Abstract

Arq Bras Cardiol

abc

Arquivos Brasileiros de Cardiologia

Arq. Bras. Cardiol.

0066-782X 1678-4170

Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC

gwr7VtF3FrK4FyJhP8yqhgw

S0066-782X2019000400374

S0066-782X2019005022103

10.5935/abc.20180271

Original Article

Effects of Chronic Exposure to Mercury on Angiotensin-Converting Enzyme Activity and Oxidative Stress in Normotensive and Hypertensive Rats

Vassallo

Dalton Valentim

1 2

0000-0003-1395-3938

Simões

Maylla Ronacher

1 Giuberti

Karina

1 Azevedo

Bruna Fernandes

1 Ribeiro

Rogerio Faustino

Junior 1 Salaices

Mercedes

3 4 Stefanon

Ivanita

1 Universidade Federal do Espírito Santo Departamento de Ciências Fisiológicas

Vitória ES

Brazil Departamento de Ciências Fisiológicas - Universidade Federal do Espírito Santo,Vitória, ES - Brazil 2 Santa Casa de Misericórdia de Vitória Escola Superior de Ciências Centro de Ciências da Saúde de Vitória

Vitória ES

Brazil Centro de Ciências da Saúde de Vitória - Escola Superior de Ciências da Santa Casa de Misericórdia de Vitória (EMESCAM), Vitória, ES - Brazil 3 Universidade Autônoma de Madri Espanha Instituto de Investigación Sanitária Hospital La Paz Departamento de Farmacologia

Madri

Spain Departamento de Farmacologia - Universidade Autônoma de Madri - Espanha Instituto de Investigación Sanitária Hospital La Paz, Madri - Spain 4 CIBER de Enfermidades Cardiovasculares

Madri

Spain CIBER de Enfermidades Cardiovasculares, Madri - Spain

Mailing Address: Maylla Ronacher Simões • Departamento de Ciências Fisiológicas - Universidade Federal do Espírito Santo - Av. Marechal Campos, 1468. Postal Code 29043-900, Maruípe, Vitória, ES - Brazil E-mail: yllars@hotmail.com, mayllaronacher@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research: Vassallo DV, Simões MR, Giuberti K, Stefanon I; acquisition of data: Giuberti K, Azevedo BF, Ribeiro Junior RF; analysis and interpretation of the data and statistical analysis: Vassallo DV, Simões MR, Giuberti K, Azevedo BF, Ribeiro Junior RF, Salaices M, Stefanon I; obtaining funding: Vassallo DV, Salaices M; writing of the manuscript: Vassallo DV, Simões MR; critical revision of the manuscript for intellectual content: Vassallo DV, Simões MR, Salaices M, Stefanon I.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

07 01 2019

04 2019

112 4 374 380 27 04 2018 04 07 2018 02 08 2018

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract Background:

Mercury’s deleterious effects are associated with increased cardiovascular risk.

Objective:

To determine whether chronic exposure to inorganic mercury increases the activity of angiotensin-converting enzyme and its relationship with oxidative stress in several organs and tissues.

Methods:

We studied male Wistar and spontaneously hypertensive rats (SHR) (3-month-old) exposed or not to HgCl₂ for 30 days. At the end of treatment, we investigated the following: changes in body weight, hemodynamic parameters, angiotensin-converting enzyme (ACE) activity and oxidative stress in the heart, aorta, lung, brain and kidney in hypertensive compared to normotensive animals. A value of p < 0.05 was considered significant.

Results:

Chronic exposure to HgCl₂ did not affect weight gain in either group. Systolic blood pressure, measured weekly, did not increase in Wistar rats but showed a small increase in SHR rats. We also observed increases in left ventricular end-diastolic pressure and ACE activity in the plasma and hearts of normotensive rats. In the SHR+Hg group, ACE activity increased in plasma but decreased in kidney, lung, heart, brain and aorta. Oxidative stress was assessed indirectly by malondialdehyde (MDA) production, which increased in Hg-treated rats in both plasma and heart. In the SHR+Hg group, MDA increased in heart and aorta and decreased in lungs and brain.

Conclusion:

These results suggest that chronic exposure to inorganic mercury aggravates hypertension and produces more expressive changes in ACE activity and oxidative stress in SHRs. Such exposure affects the cardiovascular system, representing a risk factor for the development of cardiovascular disorders in normotensive rats and worsening of pre-existing risks for hypertension.

