parasympathetic imbalance in heart failure with reduced ejection fraction. Eur Heart J. 2015;36(30):1974-82b. Floras JS Ponikowski P The sympathetic/parasympathetic imbalance in heart failure with reduced ejection fraction Eur Heart J 2015 36 30 1974 182b 44 Lowrance SA, Ionadi A, McKay E, Douglas X and Johnson JD. Sympathetic nervous system contributes to enhanced corticosterone levels following chronic stress. Psychoneuroendocrinology. 2016 Jun;68:163-70. Lowrance SA Ionadi A McKay E Douglas X Johnson JD Sympathetic nervous system contributes to enhanced corticosterone levels following chronic stress Psychoneuroendocrinology 06 2016 68 163 170 Artigo Original Estresse Físico Agudo Precondiciona o Coração Contra a Injúria por Isquemia/Reperfusão Através da Ativação do Sistema Nervoso Simpático 0000-0001-7852-8786 Imani Alireza 1 2 Parsa Hoda 1 * Chookalaei Leila Gholami 1 * Rakhshan Kamran 3 Golnazari Masoomeh 4 Faghihi Mahdieh 1 Departamento de Fisiologia - Faculdade de Medicina - Tehran University of Medical Sciences, Tehran - Irã Centro de Pesquisa do Sono Ocupacional - Tehran University of Medical Sciences, Tehran - Irã Departamento de Fisiologia - Faculdade de Medicina - Tehran University of Medical Sciences, Tehran - Irã Departmento de Biologia - Faculdade de Ciências Básicas - Hamedan Branch of Islamic Azad University, Hamedan - Irã Correspondência: Alireza Imani, Department of Physiology, School of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Tehran - Iran. E-mail:aimani@tums.ac.ir

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Imani A, Faghihi M; Obtenção de dados: Rakhshan K, Golnazari M; Análise e interpretação dos dados: Imani A, Parsa H, Chookalaei LG, Faghihi M; Análise estatística e Redação do manuscrito: Imani A, Parsa H, Chookalaei LG; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Imani A.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

O estresse é definido como um estado complicado de distúrbios da homeostase, hiperatividade do sistema nervoso simpático e das respostas do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal. O pré-condicionamento cardíaco diminui os danos do miocárdio.

 Objetivo:

Esse estudo avaliou os efeitos cardioprotetores do estresse físico agudo contra a lesão por isquemia-reperfusão (I/R) através da ativação do sistema nervoso simpático.

 Métodos:

Trinta e dois ratos machos Wistar foram divididos em quatro grupos; (1) IR (n = 8): ratos submetidos a I/R, (2) Estresse agudo (St+IR) (n = 8): estresse físico induzido 1 hora antes da I/R, (3) Simpatectomia (Symp+IR) (n = 8): a simpatectomia química foi realizada 24 horas antes da I/R e (4) Simpatectomia-estresse físico (Symp+St+IR) (n = 8): simpatectomia induzida antes do estresse físico e da I/R. A simpatectomia química foi realizada com 6-hidroxidopamina (100 mg/kg, SC). Em seguida, os corações foram isolados e colocados em aparato de Lagendorff por 30 minutos para induzir isquemia, seguida de reperfusão por 120 minutos. Os fluxos coronarianos, os parâmetros hemodinâmicos, o tamanho do infarto e os níveis de corticosterona plasmática foram investigados. Valores de p < 0,05 foram considerados significativos.

 Resultados:

O estresse físico anterior à I/R pode melhorar a pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (PDVE) e duplo produto (DP), respectivamente, (63 ± 2 versus 42 ± 1,2, p < 0,05, 70 ± 2 versus 43 ± 2,6, p < 0,05) e reduzir o tamanho do infarto (22,16 ± 1,3 versus 32±1,4, p < 0,05) quando comparado com a I/R isoladamente. A simpatectomia química antes do estresse físico eliminou o efeito protetor do estresse físico sobre os danos cardíacos induzidos pela I/R (DP: 21 ± 6,6 versus 63 ± 2, p < 0,01) (PDVE: 38 ± 4,5 versus 43 ± 2,6, p < 0,01) (tamanho do infarto: 35 ± 3,1 versus 22,16 ± 1,3, p < 0,01).

