Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC cc4KS6rpNJYkfwFLGw6bfBD S0066-782X2019000700077 S0066-782X2019005011101 10.5935/abc.20190112 Original Article GLA Gene Mutation in Hypertrophic Cardiomyopathy with a New Variant Description: Is it Fabry's Disease? 0000-0002-9008-402X Chaves-Markman Ândrea Virgínia 1 2 3 4 5 Markman Manuel 2 Calado Eveline Barros 1 Pires Ricardo Flores 6 0000-0001-6025-9821 Santos-Veloso Marcelo Antônio Oliveira 3 4 5 Pereira Catarina Maria Fonseca 7 Lordsleem Andréa Bezerra de Melo da Silveira 1 3 5 Lima Sandro Gonçalves de 1 3 5 Markman Brivaldo Filho 1 Oliveira Dinaldo Cavalcanti de 1 4 5 Universidade Federal de Pernambuco Hospital das Clínicas Área Acadêmica de Medicina Clínica Recife PE Brazil Universidade Federal de Pernambuco - Hospital das Clínicas - Área Acadêmica de Medicina Clínica - Centro de Medicina Clínica - CCM, Recife, PE - Brazil Hospital Agamenon Magalhães Recife PE Brazil Hospital Agamenon Magalhães, Recife, PE - Brazil Universidade Federal de Pernambuco Grupo de pesquisa em Epidemiologia e Cardiologia Recife PE Brazil Universidade Federal de Pernambuco - Grupo de pesquisa em Epidemiologia e Cardiologia (EPICARDIO), Recife, PE - Brazil Universidade Federal de Pernambuco Pós Graduação em Inovação Terapêutica Recife PE Brasil Pós Graduação em Inovação Terapêutica (PPGIT) - Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE - Brasil Centro Universitário Mauricio de Nassau Curso de Medicina Recife PE Brasil Centro Universitário Mauricio de Nassau - Curso de Medicina, Recife, PE - Brasil Clínica de Doenças Metabólicas Porto Alegre RS Brasil Clínica de Doenças Metabólicas, Porto Alegre, RS - Brasil Cetogene AG Rostock Germany Cetogene AG, Rostock - Germany Mailing Address: Ândrea Virgínia Chaves-Markman, Rua Doutor Pedro de melo Cahú, 51/2102. Postal Code 51020-080, Boa Viagem, Recife, PE - Brazil. E-mail: andreachaves.cardio@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research: Chaves-Markman AV, Markman Filho B, Oliveira DC; Acquisition of data: Chaves-Markman AV, Markman M, Calado EB, Pereira CMF, Lordsleem, ABMS; Analysis and interpretation of the data: Chaves-Markman AV, Santos-Veloso MAO, Lima SG, Markman Filho B, Oliveira DC; Statistical analysis: Lima SG, Oliveira DC; Writing of the manuscript: Chaves-Markman AV, Calado EB, Pires RF; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Chaves-Markman AV, Markman Filho B, Oliveira DC.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 10 07 2019 07 2019 113 1 77 84 14 06 2018 31 10 2018 01 11 2018 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited Abstract Background:

Fabry disease (FD) is an X-linked lysosomal storage disorder caused by mutations in the alpha galactosidase A gene (GLA) that lead to the enzymatic deficiency of alpha galactosidase (α-Gal A), resulting in the accumulation of globotriaosylceramide (Gb3) and globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3), causing multiple organ dysfunctions.

 Objective:

To perform GLA gene screening in a group of patients with echocardiographic diagnosis of hypertrophic cardiomyopathy (HCM).

 Methods:

a cross-sectional study was conducted with HCM patients from a university hospital. Patients with coronary artery disease and valvulopathies were excluded. Mutation analysis of the GLA gene was performed. In male subjects, the analysis was performed after evidence of low α-Gal A activity.

 Results:

60 patients with echocardiographic diagnosis of HCM were included. Age ranged from 12 to 85 years and 60% were women. Mean myocardial fibrosis percentage on MRI was 10.7 ± 13.1% and mean ventricular thickness was18.7 ± 6.7 mm. Four patients had the following GLA gene mutations: c.967C>A (p.Pro323Thr), not yet described in the literature; c.937G>T (p.Asp313Tyr); and c.352C>T (p.Arg118Cys). All patients had normal levels of lyso-Gb3 and non-ischemic myocardial fibrosis on magnetic resonance imaging; one patient had proteinuria and one patient had ventricular tachycardia.

 Conclusion:

in this study, the frequency of mutation in the GLA gene in patients with HCM was 6.7%. A novel mutation in exon 6 of the GLA gene, c.967C>A (p.Pro323Thr), was identified. Patients with HCM may have GLA mutations and FD should be ruled out. Plasma (lyso-Gb3) levels do not seem to be sufficient to attain a diagnosis and organ biopsy should be considered.

 Keywords: Fabry Disease/genetic Cardiomyopathy, Hypertrophic Hypertrophy, Left Ventricular Glycosphingolipids Introduction

Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is the most prevalent cardiopathy of genetic origin, caused by >1400 mutations in genes encoding proteins that are components of cardiac sarcomeres and other proteins of related structures, such as Z-discs and intercalated discs.1-3 Due to advances in molecular biology techniques, the differential diagnosis of HCM has been extended, and other genetic disorders that present with ventricular hypertrophy have been reported.4

Fabry disease (FD) is a rare X-linked genetic condition. It is caused by inborn errors in glycosphingolipid metabolism due to mutations in the gene encoding the enzyme α-galactosidase A (α-Gal A). Total or partial deficiency of this enzyme results in progressive accumulation of globotriaosylceramide (Gb3) and globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3) in some tissues, particularly in the blood vessels, kidneys, and myocardium.5-7 More than 900 mutations with different effects on α-Gal A enzyme activity have been described.8,9

The incidence of FD is estimated at 1:40,000 to 117,000 individuals, and both male homozygous and female heterozygous may be affected.5,6,8,9 Two phenotypes are recognized: a classic form that is characterized by an early-onset with manifestations during childhood, and a late-onset form that frequently affects only one organ.5,6,8 Cardiac changes seem to be present in the early stages of life; however, it is usually not clinically detectable until the third or fourth decade of life. Deposits of glycosphingolipids in valves and coronary vessels are frequent, which may cause complete atrioventricular block, mitral insufficiency, left ventricular hypertrophy (LVH), or myocardial ischemia.10

Currently, specific mutations are associated with the cardiac variant showing myocardial hypertrophy that is clinically similar to HCM.11,12 Patients with FD are at risk for developing cerebrovascular disease (CVD), cardiac sudden death, and renal failure, and these patients can benefit from specific treatments.13-15

In this study, a screening for the GLA gene was performed in a group of patients with echocardiographic diagnosis of hypertrophic cardiomyopathy (HCM).

