Arq Bras CardiolabcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCtBCc3kMwQdLhptvTn5bsCFJS0066-782X2019000700011S0066-782X201900501010310.5935/abc.20190094Original ArticleCharacterization of Decellularized Human Pericardium for Tissue Engineering and Regenerative Medicine ApplicationsWollmannLuciana10000-0002-8525-3853SussPaula1MendonçaJoão1LuziaCesar1SchittiniAndressa10000-0002-2614-2934RosaGeorge Willian Xavier da1CostaFrancisco1TuonFelipe F.1Pontifícia Universidade Católica do ParanáCuritibaPRBrazilPontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, PR - BrazilMailing Address: Felipe F. Tuon Imaculada Conceição, 1155. Postal Code 80215-901, Curitiba, PR - Brazil E-mail: flptuon@gmail.com
Author contributions
Conception and design of the research: Wollmann L, Suss P; Acquisition of data: Wollmann L, Suss P, Mendonça J, Luzia C, Schittini A, Rosa GWX; Analysis and interpretation of the data: Luzia C, Tuon FF; Statistical analysis and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Tuon FF; Obtaining financing: Costa F; Writing of the manuscript: Suss P, Tuon FF.
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
2706201907201911311117220620181308201819092018This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.AbstractBackground:
Pericardium tissue allograft can be used for surgical repair in several procedures. One of the tissue engineering strategies is the process of decellularization. This process decreases immunogenic response, but it may modify the natural extracellular matrix composition and behavior.
Objective:
The aim of this study was to evaluate the effectiveness of cell removal, maintenance of extracellular matrix properties and mechanical integrity of decellularized human pericardium using a low concentration solution of sodium dodecyl sulfate.
Methods:
Decellularization was performed with sodium dodecyl sulfate and ethylenediaminetetraacetic acid. Histological analysis, DNA quantification, evaluation of glycosaminoglycans and collagen were performed. Biomechanical assay was performed using tensile test to compare the decellularization effects on tissue properties of tensile strength, elongation and elastic modulus. P < 0.05 was considered significant.
Results:
There was reduction in visible nuclei present in pericardium tissue after decellularization, but it retained collagen and elastin bundles similar to fresh pericardium. The DNA contents of the decellularized pericardium were significantly reduced to less than 511.23 ± 120.4 ng per mg of dry weight (p < 0.001). The biomechanical assay showed no significant difference for fresh or decellularized tissue.
Conclusion:
The decellularization process reduces cell content as well as extracellular matrix components without changing its biomechanical properties.
Development of extracellular matrix-derived bioscaffolds has been highly desired for applications in tissue engineering and regenerative medicine.1 These scaffolds can be obtained from a variety of allogeneic or xenogeneic tissue sources and from several different species.2 However, biomaterial antigenicity represents the primary barrier to expanding the use of xenogeneic tissues in clinical practice.3
Pericardium is a collagen-rich biological tissue containing glycoproteins and glycosaminoglycans3 and is readily available, easy to handle, and pliable. Human pericardium can be used as a patch for heart surgeries4 and non-heart surgeries (Peyronie's disease,4 glaucoma and corneal surgery,5,6 to cover exposed scleral buckles7 and oculoplastic surgery.8
Human pericardium patch is a well-recognized material for cardiovascular repair.4 The physicochemical features of autologous pericardium used for repair include fresh pericardium9,10 and glutaraldehyde-treated pericardium.11 However, the use of fresh autologous untreated pericardium can result in tissue retraction, thickening, fibrosis and loss of pliability12 and the use of glutaraldehyde-treated autologous pericardium can result in calcification.13
The main obstacle is the development of biocompatible and functional extracellular matrix-derived bioscaffold. The use of biological tissues increases the potential risks of pathogen transmission14 and inflammatory or immunogenic response.2,15 Decellularization techniques have been used to minimize these issues.16
Tissue decellularization can be performed by using different protocols, detergent extraction or enzymatic extraction with hypotonic or hypertonic washings and physical (agitation, sonication, mechanical pressure or freeze-thawing) treatments.2 The ideal decellularization method must remove all antigenic components (nucleic acids, cell membranes, cytoplasmic structures, lipids and soluble matrix) from the tissue without damaging extracellular matrix structure and integrity.17,18 However, the decellularization process can modify the natural extracellular matrix composition, as well as mechanical and structural characteristics.19 Furthermore, high levels of donor variability to naive ECM composition undoubtedly lead to different ECM fractional composition post-decellularization. Hence, ECM standardization as a biomaterial remains elusive.18 Several procedures of decellularization has been described, but this study evaluated low concentration of detergent.
The aim of this study was to evaluate the effectiveness of cell removal, maintenance of extracellular matrix properties and mechanical integrity of decellularized human pericardium using a low concentration solution of sodium dodecyl sulfate.
Methods
All procedures followed the Brazilian National Regulations and Guidelines according to Regulatory Ordinance nº 2.600, published on October 21, 2009 and ANVISA Resolution - RDC n° 55, published on December 11, 2015. This study was approved by the Ethical Committee of Pontifícia Universidade Católica do Paraná (approval number 1.455.773).
