Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC cy9PxzshTNSZsg8x8bzWS4p S0066-782X2019000500545 S0066-782X2019005009101 10.5935/abc.20190072 Original Article Resistance Exercise Modulates Oxidative Stress Parameters and TNF-α Content in the Heart of Mice with Diet-Induced Obesity 0000-0002-1746-8289 Effting Pauline Souza 1 0000-0002-2572-5724 Brescianini Stella M. S. 1 0000-0002-0592-7337 Sorato Helen R. 1 0000-0002-1528-3221 Fernandes Bruna Barros 1 0000-0002-5868-7058 Fidelis Giulia dos S. Pedroso 1 0000-0001-7787-8530 Silva Paulo Roberto L. da 1 0000-0003-4908-2257 Silveira Paulo César L. 1 4 0000-0002-6774-0893 Nesi Renata T. 1 0000-0002-8888-1281 Ceddia Rolando B. 3 0000-0003-3116-4553 Pinho Ricardo A. 1 2 Universidade do Extremo Sul Catarinense Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde Fisiologia e Bioquímica do Exercício Criciúma SC Brazil Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício (LAFIBE) - Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde (PPGCS) - Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC), Criciúma, SC - Brazil Pontifícia Universidade Católica do Paraná Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde Bioquímica do Exercício em Saúde Curitiba PR Brazil Laboratório de Bioquímica do Exercício em Saúde (BioEx) - Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde (PPGCS) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR), Curitiba, PR - Brazil York University School of Kinesiology and Health Center Muscle Health Research Center Toronto ON Canadá Muscle Health Research Center, School of Kinesiology and Health Center - York University, Toronto, ON - Canadá Universidade do Extremo Sul Catarinense Criciúma SC Brazil Laboratório de Fisiopatologia Experimental - Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde (PPGCS) - Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC), Criciúma, SC - Brazil Mailing Address: Pauline Souza Effting, Rua Alda Agliardi Colombo, 210. Postal Code 88816-735, Pedro Zanivan, Criciúma, SC - Brazil. E-mail: paulinese@gmail.com, paulinese@outlook.com

Author contributions

Conception and design of the research: Ceddia RB, Pinho RA; Acquisition of data: Brescianini SMS, Fernandes BB, Fidelis GSP, da Silva PRL, Nesi RT; Analysis and interpretation of the data: Effting PS, Brescianini SMS, Silveira PCL, Nesi RT, Pinho RA; Statistical analysis: Effting PS, Silveira PCL, Pinho RA; Obtaining financing: Pinho RA; Writing of the manuscript: Effting PS, Pinho RA; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Ceddia RB, Pinho RA.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 25 04 2019 05 2019 112 5 545 552 29 05 2018 20 08 2018 02 10 2018 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited Abstract Background:

Obesity can be characterized by low-grade chronic inflammation and is associated with an excesso production of reactive oxygen species, factors that contribute to coronary heart disease and other cardiomyopathies.

 Objective:

To verify the effects of resistance exercise training on oxidative stress and inflammatory parameters on mice with obesity induced by a high-fat diet (HFD).

 Methods:

24 Swiss mice were divided into 4 groups: standard diet (SD), SD + resistance exercise (SD + RE), diet-induced obesity (DIO), DIO + RE. The animals were fed SD or HFD for 26 weeks and performed resistance exercises in the last 8 weeks of the study. The insulin tolerance test (ITT) and body weight monitoring were performed to assess the clinical parameters. Oxidative stress and inflammation parameters were evaluated in the cardiac tissue. Data were expressed by mean and standard deviation (p < 0.05).

 Results:

The DIO group had a significant increase in reactive oxygen species levels and lipid peroxidation with reduction after exercise. Superoxide dismutase and the glutathione system showed no significant changes in DIO animals, with an increase in SD + RE. Only catalase activity decreased with both diet and exercise influence. There was an increase in tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) in the DIO group, characterizing a possible inflammatory condition, with a decrease when exposed to resistance training (DIO+RE).

 Conclusion:

The DIO resulted in a redox imbalance in cardiac tissue, but the RE was able to modulate these parameters, as well as to control the increase in TNF-α levels.

 Keywords: Exercise Oxidative Stress Obesity Diet, High-Fat Mice Introduction

The World Health Organization (WHO)1 defines obesity as an abnormal or excessive accumulation of fat that brings health risks. The WHO brings data from the Global Health Observatory showing a worldwide prevalence of obesity of 39% in men and women over 18 years of age (2016 updated data). In this scenario, obesity is also a risk factor for lifestyle-related diseases, such as cardiovascular disease and type 2 diabetes mellitus.2 It can be characterized by low-grade chronic inflammation and is associated with increased levels of proinflammatory cytokines, as well as an excess production of reactive oxygen species.3,4

Studies have shown that hyperglycemia and alterations in glucose uptake in diabetes may lead to oxidative stress with consequent mitochondrial dysfunction, as well as to an inflammatory process with the presence of elevated proinflammatory cytokines, such as TNF-α. Both cases may be triggering factors for coronary heart disease and other cardiomyopathies5 (see review by Adeghate and Singh). Gamez-Mendez et al.,6 also showed that 8 weeks of high-fat diet (HFD) led to an increase in oxidative stress, resulting in an imbalance of vasoactive substances and consequent endothelial dysfunction of the coronary arteries in obese rats.

Studies point to physical exercise as an important ally in reducing the risks related to obesity due to its ability to reestablish the balance between pro-anti-inflammatory cytokines and regulate the cell redox state.7,8 According to Boardman et al.,9 physical exercise is not only an important therapeutic approach in obesity, but it is also crucial for cardiac function improvement and ischemic injury prevention in obese and/or diabetic animals.

Although the literature indicates that exercise is important to prevent or complement the treatment of obesity,10 one should consider the characteristics of the performed exercise, such as: intensity, duration, frequency and type.

Based on the aforementioned facts, this study aimed to identify whether resistance exercise (RE) modifies the oxidative stress and inflammation parameters caused by an HFD in an experimental model of obesity.

 Methods Animals

Male Swiss mice (40 days), obtained at the vivarium of Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC (Criciúma/SC - Brazil), with an average weight of 35.45 g (± 1.29) were studied. The animals were kept at a 12/12h light/dark cycle at 22ºC in collective boxes (6 animals per box) and randomly divided into four groups (n = 6): standard diet (SD); diet-induced obesity (DIO); SD + RE; DIO + RE. The random selection procedure was carried out by arbitrarily or randomly allocating the animals to the respective groups, without prior performance evaluation or using any other indicator that allowed the groups to be divided.

 Diet

The animals were fed ad libitium for 26 weeks with low-fat SD (SD: 27%, 23% and 50% of calories from proteins, fats and carbohydrates, respectively - 3.3kcal/g) or HFD (HFD: 15%, 59% and 26% of calories from proteins, fats and carbohydrates, respectively - 5.3kcal/g). The SD was purchased from the Puro Trato Nutrição Animal (Puro Lab 22PB) Santo Augusto/RS - Brazil, and the HFD from PragSoluções Biociência, Jaú/SP - Brazil.