 Methods Subjects

A cross-sectional study was conducted in a convenience sample of patients with HCM treated at the cardiology outpatient clinic at a university hospital in Recife, Pernambuco, Brazil. All patients with an echocardiographic diagnosis of HCM based on the European Society of Cardiology16 criteria were included. Patients with coronary artery disease, valvulopathies and hypertensive cardiomyopathy were excluded.

 Definitions of HCM

A Transthoracic Echocardiography (TTE) was used to establish the diagnosis of HCM based on the following criteria: unexplained maximum ventricular thickness (MVT) ≥ 15 mm in any cardiac segment or a MVT ≥ 13 mm in a patient with family history of HCM. The obstructive presentation was defined by a left ventricular outflow gradient ≥ 30 mmHg at rest or after Valsalva maneuver or in orthostatism.13,16

Echocardiographic assessment

The TTE was previously performed in all subjects to establish the diagnosis of HCM (Vivid 7 or Vivid E9 GE) with offline dataset analysis (EchoPac®, GE Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom). The diameters of the interventricular septum and the left ventricular (LV) posterior wall, LV end diastolic volume, and LV end systolic volume were determined through M-mode or 2D imaging. The MVT of all segments were measured in the parasternal short axis. The ejection fraction (EF) and diastolic function were calculated using Simpson’s method and pulsatile Doppler, respectively.17,18

Magnetic resonance imaging

Magnetic resonance imaging (MRI) was performed in all patients with GLA mutation to assess the presence of myocardial fibrosis using the delayed myocardial enhancement technique (DMET). A 1.5-T MRI scanner (MAGNETOM Essenza, Siemens Healthcare, Erlangen, Germany) with an eight-channel phased array coil was used. The images were acquired in the cardiac short axis, from the base to the apex, with 8-mm slices and 2-mm intervals using the T1-weighted echo-gradient sequence. An inversion recovery prepulse and adjusted inversion time were used to neutralize the myocardial signal. Image acquisition was started at approximately 8-10 min after the infusion of gadolinium contrast at a dosage of 0.2 mmol/kg. DMET increases the amount of contrast between the normal tissue (dark due to signal neutralization) and the fibrotic tissue (white due to enhancement of gadolinium in the T1-weighted sequence).19

Electrocardiography and Dynamic electrocardiography (24-h Holter)

A resting 12-lead electrocardiogram was performed in all patients. A continuum digital recorder (Cardio Light®, Cardio Sistemas Comercial Industrial, São Paulo, Brazil) was used to record and analyze the Holter tests for 24 h. The electrodes were positioned in the electrocardiographic derivations MV1, MV4, and MV6. The results were analyzed using the Cardiomanager 540® (Cardio Sistemas Comercial Industrial, São Paulo, Brazil) software by an independent observer searching for cardiac arrhythmias.

 Molecular and enzymatic essays

All included patients underwent digit blood capillary puncture and blood samples were collected on filter paper. The samples were dried for 3-4h at room temperature, stored in a plastic envelop at 4°C, and sent to the Centogene Laboratory (Rostock, Germany).

Molecular analysis to determine GLA gene mutations was performed in the samples from the female subjects, whereas mutation analysis was performed after evidence of low α-Gal A activity in male subjects. The expression level and enzymatic activity of the biomarker lyso-Gb3 were identified through high-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry.

The GLA gene was analyzed using polymerase chain reaction (PCR) and sequencing of all coding regions and highly conserved exon-intron boundaries through next-generation sequencing with Illumina HiSeq (Illumina, California, USA). GLA gene analysis was performed in all patients with HCM.

 Statistical analyses

Data were analyzed descriptively using the Statistical Package for the Social Sciences version 20.0 (IBM Company, Armonk, NY, USA). Before analyzing the continuous variables, the data sets were tested for normality by performing the Shapiro-Wilk test. Normally-distributed continuous variables were presented with measures of central tendency and dispersion (mean and standard deviation), and categorical variables were described as absolute (n) and relative (%) frequencies. Comparative analysis was performed using Pearson’s chi-square test for categorical variables. Numerical variables were analyzed using the paired Student’s t-test. The significance level was defined as 5% throughout the entire statistical analysis (p < 0.05).

Paired student’s t-test was used to compare the baseline characteristics of both HCM and GLA mutation groups, and Pearson’s chi-square test was used to identify any associations between the clinical variables.

 Ethical standards

The study was approved by the Institutional Ethics Committee and was carried out according to Resolution 196/96 of the Brazilian National Health Council, which deals with the guidelines and standards for research involving human subjects. The investigation was also conducted in accordance with the Declaration of Helsinki. Informed consent was obtained from all patients before inclusion in this study.

 Results

We included 60 patients with an echocardiographic diagnosis of HCM that underwent molecular tests for FD. Their age ranged from 12 to 85 years (mean 42.3 ± 17), and 60% (n = 36) were women. Four patients, three of which were women, had GLA gene mutations, corresponding to 6.7% of our sample.

Syncope and dyspnea were the most frequent cardiac symptoms in all patients. Asymmetric septal hypertrophic cardiomyopathy was the most frequent type in patients without GLA mutations (61.5%) and in the GLA mutation group (50%). EF was similar in both groups. The most common electrocardiographic patterns of all patients were left ventricular hypertrophy (37.9%), atrioventricular block (13.8%) and left bundle branch block (10.3%). The clinical and epidemiological baseline characteristics of our sample are shown in Table 1.

Clinical characteristics and complementary test results of patients
HCM (n=56) GLA mutation (n = 4) p-value
Age (years) 42.3 ± 17.0 58.5 ± 15.2 0.11
Gender (female) 59.9% 75% 0.53
EF (%)† 67.6 ± 8.6 65.0 ± 4.2 0.43
Cardiac symptoms Dyspnea 8% 25% 0.80
Precordial pain 5% -
Syncope 17.5% 50%
Palpitation 5% -
Dizziness 7% -
Predominance of LVH † Apical 5.56% 25% 0.38
Concentric 25% 25%
AS 61.1% 50%
AM 0.05% -
PMH 2.78% -
MVT (mm) † 19.1 ± 6.4 18.7 ± 0.9 0.98
Fibrosis on MRI (%) 11.0 ± 13.9 12.0 ± 11.6 0.82
ECG alteration LVO 38.5% 100% 0.83
LAE 10.3% -
AVR 28.6% -
LBBB 10.3% 25%
AVB 5.1% 50%
QRSFrag 20.5% -

HCM: hypertrophic cardiomyopathy; EF: ejection fraction; LVH: left ventricular hypertrophy; AS: Asymmetric septal; AM: anteromedial; PMH: papillary muscle hypertrophy; MVT: maximum ventricular thickness; MRI: magnet resonance imaging; ECG: electrocardiogram; LVO: left ventricular outflow tract; LAE: left atrium enlargement; AVR: abnormal ventricular repolarization; LBBB: left bundle branch block; AVB: atrioventricular block; QRSFrag: QRS fragmentation.

measurement via transthoracic echocardiography (TTE).