Donors
Pericardium from 14 non heart-beating and heart-beating donors were obtained by convenience sampling under aseptic conditions. After heart explantation, the organ was placed in a tub with saline solution at 2-8 ºC and the intracavitary blood clots washed. The organ was placed in a sterilized plastic bag, immersed in ice-cold isotonic solution in sufficient quantity to maintain the organ totally immersed. This packaging was sealed, then packaged in two more plastic bags (configuring triple packaging), as each bag must be properly tied or sealed. The triple package containing the organ was placed in an airtight container and placed inside the thermal box in the middle of ice and transported to the human tissue bank (HTB). Dissection was carried out within 48 h after cardiac arrest. Tissue underwent dissection to remove connective tissue and the pericardial sac was cut into strips individually stored in saline solution at 2-8 ºC. Blood samples were tested for HIV, HTLV I/II, HBV, HCV, syphilis, cytomegalovirus (IgM and IgG), toxoplasmosis (IgM and IgG) and Chagas' disease. Donors data were retrieved from their medical records. Positive serology was criteria for rejection except toxoplasma IgG and cytomegalovirus IgG.
Microbiological control
Before tissue preparation, 30 mL of transport solution (sterile NaCl 0.9% solution) were obtained aseptically in a Class II-A laminar airflow cabinet with a syringe and distributed equally over to a recipient with 90 mL of thioglycolate (Laborclin, Pinhais, Brazil), 90 mL of tryptic soy broth (Laborclin, Pinhais, Brazil) and 90 mL of Sabouraud (Laborclin, Pinhais, Brazil) for bacteriological and mycological testing. The samples were cultured for 14 days at 35°C, 22°C and 22°C, respectively. Cultures were examined daily for visual evidence of turbidity. The ones that showed microorganisms growth were identified for genus and species level.
Tissue preparation and decontamination
Adherent adipose tissue was dissected with the aid of scissors and forceps. The pericardium was divided into two portions to characterize fresh pericardium versus decellularized pericardium. The pericardia were decontaminated in a RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) medium with antibiotics (240 µg/mL cefoxitin, 50 µg/mL vancomycin, 120 µg/mL lincomycin and 100 µg/mL polymyxin B) and were kept between 24 and 48 hours at 2-8°C. Persistent positive cultures after decontamination were used as exclusion criteria.
Decellularization
Briefly, the pericardia were treated under shaking conditions with a solution of 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) (w/v) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) and 7 mM ethylenediaminetetraacetic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) for 24 hours at room temperature. Then, they were washed with 70% ethanol (v/v) for 24 hours at room temperature followed by 10 days of washing with sodium chloride (NaCl) 0.9% solution (Baxter International, Deerfield, USA) to remove residual substances and cellular debris.
Histological analysis
Longitudinal 3.0 mm cuts with were fixed with neutral buffered formaline 10%, subsequently embedded in paraffin and 4-µm thick sections were taken. Pericardial morphological integrity was analyzed with hematoxylin and eosin (H&E) and Russell-Movat pentachrome (RMP) dyes using an optical microscope BX51 (Olympus Tokyo, Japan). Fresh pericardium was used as control to evaluate changes caused by decellularization. Slides were scanned using an Axio Scan.Z1 slide scanner (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany) and subsequent image preparation was performed using software Zen lite (Carl Zeiss, Jena, Germany).
DNA extraction and quantification
DNA quantification was used to determine the total remaining DNA by comparing the levels in fresh and decellularized pericardium. Tissue samples were weighted, purified and rehydrated using a QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, USA) according to the recommended protocol. The concentration of extracted DNA was determined using a Nanodrop spectrophotometer (ThermoFisher Scientific, Wilmington, USA). Extracted DNA sample (1 µL) was loaded onto the Nanodrop and the absorbance was determined at 260 nm. Four readings were taken for each sample and the mean was considered as the absorbance of the sample. DNA concentration was calculated and expressed as micrograms per milligram of dry tissue.
The pericardium was digested with papain solution at 60°C for 6 h. Papain (Sigma, St. Louis, MO) was dissolved at 400 mg/mL in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) with 5 mM cysteine hydrochloride and 5 mM EDTA. The lysates were used for detection of the sGAG amount. The amount of sGAG was measured using a Blyscan sGAG assay kit (Biocolor, Newtownabbey, UK) according to the manufacturer's manual. The tissue lysate was mixed with Blyscan dye to bind the GAG. The GAG-dye complex was then collected by centrifugation. Subsequently, the supernatant was removed and the tube drained, and the dissociation reagent was added. Then solution was transferred into a 96-well plate. Absorbance against the background control was obtained at a wavelength of 656 nm on a Versamax spectrophotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, USA). The sGAG amount was calculated based on a standard curve obtained with the standard sGAG supplied with the kit.
Collagen
Collagen contents in the pericardium were determined using the Sircol collagen assay (Biocolor, Newtownabbey, UK) according to the manufacturer's instructions. The pericardia were incubated for 48 h at 48°C in 0.5 M acetic acid containing 0.1 mg/ml pepsin. The samples were added to Sircol dye reagent, and collagen-dye complexes formed and precipitated out from the soluble unbound dye. After centrifugation, the pellet was washed once with Acid-Salt Wash Reagent and suspended in alkali reagent. The solution was transferred to a 96-well plate and the absorbance was read at 550 nm on a Versamax spectrophotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, USA). The amount of collagen was calculated based on a standard curve obtained with standard bovine type I collagen supplied with the kit.