 Exercise

The exercise adaptation protocol was started in the 17thweek of the diet and the RE protocol in the 18th. The resistance training was performed in a 1-m ladder apparatus with 2cm steps and 85º-slope.11 The animals were familiarized with the climbing exercise on the steps for 5 consecutive days without load. The training protocol, adapted from Scheffer et al.,12,13 started 3 days after the last adaptation training, and was performed with a 48-h interval between sessions, for 8 weeks, totaling 28 training sessions. The exercise was performed with intensity progression by adding a weight to the animal's tail (load increase of 20% to 75% of body weight), and volume progression (5-10 series per session) (Table 1), with a 2-min interval between sessions in the rest area (closed box at the top of the steps measuring 20x20x20 cm). Each series was performed until the animals completed 5 repetitions/climbings (without interval), or could not climb the stairs even after encouragement (manual stimulation at the base of the tail).

Resistance training protocol
Weeks Load Series Interval between series
1st 20% 5 1 (2min)
2nd 20% 7 1 (2min)
3rd 50% 5 1 (2min)
4th 50% 7 1 (2min)
5th 50% 10 1 (2min)
6th 50% 10 1 (2min)
7th 75% 7 1 (2min)
8th 75% 10 1 (2min)
Source: Study data. Adapted from Scheffer et al.12 Body weight and insulin tolerance test (ITT)

Individual body weight was measured at the start of the study and at weeks 3, 6, 10, 14, 18, 22 and 26. After 17 weeks on the diet, an ITT was performed to confirm insulin resistance. After 6 hours of fasting,14 all animals received a dose of 2 U/kg of insulin. Blood glucose was measured with a glycometer using a drop of blood collected from a small incision at the tip of the animal's tail. The same protocol was performed at the end of the experiment, 48 hours after the last exercise session.

 Euthanasia

24 h after the last insulin tolerance test, euthanasia by decapitation was performed and the left ventricle of the heart was surgically extracted, immediately frozen in liquid nitrogen, and stored at -80ºC for biochemical analysis.

 Biochemical analyses

For the biochemical assays described below and ELISA test, all samples were homogenized in 50 mM phosphate-buffered saline (PBS), with the addition of 10uM aprotinin. The homogenate was centrifuged for 10 min at 4ºC and the supernatant was stored at -80ºC. Protein levels were determined in all samples using the Bradford method.15

Oxidation of dichlorodihydrofluorescein (DCFH)

Reactive species levels were measured based on oxidation of the 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) probe in a fluorescent 2',7'-dichlorodihydrofluorescein (DCF) compound as previously described.16 An aliquot of the lysate was incubated with 80 mM DCFH-DA at 37ºC for 15 minutes. The production of reactive species was quantified using a standard DCF curve and data were expressed as nM DCF/mg protein.

 Antioxidant enzyme activity

The superoxide dismutase (SOD) activity was estimated by inhibiting the auto oxidation of adrenaline and read spectrophotometrically at 480 nm according to the method described by McCord and Fridovich.17 Catalase (CAT) activity was established based on the rate of hydrogen peroxide (H2O2) decomposition, generated by the enzyme present in the sample using a 10 mM H2O2 solution in potassium phosphate buffer with pH of 7.0. The maximum rate of H2O2 decomposition was measured at 240 nm.18 Values were expressed as units of SOD or CAT per mg of protein.

 Total glutathione (GSH) levels

GSH levels were measured using the Hissin method.19 Samples were incubated in 0.6% sulfosalicylic acid followed by a reaction of the GSH present in the sample with 2-nitrobenzoic acid (5,5'-Dithiobis) (DTNB) producing an oxidized glutathione-TNB adduct (GS-TNB). The resulting color from the reaction between the DTNB and thiols compared to the standard curve for GSH was kinetically established at 412 nm for 10 min. Values were expressed as nmol/min/mg protein.

 Lipoperoxidation

The concentrations of malondialdehyde (MDA) in the samples were determined by high-performance liquid chromatography (HPLC) (Agilent Technologies 1200 Series; Santa Clara, CA, USA),according to Grotto et al. (2007)20 using a derivative of thiobarbituric acid (TBA). A standard curve was created using MDA tetrabutylammonium salt at concentrations ranging from 0.5 to 5 µmol/L. The MDA was determined at 532 nm and the results were expressed as umol/L of MDA/milligram protein.

 Inflammatory Parameter

The concentration of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) was assessed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) according to the manufacturer's recommendations (ThermoFisher Scientific, cat.KMC3011). The results were expressed in pg/mg of protein.

 Statistical analysis

Initially, the data were assessed using Grubbs test to verify possible outliers followed by the Shapiro-Wilk normality test, and in both of them the data met the assumptions for the use of parametric tests. Then, the Two-way ANOVA test was performed, followed by the Bonferroni post-hoc test when necessary. For analysis of the ITT data (table 2), the one-way variance test (one-way ANOVA) of repeated measures was performed, followed by post-hoc Tukey test when necessary. The level of significance was set at p < 0.05. The Graph Pad Prism software, version 5, was used as the statistical package. All data were expressed as mean and standard deviation, except for figure 1A, expressed as mean and standard error of mean.

 Results Body weight and insulin resistance

The RE had a beneficial effect, preventing the DIO + RE group from continuing to gain weight even with the HFD consumption, not characterizing weight loss, but rather weight maintenance, even without food intake control (Figure 1A-C).

A – Total body weight during the study; B - Delta (body weight variation in relation to the start of the study); C - weight comparison between the 1st week (start), 18<sup>th</sup> week (pre-exercise) and 26<sup>th</sup> week (post-exercise); D - Glucose decay rate in the insulin tolerance test (kITT). Figure A, B and D - <sup>*</sup>p < 0.05 vs. respective untrained of the same period, <sup>#</sup>p < 0.05, <sup>##</sup>p < 0.01 and <sup>###</sup>p < 0,001 vs. respective SD of the same period; <sup>&</sup>p < 0.05 vs. same group of the previous week. Figure C - *p < 0.001 vs. respective untrained of the same period; #p < 0.01 and ##p < 0.001 vs. respective SD of the same period; <sup>&</sup>p < 0.05, <sup>&&</sup>p < 0.001 vs. same group of the previous week.

The pre-exercise ITT showed that the DIO animals had insulin resistance (p > 0.05) (Table 2). The results demonstrated that HFD can lead to a loss of glucose uptake even with an external insulin stimulus (2U/kg body weight). The RE (p < 0.05), even with HFD intake, was able to delay the progression of the disease, maintaining a better glucose decay rate when compared to the sedentary DIO group (p < 0.01). There was no significant difference between pre- and post-exercise in any group (Figure 1D).