Three mutations with heterozygote variants were found: c.967C>A (p.Pro323Thr), which is a novel mutation not yet described in literature (Figure 1); c.937G>T (p.Asp313Tyr); and c.352C>T (p.Arg118Cys). One homozygous variant was also found: c.352C>T (p.Arg118Cys). Five male patients underwent molecular analysis due to low α-Gal A enzyme activity; however, none of them had GLA gene mutations. The clinical and epidemiological characteristics of the patients with GLA gene mutations are described in Table 2.

Chromatogram of the novel GLA gene mutation: c.967C>A (p.Pro323Thr).

Clinical characteristics and complementary test results of FD patients
Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4
Age (years) 69 39 72 53
Gender F F F M
Cardiac symptoms Syncope Syncope, dyspnea No No
Extracardiac symptoms TIA Acroparesthesia, intolerance to heat/cold, mood changes Acroparesthesia, arteria thrombosis ICVA
ECG RHR, LVO, FDAVB, LBBB RHR, LVO RHR, LVO, FDAVB RHR, LVO
24h Holter 8 episodes of VT, 677 PVC No arrhythmias Paroxysmal AFib No arrhythmias
EF† 67% 60% 70% 65%
Predominance of LVH† Apical Asymmetrical septal hypertrophy Asymmetrical septal hypertrophy Concentric
MVT (mm)† 19 20 18 18
Diastolic disfunction† Mild Pseudonormal Mild Mild
LVOTO† No No No No
Fibrosis on MRI 6% 28% 13% 1.36%
FSD Yes Yes No No
ICD Yes Yes No No
GLA gene mutation c.967C>A (p. Pro323Thr) c.937G>T (p.Asp313Tyr) c.352C>T (p.Arg118Cys) c.352C>T (p.Arg118Cys)
High lyso-Gb3 No No No No
Low α-Gal A NM NM NM Yes
Proteinuria No No Yes No

F: female; M: male; TIA: transitory ischemic attack; ICVA: ischemic cerebrovascular accident; ECG: electrocardiogram; RHR: regular heart rate; LVO: left ventricular overload; FDAVB: first degree atrio-ventricular block; LBBB: left bundle branch block; VT: ventricular tachycardia, PVC: premature ventricular contraction; AFib: atrial fibrillation; EF: ejection fraction; LVH: left ventricular hypertrophy; MVT: maximum ventricular thickness; LVOTO: left ventricular outflow tract obstruction; MRI: magnetic resonance imaging; FSD: family sudden death; ICD: implantable cardioverter defibrillator; NM: not measured.

measurement via transthoracic echocardiography (TTE).

Discussion

In our sample of 60 patients with HCM, we determined through molecular tests that the prevalence of GLA mutation was 6.7%. Additionally, we found a new mutation in the GLA gene. Enzyme replacement was started in one patient with GLA mutation.

FD has X-linked inheritance. The classic X-linked disorder generally shows a vertical transmission, in which heterozygous females transmit the allele down to their offspring. The majority of mutations in X-linked genes result in diseases that will only occur in males. However, some of the X-linked diseases show different rates of penetrance and expressivity in both genders. In FD, heterozygous individuals (females) are usually affected, but tend to have a milder and more variable phenotype than homozygous ones (males).20

The prevalence of FD is estimated to be 0.02-0.09:10,000 in the overall population, though molecular screening in newborns suggests a higher prevalence.21,22 Regarding the cardiac variant, the prevalence may be as high as 12%, depending on the method used.23-26

The mean maximum ventricular thickness (MVT) in patients with GLA mutation in our sample was greater than that in previous studies. The mean MVT was 11.6 ± 3.3 mm in the study by Koskenvuo et al.,27 and only eight patients had LVH. The mean MVT was 16.7 ± 1.9 mm in the study by Takenaka et al.,28 which is closer to that shown in this study. Patients with GLA mutation were screened from an HCM sample, which may explain the tendency for the higher mean values of MVT.

In our study, patients with GLA mutations had an older mean age. This finding could perhaps be attributed to the fact that the cardiac variant of FD has a later onset.

Regarding the hypertrophy pattern, FD is predominantly associated with concentric hypertrophy.29 However, some studies found a higher prevalence of the asymmetrical variety,25 which was in accordance with our results. This variety is usually associated with severe presentations of the disease.25,29

Atrioventricular block was present in the electrocardiographic (ECG) findings in two patients with GLA mutation (50%), which is in accordance with the findings from previous studies.29 However, repolarization abnormalities were common in patients with HCM, but not in patients with FD, as expected. These abnormalities are associated with mild concentric hypertrophy.30 In our study, only one patient showed concentric hypertrophy, which may explain the absence of repolarization abnormalities in the ECG results of our patients with GLA mutation.

The mean myocardial fibrosis percentage on MRI was 12±11.6% and 10.5±13.7% in patients with GLA mutation and no mutation, respectively. However, there was no statistically significant differences between the compared groups (p = 0.85). Although the clinical presentation of FD has been well described, the physiopathological mechanism linking the intracellular accumulation of Gb3 to tissue damage and clinical manifestations is still not well established.31 It is hypothesized that intracellular storage of Gb3 triggers important physiopathological cascades related to inflammatory processes, leading to myocardial cell changes and, over time, to fibrosis.31-33

GLA mutation was not associated with any specific late gadolinium enhancement (LGE) pattern on MRI. Patient 2 shows LGE in the basal midventricular septum, anterior septum, lateral inferior and apical segments of the left ventricle. Patient 3 shows LGE in the interventricular septum, inferior wall and in the right ventricle insertions. Patient 4 shows LGE in the basal segments of the inferior septum and inferior wall segments of the right ventricle. Information about LGE in patient 1 was not available.

One of the variants found has not been described in previous studies and in the Exome Aggregation Consortium, Exome Sequencing Project or 1000 Genomes Browser databases. The variant, c.967C>A (p.Pro323Thr), is located in exon 6 of the GLA gene. This mutation results in the substitution of a threonine amino acid by a proline amino acid at position 323 of the protein. This position shows a highly conserved nucleotide and a highly conserved amino acid, with moderated physico-chemical differences between the proline and threonine amino acids. It has characteristics of pathogenicity based on the analysis using Polyphen-2, SIFT, MutationTaster, and Align-GVGD software. Patient 1, the carrier of this mutation, had severe cardiac defects, manifested as arrhythmia and hypertrophy, with no other explainable causes.

The variant 352C>T (p.Arg118Cys) in exon 2 of the GLA gene was initially described to be pathogenic by Spada et al.34 According to Ferreira et al.,35 the moderated enzymatic deficiency related to p.Arg118Cys may not be sufficient to cause major complications of FD, suggesting low pathogenicity.35 This mutation was found in two unrelated patients (patients 3 and 4), both with LVH. Patient 3 also showed first-degree atrioventricular block and paroxysmal atrial fibrillation on ECG, as well as proteinuria. Patient 4 had a history of ischemic stroke. Despite the controversy over the pathogenicity of this variant, the authors believe it may cause specific organ manifestations, such as cardiac and cerebral involvement.