 Conclusão:

Os achados indicam que o estresse físico agudo pode funcionar como um estimulador pré-condicional e, provavelmente, a presença do sistema nervoso simpático é necessária.

 Palavras-chave: Estresse Mecânico Sistema Nervoso Simpático Sistema Hipotálamo Hipofisario Isquemia Simpatectomia Introdução

A doença isquêmica do coração é o principal problema de saúde no mundo.1 Embora a reperfusão, que se refere ao rápido reestabelecimento do fluxo sanguíneo, seja um dos métodos mais eficazes contra as lesões letais,2 ela está associada com danos adicionais ao miocárdio.3 Foram propostos muitos métodos para minimizar os efeitos deletérios das lesões por isquemia/reperfusão (I/R) e aumentar a resistência cardíaca. Com base nesses avanços, a indução de episódios de curto prazo de I/R ou o uso precoce de agentes farmacológicos, ao invés de períodos prolongados de I/R, induz o pré-condicionamento cardíaco, que pode atenuar a necrose celular e conservar níveis altos de energia com sucesso.4,5

O sistema nervoso simpático e o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) são dois sistemas de defesa coordenados. Eles podem mediar a comunicação bidirecional entre cérebro e corpo durante situações de estresse.6 A ativação do sistema autonômico contribui para as respostas comportamentais em animais e promove a regulação da homeostase e a melhora da resistência.7 O estresse é caracterizado por uma resposta geral do eixo HHA contra estímulos potenciais e deletérios.8 De fato, o estresse, através do aumento da atividade do eixo HHA e da liberação de corticosterona, desempenha um papel fundamental na coordenação das funções neuroendócrina, autonômica e comportamental e resulta em respostas adaptativas.9,10 A ocorrência de estresse aumenta a atividade do sistema nervoso simpático bem como altera a secreção de neurotransmissores.11 Vários sistemas corporais, tais como os sistemas nervoso, cardiovascular e imunológico são influenciados pelo estresse. Além disso, são observadas alterações significativas nos parâmetros hemodinâmicos, tais como frequência cardíaca (FC) e pressão arterial, durante o estresse, que podem causar doenças do coração.12 Por outro lado, a liberação de norepinefrina do sistema nervoso simpático aumenta na isquemia letal e contribui para a indução de lesões por I/R através da produção de radicais livres de hidroxila. Este estudo foi elaborado com a finalidade de avaliar o papel do sistema nervoso simpático na mediação da cardioproteção induzida por estresse agudo contra lesões por I/R em corações isolados de ratos.

 Métodos

No total, 32 ratos machos Wistar (200-250 g) foram mantidos em ambiente com ar condicionado, com ciclo de 12h de luz e 12h de escuridão, a uma temperatura de 22 ± 2˚C, com livre acesso a água e comida. Os protocolos experimentais seguidos nesse estudo estão em conformidade com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicadas pelo National Institutes of Health (NIH publicação no. 85-23, revista em 1996) e foram posteriormente aprovados pelo comitê de ética institucional da Universidade de Ciências Médicas de Tehran (Tehran, Irã).