Cytotoxicity Assay
Cytotoxicity of decellularized pericardium was performed in accordance with ISO 10993/5. L929 fibroblasts (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929) were seeded in 6-well plates (Nest) at a density of 1x105 cells/well. Each well, with inner diameter of 35 mm, received 4 mL of DMEM + 2mM Glutamine + 10% Fetal Bovine Serum. The plates were incubated for 48 h at 37ºC in an atmosphere of 5% ± 0.5% CO2 in the air, until a monolayer, with greater than 80% confluence. The medium was removed from the wells and replaced with agar 1.8% added to neutral red dye 0.01%. Samples in triplicate, positive, negative and blank controls on the agar overlay featured 6-well plates. After an incubation period of 24 h at 37 ºC in a humidified atmosphere of 5% ± 0.5% CO2 in air, the inhibition zone around the samples was measured, as neutral red is free from dead cells. The biological reactivity of the samples was scored from 0 to 4 in accordance with the following criteria: 0 = absent cytotoxicity (absence of a zone of lysis underneath the sample); 1 = slight (zones of cell lysis underneath the sample only); 2 = mild (zones of cell lysis ≤5 mm from the sample); 3 = moderate (zones of cell lysis>5 mm and ≤10 mm from the sample); 4 = severe (zones of cell lysis >10 mm, but not involving the entire well). In addition, the wells were examined with an inverted microscope (Nikon Eclipse TS 100; Nikon) to observe cell changes.
Biomechanical Assay
The biomechanical assay of human pericardium was performed with tensile test to compare the decellularization effects on tissue properties of tensile strength, elongation and elastic modulus. An EMIC DL 500 universal testing machine was used to perform the tests. The sample quantity of fresh and decellularized tissue used was 8 and 6 respectively, and collagen fibers traction direction was random. The dumbbell-shaped sample was based on the ASTM D1708-13 standard because of the small-size tissue available to the tests. To obtain the samples, it was necessary to manufacture a steel rule die according to standard specifications, which was used to cut the pericardium. Before each test, sample thickness, width and initial length values were provided to the equipment. Thickness and width are necessary to calculate the cross-sectional area and consequently the stress (equation 1). Initial length is necessary to calculate the strain and consequently the elongation percentage (equation 2). Thickness was measured with a thickness gauge at three points of the tissue. Pre-load of 0.1 N and 5 mm/min velocity were applied to the test.
Equation 1. Stress calculation.
σ=F/A
where:
σ is the stress in megapascal [MPa];
F is the force in newton [N] and
A is the cross-sectional area in square millimeter [mm2].
Equation 2. Calculation of elongation percentage.
%El=∆L/Li×100=ε×100
where:
%El is the elongation percentage;
ΔL is the variation of sample length in millimeters [mm];
Li is the initial sample length in millimeters [mm] and
ε is the strain in millimeters per millimeter [mm/mm].
Statistical analyses
Continuous variables with normal distribution were expressed as mean ± SD and median and interquartile range for non-normal distribution, while categorical variables were expressed as frequencies or percentages. Mann-Whitney was used for non-normal distribution of continuous variables, t-test for normal distribution of continuous variables. All tests were two-tailed, and p value < 0.05 was considered significant. Statistical analyses were carried out using SPSS 23.0.
ResultsDonors' characteristics
The mean age was 39 ± 14 years ranging between 17 and 59 years old. Regarding race, among the samples used, there was a preponderance of donors declared white, 86% (n = 12) of the total and 7% (n = 1) declared themselves as Afro-descendants. An additional 7% (n = 1) was not recorded in the forms.
Microbiological assessment
Transport solution was positive in 5 samples from 14. Corynebacterium spp., Streptococcus salivarius, Staphylococcus aureus, Klebsiella oxytoca, Anaerococcus prevotii and Leuconostoc pseudomesenteroides were the bacteria identified. Other microbiological tests after decontamination and decellularization were negative.
Analysis of extracellular matrix integrity and cell removal
H&E and DAPI staining revealed a reduction in visible nuclei present in pericardium tissue after decellularization (Figure 1A, B, D and E). The main extracellular matrix components were examined in RMP staining (collagen - yellow, elastin - black, and glycosaminoglycans - blue). The structure of the decellularized pericardium extracellular fibers retained collagen and elastin bundles similar to fresh pericardium. However, there was increased thickness of the decellularized tissue compared with the fresh one (Figure 1 C and F).
Histological characterization of fresh and decellularized human pericardium. H&E and DAPI staining showed no evidence of cell in the tissue sections (D and E). H&E and RPM staining showed that decellularization did not affect the structure of collagen bundles. Howevers there was a reduction of collagen and increased thickness of the decellularized tissue compared with the fresh one (D and F).
DNA quantification
Fresh pericardium tissue with complete cellular contents had a DNA amount as high as 1591±726 ng per mg dry weight. The DNA contents of the decellularized pericardium were significantly reduced to less than 511.23±120.4 ng per mg dry weight. (p < 0.001) (table 1).
Collagen, glycosaminoglycan and DNA content of fresh and decellularized human pericardium
Collagen µg/mg
Glycosaminoglycan µg/mg
DNA ng/mg
Fresh pericardium
126.9 ± 45.8
0.64 ± 0.50
1591 ± 726.0
Decellularized pericardium
138.3 ± 58.6
0.02 ± 0.06
511.23 ± 120.4
P value
0.716
0.014
< 0.001
Effect of decellularization on sulfated glycosaminoglycan and collagen content
The concentration of collagen per mg of dry weight of human pericardium tissue before and after decellularization was 126.9 ± 45.8 and 138.3 ± 58.6 µg/mg of dry tissue, respectively (p = 0.716). Quantification of collagen content in fresh pericardium demonstrated a small increase in the collagen content of the tissue after decellularization. sGAG content was determined to be 0.64±0.50 and 0.02 ± 0.06 sGAG per mg of dry tissue, respectively. (p = 0.014)
Cytotoxicity assay
Decellularized human pericardium (n = 3) was incubated for 24 h (Figure 2A). The samples from the decellularized pericardium had no effect on the cells, as indicated by their normal cell morphology after incubation for 24 h. The negative control also had no effect on the cells (Figure 2B). In contrast, latex (positive control) caused cell death (Figure 2C).