With regard to the third variant found in exon 6 of the GLA gene, GLA c.937G>T (p.Asp313Tyr) in patient 2, there are also contradictory results about its pathogenicity. Some studies showed that genotype D313Y is not responsible for severe organic lesions similar to those associated with the well-established genotypes of classic FD.36

Lenders et al.36 and Niemann et al.,37) reported that the presence of this variant is potentially associated with important white matter lesions in the central nervous system.36,37 The patient had severe cardiac hypertrophy, a history of uncontrolled systemic arterial hypertension, and complained of generalized pain with emotional lability. She has been receiving enzymatic replacement therapy for six months and has shown significant improvement of symptoms and blood pressure control.

The study of variants c.937G>T (p.Asp313Tyr) and c.352C>T (p.Arg118Cys) show contradictory results in the literature, but the authors believe they are pathogenic. The variant p. Asp313Tyr, found in this group, was identified in members of the same family and all follow the X-linked inheritance, with important cardiac hypertrophy and symptoms. Regarding the p.Arg118Cys, which has also shown controversial results in the literature, it was found in two patients from different families in this group. One is a homozygous male with cardiac hypertrophy and ischemic stroke; the other one is a heterozygous female patient also with cardiac hypertrophy, arterial thrombosis and proteinuria. The authors are currently working with the objective of gathering more evidence about the pathogenicity of these variants in the other family members. The new variant found, c.967C>A (p. Pro323Thr) seems to be pathogenic according to the analysis carried out with Polyphen-2, SIFT, MutationTaster and Align-GVGD software. As stated before, the patient is a heterozygous female with cardiac hypertrophy and transitory ischemic attack and investigation of the family members suggest pathogenicity.

Although the 352C> T (p.Arg118Cys) and c.937G> T (p.Asp313Tyr) variants are controversial as to pathogenicity, the families' heredogram confirms an X-linked inheritance. One of the most relevant results of the study was the identification of a new mutation in the GLA gene that seems to be pathogenic, in addition to the identification of 14 other carriers among the relatives of the four index patients. The probability of performing enzyme replacement therapy and pharmacological chaperones emphasizes the importance of an early diagnosis of FD38-40 and the search to identify the pathogenicity of the variants found.

Limitations

The main limitations of our study were: the absence of sample calculation, the small sample size due to the disease rarity and the small number of patients with GLA mutations (statistical analyses were limited). Also, molecular analysis of sarcomeric genes in patients with HCM was not performed.

T1 mapping was performed on MRI images only for patient 4. At the time of the other scans, MRI T1 mapping was not available at our institution.

The authors understand that a renal or cardiac biopsy could be performed to confirm pathogenicity for those uncertain variants.

 Conclusion

In this study, the frequency of mutations in the GLA gene in patients with hypertrophic cardiomyopathy was 6.7%. A novel mutation in exon 6 of the GLA gene, c.967C>A (p.Pro323Thr), was identified. Patients with HCM may have GLA mutations and Fabry disease should be ruled out. Plasma lyso-GB3 levels do not seem to be sufficient to attain a diagnosis, and organ biopsy should be considered.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Ândrea Virgínia Chaves-Markman from Universidade Federal de Pernambuco.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães under the protocol number 3076174. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.

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Spada M Pagliardini S Yasuda M Tukel T Thiagarajan G Sakuraba H High incidence of later-onset Fabry disease revealed by newborn screening Am J Hum Genet 2006 79 1 31 40 35 Ferreira S, Ortiz A, Germain DP, Viana-Baptista M, Caldeira-Gomes A, Camprecios M, et al. The alpha-galactosidase A p.Arg118Cys variant does not cause a Fabry disease phenotype: data from individual patients and family studies. Mol Genet Metab. 2015;114(2):248-58. Ferreira S Ortiz A Germain DP Viana-Baptista M Caldeira-Gomes A Camprecios M The alpha-galactosidase A p.Arg118Cys variant does not cause a Fabry disease phenotype: data from individual patients and family studies Mol Genet Metab 2015 114 2 248 258 36 Lenders M, Duning T, Schelleckes M, Schmitz B, Stander S, Rolfs A, et al. Multifocal white matter lesions associated with the D313Y mutation of the ?-Galactosidase A gene. PLoS One. 2013;8(2):e55565. Lenders M Duning T Schelleckes M Schmitz B Stander S Rolfs A Multifocal white matter lesions associated with the D313Y mutation of the?-Galactosidase A gene PLoS One 2013 8 2 e55565 37 Niemann M, Rolfs A, Giese A, Mascher H, Breunig F, Ertl G, et al. Lyso-Gb3 indicates that the Alpha-Galactosidase A Mutation D313Y is not clinically relevant for Fabry disease. JIMD Rep. 2013;7:99-102. Niemann M Rolfs A Giese A Mascher H Breunig F Ertl G Lyso-Gb3 indicates that the Alpha-Galactosidase A Mutation D313Y is not clinically relevant for Fabry disease JIMD Rep 2013 7 99 102 38 Kampmann C, Perrin A, Beck M. Effectiveness of agalsidase alfa enzyme replacement in Fabry disease: cardiac outcomes after 10 years' treatment. Orphanet J Rare Dis. 2015 Sep 29;10:125. Kampmann C Perrin A Beck M Effectiveness of agalsidase alfa enzyme replacement in Fabry disease: cardiac outcomes after 10 years' treatment Orphanet J Rare Dis 2015 09 29 10 125 125 39 Biegstraaten M, Arngrímsson R, Barbey F, Boks L, Cecchi F, Deegan PB, et al. Recommendations for initiation and cessation of enzyme replacement therapy in patients with Fabry disease: the European Fabry Working Group consensus document. Orphanet J Rare Dis. 2015 Mar 27;10:36. Biegstraaten M Arngrímsson R Barbey F Boks L Cecchi F Deegan PB Recommendations for initiation and cessation of enzyme replacement therapy in patients with Fabry disease: the European Fabry Working Group consensus document Orphanet J Rare Dis 2015 03 27 10 36 36 40 Germain DP, Hughes DA, Nicholls K, Bichet DG, Giugliani R, Wilcox WR, et al. Treatment of Fabry's disease with the Pharmacologic Chaperone Migalastat. N Engl J Med. 2016;375(6):545-55. Germain DP Hughes DA Nicholls K Bichet DG Giugliani R Wilcox WR Treatment of Fabry's disease with the Pharmacologic Chaperone Migalastat N Engl J Med 2016 375 6 545 555 Artigo Original Mutação do Gene GLA na Cardiomiopatia Hipertrófica com Descrição de Nova Variante: É Doença de Fabry? 0000-0002-9008-402X Chaves-Markman Ândrea Virgínia 1 2 3 4 5 Markman Manuel 2 Calado Eveline Barros 1 Pires Ricardo Flores 6 0000-0001-6025-9821 Santos-Veloso Marcelo Antônio Oliveira 3 4 5 Pereira Catarina Maria Fonseca 7 Lordsleem Andréa Bezerra de Melo da Silveira 1 3 5 Lima Sandro Gonçalves de 1 3 5 Markman Brivaldo Filho 1 Oliveira Dinaldo Cavalcanti de 1 4 5 Universidade Federal de Pernambuco - Hospital das Clínicas - Área Acadêmica de Medicina Clínica - Centro de Medicina Clínica - CCM, Recife, PE - Brasil Hospital Agamenon Magalhães, Recife, PE - Brasil Universidade Federal de Pernambuco - Grupo de pesquisa em Epidemiologia e Cardiologia (EPICARDIO), Recife, PE - Brasil Pós Graduação em Inovação Terapêutica (PPGIT) - Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE - Brasil Centro Universitário Mauricio de Nassau - Curso de Medicina, Recife, PE - Brasil Clínica de Doenças Metabólicas, Porto Alegre, RS - Brasil Cetogene AG, Rostock - Alemanha Correspondência: Ândrea Virgínia Chaves-Markman, Rua Doutor Pedro de melo Cahú, 51/2102. CEP 51020-080, Boa Viagem, Recife, PE - Brasil. E-mail: andreachaves.cardio@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Chaves-Markman AV, Markman Filho B, Oliveira DC; Obtenção de dados: Chaves-Markman AV, Markman M, Calado EB, Pereira CMF, Lordsleem, ABMS; Análise e interpretação dos dados: Chaves-Markman AV, Santos-Veloso MAO, Lima SG, Markman Filho B, Oliveira DC; Análise estatística: Lima SG, Oliveira DC; Redação do manuscrito: Chaves-Markman AV, Calado EB, Pires RF; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Chaves-Markman AV, Markman Filho B, Oliveira DC.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