Insulin tolerance test (ITT) – blood glucose curve
Time of collection (Glucose mg/dL and variation in relation to time 0 min)
0 min 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min
Pre-exercise SD 154.3 139.2 (-15.0) 98.7 (-55.5) 77.5 (-76.8) 65.2 (-89.0) 56.7 (-97.5) 43.2 (-111.0)
SD + RE 129.3 134.7 (+5.5) 57.7 (-71.5) 54.7 (-74.5) 46.7 (-82.5) 35.3 (-94.0) 25.5 (-103.8)
DIO 191.0† 186.0 (-5.0) 125.5 (-65.5) 118.0 (-73.0) 106.5 (-84.5)† 101.3 (-89.8)† 99.0 (-92.0)†
DIO + RE 163.8*† 164.5 (+0.8) 128.0 (-35.8)† 115.2 (-48.5)† 107.3 (-56.5)† 100.8 (-63.0)† 99.5 (-64.3)†
Post-exercise SD 129.0 97.5 (-31.5) 71.0 (-58.0) 54.5 (-74.5) 59.0 (-70.0) 37.5 (-91.5) 27.0 (-102.0)
SD + RE 122.3 102.0 (-20.3) 66.2 (-56.0) 53.5 (-68.8) 42.0 (-80.3)* 23.0 (-99.3) 15.8 (-106.5)
DIO 150.8†‡ 120.7 (-30.0)‡ 110.5 (-40.3)† 105.5 (-45.3)† 97.0 (-53.8)† 94.0 (-56.8)† 92.0 (-58.8)†
DIO + RE 127.8*‡ 133.5 (+5.8) 93.7 (-34.0) 68.0 (-59.8)‡ 64.3 (-63.5)*‡ 58.5 (-69.3)*†‡ 46.5 (-81.3)*†‡
Source: study data. Pre-adaptation/exercise (week 17) and post-exercise (week 26). Blood glucose was measured after 6 hours of fasting (data from the table) at times 0 min (baseline), followed by an intraperitoneal insulin injection (2 U/kg) and measurements at times 5-30 min.

p < 0.05 versus respective untrained;

p < 0.05 versus respective standard diet;

p < 0.05 versus respective pre-exercise. SD: standard diet; RE: resistance exercise; DIO: diet-induced obesity.

 DCFH oxidation

DCFH oxidation levels were measured as indicators of the reactive species production, especially hydrogen peroxide, and the results showed that in untrained animals, DIO caused an increase in DCF levels (p < 0.001) in comparison to animals with SD. HFD-fed animals submitted to resistance training (DIO + RE) showed a significant decrease in DCF levels compared to the DIO group (p < 0.01) (Figure 2A).

Redox balance and inflammatory parameters in cardiac tissue of animals fed standard or high-fat diet and subsequently submitted to resistance training. A - DCFH oxidation; B - MDA content; C - SOD enzyme activity; D - CAT enzyme activity; E - Total glutathione content (reduced and oxidized); F - levels of TNF-α. <sup>*</sup>p < 0.05, <sup>**</sup>p < 0.01 and <sup>***</sup>p < 0.001 vs. respective untrained; <sup>#</sup>p < 0.05, <sup>##</sup>p < 0.01 and <sup>###</sup>p < 0.001 vs. respective SD.

Lipoperoxidation

As shown in Figure 2B, MDA levels suggest an increase in lipoperoxidation in DIO animals (p < 0.05), with reversion of the condition (p < 0.05) with resistance training (DIO + RE).

 SOD Activity

The results observed in Figure 2C show that DIO did not alter SOD activity, but resistance training was able to increase its activity in the SD + RE group (p < 0.05), an increase not observed when exercise was performed in the obese group.

 CAT Activity

The results observed in Figure 2D show a reduction in CAT activity in trained animals (SD + RE, p < 0.001 and SD, DIO + RE, p < 0.01 vs. untrained animals). On the other hand, the HFD animals also showed a decrease in CAT (p < 0.05), but only when compared to the SD animals.

 GSH

Total glutathione levels were not significantly altered in both the interventions used in the present study (diet and exercise) (Figure 2E).

 Inflammatory Parameter

The levels of TNF-α were used as an inflammatory indicator in cardiac tissue and the results observed in figure 2F showed an increase in TNF-α content in DIO animals (p < 0.05), which was significantly reduced (p < 0.05) after the intervention with resistance physical exercise (DIO + RE).

 Discussion

Studies have shown that the consumption of a diet rich in fat, concomitant with a sedentary lifestyle, can trigger several health problems21,22 with a significant impact on the cardiovascular system. Therefore, experimental studies have been used to study the cellular effects of a high fat diet.6,23,24 The results of body weight and ITT showed that the adopted experimental model was effective in increasing weight and causing insulin resistance. Increased body weight has been associated to inflammatory changes and oxidative stress, and both these alterations to insulin resistance in skeletal muscle,25,26 but recent studies have also shown that cardiac cells are also susceptible to weight gain, by elevating inflammatory mediators and oxidative stress.6,23,24,27,28 In this context, previous studies suggested an important role of physical exercise, specifically aerobic or endurance, on the biochemical and molecular changes occurring in the myocardium as the result of a diet rich in fat.3,7 However, these effects depend on the characteristics of the exercise, such as duration, frequency, intensity and type.

The initial results of our study show that DIO animals have elevated levels of DCF, an indirect indicator of hydrogen peroxide production.29 These data were also observed by a recent study published in 2017 by Zeng et al.23 The authors showed high myocardial susceptibility to oxidative stress, with a significant increase in DCFH oxidation, both in vitro and in vivo, mediated by a high-fat diet. These increased DCF values, observed in DIO animals, were significantly reduced after resistance training, which suggests an important role of this type of training in the regulation of cell oxidant levels. Such effect may be associated to the fact that resistance training has a modulatory role on endogenous antioxidant enzymes. This observation is based on previous studies of our group in other experimental models of inflammation, which show the important role of resistance training on the enzymatic antioxidant system in different tissues.30,31

SOD and CAT are two enzymes that act synergistically in the formation (via superoxide radical dismutation) and catalysis of hydrogen peroxide, respectively. DIO animals showed no changes in SOD activity, suggesting that an increased production of DCF may be associated with other stimuli independent from SOD. One of the factors responsible for it is that, although the oxidation of DCFH to DCF is widely used as an indicator of hydrogen peroxide production, studies have observed that DCFH can also be oxidized by other reactive species, on a smaller scale, such as hydroxyl, peroxyl, nitric oxide and peroxide nitrite.29 It is also noteworthy that the formation of hydrogen peroxide is not totally dependent on SOD activity. On a smaller scale, auto-oxidation events of biomolecules also contribute to the formation of hydrogen peroxide.32 These conditions would limit SOD activity, which may justify the results found.

Catalases constitute a group of enzymes that catalyze the decomposition of hydrogen peroxide into water and oxygen. Our results show a reduction in the activity of this enzyme after resistance training in the group exposed to SD. As observed, SOD activity was increased in this same group, thus generating higher levels of hydrogen peroxide. However, the decrease in enzyme activity suggests a lower hydrogen peroxide catalysis, but it is worth noting that hydrogen peroxide can be catalyzed under these conditions by other cell detoxification systems, such as glutathione and peroxins,33 which could justify our results since the glutathione system showed an increase in this group (SD + RE). Furthermore, we observed reduced levels of CAT after resistance training in the DIO + RE group and, therefore, considering that the diet significantly increases the production of cell oxidants such as hydrogen peroxide, a reduced CAT activity could have an impact on the possible oxidative damages in the myocardium, if hydrogen peroxide were not catalyzed by other aforementioned systems (not investigated in the present study, although they deserve attention in future studies).