Agar overlay cytotoxicity assay. Testing image after 24 hours in contact with agar-overlay. Decellularized human pericardium (A), negative control (B) and positive control (C).
Biomechanical Assay
Average human pericardium thickness showed no significant difference (Welch's t test: p = 0.9518), which was 0.45 ± 0.06 mm for fresh tissue and 0.44 ± 0.05 mm for the decellularized tissue. Tensile strength, elongation and elastic modulus are presented as column scatter plot graphs (Figure 3A, B and C) showing the mean and standard deviation. The mean difference among the groups was not significant for all properties (p > 0.05). The average stress-strain curve of fresh and decellularized tissue are presented in Figure 3D, which shows the typical behavior for biological tissues as previously described.20 It is also possible to observe that the behavior of curves was similar in the initial phase until transition phase, keeping approximate parallels until maximum stress.
Graphical representation of the mechanical parameters obtained for fresh and decellularized human pericardium. (A) Tensile strength [MPa]; (B) elongation [%]; (C) elastic Modulus [MPa] and (D) the curves indicate the mean stress-strain behavior of fresh and decellularized human pericardium
Discussion
The aim of decellularization is to minimize the immune response by completely removing cellular components as well as preserving the physical characteristics of the extracellular matrix.2,21 The ideal decellularized tissue must achieve complete decellularization and preservation of the extracellular matrix for biomechanical stability and function, but it is recognized that any decellularization protocol may result in extracellular matrix disruption and potential loss of surface structure and composition.2
In the histological analysis, this study revealed that most cellular components were removed, but some components of the extracellular matrix were reduced and the decellularized tissue thickness increased. Similar findings were reported by Courtman et al.22 with a 3-fold increase in tissue thickness. However, Mirsadraee et al.23 did not observe any significant changes using an SDS-based decellularization protocol in the histological analysis comparing both fresh and decellularized human pericardium.
In this study, decellularized human pericardium got a small increase in the collagen content and a significant reduction in sGAG content. In agreement with our observation, Mendoza-Novelo et al.24 reported a reduction in fresh pericardium tissue sGAG content after decellularization with surfactant tridecyl alcohol ethoxylate and reversible alkaline swelling.24 On the other hand, a study by Mirsadraee et al.23 reported a small increase in hydroxyproline and GAG content in the tissue after decellularization.23 The authors concluded that increase of hydroxyproline was due to a relative increase in the ratio of these molecules regarding total dry weight, due to the loss of soluble proteins and cell components.
In order to ensure adequate residual removal, contact cytotoxicity assays were performed to determine the effect of any chemical residuals in the decellularized tissue on the growth of cultured L929 cells. Assay results showed that cells grew well in contact with samples of decellularized human pericardium, indicating that the decellularized tissues were non-toxic. This result also correlates with previous study on decellularized human pericardium.23
We compared the mechanical properties of fresh and decellularized pericardium and there were no significant differences between them. SDS-based decellularization by itself does not modify the performance of human pericardium as for the parameters of tensile strength, elongation and elastic modulus. These results were previously assessed in the acellular human pericardium.23 In a more recent work, the biomechanical properties of decellularized and cryopreserved human pericardium were preserved in comparison with fresh tissue.25
Nevertheless, this study did not evaluate the outcome of implanted human decellularized pericardium. In vitro analysis is not enough to confirm complete decellularization. The maintenance of extracellular matrix in this study does not allow to determine that all molecular and physiological properties are really ideal.
Conclusion
The decellularization process reduces cell content as well as extracellular matrix components and increases thickness without changing the biomechanical properties of the decellularized tissue compared with the fresh one. Decellularized human pericardium may be a suitable candidate for the production of extracellular matrix-derived scaffolds for tissue engineering and regenerative medicine applications.
Sources of Funding
This study was funded by Fundo Nacional de Saúde - Ministério da Saúde - projeto nº 814611/2014.
Study Association
This study is not associated with any thesis or dissertation work.
Ethics approval and consent to participate
This article does not contain any studies with human participants or animals performed by any of the authors.
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Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa: Wollmann L, Suss P; Obtenção de dados: Wollmann L, Suss P, Mendonça J, Luzia C, Schittini A, Rosa GWX; Análise e interpretação dos dados: Luzia C, Tuon FF; Análise estatística e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Tuon FF; Obtenção de financiamento: Costa F; Redação do manuscrito: Suss P, Tuon FF.
Potencial conflito de interesses
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
ResumoFundameto:
O enxerto de pericárdio pode ser usado em muitos procedimentos de correção cirúrgica. Uma das estratégias da engenharia tecidual é o processo de descelularização. No entanto, embora esse processo diminua a resposta imunogênica, a descelularização pode modificar tanto o comportamento como a composição da matriz extracelular natural.
Objetivos:
Avaliar a eficácia da descelularização usando baixa concentração de dodecil sulfato de sódio na remoção celular, na manutenção das propriedades da matriz extracelular e na integridade mecânica do pericárdio humano descelularizado.
Métodos:
A descelularização foi realizada com dodecil sulfato de sódio e ácido etilenodiamino tetra-acético. Foi realizada análise histológica, quantificação de DNA, e avaliação de glicosaminoglicanos e colágeno. O estudo biomecânico foi conduzido pelo teste de tração para comparar os efeitos da descelularização sobre as propriedades teciduais de resistência à tração, alongamento e módulo de elasticidade. Foi considerado um valor de p < 0,05 como estatisticamente significativo.