A doença de Fabry (DF) é uma doença de armazenamento lisossômico ligada ao cromossomo X, devido a mutações no gene da alfa galactosidase A (GLA), levando a deficiência enzimática de alfa-galactosidase (α-Gal A) e acúmulo de globotriaosilceramida (Gb3) e globotriaosilsulfingosina (liso-Gb3), causando disfunção de múltiplos órgãos.

 Objetivo:

realizar a triagem do gene GLA em um grupo de pacientes com diagnóstico ecocardiográfico de cardiomiopatia hipertrófica (CMH).

 Métodos:

estudo transversal realizado com pacientes com CMH em um hospital universitário. Pacientes com doença arterial coronariana e valvopatias foram excluídos. Foi realizada análise de mutação do gene GLA. Em indivíduos do sexo masculino, a análise foi realizada após evidência de baixa atividade de α-Gal A.

 Resultados:

Foram incluídos 60 pacientes com diagnostico ecocardiográfico de CMH. A idade variou de 12 a 85 anos e 60% eram mulheres. O percentual médio de fibrose miocárdica na RM foi 10,7 ± 13,1% e a espessura ventricular média foi 18,7 ± 6,7 mm. Quatro pacientes tinham as seguintes mutações do GLA: c.967C>A (p.Pro323Thr), ainda não descrita na literatura; c.937G>T (p.Asp313Tyr); e c.352C>T (p.Arg118Cys). Todos os pacientes apresentavam níveis normais de liso-Gb3 e fibrose miocárdica não isquêmica na ressonância magnética; um paciente apresentou proteinúria; um paciente apresentou taquicardia ventricular.

 Conclusão:

Neste estudo, a frequência de mutação no gene GLA em pacientes com CMH foi 6,7%. Uma nova mutação no exon 6 do gene GLA, c.967C>A (p.Pro323Thr), foi identificada. Pacientes com CMH podem ter mutações do GLA e a DF deve ser excluída. Os níveis plasmáticos de (liso-Gb3) não parecem ser suficientes para fazer um diagnóstico e biópsia de órgãos deve ser considerada.

 Palavras-chave: Doença de Fabry/genética Cardiomiopatia Hipertrófica Hipertrofia Ventricular Esquerda Glicoesfingolipídeos Fundamento

A cardiomiopatia hipertrófica (CMH) é a cardiopatia de origem genética mais prevalente, causada por >1.400 mutações em genes codificando proteínas que são componentes de sarcômeros cardíacos e outras proteínas de estruturas relacionadas, tais como discos Z e discos intercalados.1-3 Devido a avanços nas técnicas de biologia molecular, o diagnóstico diferencial da CMH foi ampliado e outros distúrbios genéticos que se apresentam com hipertrofia ventricular têm sido relatados.4

A doença de Fabry (DF) é uma condição genética rara ligada ao cromossomo X. É causada por erros inatos no metabolismo dos glicoesfingolipídeos, devido a mutações no gene que codifica a enzima α-galactosidase A (α-Gal A). A deficiência total ou parcial dessa enzima resulta em acúmulo progressivo de globotriaosilceramida (Gb3) e globotriaosilsulfingosina (liso-Gb3) em alguns tecidos, particularmente nos vasos sanguíneos, rins e miocárdio.5-7 Mais de 900 mutações com diferentes efeitos sobre a atividade enzimática da α-Gal já foram descritas.8,9

A incidência de DF é estimada em 1: 40.000 a 117.000 indivíduos, homozigotos masculinos e heterozigotos femininos podem ser afetados.5,6,8,9 Dois fenótipos são reconhecidos: uma forma clássica, que é caracterizada por um início precoce com manifestações durante a infância, e uma forma de início tardio, que frequentemente afeta apenas um órgão.5,6,8 As alterações cardíacas parecem estar presentes nos estágios iniciais da vida; entretanto, geralmente não é clinicamente detectável até a terceira ou quarta décadas de vida.

Depósitos de glicoesfingolipídeos em válvulas e vasos coronarianos são frequentes, podendo causar bloqueio atrioventricular total, insuficiência mitral, hipertrofia ventricular esquerda (HVE) ou isquemia miocárdica.10

Atualmente, mutações específicas estão associadas à variante cardíaca mostrando hipertrofia miocárdica que é clinicamente semelhante à CMH.11,12 Os pacientes com DF estão em risco de desenvolver doença cerebrovascular (DCV), morte súbita cardíaca e insuficiência renal, e esses pacientes podem se beneficiar de tratamentos específicos.13-15

Neste estudo, foi realizada uma triagem para o gene GLA em um grupo de pacientes com diagnóstico ecocardiográfico de cardiomiopatia hipertrófica (CMH).

 Métodos Amostra

Um estudo transversal foi realizado em uma amostra de conveniência de pacientes com CMH atendidos no ambulatório de cardiologia de um hospital universitário de Recife, Pernambuco, Brasil. Todos os pacientes com diagnóstico ecocardiográfico de CMH com base nos critérios da European Society of Cardiology16 foram incluídos. Pacientes com doença arterial coronariana, valvopatias e cardiomiopatia hipertensiva foram excluídos.