Keywords: Mercury Poisoning Oxidative Stress/radiation effects Peptidyl-Dipeptidase A Hypertension Rats

FAPES

CAPES

CNPq

Ministério da Economia e Competitividade

2016-80305-P

This study was funded by FAPES, CAPES, CNPq, Ministério da Economia e Competitividade (SAF 2016-80305-P).

Introduction

Mercury is a toxic metal that causes harmful effects on the cardiovascular system. Blood concentrations levels of 8 ng/mL are found in exposed individuals,1^,2 which might have a relationship with hypertension development.3

Several reports showed that mercury induces oxidative stress and might damage several organs and systems.4^-9 In addition, increased mercury exposure has been associated with cardiovascular diseases, such as hypertension, carotid atherosclerosis, myocardial infarction and coronary heart disease.10^,11 Moreover, oxidative stress is reported to be an efficient mechanism for generation of oxidized low-density lipoprotein and subsequently atherosclerosis;12^,13 then, generation of advanced glycation end-products and participation of inflammatory cells take place, sustaining vascular injury.14

One of the main harmful actions of mercury is the generation of oxygen free radicals. NADPH oxidase activation and cyclooxygenase (COX) stimulation induced by mercury may trigger the production of reactive oxygen species (ROS).11^,15^,16 Moreover, in animal models chronic mercury exposure for 30 days promoted contractility dysfunction in isolated hearts as a result of decreased Na⁺-K⁺-ATPase (NKA) activity, reduction in sodium/calcium exchanger (NCX) and sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) activity and increased phospholamban (PLB) expression.17 Although no effects on blood pressure, heart rate or left ventricular systolic pressure have been reported, mercury causes a small increase in left ventricular end-diastolic pressure in rats.17

Additionally, at the vascular level, the vasoconstrictor response to phenylephrine was increased in caudal, mesenteric, coronary arteries and in the rat aorta, effects commonly related to reduced bioavailability of nitric oxide (NO) and increased oxidative stress.4^,18^,19 Interacting with NO, superoxide anion (O₂.-) forms peroxynitrite, decreasing NO availability for smooth muscle relaxation.20^-22

We reported that mercury administration increases local angiotensin converting enzyme (ACE) activity,18 releasing more angiotensin II that enhances the production of free radicals.23 These results show that mercury pressor effects might depend on angiotensin II generation and are involved in oxidative stress generation. Previous studies showed that mercury could increase local ACE activity and oxidative stress with subsequent oxidative damage in several organs and systems,5^,11^,24^-27 but the in vivo effects of mercury chronic exposure on cardiovascular activity are not yet completely understood.

Moreover, investigations on mercury effects have been mainly focused on the cardiovascular systems of normotensive animals. However, little information exists about the chronic effects of low doses of inorganic mercury regarding ACE activity in organs and tissues of normotensive and hypertensive animals. To investigate such effects, increased mercury levels were induced to produce blood level concentrations similar to those of exposed individuals. Therefore, we aimed to determine whether chronic exposure to inorganic mercury increases the activity of ACE and the relationship of such exposure with oxidative stress on heart, aorta, lung, brain and kidney in hypertensive compared to normotensive animals.

Methods Animals

Three-month-old male normotensive Wistar rats and SHRs (spontaneously hypertensive rats) were obtained from the Federal University of Espirito Santo breeding laboratories. During treatment, rats were housed at a constant room temperature, humidity, and 12:12-h light-dark cycle. Rats had free access to tap water and were fed with standard chow ad libitum. All experiments were conducted in compliance with the guidelines for biomedical research as stated by Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal-CONCEA, and in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institute of Health. The protocols were approved by the Ethics Committee of Escola Superior de Ciências da Santa Casa de Misericórdia de Vitória, Brazil (CEUA-EMESCAM 003/2007). Wistar rats and SHRs were divided into four groups: control Wistar rats (n = 6) and SHRs (n = 9) treated with vehicle (saline solution, im), and Wistar rats (n = 8) and SHRs (n = 9) treated with mercury chloride (HgCl₂) for 30 days (1^st dose 4.6 µg/kg, subsequent dose 0.07 µg/kg/day, im to cover daily loss). We used the model described by Wiggers et al.4 to reach blood level concentrations (7,97 ng/ml) similar to those of exposed individuals.

Blood pressure measurements

Indirect systolic blood pressure was measured at both the beginning and the end of the treatment using tail-cuff plethysmography (IITC Life Science Inc.). For this measurement, conscious rats were restrained for 5-10 min in a warm and quiet room and were conditioned to numerous cuff inflation-deflation cycles by a trained operator. Subsequently, systolic blood pressure was measured, and the mean of three measurements was recorded.