Uma caixa com dispositivo estressor foi usada para exposição ao estresse físico. Ela continha barras de aço inoxidável na parte inferior, ligadas a um dispositivo de eletrochoque através de um cabo de conexão. O estresse físico foi induzido através de choque elétrico nas patas (1mA) por 10 segundos com 50 segundos de intervalos durante 1 hora. Depois disso, os animais foram anestesiados com tiopental sódico (60 mg/kg, i.p)13 e colocados na prancha cirúrgica. O tórax foi aberto e a sutura de seda 6-0 foi colocada sob a raiz da artéria coronária descendente anterior esquerda (DAE). Finalmente, o coração foi removido do tórax e ligado a um aparelho de perfusão de Langendorff. O coração foi perfundido de forma retrógrada com tampão de bicarbonato de Krebs-Henseleit (em mmol/l): bicarbonato de sódio = 25, cloreto de sódio = 118,5, cloreto de potássio= 4,7, sulfato de magnésio = 1,2, glicose = 11, borbulhada com uma combinação de 95% O2 e 5% CO2 (pH = 7,3-7,4, a 37˚C). Depois disso, as extremidades da sutura foram passadas por uma pipeta de plástico para formar um laço para indução da isquemia. A reperfusão foi realizada através da liberação do laço. Um balão de látex foi inserido no ventrículo esquerdo e conectado a um transdutor de pressão (Harvard, March-Hugstetten, Alemanha), o aparato da Biolab foi usado para o registro das pressões ventriculares. Durante o procedimento cirúrgico, o registro foi feito ao longo de três períodos determinados: 20-30 minutos nos momentos basais (período sem qualquer manipulação), 30 minutos da isquemia local e 120 minutos da reperfusão. Após a reperfusão, a artéria coronária DAE foi ocluída novamente; foi administrado 3mL da solução de azul de Evans a 1,5% para diferenciar a zona isquêmica (a área sob risco; [ASR]) da zona não isquêmica.14 Após congelado (−20°C por 24 horas), o coração foi cortado em secções paralelas de 2mm e mantido em 2,3,5-cloreto de trifeniltetrazólio (1%) (TTC em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 - Sigma) por 15-20 min a 37°C para separar a zona isquêmica da zona de infarto.15 Ao final dos experimentos, a razão do tamanho do infarto sobre a área sob risco (TI/ASR %) foi calculada usando o programa Photoshop.

Os animais foram alocados em 4 grupos:

Grupo IR (n = 8): Os ratos foram mantidos em caixas com dispositivo estressor (sem exposição ao estresse) durante 1 hora e, em seguida, os corações foram removidos do tórax e submetidos a isquemia e reperfusão.

Grupo Estresse agudo (St+IR) (n = 8): Os ratos foram expostos a choques elétricos nas patas na caixa estressora durante 1 hora e, em seguida, os corações foram removidos do tórax e submetidos a isquemia e reperfusão.

Grupo Simpatectomia (Symp+IR) (n = 8): a simpatectomia química foi realizada através de injeção de 6 hidroxidopamina (6-OHDA, 100 mg/kg, SC) 24 horas antes da indução da I/R.16

Grupo Simpatectomia-estresse físico (Symp+St+IR) (n = 8): a simpatectomia química foi realizada 24 horas antes do estresse físico e da indução da I/R.

Os níveis séricos de corticosterona foram medidos usando o método de ELISA. Além disso, a pressão arterial sistólica foi medida usando uma técnica não-invasiva (Tail Cuff e power lab) para confirmar a simpatectomia química (n = 4).

Análise estatística

O tamanho da amostra e as divisões dos grupos foram definidos com base em estudos anteriores.17 Todos os dados foram relatados como média ± DP. A normalidade foi checada por meio do teste de Kolmogorov-Smirnov, software SPSS versão 20. Para comparação dos parâmetros entre os diferentes grupos foi utilizado o teste One-way ANOVA e teste Post-Hoc de Tukey. A análise das alterações nos valores médios por mais de três vezes foi feita utilizando ANOVA de medição repetida dentro de cada grupo. O teste t da amostra foi usado para comparar a pressão arterial sistólica antes e depois da simpatectomia. Foram consideradas alterações significativas quando p< 0,05.