Aiming to observe the effects of RE on oxidative damage in the myocardium induced by the DIO model, we evaluated the levels of MDA, a byproduct of lipoperoxidation, and observed that DIO animals showed greater lipid damage in relation to the SD group and that the RE was able to reverse these effects. These effects of the DIO model on lipoperoxidation levels were also observed in a study with BL6/C57 mice performed by Muthulakshmi and Saravanan (2013).34 Positive RE results are possibly associated with the exercise capacity to promote the modulation of antioxidant systems, in addition to the activity of primary antioxidant enzymes such as SOD and CAT. One of the mechanisms that can be mediated by RE is the Nuclear Factor Erythroid 2 (NRF2) translocation to the nucleus and expression of several antioxidant enzymes such as NADH: quinone oxidoreductase 1 (NQO1) and Heme Oxygenase-1 (HO1). which help to detoxify the biological system and contribute to the reduction of oxidative stress.35 Merry and Ristow (2016)36 suggest that exercise may stimulate NRF2 translocation to functionally regulate mitochondrial biogenesis of skeletal muscle and the expression of antioxidants defense genes. Although these results are obtained from aerobic training and in skeletal muscle, it is believed that such effects may also occur via resistance training, as resistance training activates the Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase (AMPK)37, which enhances the phosphorylation of NRF2 in the cell and increases the level of phosphorylated NRF2 in the nucleus.38

The increased production of oxidants in the myocardium can be mediated by a possible inflammatory response induced by obesity/HFD with the secretion of different mediators. In this context, TNF-α is a mediator sensitive to the HFD model that shows a wide range of pro-inflammatory actions. Our results showed a significant increase in TNF-α levels in DIO animals with a consequent reduction after resistance training. Increased levels of TNF-α in the myocardium induced by a HFD have also been observed in previous studies.3,28 The effects of exercise may be related to the fact that aerobic and resistance exercises promote increased secretion of anti-inflammatory cytokines and regulate TNF-α levels.30,31 During the exercise, the muscles release myosins, which are involved in tissue growth, repair and anti-inflammatory responses.39 IL-6 is the primary myosin released in response to exercise and increases IL-10 and decreases TNF-α levels.40 IL-10 reduces cardiac dysfunction by decreasing cardiac fibrosis.39 In this scenario, HFD-induced obesity decreases IL-10 protein levels, but physical training significantly increases the IL-10 levels in cardiac tissues.3

According to data from previous studies, the control of TNF-α secretion in the myocardium by RE is considered an important factor in the cardioprotection mechanisms related to oxidative stress.

 Conclusion

Our results showed an important effect of RE on the control/stabilization of body weight even without food intake control. It was also demonstrated that there is a redox alteration in the cardiac tissue with an obesity model, but it does not seem to be mediated mainly by the classic antioxidant production and control of hydrogen peroxide, but rather by other reactive species. However, RE was able to reverse lipid damage and the production of reactive species, even with the consumption of a HFD, as well as positively modulate one of the main cytokines responsible for the activation of the inflammatory process.

Therefore, RE can be a great ally in the health process regarding the therapeutic approach to obesity. Some limitations found in these studies were the data related to the quantification of serum insulin to better confirm insulin resistance, and the evaluation of other molecules that can alter the cell redox balance. These tests were not performed for technical reasons.

Finally, other studies should be performed aiming to better explain how RE promotes these effects, particularly in the regulation of reactive species such as hydroxyl, peroxyl, nitric oxide and peroxide nitrite, as well as other inflammatory and anti-inflammatory parameters in cardiac tissue.

Sources of Funding

This study was funded by CNPq and Capes.

Study Association

This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Pauline Souza Effting, from Universidade do Extremo Sul Catarinense.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee on Animal Experiments of the Universidade do Extremo Sul Catarinense under the protocol number 067/2014-2.

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Chen X Zhong Z Xu Z Chen L Wang Y 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: forty years of application and controversy Free Radic Res 2010 44 6 587 604 30 Tuon T, Souza PS, Santos MF, Pereira FT, Pedroso GS, Luciano TF, et al. Physical training regulates mitochondrial parameters and neuroinflammatory mechanisms in an experimental model of Parkinson's disease. Oxid Med Cell Longev. 2015;2015:261809. Tuon T Souza PS Santos MF Pereira FT Pedroso GS Luciano TF Physical training regulates mitochondrial parameters and neuroinflammatory mechanisms in an experimental model of Parkinson's disease Oxid Med Cell Longev 2015 2015 261809 261809 31 Souza PS, Gonçalves ED, Pedroso GS, Farias HR, Junqueira SC, Marcon R, et al. Physical exercise attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis by inhibiting peripheral immune response and blood-brain barrier disruption. Mol Neurobiol. 2017;54(6):4723-37. 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Merry TL Ristow M Nuclear factor erythroid-derived 2-like 2 (NFE2L2, Nrf2) mediates exercise-induced mitochondrial biogenesis and the anti-oxidant response in mice J Physiol 2016 594 18 5195 5207 37 Williamson D, Gallagher P, Harber M, Hollon C, Trappe S. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway activation: effects of age and acute exercise on human skeletal muscle. J Physiol. 2003;547(Pt 3):977-87. Williamson D Gallagher P Harber M Hollon C Trappe S Mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway activation: effects of age and acute exercise on human skeletal muscle J Physiol 2003 547 3 977 987 38 Joo MS, Kim WD, Lee KY, Kim JH, Koo JH, Kim SG. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at serine 550. Mol Cell Biol. 2016;36(14):1931-42. Joo MS Kim WD Lee KY Kim JH Koo JH Kim SG AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at serine 550 Mol Cell Biol 2016 36 14 1931 1942 39 Petersen AMW, Pedersen BK. 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Pedroso 1 0000-0001-7787-8530 Silva Paulo Roberto L. da 0000-0003-4908-2257 Silveira Paulo César L. 1 4 0000-0002-6774-0893 Nesi Renata T. 1 0000-0002-8888-1281 Ceddia Rolando B. 3 0000-0003-3116-4553 Pinho Ricardo A. 1 2 Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício (LAFIBE) - Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde (PPGCS) - Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC), Criciúma, SC - Brasil Laboratório de Bioquímica do Exercício em Saúde (BioEx) - Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde (PPGCS) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR), Curitiba, PR - Brasil Muscle Health Research Center, School of Kinesiology and Health Center - York University, Toronto, ON - Canadá Laboratório de Fisiopatologia Experimental - Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde (PPGCS) - Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC), Criciúma, SC - Brasil Correspondência: Pauline Souza Effting, Rua Alda Agliardi Colombo, 210. CEP 88816-735, Pedro Zanivan, Criciúma, SC - Brasil. E-mail: paulinese@gmail.com, paulinese@outlook.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Ceddia RB, Pinho RA; Obtenção de dados: Brescianini SMS, Fernandes BB, Fidelis GSP, da Silva PRL, Nesi RT; Análise e interpretação dos dados: Effting PS, Brescianini SMS, Silveira PCL, Nesi RT, Pinho RA; Análise estatística: Effting PS, Silveira PCL, Pinho RA; Obtenção de financiamento: Pinho RA; Redação do manuscrito: Effting PS, Pinho RA; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Ceddia RB, Pinho RA.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

A obesidade pode ser caracterizada por uma inflamação crônica de baixo grau e está associada à produção excessiva de espécies reativas de oxigênio, fatores que contribuem para doenças coronarianas e outras cardiomiopatias.