 Definições de CMH

Um ecocardiograma transtorácico (ETT) foi utilizado para estabelecer o diagnóstico de CMH com base nos seguintes critérios: hipertrofia ventricular máxima (HVM) inexplicável ≥ 15 mm em qualquer segmento cardíaco ou HVM ≥ 13 mm em um paciente com história familiar de CMH. A apresentação obstrutiva foi definida por um gradiente da via de saída do ventrículo esquerdo ≥ 30 mmHg em repouso ou após manobra de Valsalva ou em ortostatismo.13,16

Avaliação Ecocardiográfica

O ETT foi previamente realizado em todos os indivíduos para estabelecer o diagnóstico de CMH (Vivid 7 ou Vivid E9 GE) com análise de conjuntos de dados off-line (EchoPac®, GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). Os diâmetros do septo interventricular e da parede posterior do ventrículo esquerdo (VE), volume diastólico final do VE e volume sistólico final do VE foram determinados pelo modo M ou da imagem em 2D. O MVT de todos os segmentos foi medido no eixo curto paraesternal. A fração de ejeção (FE) e a função diastólica foram calculadas pelo método de Simpson e pelo Doppler pulsátil, respectivamente.17,18

Imagem de ressonância magnética

A avaliação por ressonância magnética (RM) foi realizada em todos os pacientes com mutação do GLA para avaliar a presença de fibrose miocárdica, utilizando a técnica do realce tardio miocárdico (RTM). Um aparelho de RM de 1,5 T (MAGNETOM Essenza, Siemens Healthcare, Erlangen, Alemanha) com uma bobina de oito canais do tipo Phased Array foi utilizado. As imagens foram adquiridas no eixo curto cardíaco, da base ao ápice, com cortes de 8 mm e intervalos de 2 mm, utilizando a sequência Gradiente Eco ponderada em T1. Um pré- pulso inversão-recuperação e tempo de inversão ajustado foram utilizados para neutralizar o sinal miocárdico. A aquisição da imagem foi iniciada aproximadamente 8 a 10 minutos após a infusão do contraste de gadolínio a uma dose de 0,2 mmol/kg. O RTM aumenta a quantidade de contraste entre o tecido normal (escuro devido à neutralização do sinal) e o tecido fibrótico (branco devido ao aumento do gadolínio na sequência ponderada em T1).19

Eletrocardiografia e eletrocardiografia dinâmica (Holter de 24 h)

Um eletrocardiograma de 12 derivações em repouso foi realizado em todos os pacientes. Um gravador digital contínuo (Cardio Light®, Cardio Sistemas Comerciais Industriais, São Paulo, Brasil) foi utilizado para registrar e analisar os testes Holter por 24 horas. Os eletrodos foram posicionados nas derivações eletrocardiográficas MV1, MV4 e MV6. Os resultados foram analisados utilizando o software Cardiomanager 540® (Cardio Sistemas Comerciais Industriais, São Paulo, Brasil) por um observador independente em busca de arritmias cardíacas.

 Ensaios moleculares e enzimáticos

Todos os pacientes incluídos foram submetidos a dígito punção de sangue capilar e amostras coletadas em papel de filtro e colocadas para secar por 3-4 horas à temperatura ambiente, armazenadas em envelope plástico a 4°C e enviadas ao Centogene Laboratory (Rostock, Alemanha).

A análise molecular para determinar as mutações do gene GLA foi realizada nas amostras dos indivíduos do sexo feminino, enquanto a análise de mutação foi realizada após evidência de baixa atividade de α-Gal A em indivíduos do sexo masculino. O nível de expressão e a atividade enzimática do biomarcador liso-Gb3 foram identificados através de cromatografia líquida de alta performance e espectrometria de massa em tandem.

O gene GLA foi analisado utilizando reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento de todas as regiões codificadoras e limites exon-intron altamente conservados através de sequenciamento de próxima geração com Illumina HiSeq (Illumina, Califórnia, EUA). A análise do gene GLA foi realizada em todos os pacientes com CMH.

 Análises estatísticas

Os dados foram analisados de forma descritiva utilizando o software Statistical Package for Social Sciences, versão 20.0 (IBM Company, Armonk, NY, EUA). Antes de analisar as variáveis contínuas, os conjuntos de dados foram testados quanto à normalidade através do teste de Shapiro-Wilk. Variáveis contínuas com distribuição normal foram apresentadas com medidas de tendência central e dispersão (média e desvio-padrão), e as variáveis categóricas foram descritas como frequências absolutas (n) e relativas (%). A análise comparativa foi realizada pelo teste de qui-quadrado de Pearson para variáveis categóricas. As variáveis numéricas foram analisadas usando o teste t de Student pareado. O nível de significância foi definido como 5% através de toda a análise estatística (p < 0,05).

O teste t de Student pareado foi utilizado para comparar as características basais de ambos os grupos, HCM e com mutações no gene GLA, e o teste qui-quadrado de Pearson foi utilizado para identificar quaisquer associações entre as variáveis clínicas.

 Padrões éticos

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional e foi realizado de acordo com a Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde, que trata das diretrizes e normas para pesquisas envolvendo seres humanos. A investigação também foi conduzida de acordo com a Declaração de Helsinque. O consentimento livre e informado foi obtido de todos os pacientes antes da inclusão neste estudo.

 Resultados

Foram incluídos 60 pacientes com diagnóstico ecocardiográfico de CMH submetidos a testes moleculares para DF. Sua idade variou de 12 a 85 anos (média de 42,3 ± 17) e 60% (n = 36) eram mulheres. Quatro pacientes, sendo três mulheres, apresentaram mutações no gene GLA, correspondendo a 6,7% da nossa amostra.

Síncope e dispneia foram os sintomas cardíacos mais frequentes em todos os pacientes. A cardiomiopatia hipertrófica septal assimétrica foi o tipo mais frequente em pacientes sem mutações no gene GLA (61,5%) e no grupo com mutação no GLA (50%). A FE foi semelhante em ambos os grupos. Os padrões eletrocardiográficos mais comuns de todos os pacientes foram hipertrofia ventricular esquerda (37,9%), bloqueio atrioventricular (13,8%) e bloqueio de ramo esquerdo (10,3%). As características clínicas e epidemiológicas da nossa amostra são mostradas na Tabela 1.