 Resultados Efeito do estresse físico agudo sobre o fluxo coronariano e a frequência cardíaca

A Figura 1 mostra o fluxo coronariano (FCo) no final dos períodos de baseline, isquemia e reperfusão. Não foram encontradas diferenças significativas para o FCo no final da isquemia e reperfusão quando comparado com o final do período de baseline entre os grupos (p < 0,01). A FC diminuiu significativamente no final tanto da isquemia quanto da reperfusão em relação ao final do período de baseline entre os grupos (p < 0,01), mas nenhuma mudança significativa foi observada entre grupos diferentes (Figura 2).

Fluxo coronariano (FCo) no final do período basal, períodos de isquemia e reperfusão. IR: Isquemia/reperfusão; St: estresse físico; Symp: Simpatectomia. ** p < 0,01 vs fase basal dentro do mesmo grupo.

Frequência cardíaca (FC) no final do período basal, períodos de isquemia e reperfusão. IR: Isquemia/reperfusão, St: estresse físico; Symp: Simpatectomia. ** p < 0,01 vs. fase de linha de base dentro do mesmo grupo.

Efeito do estresse físico agudo sobre os parâmetros hemodinâmicos cardíacos

A pressão desenvolvida do ventrículo esquerdo (PDVE, a diferença entre as pressões intraventriculares sistólica e diastólica), duplo produto (DP, PDVE multiplicada pela FC) diminuíram no final da reperfusão em relação ao final do período de baseline entre os grupos.

As quantidades de DP e PDVE no grupo de estresse agudo aumentaram significativamente em comparação com o grupo IR (p < 0,05). Na indução da simpatectomia química anterior ao estresse físico, o DP e a PDVE diminuíram consideravelmente em comparação com o grupo estresse físico (p < 0,05), mas não foram encontradas diferenças acentuadas entre o grupo simpatectomia em comparação com o grupo IR (Figura 3).

Pressão desenvolvida do ventrículo esquerdo (PDVE) e taxa de duplo produto (DP) no final da reperfusão. IR: Isquemia/reperfusão; St: estresse físico; Symp: Simpatectomia. * p < 0,05 comparado ao IR, && p < 0,01 comparado a St + IR.

Efeito do estresse físico agudo no tamanho do infarto (TI/ASR %)

A Figura 4 mostra o tamanho do infarto (TI/ASR %) nos diferentes grupos.

A porcentagem de tamanho do infarto (TI/ASR%). IR: Isquemia/reperfusão; St: estresse físico; Symp: Simpatectomia. * p < 0,05 comparado ao IR, && p < 0,01 comparado a St + IR.

O tamanho do infarto foi muito menor no grupo estresse agudo se comparado com o grupo IR (p < 0,05), mas não houve alteração considerável no grupo simpatectomia química quando comparado com o grupo controle. A simpatectomia química anterior ao estresse físico agudo não representou nenhuma alteração extrema se comparado com o grupo IR, ao passo que foi demonstrada diminuição significativa no tamanho do infarto quando comparado com o estresse físico agudo isoladamente (p < 0,01).

 Efeito do estresse físico agudo nos níveis séricos de corticosterona

A Figura 5 mostra o nível sérico de corticosterona nos diferentes grupos. A indução do estresse físico agudo, com ou sem simpatectomia química nos grupos St e St+Symp+IR, aumentou a quantidade de corticosterona sérica quando comparado com o grupo IR (p < 0,01).

Nível de corticosterona no soro. IR: Isquemia/reperfusão; St: estresse físico; Symp: Simpatectomia. ** p < 0,01 comparado ao IR.

Efeito da simpatectomia química na pressão arterial sistólica

A Figura 6 representa a redução significativa da pressão arterial sistólica após a indução da simpatectomia química (p < 0,05).

Pressão arterial sistólica antes e após a simpatectomia química. * p < 0,05 comparado antes da simpatectomia.