 Objetivo:

Verificar os efeitos do treinamento resistido sobre os parâmetros de estresse oxidativo e parâmetro inflamatório em camundongos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica (DIO).

 Métodos:

24 camundongos Swiss foram divididos em 4 grupos: dieta padrão (DP), DP + exercício resistido (DP+ER), obesidade induzida por DIO, DIO + ER. Os animais foram alimentados por 26 semanas com DP ou hiperlipídica realizando treinamento resistido nas 8 semanas finais do estudo. Para avaliar parâmetros clínicos foi realizado o teste de tolerância à insulina (TTI) e monitoramento do peso corporal. No tecido cardíaco foram avaliados parâmetros de estresse oxidativo e inflamação. Dados expressos por média e desvio padrão (p < 0,05).

 Resultados:

O grupo DIO teve um aumento significativo nos níveis espécies reativas e peroxidação lipídica com redução após o exercício. A superóxido dismutase e o sistema glutationa não demonstraram alterações importantes nos animais DIO, com elevação perante DP+ER. Somente a atividade da catalase reduziu tanto com influência da dieta como do exercício. Ocorreu um aumento do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) no grupo DIO, caracterizando um possível quadro inflamatório, com redução quando expostos ao treino resistido (DIO+ER).

 Conclusão:

A DIO ocasionou um desequilíbrio redox no tecido cardíaco, porém o ER foi capaz de modular estes parâmetros, bem como controlar o aumento do TNF-α.

Palavras-chave: Exercício Estresse Oxidativo Obesidade Dieta Hiperlipídica Camundongos Introdução

A Organização Mundial de Saúde1 define a obesidade como um acúmulo anormal ou excessivo de gordura que apresenta riscos à saúde. A mesma traz dados do Observatório Mundial da Saúde demonstrando uma prevalência mundial de obesidade de 39% em homens e mulheres acima de 18 anos (dados atualizados 2016). Nesse cenário, a obesidade também se apresenta como um fator de risco para doenças relacionadas ao estilo de vida, como doenças cardiovasculares e diabetes melitus tipo II.2 Pode ser caracterizada por uma inflamação crônica de baixo grau e está associada a níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias bem como a produção excessiva de espécies reativas de oxigênio.3,4

Estudos demonstram que a hiperglicemia e alterações da captação de glicose presentes no diabetes podem levar a um quadro de estresse oxidativo com consequente disfunção mitocondrial, bem como a um processo inflamatório com presença elevada de citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α. Ambos os casos podem ser fatores desencadeantes para doenças coronarianas e outras cardiomiopatias5 (ver revisão de Adeghate e Singh).% Gamez-Mendez et al.,6 também demonstraram que 8 semanas de dieta hiperlipídica (DIO) levaram a um aumento do quadro de estresse oxidativo, o que gerou um desequilíbrio de substância vasoativas e consequente disfunção endotelial das artérias coronárias de ratos obesos.

Estudos apontam o exercício físico como importante aliado em diminuir os riscos relacionados à obesidade devido sua capacidade em reestabelecer o equilíbrio entre citocinas pró-anti-inflamatórias e regular o estado redox da célula.7,8 Segundo Boardman et al.,9 na obesidade, o exercício físico não é apenas uma importante abordagem terapêutica, mas é também crucial para melhorar a função cardíaca e prevenir a lesão isquêmica em animais obesos e/ou diabéticos.

Apesar da literatura apontar que a prática do exercício é importante para prevenir ou complementar o tratamento da obesidade,10 deve-se levar em conta às características do exercício praticado, como: intensidade, duração, frequência e tipo.

Com base no exposto, esse estudo teve por objetivo identificar se o exercício resistido (ER) altera parâmetros de estresse oxidativo e de inflamação ocasionado pela ingestão de uma DIO em um modelo experimental de obesidade.

 Métodos Animais

Foram utilizados camundongos Swiss machos (40 dias), pesando em média 35,45 g (±1,29) fornecidos pelo Biotério da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC (Criciúma/SC - Brasil). Os animais foram mantidos em um ciclo claro/escuro 12/12h, a 22ºC, em caixas coletivas (6 animais/caixa) e divididos randomicamente em quatro grupos (n = 6): dieta padrão (DP); obesidade induzida por DIO; DP + ER; DIO + ER. O procedimento de escolha aleatória se deu por alocar os animais nos respectivos grupos de forma arbitrária ou aleatória, sem haver avaliação de desempenho prévio ou utilizar qualquer outro indicador que permitisse a divisão dos grupos.

 Dieta

Os animais foram alimentados ad libitium por 26 semanas com DP com baixo teor lipídico (DP: 27%, 23% e 50% das calorias provenientes de proteínas, gorduras e carboidratos, respectivamente - 3,3 kcal/g) ou com DIO (DIO: 15%, 59% e 26% das calorias provenientes de proteínas, gorduras e carboidratos, respectivamente - 5,3 kcal/g). A DP foi adquirida da Puro Trato Nutrição Animal (Puro Lab 22PB) Santo Augusto/RS - Brasil, e a DIO da PragSoluções Biociência, Jaú/SP - Brasil.

 Exercício

O protocolo de adaptação ao exercício foi iniciado na 17ª semana de dieta e o protocolo de ER na 18ª. O treinamento resistido foi realizado em um aparato de escada de 1m com degraus de 2cm de distância e inclinação de 85º.11 Os animais foram familiarizados com o exercício de subida nos degraus por 5 dias consecutivos, sem carga. O protocolo de treinamento, adaptado de Scheffer et al.,12,13 teve início 3 dias após o último treino de adaptação e foi realizado com intervalo de 48h entre as sessões, por 8 semanas, totalizando 28 treinos. O exercício foi realizado com progressão de intensidade acoplando um peso à cauda do animal (incremento de carga de 20% a 75% do peso corporal), e progressão de volume (5-10 séries por sessão) (Tabela 1), com intervalo de 2 min entre as séries na área de descanso (caixa fechada no topo dos degraus medindo 20x20x20 cm). Cada série foi realizada até que os animais completassem 5 repetições/escaladas (sem intervalo), ou não conseguissem mais subir as escadas mesmo após incentivo (estímulo manual na base da cauda).

protocolo de treinamento resistido
Semanas Carga Séries Intervalo entre séries
1ª 20% 5 1 (2min)
2ª 20% 7 1 (2min)
3ª 50% 5 1 (2min)
4ª 50% 7 1 (2min)
5ª 50% 10 1 (2min)
6ª 50% 10 1 (2min)
7ª 75% 7 1 (2min)
8ª 75% 10 1 (2min)
Fonte: dados da pesquisa. Adaptado de Scheffer et al.12 Peso corporal e teste de tolerância à insulina (TTI)

O peso corporal individual foi mensurado no início do estudo e nas semanas 3, 6, 10, 14, 18, 22 e 26. Após 17 semanas de dieta foi realizado um TTI para confirmar um quadro de resistência à insulina. Após 6 horas de jejum,14 todos os animais receberam uma dose de 2 U/kg de insulina. A glicose sanguínea foi mensurada com um glicosímetro utilizando uma gota de sangue coletada de uma pequena incisão na ponta da cauda do animal. O mesmo protocolo foi realizado ao final do experimento, 48 horas após a última sessão de exercício.