Características clínicas e resultados de exames complementares de pacientes
CMH (n = 56) Mutação do GLA (n = 4) p-valor
Idade (anos) 42,3 ± 17,0 58,5 ± 15,2 0,11
Sexo (feminino) 59,9% 75% 0,53
FE (%)† 67,6 ± 8,6 65,0 ± 4,2 0,43
Sintomas Cardíacos Dispneia 8% 25% 0,80
Dor Precordial 5% -
Síncope 17,5% 50%
Palpitação 5% -
Tontura 7% -
Predominância de HVE † Apical 5,56% 25% 0,38
Concêntrica 25% 25%
AS 61,1% 50%
AM 0,05% -
HMP 2,78% -
HVM (mm) † 19,1 ± 6,4 18,7 ± 0,9 0,98
Fibrose na RM (%) 11,0 ± 13,9 12,0 ± 11,6 0,82
Alteração no ECG VSVE 38,5% 100% 0,83
AEA 10,3% -
RVA 28,6% -
BCRE 10,3% 25%
BAV 5,1% 50%
QRSFrag 20,5% -

CMH: cardiomiopatia hipertrófica; FE: fração de ejeção; HVE: hipertrofia ventricular esquerda; AS: assimétrica septal; AM: ânteromedial; HMP: hipertrofia do músculo papilar; HVM: hipertrofia ventricular máxima; RM: ressonância magnética; ECG: eletrocardiograma; VSVE: via de saída do ventrículo esquerdo; AEA: átrio esquerdo aumentado; RVA: repolarização ventricular anormal; BCRE: bloqueio de ramo esquerdo; BAV: bloqueio atrioventricular; QRSFrag: fragmentação de QRS.

medida via ecocardiografia transtorácica (ETT).

Três mutações com variantes heterozigotas foram encontradas: c.967C>A (p.Pro323Thr), a qual é uma nova mutação ainda não descrita na literatura (Figura 1); c.937G>T (p.Asp313Tyr); e c.352C>T (p.Arg118Cys). Uma variante homozigota também foi encontrada: c.352C>T (p.Arg118Cys). Cinco pacientes do sexo masculino foram submetidos à análise molecular devido à baixa atividade da enzima α-Gal A; no entanto, nenhum deles apresentava mutações no gene GLA. As características clínicas e epidemiológicas dos pacientes com mutações no GLA estão descritas na Tabela 2.

Cromatograma da nova mutação do gene GLA: c.967C>A (p.Pro323Thr).

Características clínicas e resultados de exames complementares de pacientes com DF
Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3 Paciente 4
Idade (anos) 69 39 72 53
Sexo F F F M
Sintomas Cardíacos Síncope Síncope, dispneia Não Não
Sintomas Extracardíacos AIT Acroparestesia, intolerância ao calor/frio, alterações de humor Acroparestesia, trombose arterial AVCi
ECG FCN, SVE, BAVPG, BCRE FCN, SVE FCN, SVE, BAVPG FCN, SVE
Holter de 24h 8 episódios de TV, 677 CVP Sem arritmias AFib Paroxística Sem arritmias
EF† 67% 60% 70% 65%
Predominância de HVE† Apical Hipertrofia septal assimétrica Hipertrofia septal assimétrica Concêntrica
HVM (mm)† 19 20 18 18
Disfunção diastólica† Leve Pseudo-normal Leve Leve
LVOTO† Não Não No Não
Fibrose na RM 6% 28% 13% 1,36%
MSF Yes Yes No No
CDI Yes Yes No No
Mutação no gene GLA c.967C>A (p. Pro323Thr) c.937G>T (p.Asp313Tyr) c.352C>T (p.Arg118Cys) c.352C>T (p.Arg118Cys)
Alto nível de lyso-Gb3 Não Não Não Não
Baixo nível de α-Gal A NM NM NM Sim
Proteinúria Não Não Sim Não

F: feminino; M: masculino; AIT: ataque isquêmico transitório; AVCi: acidente vascular cerebral isquêmico; ECG: eletrocardiograma; FCN: frequência cardíaca normal; SVE: sobrecarga ventricular esquerda; BAVPG: bloqueio atrioventricular de primeiro grau; BCRE: bloqueio de ramo esquerdo; TV: taquicardia ventricular, CVP: contração ventricular prematura; AFib: fibrilação atrial; FE: fração de ejeção; HVE: hipertrofia ventricular esquerda; HVM: hipertrofia ventricular máxima; LVOTO: obstrução da via de saída do ventrículo esquerdo; RM: ressonância magnética; MSF: morte súbita familiar; CDI: cardioversor-desfibrilador implantável; NM: não medido.

medição via ecocardiografia transtorácica (ETT).

Discussão

Em nossa amostra de 60 pacientes com CMH, determinamos através de testes moleculares que a prevalência de mutações no GLA foi de 6,7%. Além disso, encontramos uma nova mutação no gene GLA. A reposição de enzimas foi iniciada em um paciente com mutação no GLA.

A DF tem herança ligada ao X. O distúrbio clássico ligado ao cromossomo X geralmente mostra uma transmissão vertical, na qual as mulheres heterozigotas transmitem o alelo para sua descendência. A maioria das mutações nos genes ligados ao X resulta em doenças que só ocorrerão em homens. No entanto, algumas doenças ligadas ao cromossomo X apresentam diferentes taxas de penetrância e expressividade em ambos os sexos. Na DF, os indivíduos heterozigotos (mulheres) geralmente são afetados, mas tendem a ter um fenótipo mais leve e mais variável do que os homozigotos (homens).20

Estima-se que a prevalência de DF seja de 0,02-0,09: 10.000 na população geral, embora a triagem molecular em recém-nascidos tenha sugerido uma prevalência maior.21,22 Em relação à variante cardíaca, a prevalência pode ser de até 12%, dependendo do método utilizado.23-26

A média da HVM em pacientes com mutação do GLA em nossa amostra foi maior do que a encontrada em estudos anteriores. A média da HVM foi de 11,6 ± 3,3 mm no estudo de Koskenvuo et al.,27 e, apenas, oito pacientes tinham HVE. A média da HVM foi de 16,7 ± 1,9 mm no estudo de Takenaka et al.,28 mais próximo do encontrado neste estudo. Pacientes com mutação no gene GLA foram selecionados de uma amostra de CMH, o que pode explicar a tendência para os valores médios mais elevados da HVM. Em nosso estudo, pacientes com mutações no GLA tinham média de idade maior. Esse achado talvez possa ser atribuído ao fato de que a variante cardíaca da DF apresentar início mais tardio.

Em relação ao padrão de hipertrofia, a DF está predominantemente associada à hipertrofia concêntrica.29 No entanto, alguns estudos encontraram maior prevalência da variedade assimétrica,25 o que está de acordo com nossos resultados. Essa variedade é geralmente associada às formas graves da doença.25,29

O bloqueio atrioventricular estava presente nos achados eletrocardiográficos (ECG) em dois pacientes com mutação do GLA (50%), o que está de acordo com achados de estudos anteriores.29 Entretanto, anormalidades de repolarização foram comuns em pacientes com CMH, mas não em pacientes com DF, como esperado. Essas anormalidades estão associadas à hipertrofia concêntrica leve.30 Em nosso estudo, apenas um paciente apresentou hipertrofia concêntrica, o que pode explicar a ausência de anormalidades de repolarização nos resultados do ECG de nossos pacientes com mutação do GLA.