Discussão

Atualmente a vida cotidiana está associada com o estresse, que é dividido em estresse agudo e estresse crônico, dependendo da duração da exposição.18 O estresse agudo medeia várias vias neurogênicas.19 Registros eletrofisiológicos revelaram que o estresse agudo pode ter efeitos positivos, tais como favorecer maior estimulação e aumentar a flexibilidade cognitiva em tarefas de mudança de configuração atencional.20 Sob outro ponto de vista, o estresse é dividido em físico e psicológico. Um estressor físico, como uma cirurgia, um trauma e atividade física pesada podem desencadear muitos eventos cardíacos.21 O estresse psicológico pode afetar o sistema cardiovascular através de fatores metabólicos, inflamatórios e hormonais.22,23 Nesse estudo, foram avaliados os efeitos do estresse físico agudo anteriores à simpatectomia sobre as lesões por isquemia-reperfusão no coração isolado de ratos.

Os efeitos do estresse

Os resultados mostraram que a indução do estresse agudo antes do período isquemia-reperfusão levou a uma diminuição no tamanho do infarto, melhorou os parâmetros hemodinâmicos e aumentou os níveis séricos de corticosterona quando comparado com os grupos IR e Symp+IR. Duas teorias paradoxais foram propostas para explicar tanto os efeitos vantajosos e desvantajosos do estresse para o coração. A FC extremamente elevada, a contratilidade cardíaca e a resistência periférica decorrentes da exposição ao estresse podem aumentar a carga cardíaca e o consumo de oxigênio. Em contrapartida, existem indícios crescentes do efeito oposto, por exemplo; o estresse de contenção no frio induz a proteção das células do coração 24 e pode diminuir o tamanho do infarto como parâmetro principal do dano cardíaco.25

A este respeito, Abe et al. demonstraram que o estresse agudo atenua a lesão por isquemia-reperfusão no rim através da ativação da via simpática e antiinflamatória.26

Além disso, a exposição para intermediar o estresse envolve a proteção celular contra uma isquemia letal posterior, como um conceito, e fenômeno pré-condicionante.27,28 Parece que a exposição ao estresse físico como um agente pré-condicionante protege o coração contra a I/R. Foi observado um aumento das quantidades de DP e PDVE em decorrência da indução do estresse agudo no grupo St+IR em comparação com o grupo IR, indicando que o estresse agudo desencadeou mecanismos para preparar o corpo para respostas adequadas aos estímulos, uma vez que a melhora da função cardíaca é importante. Consequentemente, parece que a eficácia da indução do estresse está associada com; 1. natureza do estressor, 2. duração do episódio de estresse, 3. intensidade do estímulo e 4. previsibilidade ou imprevisibilidade do estresse. De fato, cada um dos fatores acima tem efeitos sobre as respostas neurais e hormonais ao estresse. Nossos resultados mostraram que a corticosterona aumenta após a indução de estresse, e no grupo Symp+St+IR ela é mais elevada do que no grupo IR. É um fato que o estresse melhora a atividade do eixo HPA que resulta no aumento da secreção da corticosterona22,29 que pode ter um efeito protetor uma vez que prepara o organismo para lidar com desafios. Com base nos nossos resultados, a simpatectomia não teve efeito na corticosterona elevada por indução de estresse possivelmente porque o estresse afeta o eixo HPA por meio de diferentes mecanismos, tais como alterações nos fatores metabólicos e inflamatórios além do aumento do sistema nervoso simpático.22 Ademais, esse hormônio induz mudanças na redistribuição das células imunes que melhoram a função imunológica.30 Foram demonstradas uma diminuição no tamanho do infarto no grupo St+IR em relação ao grupo IR e uma melhora dos parâmetros hemodinâmicos no grupo St+IR em comparação com o grupo IR. A diminuição no tamanho do infarto levou à redução de ocorrência de arritmia cardíaca31,32 e também melhorou a contratilidade cardíaca.33 Parece que os efeitos benéficos da indução do estresse agudo podem estar relacionados com a melhora da função do sistema imunológico como consequência do encontro do nível elevado de corticosterona com fatores inflamatórios, desencadeando as lesões por I/R.