Resultados:
Observou-se uma redução na quantidade de núcleos presentes no pericárdio após a descelularização, apesar de manter quantidades similares de feixes de elastina e de colágeno. As concentrações de DNA do pericárdio descelularizado foram significativamente reduzidas para menos que 511,23 ± 120,4 ng por mg de peso seco (p < 0,001). O teste biomecânico não apontou diferenças entre os tecidos fresco e descelularizado.
Conclusão:
A descelularização reduziu a concentração de células bem como os componentes da matriz extracelular sem afetar suas propriedades biomecânicas.
Palavras-chavePericárdioBancos de TecidosEngenharia Tecidual/tendênciasSeparação CelularGlicosaminoglicanosIntrodução
O desenvolvimento de bioscaffolds a partir da matriz extracelular (MEC) tem sido muito almejado para uso na engenharia tecidual e medicina regenerativa.1 Esses scaffolds podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes teciduais alogênicas e xenogênicas de diferentes espécies.2 No entanto, a antigenicidade do biomaterial representa a primeira barreira para se expandir o uso de tecidos xenogênicos na prática clínica.3
O pericárdio é um tecido biológico rico em colágeno contendo glicoproteínas e glicosaminoglicanos.3 Trata-se de um tecido prontamente disponível, maleável e de fácil manipulação. O pericárdio humano pode ser usado como um remendo (patch) em cirurgias cardíacas4 e não cardíacas, tais como na doença de Peyronie,4 glaucoma, e cirurgia de córnea5,6 para cobrir explantes esclerais7 e oculoplastias.8
O patch de pericárdio humano é um material bem conhecido na cirurgia cardiovascular.4 Quanto às características físico-químicas, o pericárdio autólogo usado em cirurgia inclui pericárdio fresco9,10 e pericárdio tratado com glutaraldeído.11 Porém, enquanto o uso de pericárdio autólogo fresco não tratado pode resultar em retração, espessamento, fibrose e perda de maleabilidade do tecido,12 o uso do pericárdio autólogo tratado com glutaraldeído pode resultar em calcificação.13
Assim, o principal desafio é o desenvolvimento de bioscaffold derivado da MEC que seja biocompatível e funcional. O uso de tecidos biológicos aumenta os riscos potenciais de transmissão de patógenos14 e resposta inflamatória ou imunogênica.2,15 As técnicas de descelularização têm sido usadas para minimizar essas questões.16
A descelularização tecidual pode ser realizada utilizando-se diferentes protocolos, extração com detergente ou extração enzimática com soluções hipotônicas ou hipertônicas e tratamentos físicos (agitação, sonicação, pressão mecânica, congelamento-descongelamento).2 O método ideal de descelularização deve remover todos os componentes antigênicos (ácidos nucleicos, membranas celulares, estruturas citoplasmáticas, lipídios e matriz solúvel) do tecido sem danificar a estrutura e a integridade da MEC.17,18 Contudo, o processo de descelularização pode modificar a composição natural da MEC, bem como suas características mecânicas e estruturais.19 Ainda, altos níveis de variabilidade dos doadores quanto à composição da MEC leva à diferente composição fracionária da MEC após a descelularização. Assim, a padronização da MEC como um biomaterial ainda é um desafio.18 Apesar de vários procedimentos de descelularização já terem sido descritos, o presente estudo avaliou a utilização de baixa concentração de detergente.
O objetivo deste estudo foi avaliar a remoção celular, a manutenção das propriedades da MEC e a integridade mecânica do pericárdio humano após o processo de descelularização utilizando uma solução com baixa concentração de dodecil sulfato de sódio.
Métodos
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Portaria número 2600 do Ministério da Saúde, publicada em 11 de dezembro de 2009, e resolução RDC n° 55 da ANVISA, publicada em 11 de dezembro de 2015. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Pontifícia Universidade Católica do Paraná (protocolo número 1.455.773).
Doadores
Foi obtido, sob condições assépticas, pericárdio de 14 doadores em PCE e ME por amostragem de conveniência. Após o explante do coração, o órgão foi colocado em uma cuba contendo solução salina a 2-8ºC, e os coágulos intracavitários foram lavados. O órgão foi colocado em um saco plástico esterilizado, imerso em (NaCl 0,9%) gelada em quantidade suficiente para manter o órgão totalmente imerso. Esse saco foi lacrado, e colocado em dois outros sacos plásticos (embalagem tripla), de modo que cada saco foi adequadamente amarrado ou selado. A embalagem contendo o órgão foi colocado em um recipiente hermético e armazenado dentro de uma caixa térmica com gelo e transportado para o banco de tecidos humanos. A dissecção foi realizada dentro de 48 horas da parada cardíaca. Realizou-se dissecção do tecido para remoção de tecido conjuntivo, e o saco pericárdico cortado em tiras, as quais foram armazenadas individualmente em solução salina a 2-8ºC. As amostras sanguíneas foram testadas para HIV, HTLV I/II, HBV, HCV, sífilis, citomegalovírus (IgM e IgG), toxoplasmose (IgM e IgG) e doença de Chagas. Os dados dos doadores foram obtidos dos prontuários médicos. Qualquer sorologia positiva foi usada como critério de exclusão, exceto IgG positivo para toxoplasmose e IgG para citomegalovírus.
Controle microbiológico
Antes do preparo do tecido, 30mL de solução de transporte (solução NaCl 0,9%) foi obtida assepticamente com uma seringa em cabine de segurança biológica classe II-A, e igualmente distribuída em um recipiente de 90mL contendo tioglicolato (Laborclin, Pinhais, Brasil), 90mL de caldo de soja tríptico (Laborclin, Pinhais, Brasil) ou 90mL de ágar Sabouraud (Laborclin, Pinhais, Brasil) para análise bacteriológica e micológica. As amostram foram cultivadas por 14 dias a 35°C, 22°C e 22°C, respectivamente. As culturas foram examinadas diariamente quanto à evidência visual de turvação; aquelas que apresentavam crescimento de microrganismos foram identificadas quanto ao gênero e espécie.