 Eutanásia

Após 24h do último teste de tolerância à insulina foi realizada a eutanásia por decapitação e o ventrículo esquerdo do coração foi cirurgicamente extraído, imediatamente congelado em nitrogênio líquido, e armazenado à -80ºC para análises bioquímica.

 Análises bioquímicas

Para os ensaios bioquímicos descritos a seguir e teste de ELISA, todas as amostras foram homogeneizadas em tampão PBS (fosfato-salino) 50 mM, com adição de 10 uM de aprotinina. O homogeneizado foi centrifugado por 10min a 4ºC e o sobrenadante foi estocado à -80ºC. Os níveis de proteína foram determinados em todas as amostras utilizando o método Bradford.15

Oxidação de diclorodiidrofluorescína (DCFH)

Os níveis de espécies reativas foram mensurados com base na oxidação da sonda 2',7'- diclorodiidrofluorescína diacetato (DCFH-DA) em um composto fluorescente 2',7'- diclorodiidrofluoresceína (DCF), como previamente descrito.16 Uma alíquota do lisado foi incubada com DCFH-DA 80 mM a 37ºC durante 15 minutos. A produção de espécies reativas foi quantificada utilizando uma curva padrão de DCF e os dados foram expressos como nM DCF/mg de proteína.

 Atividade de enzimas antioxidantes

A atividade da superóxido dismutase (SOD) foi estimada através da inibição da auto oxidação da adrenalina e lida espectofotometricamente a 480 nm de acordo com o método descrito por McCord e Fridovich.17 A atividade da catalase (CAT) foi determinada com base na taxa de decomposição de Peróxido de Hidrogênio (H2O2) gerada pela enzima presente na amostra usando uma solução H2O2 em 10mM em tampão fosfato de potássio, pH 7,0. A taxa máxima de decomposição H2O2 foi medida em 240 nm.18 Os valores foram expressos como unidades de SOD ou CAT por mg de proteína.

 Níveis de glutationa total (GSH)

Os níveis de GSH foram pelo método de Hissin.19 As amostras foram incubadas em 0,6% de ácido sulfosalicílico seguido por uma reação de GSH presente na amostra com ácido 2-nitrobenzóico (5,5'-Dithiobis) (DTNB) produzindo um aducto de glutationa-TNB oxidado (GS-TNB). A cor resultante a partir da reação entre o DTNB e tióis contra a curva padrão de GSH foi determinado cineticamente a 412 nm depois por 10 min. Valores expressos em nmol/min/mg de proteína.

 Lipoperoxidação

As concentrações de malondialdeído (MDA) nas amostras foram determinadas por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (Agilent Technologies 1200 Series; Santa Clara, CA, EUA) de acordo com Grotto et al.,20 utilizando uma derivação de ácido tiobarbitúrico (TBA). Uma curva padrão foi preparada utilizando sal de tetrabutilamônio de MDA em concentrações que variam de 0,5 a 5 µmol/L. O MDA foi determinado à 532 nm e os resultados foram expressos em umol/L de MDA/miligrama de proteína.

 Parâmetro inflamatório

A concentração do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) foi avaliado por ensaio de imuno absorção enzimática (ELISA) de acordo com as recomendações do fabricante (ThermoFisher Scientific, cat.KMC3011). Resultados expressos em pg/mg de proteína.

 Análise estatística

Inicialmente, os dados foram confrontados pelo teste de Grubbs para verificação de possíveis outliers seguido pelo teste de normalidade Shapiro-Wilk, sendo que os mesmos atenderam às pressuposições para o uso de testes paramétricos. Foi então realizado o teste variância de duas vias (two-way ANOVA) seguido pelo teste post-hoc Bonferroni quando necessário. Para análise dos dados do TTI (Tabela 2) foi realizado o teste de variância de uma via (one-way ANOVA) de medida repetida seguido pelo post-hoc teste de Tukey quando necessário. O nível de significância adotado foi de p < 0,05. Foi utilizado o Graph Pad Prism versão 5 como pacote estatístico. Todos os dados foram expressos em média e desvio padrão, exceto pela figura 1A, expressa em média e erro padrão da média.

 Resultados Peso corporal e resistência à insulina

O ER teve um efeito benéfico impedindo que o grupo DIO+ER continuasse ganhando peso mesmo frente ao consumo da DIO, não caracterizando emagrecimento, mas sim uma manutenção do peso mesmo sem controle de ingesta (Figura 1A-C).

A - Peso corporal total ao longo do estudo; B – delta (variação do peso corporal em relação ao início do estudo); C – comparação dos pesos entre 1ª semana (início), 18ª saemana (pré-exercício) e 26ª semana (pós-exercício); D - Taxa de decaimento da glicose no teste de tolerância à insulina (kITT). Figura A, B e D - <sup>*</sup>p < 0,05 vs. respectivo não treinado do mesmo período, <sup>#</sup>p < 0,05, <sup>##</sup>p < 0,01 e <sup>###</sup>p < 0,001 vs. respectivo DP do mesmo período; <sup>&</sup>p < 0,05 vs. mesmo grupo da semana anterior. Figura C - <sup>*</sup>p < 0,001 vs. respectivo não treinado do mesmo período; <sup>#</sup>p < 0,01 e <sup>##</sup>p < 0,001 vs. respectivo DP do mesmo período; <sup>&</sup>p < 0,05, <sup>&&</sup>p < 0,001 vs. mesmo grupo da semana anterior.

O TTI realizado pré-exercício demonstrou que os animais expostos à DIO apresentam um quadro de resistência à insulina (p > 0,05) (Tabela 2). Os resultados demonstraram que a DIO pode levar a um prejuízo da captação da glicose mesmo frente à um estímulo externo de insulina (2U/kg de peso). O ER (p < 0,05), mesmo frente ao consumo de DIO, foi capaz de retardar a progressão do quadro, mantendo melhor taxa de decaimento da glicose quando comparada ao grupo DIO sedentário (p < 0,01). Não houve diferença significativa entre pré e pós exercício em nenhum grupo (Figura 1D).