A média do porcentual de fibrose miocárdica na RM foi 12 ± 11,6% e 10,5 ± 13,7% em pacientes com mutação do GLA e sem mutação, respectivamente. No entanto, não houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos comparados (p = 0,85). Embora a apresentação clínica da DF tenha sido bem descrita, o mecanismo fisiopatológico que liga o acúmulo intracelular de Gb3 ao dano tecidual e às manifestações clínicas ainda não está bem estabelecido.31 Pressupõe-se que o armazenamento intracelular de Gb3 desencadeie importantes cascatas fisiopatológicas relacionadas aos processos inflamatórios, levando a alterações celulares miocárdicas e, com o tempo, à fibrose.31-33

A mutação do GLA não foi associada a nenhum padrão específico de realce tardio pelo gadolínio (RTG) na ressonância magnética. O paciente 2 mostra o RTG no septo médio ventricular basal, septo anterior, segmento lateral inferior e apical do ventrículo esquerdo. O paciente 3 mostra o RTG no septo interventricular, na parede inferior e nos pontos de inserção do ventrículo direito. O paciente 4 mostra o RTG nos segmentos basais do septo inferior e segmentos da parede inferior do ventrículo direito. Informações sobre o RTG no paciente 1 não estavam disponíveis.

Uma das variantes encontradas não foi descrita em estudos anteriores nos bancos de dados do Exome Aggregation Consortium, Exome Sequencing Project ou 1000 Genomes Browser. A variante c.967C>A (p.Pro323Thr), está localizada no exon 6 do gene GLA. Esta mutação resulta na substituição de um aminoácido de treonina por um aminoácido prolina na posição 323 da proteína. Esta posição mostra um nucleotídeo altamente conservado e um aminoácido altamente conservado, com diferenças físico-químicas moderadas entre os aminoácidos prolina e treonina. Ela apresenta características de patogenicidade, com base na análise utilizando os programas Polyphen-2, SIFT, MutationTaster e Align-GVGD. O paciente 1, portador dessa mutação, apresentava defeitos cardíacos graves, manifestando-se como arritmia e hipertrofia, sem outras causas explicáveis.

A variante 352C>T (p.Arg118Cys) no exon 2 do gene GLA foi inicialmente descrita como sendo patogênica por Spada et al.,34 De acordo com Ferreira et al.,35 a deficiência enzimática moderada relacionada à variante p.Arg118Cys pode não ser suficiente para causar complicações maiores da DF, sugerindo baixa patogenicidade.35 Essa mutação foi encontrada em dois pacientes não aparentados (pacientes 3 e 4), ambos com HVE. O paciente 3 também apresentou bloqueio atrioventricular de primeiro grau e fibrilação atrial paroxística no ECG, bem como proteinúria. O paciente 4 tinha histórico de acidente vascular cerebral isquêmico. Apesar da controvérsia sobre a patogenicidade dessa variante, os autores acreditam que ela pode causar manifestações órgão-específicas, tais como comprometimento cardíaco e cerebral.

Com relação à terceira variante encontrada no exon 6 do gene GLA, GLA c.937G> T (p.Asp313Tyr) no paciente 2, há também resultados contraditórios sobre sua patogenicidade. Alguns estudos mostraram que o genótipo D313Y não é responsável por lesões orgânicas graves similares àquelas associadas aos genótipos bem estabelecidos da DF clássica.36

Lenders et al.,36) e Niemann et al.,37) relataram que a presença dessa variante está potencialmente associada a lesões importantes da substância branca no sistema nervoso central.36,37 A paciente apresentava hipertrofia cardíaca grave, história de hipertensão arterial sistêmica descontrolada e queixava-se de dor generalizada com labilidade emocional. Ela vem recebendo terapia de reposição enzimática há seis meses e tem mostrado melhora significativa dos sintomas e controle da pressão arterial.

O estudo das variantes c.937G>T (p.Asp313Tyr) e c.352C>T (p.Arg118Cys) mostra resultados contraditórios na literatura, mas os autores acreditam que as mesmas sejam patogênicas. A variante p. Asp313Tyr, encontrada neste grupo, foi identificada em membros da mesma família e todos seguem a herança ligada ao X, com hipertrofia e sintomas cardíacos importantes. Em relação à p.Arg118Cys, que também mostrou resultados controversos na literatura, foi encontrada em dois pacientes de diferentes famílias nesse grupo. Um é um homem homozigoto com hipertrofia cardíaca e acidente vascular cerebral isquêmico; a outra é uma paciente heterozigota, também com hipertrofia cardíaca, trombose arterial e proteinúria. Os autores estão atualmente trabalhando com o objetivo de reunir mais evidências sobre a patogenicidade dessas variantes nos outros membros da família.

A nova variante encontrada, c.967C>A (p. Pro323Thr), parece ser patogênica, de acordo com a análise realizada com os softwares Polyphen-2, SIFT, MutationTaster e Align-GVGD. Como dito anteriormente, a paciente é uma mulher heterozigota com hipertrofia cardíaca e ataque isquêmico transitório, e a investigação dos membros da família sugere patogenicidade.

Embora as variantes 352C> T (p.Arg118Cys) e c.937G> T (p.Asp313Tyr) apresentem resultados controversos em relação à patogenicidade, o heredograma das famílias confirma uma herança ligada ao X. Um dos resultados mais relevantes do estudo foi a identificação de uma nova mutação no gene GLA que parece ser patogênica, além da identificação de outros 14 portadores entre os familiares dos quatro pacientes-índice. A probabilidade de realizar terapia de reposição enzimática e acompanhantes farmacológicos enfatiza a importância do diagnóstico precoce da DF38-40 e a busca para identificar a patogenicidade das variantes encontradas.

Limitações

As principais limitações do nosso estudo foram: a ausência de cálculo amostral, o pequeno tamanho da amostra devido à raridade da doença e o pequeno número de pacientes com mutações no GLA (as análises estatísticas foram limitadas). Além disso, a análise molecular dos genes sarcoméricos em pacientes com CMH não foi realizada.

O mapeamento de T1 foi realizado em imagens de ressonância magnética apenas para o paciente 4. No momento das outras avaliações por imagem, o mapeamento de T1 por RM não estava disponível em nossa instituição. Os autores entendem que uma biópsia renal ou cardíaca poderia ser realizada para confirmar a patogenicidade dessas variantes incertas.

 Conclusão

Neste estudo, a frequência de mutação no gene GLA em pacientes com cardiomiopatia hipertrófica foi de 6,7%. Uma nova mutação no exon 6 do gene GLA, c.967C>A (p.Pro323Thr), foi identificada. Pacientes com CMH podem ter mutações do GLA e a doença de Fabry deve ser excluída. Os níveis plasmáticos de liso-Gb3 parecem não ser suficientes para o diagnóstico, e a biópsia de órgãos deve ser considerada.

Fontes de financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Ândrea Virgínia Chaves-Markman pela Universidade Federal de Pernambuco.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães sob o número de protocolo 3076174. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.