Preparo do tecido e descontaminação
O tecido adiposo foi dissecado com auxílio de tesouras e pinças. O pericárdio foi dividido em duas partes para caracterizar o pericárdio fresco versus pericárdio descelularizado. Os pericárdios foram descontaminados em meio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) contendo antibióticos (240 µg/mL cefoxitina, 50 µg/mL vancomicina, 120 µg/mL lincomicina e 100 µg/mL polimixina B), e mantidos a 2-8°C por 24-48 horas. Culturas que permaneciam positivas após a descontaminação foram usadas como critérios de exclusão.
Descelularização
Em resumo, os pericárdios foram tratados sob agitação com uma solução de dodecil sulfato de sódio (SDS, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) a 0,1% P/V. Em seguida, foram lavados com etanol a 70% (V/V) por 24 horas em temperatura ambiente, seguido de 10 dias de lavagem com cloreto de sódio (0,9%) para remoção de substâncias residuais e fragmentos celulares.
Análise histológica
Cortes longitudinais de 3,0 mm foram fixados com formalina tamponada neutra a 10% e em seguida em parafina. Cortes de 4 µm de espessura foram depois realizados. Para análise da integridade morfológica do pericárdio, realizou-se marcação com hematoxilina e eosina (H&E) e Russell-Movat (RMP), e utilizou-se um microscópio ótico BX51 (Olympus Tóquio, Japão). Pericárdio fresco foi usado como controle para avaliar mudanças causadas pela descelularização. As lâminas foram examinadas utilizando-se um scanner Axio Scan.Z1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha), e o preparo das imagens foi realizado usando-se o programa Zen lite (Carl Zeiss, Jena, Alemanha).
Extração e quantificação de DNA
A quantificação de DNA foi usada para determinar o total de DNA remanescente comparando-se seus níveis no pericárdio fresco e no pericárdio descelularizado. As amostras de tecidos foram pesadas, purificadas e reidratadas usando-se o kit QIAGEN DNeasy para amostras de sangue ou tecido (QIAGEN, Valencia, EUA), seguindo-se protocolo recomendado. A concentração de DNA extraído foi determinada usando o espectrofotômetro Nanodrop (ThermoFisher Scientific, Wilmington, EUA). A amostra de DNA extraída (1 µL) foi colocada no Nanodrop, e a absorbância determinada a 260 nm. Foram realizadas quatro leituras para cada amostra, e a média foi considerada como a absorbância da amostra. A concentração de DNA foi calculada e expressa em microgramas por miligrama de tecido seco.
O pericárdio foi digerido com uma solução de papaína a 60 oC por 6 horas. A papaína (Sigma, St. Louis, MO) foi dissolvida a 400 mg/mL em tampão fosfato 0,1 M (pH 6,0) contendo hidrocloreto de cisteína 5mM e EDTA 5mM. Os produtos da lise foram usados para detecção da quantidade de GAGs, a qual foi medida usando-se o kit Blyscan (Biocolor, Newtownabbey, Reino Unido), seguindo-se o manual do fabricante. O lisado de tecido foi misturado com o corante Blyscan para esse se ligar ao GAG. O complexo GAG-corante foi então coletado por centrifugação. Subsequentemente, o sobrenadante foi removido, o tubo drenado, e em seguida adicionou-se o reagente de dissociação. A solução foi então transferida para uma placa de 96 poços. A absorbância em relação ao controle de referência foi obtida a um comprimento de onda de 656 nm em um espectrofotômetro VersaMaxTM (Molecular Devices, Sunnyvale, EUA). A quantidade de GAGs foi calculada com base na curva padrão obtida com o GAG padrão do kit.
Colágeno
A concentração de colágeno no pericárdio foi determinada pelo ensaio Sircol (Biocolor, Newtownabbey, Reino Unido), seguindo-se as instruções do fabricante. Os pericárdios foram incubados a 48oC por 48 horas em ácido acético 0,5M contendo pepsina 0,1 mg/mL. As amostras foram adicionadas ao corante Sircol, e os complexos colágeno-corantes foram formados e precipitados. Após a centrifugação, o precipitado foi lavado uma vez com solução de lavagem e suspenso em reagente alcalino. A solução foi transferida para uma placa de 96 poços e a leitura da absorbância realizada pelo espectrofotômetro VersaMaxTM (Molecular Devices, Sunnyvale, EUA) a 550 nm. A quantidade de colágeno foi calculada com base em uma curva padrão obtida com colágeno tipo I bovino padrão fornecido no kit.
Análise de citotoxicidade
A citotoxicidade do pericárdio descelularizado foi avaliada de acordo com ISO 10993/5. Fibroblastos L929 (ATCC linhagem CCL 1, NCTC clone 929) foram semeados em placas de seis poços (Nest) em uma densidade de 1x105 células/poço. Em c2mM + soro bovino fetal 10%. As placas foram incubadas por 48 horas a 37ºC em ambiente controlado (5% ± 0,5% de CO2) até que se obtivesse uma monocamada, em confluência superior a 80%. O meio foi removido dos poços e substituído com ágar 1,8% e corante vermelho neutro a 0,01%. Amostras em triplicata, controle positivo, negativo e branco sobre a camada de ágar configuraram as placas. Após incubação por um período de 24 horas a 37ºC em atmosfera umidificada (5% ± 0,5% de CO2), mediu-se a zona de inibição ao redor das amostras, uma vez que o vermelho neutro não contém células mortas. A reatividade biológica das amostras foi classificada de 0 a 4 de acordo com os seguintes critérios: 0=ausência de citotoxicidade (ausência de uma zona de lise sob a amostra); 1=leve (zonas de lise celular somente sob a amostra); 2=baixa (zonas de lise celular ≤5 mm da amostra); 3=moderada (zonas de lise celular >5 mm e ≤10 mm da amostra); 4=grave (zonas de lise celular >10 mm, sem envolver o poço inteiro. Além disso, os poços foram examinados com um microscópio invertido (Nikon Eclipse TS 100; Nikon) para avaliar alterações celulares.