Teste de tolerância à insulina (TTI) – Curva de glicemia
Tempo de coleta (Glicose mg/dL e variação em relação ao tempo 0 min)
0 min 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min
Pré-exercício DP 154,3 139,2 (-15,0) 98,7 (-55,5) 77,5 (-76,8) 65,2 (-89,0) 56,7 (-97,5) 43,2 (-111,0)
DP+ER 129,3 134,7 (+5,5) 57,7 (-71,5) 54,7 (-74,5) 46,7 (-82,5) 35,3 (-94,0) 25,5 (-103,8)
DIO 191,0† 186,0 (-5,0) 125,5 (-65,5) 118,0 (-73,0) 106,5 (-84,5)† 101,3 (-89,8)† 99,0 (-92,0)†
DIO+ER 163,8*† 164,5 (+0,8) 128,0 (-35,8)† 115,2 (-48,5)† 107,3 (-56,5)† 100,8 (-63,0)† 99,5 (-64,3)†
Pós-exercício DP 129,0 97,5 (-31,5) 71,0 (-58,0) 54,5 (-74,5) 59,0 (-70,0) 37,5 (-91,5) 27,0 (-102,0)
DP+ER 122,3 102,0 (-20,3) 66,2 (-56,0) 53,5 (-68,8) 42,0 (-80,3)* 23,0 (-99,3) 15,8 (-106,5)
DIO 150,8†‡ 120,7 (-30,0)‡ 110,5 (-40,3)† 105,5 (-45,3)† 97,0 (-53,8)† 94,0 (-56,8)† 92,0 (-58,8)†
DIO+ER 127,8*‡ 133,5 (+5,8) 93,7 (-34,0) 68,0 (-59,8)‡ 64,3 (-63,5)*‡ 58,5 (-69,3)*†‡ 46,5 (-81,3)*†‡
Fonte: dados da pesquisa. Pré-adaptação/exercício (semana 17) e pós-exercício (semana 26). Após 6 horas de jejum foi mensurada da glicose sanguínea (dados da tabela) nos tempos 0 min (basal), seguida da aplicação intraperitoneal de insulina (2 U/kg) e mensurações nos tempos 5-30 min.

p < 0,05 versus respectivo não treinado;

p < 0,05 versus respectiva dieta padrão;

p < 0,05 versus respectivo pré-exercício. DP: dieta padrão; ER: exercício resistido; DIO: dieta hiperlipídica.

 Oxidação do DCFH

Os níveis de oxidação de DCFH foram mensurados como indicadores da produção de espécies reativas, especialmente peróxido de hidrogênio, e os resultados demonstraram que em animais não treinados, a DIO causou aumento dos níveis de DCF (p < 0,001) em comparação aos animais com DP. Por sua vez, nos animais alimentados com DIO e submetidos ao treinamento resistido (DIO+ER), foi observado uma diminuição significativa dos níveis de DCF em comparação com o grupo DIO (p < 0,01) (Figura 2A).

Balanço redox e parâmetro inflamatório em tecido cardíaco de animais alimentados com dieta padrão ou hiperlipídica e posteriormente submetidos ao treinamento resistido. A - Oxidação de DCFH; B – Conteúdo de MDA; C – Atividade da enzima SOD; D – Atividade da enzima CAT; E – Conteúdo de glutationa total (reduzida e oxidada); F – níveis de TNF-α. <sup>*</sup>p < 0,05, <sup>**</sup>p < 0,01 e <sup>***</sup>p < 0,001 vs. respectivo não treinado; <sup>#</sup>p < 0,05, <sup>##</sup>p < 0,01 e <sup>###</sup>p < 0,001 vs. respectivo DP.

Lipoperoxidação

Como observado na figura 2B, os níveis de MDA sugerem uma elevação da lipoperoxidação nos animais DIO (p < 0,05), com reversão do quadro (p < 0,05) perante o treinamento resistido (DIO+ER).

 Atividade da SOD

Os resultados observados na figura 2C mostram que a DIO não alterou a atividade da SOD, porém o treino resistido foi capaz de aumentar sua atividade no grupo DP+ER (p < 0,05), aumento esse, não observado, quando o exercício foi realizado no grupo obeso.

 Atividade da CAT

Os resultados observados na figura 2D demonstram uma redução na atividade da CAT nos animais treinados (DP+ER, p < 0,001 e DP; DIO+ER, p < 0,01 vs. respectivo não treinado). Já os animais DIO, também apresentava uma diminuição da CAT (p < 0,05), porém somente quando comparado ao respectivo DP.

 GSH

Os níveis totais de glutationa não foram significativamente alterados em ambas as intervenções utilizadas no presente estudo (dietética e exercício) (Figura 2E).

 Parâmetro inflamatório

Os níveis de TNF-α foram utilizados como indicador inflamatório no tecido cardíaco e os resultados observados na figura 2F revelam um aumento no conteúdo de TNF-α nos animais DIO (p < 0,05), sendo reduzida significativamente (p < 0,05) após a intervenção com exercício físico resistido (DIO+ER).

 Discussão

Estudos têm demonstrado que o consumo de uma dieta rica em gordura, concomitante a um estilo de vida sedentário, pode desencadear diversos problemas de saúde21,22 com impacto significativo sobre o sistema cardiovascular. Nesse sentido, estudos experimentais têm sido utilizados para estudar os efeitos celulares provados por dieta rica em gordura.6,23,24 Os resultados de peso corporal e do TTI demonstraram que o modelo experimental adotado foi eficaz no aumento do peso e na instalação de um quadro de resistência à insulina sistêmica. O aumento do peso corpóreo tem sido relacionado com alterações inflamatórias e estresse oxidativo e ambas as alterações com a resistência à insulina em músculo esquelético,25,26 mas recentes estudos também têm demostrado que as células cardíacas são também susceptíveis ao aumento de peso elevando mediadores inflamatórios e de estresse oxidativo.6,23,24,27,28 Nesse contexto, estudos prévios têm sugerido um importante papel do exercício físico, em particular, aeróbio ou de endurance, sobre as mudanças bioquímicas e moleculares que ocorrem no miocárdio decorrente de uma dieta rica em gordura.3,7 Contudo, esses efeitos são de maneira-dependente às características do exercício como duração, frequência, intensidade e tipo.