 Os efeitos da simpatectomia

Já foi estabelecido que a exposição a condições estressantes aumenta a atividade do sistema nervoso autonômico.30 A cardioproteção da atividade simpática foi estudada34 e nós utilizamos a simpatectomia química após a indução do estresse agudo para confirmar os efeitos protetivos do sistema nervosa simpático. Os animais no grupo Symp+IR foram submetidos à simpatectomia química antes da indução da I/R e não houve mudança significativa no tamanho do infarto em relação ao grupo IR, indicando que a denervação simpática química não tem nenhum efeito sobre a lesão por IR. Adicionalmente, a simpatectomia química anterior ao estresse físico agudo removeu o efeito de cardioproteção do estresse agudo sobre o tamanho do infarto no grupo Symp+St+IR, o que enfatiza que a presença do sistema simpático é necessária para os efeitos cardioprotetores do estresse agudo. Foi constatado que a indução do estresse agudo após a simpatectomia química superou os efeitos nocivos do sistema simpático suprimido sobre os parâmetros hemodinâmicos no grupo Symp+St+IR quando comparado com o grupo Symp+IR, indicando o papel primordial da atividade fisiológica do sistema simpático na regulação da FC, da pressão e do fluxo.35 Hara e Abiko28 declarou que a norepinefrina tem dois efeitos positivos sobre os danos conforme a duração da isquemia, o que significa que a isquemia curta pode proteger o coração e a isquemia prolongada, aumentar as lesões.28 As propriedades positiva e negativa do sistema nervoso simpático estão associadas com o tempo de exposição ao estímulo. Na isquemia de longo prazo, grandes quantidades de norepinefrina são liberadas do sistema nervosa simpático, agindo como uma fonte de radical livre e geração subsequente do radical livre OH.36 O efeito protetor da norepinefrina pode surgir da produção de energia para o músculo cardíaco em episódios de isquemia de curto prazo.37 Além disso, a administração de ioimbina (como antagonista dos receptores alfa-2) reduziu a incidência de arritmia através do aumento da liberação da norepinefrina simpática.37,38 De acordo com estudos prévios, o pré-tratamento com agonistas do receptor alfa, tais como a fenilefrina, pode proteger os cardiomiócitos contra os danos da I/R na FC isolada.39 A ativação da proteína quinase-C (PKC) via de sinalização40 e a liberação de NO41 pela norepinefrina, estão envolvidas na abertura de canais KATP mitocondriais, que por sua vez podem reduzir a carga mitocondrial de cálcio42 e causar a atenuação dos efeitos benéficos da norepinefrina. Também foi demonstrado que a pressão arterial sistólica diminuiu após a simpatectomia química, corroborando o fato de que a descarga simpática muscular é responsável pela regulação da pressão arterial.43 As limitações desse estudo foram o método de indução de estresse físico que não ocorre normalmente na vida cotidiana. Infelizmente, nós não tínhamos os dados do nível de corticosterona no grupo Symp+IR, de modo que não foi possível discutir o efeito da simpatectomia no nível de corticosterona e a comparação entre o grupo St+IR e o grupo Symp+St+IR não foi significativa. Em consonância com nossos resultados, Lowrance et al. mostraram que o nível de corticosterona induzido por estresse não sofreu alteração após a simpatectomia farmacológica.44

Conclusão

O presente estudo mostrou que a indução de estresse físico agudo anterior à I/R teve como como consequência a cardioproteção e a simpatectomia química removeu esse efeito benéfico do estresse agudo físico.

Contribuíram igualmente para este trabalho

Fontes de financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Alireza Imani pela Tehran University of Medical Sciences.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Tehran University of Medical Sciences sob o número de protocolo 30486. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013.

 Agradecimentos

Esse estudo foi financiado pela Universidade de Ciências Médicas de Tehran.