Estudo biomecânico
O estudo biomecânico do pericárdio humano foi realizado pelo teste de tração para comparar os efeitos de descelularização sobre as propriedades teciduais de resistência de tração, alongamento e módulo de elasticidade. Os testes foram realizados pela máquina universal EMIC DL 500. Foram utilizadas oito amostras de tecido fresco e seis amostras de tecido descelularizado, e a direção de tração das fibras de colágeno foi aleatória. A amostra (forma de halteres, do inglês dumbbell-shaped) foi baseada no padrão ASTM D1708-13 devido ao pequeno tamanho do tecido disponível. Para obtenção das amostras, foi necessário a fabricação de um cortador de aço, seguindo-se especificações padrões, usado para cortar o pericárdio. Antes de cada teste, foram obtidos espessura, largura e comprimento inicial das amostras. A espessura e a largura são necessárias para cálculo da área transversal e consequentemente do estresse (equação 1). O comprimento inicial é necessário para cálculo da tensão e porcentagem de alongamento (equação 2). A espessura foi medida com um medidor próprio em três pontos do tecido. Aplicou-se uma pré-carga de 0,1 N e velocidade de 5mm/min.
Equação 1. Cálculo do estresse
σ=F/A
onde:
σ é o estresse, em Megapascal [MPa];
F é a força, em Newton [N] e
A é a área transversal em milímetros quadrado (mm2)
Equação 2. Cálculo da porcentagem de alongamento
%El=∆C/Ci×100=ε×100
onde:
%El é a porcentagem de alongamento;
ΔC é a variação do comprimento da amostra, em milímetros (mm);
Ci é o comprimento inicial da amostra em mm, e
ε é a tensão em mm/mm
Análise estatística
As variáveis contínuas com distribuição normal foram expressas em média ± desvio padrão (DP), e aquelas com distribuição não normal em mediana e intervalo interquartil SD. As variáveis categóricas foram expressas em frequências ou porcentagens. O teste t de Student e o teste de Mann-Whitney foram usado para variáveis contínuas de distribuição normal e não normal, respectivamente. Todos os testes foram bicaudais, e um valor de P ≤ 0,05 foi considerado significativo. A análise estatística foi realizada usando o SPSS 23.0.
ResultadosCaracterísticas dos doadores
A idade média dos doadores foi 39 ± 14 anos, variando entre 17 e 59 anos. A maioria n = 12 (86%) dos doadores se autodeclarou como brancos e um indivíduo como afrodescendente n = 1 (7%). A raça de um paciente (7%) não foi encontrada registrada.
Avaliação microbiológica
Solução de transporte foi positiva em cinco das 14 amostras. Foram identificadas as bactérias Corynebacterium spp., Streptococcus salivarius, Staphylococcus aureus, Klebsiella oxytoca, Anaerococcus prevotii e Leuconostoc pseudomesenteroides. Os demais testes microbiológicos após descontaminação e descelularização foram negativos.
Análise da integridade da MEC e remoção das células
A coloração com H&E e DAPI mostraram redução dos núcleos visíveis presentes no tecido do pericárdio após a descelularização (Figura 1 A, B, D e E). Os principais componentes da MEC foram examinados com coloração RMP (colágeno: amarelo; elastina: preto; glicosaminoglicanos: azul). A estrutura das fibras extracelulares do pericárdio descelularizado reteve grupamentos de colágeno e elastina similares aos do pericárdio fresco. No entanto, o tecido descelularizado apresentava espessura aumentada em comparação ao tecido fresco (Figura 1 C e F).
Caracterização histológica do pericárdio humano fresco e pericárdio humano descelularizado. Coloração hematoxilina e eosina (H&E) e a coloração de DAPI não mostraram evidência de células nos cortes teciduais (D e E). H&E e RPM mostraram que a descelularização não afeta a estrutura dos feixes de colágeno); no entanto, houve uma redução no colágeno e aumento na espessura do tecido descelularizado em comparação ao tecido fresco (D e F)
Quantificação de DNA
A quantidade de DNA no tecido de pericárdio fresco com todos os componentes celulares foi 1591 ± 726 ng por mg de peso seco, ao passo que no pericárdio descelularizado, a quantidade de DNA foi reduzida para 511.23 ± 120.4 ng por mg de peso seco. (p < 0,001) (Tabela 1).
Concentração de colágeno, glicosaminoglicanos e DNA no pericárdio humano descelularizado
Colágeno µg/mg
Glicosaminoglicano µg/mg
DNA ng/mg
Pericárdio fresco
126,9 ± 45,8
0,64 ± 0,50
1591 ± 726,0
Pericárdio descelularizado
138,3 ± 58,6
0,02 ± 0,06
511,23 ± 120,4
Valor de p
0,716
0,014
< 0,001
Efeito da descelularização sobre o teor de GAGs e colágeno
A concentração de colágeno por mg de peso seco do pericárdio humano antes e a após a descelularização foi 126,9 ± 45,8 e 138,3 ± 58,6 µg/mg de tecido seco, respectivamente (p = 0,716). Após a descelularização, observou-se um pequeno aumento na concentração de colágeno no tecido de pericárdio fresco. A concentração de GAGs foi 0,64 ± 0,50 e 0,02 ± 0,06 por mg de tecido seco antes e a após a descelularização, respectivamente (p = 0,014)
Análise de citotoxicidade
O pericárdio humano descelularizado (n=3) foi incubado por 24 horas (Figura 2A). A descelularização não teve efeito sobre as células, apontado pela morfologia normal das células após a incubação. O controle negativo também não teve efeito sobre as células (Figura 2B), ao passo que o látex (controle positivo) causou morte celular (Figura 2 C).