Resultados iniciais do nosso estudo demostram que animais DIO apresentam níveis elevados de DCF, um indicador indireto da produção de peróxido de hidrogênio.29 Esses dados são também observados por recente estudo publicado em 2017 por Zeng et al.,23 Os autores revelaram uma elevada susceptibilidade do miocárdio ao estresse oxidativo com significativo aumento na oxidação de DCFH, tanto in vitro quanto in vivo, mediado por dieta rica em gordura. Esses valores aumentados de DCF, observado nos animais DIO, foram significativamente reduzidos após o treinamento resistido, o que sugere um papel importante desse tipo de treinamento na regulação dos níveis de oxidantes celulares. Tal efeito pode estar associado ao fato do treinamento resistido exercer papel modulatório sobre enzimas antioxidantes endógenas. Essa observação é pautada em estudos prévios de nosso grupo em outros modelos experimentais inflamatórios que mostram importante papel do treinamento resistido sobre o sistema antioxidante enzimáticos em diferentes tecidos.30,31

A SOD e a CAT são duas enzimas que atuam sinergicamente na formação (via dismutação do radical superóxido) e catálise do peróxido de hidrogênio, respectivamente. Os animais DIO não apresentaram mudanças na atividade da SOD, o que sugere que a produção aumentada de DCF pode estar associada a outros estímulos independente da SOD. Um dos fatores para isso é que apesar da oxidação de DCFH para DCF ser amplamente usado com indicador de produção de peróxido de hidrogênio, estudos têm observado que DCFH também pode ser oxidado por outras espécies reativas, em menor escala, como hidroxila, peroxila, óxido nítrico e peróxido nitrito.29 Também cabe observar que a formação de peróxido de hidrogênio não é totalmente dependente da atividade da SOD. Em menor escala, eventos de auto oxidação de biomoléculas também contribuem para a formação de peróxido de hidrogênio.32 Essas condições limitariam a atividade da SOD, o que pode justificar os resultados encontrados.

Catalases são um grupo de enzimas que catalisam a decomposição do peróxido de hidrogênio para água e oxigênio. Nossos resultados mostram uma redução na atividade dessa enzima após o treinamento resistido no grupo exposto a DP. Como observado, a atividade da SOD foi aumentada nesse mesmo grupo, gerando, portanto, maiores níveis de peróxido de hidrogênio. Contudo, a redução na atividade da enzima sugere uma menor catálise do peróxido de hidrogênio, mas vale a ressalva que o peróxido de hidrogênio pode ser catalisado, sob essas condições, por outros sistemas de detoxificação celular como sistema glutationa e peroxinas,33 o que poderia justificar nossos resultados já que o sistema glutationa apresentou aumento no grupo em questão (DP+ER). Ainda, observamos níveis reduzidos de CAT após o treinamento resistido no grupo DIO+ER e, portanto, considerando que a dieta aumenta significativamente a produção de oxidantes celulares como o peróxido de hidrogênio, uma atividade reduzida da CAT, poderia impactar nos possíveis danos oxidativos no miocárdio se o peróxido de hidrogênio não fosse catalisado por outros sistemas já mencionados (não investigado no presente estudo, mas que merece atenção em estudos futuros).

No sentido de observar os efeitos do ER sobre os danos oxidativos no miocárdio induzidos pelo modelo de DIO, nós avaliamos os níveis de MDA, um subproduto da lipoperoxidação, e observamos que animais DIO apresentam maiores danos em lipídeos em relação ao grupo com DP e que o ER foi capaz de reverter esses efeitos. Esses efeitos do modelo de DIO sobre os níveis de lipoperoxidação também foram observados em um estudo com camundongos BL6/C57 conduzido por Muthulakshmi and Saravanan (2013).34 Os resultados positivos do ER estão, possivelmente, associados com a capacidade do exercício em promover uma modulação dos sistemas antioxidantes para além da atividade de enzimas antioxidantes primárias como SOD e CAT. Um dos mecanismos que pode ser mediado pelo ER é a translocação do Fator Nuclear Eritroide 2 - tipo 2 (NRF2) para o núcleo e promover a expressão de diversas enzimas antioxidantes como NADH: quinone oxidoreductase 1 (NQO1 e Heme Oxigenase 1 (HO1), que ajudam a detoxificar o sistema biológico e contribuir para a redução do estresse oxidativo.35 Merry and Ristow (2016)36 sugerem que o exercício pode estimular a translocação do NRF2 para regular funcionalmente a biogênese mitocondrial do músculo esquelético e a expressão de genes de defesa antioxidantes. Embora esses resultados sejam a partir de treinamento aeróbio e em músculo esquelético, acredita-se que tais efeitos possam também ocorrer via treinamento resistido, uma vez que o treinamento resistido ativa Proteína Quinase Ativada por Adenosina Monofosfato (AMPK)37 que aumenta a fosforilação do NRF2 na célula e eleva o nível de NRF2 fosforilado no núcleo.38

O aumento na produção de oxidantes no miocárdio pode ser mediado por uma possível resposta inflamatória induzida pela obesidade/DIO com secreção de diferentes mediadores. Nesse contexto, o TNF-α é um mediador sensível ao modelo DIO que apresenta uma vasta gama de ações pró-inflamatórias. Nossos resultados demostraram um aumento significativo nos níveis de TNF-α em animais DIO com consequente redução após o treinamento resistido. Níveis aumentados de TNF-α no miocárdio induzidos pela DIO também foram observados em estudos prévios.3,28 Os efeitos do exercício podem estar relacionados ao fato do exercício aeróbio e resistido promoverem aumento na secreção de citocinas anti-inflamatórias e regular os níveis de TNF-α.30,31 Durante o exercício, os músculos liberam miocinas que estão envolvidas no crescimento, reparo e respostas anti-inflamatórias dos tecidos.39 A IL-6 é a miocina primária liberada em resposta ao exercício e aumenta os níveis da IL-10 e diminui os níveis do TNF-α.40 A IL-10 reduz a disfunção cardíaca pela diminuição da fibrose cardíaca.39 Nesse cenário, a obesidade induzida por DIO diminui os níveis de proteína de IL-10, mas o treinamento físico aumenta significativamente os níveis de IL-10 nos tecidos cardíacos.3

Conforme dados de estudos prévios, considera-se o controle da secreção de TNF-α no miocárdio pelo ER um fator importante nos mecanismos de cardioproteção relacionados ao estresse oxidativo.

 Conclusão

Nossos resultados demostraram um importante efeito do ER sobre o controle/estabilização do peso corporal mesmo sem controle de ingesta. Também ficou demonstrado que existe uma alteração redox do tecido cardíaco frente a um modelo de obesidade, porém parece não ser mediado majoritariamente pela produção e controle antioxidante clássica de peróxido de hidrogênio, e sim por outras espécies reativas. Porém o ER foi capaz de reverter o dano em lipídeos e a produção de espécies reativas, mesmo com o consumo de DIO, bem como modular positivamente uma das principais citocinas responsáveis pela ativação do processo inflamatório.

Desta forma, o ER pode ser um grande aliado no processo de saúde referente à abordagem terapêutica da obesidade. Algumas limitações encontradas nestes estudos foram referentes a dados relacionados à quantificação da insulina sérica para melhor confirmar o quadro de resistência à insulina, e a avaliação de outras moléculas que podem alterar o balanço redox da célula. Estes testes não foram realizados por razões técnicas.

Finalmente, outros estudos devem ser conduzidos a fim de melhor esclarecer como o ER promove esses efeitos, em particular na regulação de espécies reativas como hidroxila, peroxila, óxido nítrico e peróxido nitrito, bem como outros parâmetros inflamatórios e anti-inflamatórios no tecido cardíaco.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pelo CNPq e Capes.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Pauline Souza Effting pela Universidade do Extremo Sul Catarinense.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Universidade do Extremo Sul Catarinense sob o número de protocolo 067/2014-2.