Teste de citotoxicidade sobre camada de ágar. Imagem do teste após 24 horas em contato com a camada de ágar. Pericárdio humano descelularizado (A), controle negativo (B) e controle positivo (C)
Estudo biomecânico
Não houve diferença estatística (teste de Welch: p = 0,9518) na espessura do pericárdio entre o tecido fresco e o tecido descelularizado (0,45 ± 0,06 mm e 0,44 ± 0,05 mm), respectivamente. A resistência de tração, alongamento e módulo de elasticidade elástico são apresentados em gráficos de dispersão em colunas (Figuras 3A, B e C), em média e DP. A diferença média entre os grupos não foi estatisticamente significativa para nenhuma das características. A curva da média stress-tensão dos tecidos fresco e descelularizado são apresentados na Figura 3D, o que demonstra o comportamento típico de tecidos biológicos descrito anteriormente.20 Também é possível observar que o comportamento das curvas foi similar na fase inicial até a fase de transição, mantendo-se praticamente paralelas até a tensão máxima.
Representação gráfica dos parâmetros mecânicos obtidos de pericárdio fresco e descelularizado. (A) resistência de tração (MPa), (B) alongamento (%), (C) módulo de elasticidade (MPa) e (D) curva da média do comportamento stress-tensão do pericárdio fresco e do pericárdio descelularizado.
Discussão
O objetivo da descelularização é minimizar a resposta imune por meio da total remoção dos componentes celulares, bem como pela preservação das características físicas da MEC.2,21 O tecido descelularizado ideal deve atingir completa descelularização e preservação da MEC quanto à estabilidade e função biomecânica. Porém, reconhece-se que qualquer protocolo de descelularização pode resultar na ruptura da MEC e potencial perda da estrutura e composição da superfície.2
No presente estudo, a análise histológica mostrou que, apesar de a maioria dos componentes celulares ter sido removido, houve redução de alguns componentes da MEC e aumento da espessura do tecido descelularizado. Resultados semelhantes foram descritos por Courtman et al.,22 com aumento em três vezes na espessura do tecido. No entanto, no estudo de Mirsadraee et al.,23 em que se utilizou um protocolo de descelularização com SDS, não foram observadas mudanças significativas no pericárdio humano descelularizado em comparação ao pericárdio fresco na análise histológica.
No presente estudo, o pericárdio humano descelularizado apresentou pequeno aumento na quantidade de colágeno e uma redução significativa na quantidade de GAGs. Esses dados estão de acordo com os relatados por Mendoza-Novelo et al.,24 que mostraram uma redução na quantidade de GAGs no pericárdio fresco após a descelularização com tridecil álcool etoxilado e dilatação reversível em meio alcalino.24 Por outro lado, Mirsadraee et al.,23 relataram um pequeno aumento no teor de hidroxiprolina e GAG no tecido após a descelularização. Os autores concluíram que o aumento de hidroxiprolina deveu-se ao aumento relativo na proporção dessas moléculas em relação ao peso seco, dada a perda de proteínas solúveis e componentes celulares.
A fim de assegurar uma remoção residual adequada, foram realizados testes de citotoxicidade para determinar o efeito de resíduos químicos presentes no tecido descelularizado sobre o crescimento de células L929. Os resultados do teste mostraram crescimento adequado das células em contato com amostras do pericárdio humano descelularizado, indicando que os tecidos descelularizados eram atóxicos. Esse resultado também se correlaciona com dados de um estudo prévio23 com pericárdio humano descelularizado.
Nós comparamos as propriedades mecânicas do pericárdio fresco e do pericárdio descelularizado, e não observamos diferenças significativas entre elas. A descelularização com SDS em si não modifica o desempenho do pericárdio humano quanto aos parâmetros de resistência de tração, alongamento e módulo de elasticidade. Esses resultados haviam sido avaliados em pericárdio humano acelular.23 Em um estudo mais recente, em comparação ao pericárdio fresco, as propriedades biomecânicas do pericárdio descelularizado e criopreservado foram mantidas.25
No entanto, este estudo não avaliou o desempenho do implante de pericárdio humano descelularizado. A análise in vitro não é suficiente para confirmar completa descelularização. A manutenção da MEC neste estudo não permite afirmar que todas as características fisiológicas e moleculares sejam realmente ideais.
Conclusão
O processo de descelularização reduz a quantidade de células bem como a de componentes da MEC, e promove um aumento na espessura do tecido descelularizado em comparação ao tecido fresco sem alterar as propriedades biomecânicas. O pericárdio humano descelularizado pode ser um candidato apropriado para a produção de scaffolds a partir da MEC para aplicações na engenharia tecidual e na medicina regenerativa.
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Fontes de financiamento
O presente estudo foi financiado pelo Fundo Nacional de Saúde - Ministério da Saúde - projeto nº 814611/2014.
Vinculação acadêmica
Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.
Aprovação ética e consentimento informado
Este artigo não contém estudos com humanos ou animais realizados por nenhum dos autores.