Hemodynamic parameter measurements

At the end of treatment, control and HgCl₂-treated rats (n = 26) were anaesthetized with urethane (1.2 g/kg, Sigma, St Louis, MO, USA), and the carotid artery and jugular vein were cannulated. A polyethylene catheter (PE50/Clay-Adams) filled with heparinized saline (50 U/mL) was introduced into the carotid artery to measure systolic blood pressure (SBP) and diastolic blood pressure (DBP). The carotid artery catheter was introduced into the left ventricle, and the jugular vein cannula was advanced into the right ventricular chamber to measure the left and right ventricular systolic pressures (LVSP and RVSP) and their positive and negative time derivatives (+dP/dt and - dP/dt, respectively) along with the left and right ventricular end-diastolic pressures (LVEDP and RVEDP). Recordings were performed over 30 min with a pressure transducer (TSD 104A-Biopac) and with an interface and software for computer data collection (MP100A, Biopac System, Inc., Santa Barbara, CA, USA). Heart rate (HR) was determined in the interbeat intervals.

Measurement of malondialdehyde (MDA) production. Levels of MDA in plasma, heart, aorta, brain, kidney and lung were measured using a modified thiobarbituric acid (TBA) assay.28 Plasma and tissue samples were mixed with 20% trichloroacetic acid in 0.6 M HCl (1:1, v/v), and tubes were kept on ice for 20 min to precipitate plasma components to avoid possible interferences. Samples were centrifuged at 1500 x g for 15 minutes before adding TBA (120 mM in Tris 260 mM, pH 7) to the supernatant in a proportion of 1:5 (v/v); then, the mixture was boiled at 97ºC for 30 min. Spectrophotometric measurements at 535 nm were taken at 20º C.

ACE activity assay

ACE activity was measured in plasma, heart, aorta, brain, kidney and lung using a fluorometric method adapted from Friedland and Silverstein.29 Briefly, triplicate tissue and plasma samples (3 µL) were incubated for 15-90 minutes at 37ºC with 40 µL of assay buffer containing the ACE substrate 5 mM Hip-His-Leu (Sigma). The reaction was stopped by the addition of 190 µL of 0.35 M HCl. The generated product, His-Leu, was measured fluorometrically following 10 min of incubation with 100 µL of 2% o-Phthalaldehyde in methanol. Fluorescence measurements were taken at 37ºC in a FLUOstar Optima plate reader (BMG Labtech, Offenburg, Germany) with 350 nm excitation and 520 nm emission filters. The fluorescence plate reader was controlled using the FLUOstar Optima Software. Black 96-Well polystyrene microplates (Biogen Cientifica, Madrid, Spain) were used. A calibration curve with ACE from the rabbit lung (Sigma) was included in each plate.

Data analysis and statistics

The results are expressed as the mean ± SD. All parameters were tested for normality using the one-sample Kolmogorov-Smirnov test. Differences were analysed using one-way ANOVA, followed by a post hoc Tukey test (GraphPad Prism Software, San Diego, CA). A p value < 0.05 was considered significant.

Results

At 30 days of mercury treatment, Wistar controls, Wistar treated rats, and treated and untreated SHRs had similar body weights, although the SHRs had lower body weights when compared with Wistar rats (Table 1).

Table 1 Body Weight (BW), Brain/BW, Heart/BW, Kidney/BW, Lung/BW, Adrenals/BW, Spleen/PC and Liver/PC from HgCl2-treated and non-treated Wistar rats and spontaneously hypertensive rats (SHRs)

	Wistar Controln = 6	Wistar HgCl₂-treatedn = 8	SHR Controln = 9	SHR HgCl₂-treatedn = 9
Body weight (BW) (g)	399 ± 58.3	384 ± 18.1	216 ± 20.1* ^†	222 ± 14.4* ^†
Brain/BW (mg/g)	4.58 ± 0.7	4.69 ± 0.5	7.48 ± 0.7* ^†	7.41 ± 0.5* ^†
Heart/BW (mg/g)	3.06 ± 0.6	3.43 ± 0.2	3.77 ± 0.2	3.81± 0.2
Kidney/BW (mg/g)	6.44 ± 1.7	6.53 ± 0.5	6.78 ± 0.3	6.80 ± 0.6
Lung/BW (mg/g)	3.97 ± 1.5	4.53 ± 0.6	6.48 ± 1.2* ^†	7.91 ± 1.2* ^†

Results represent mean ± SD; n: number of animals used. One-way ANOVA, post hoc Tukey’s.

p < 0.05 compared with the Wistar control and

^†

p < 0.05 compared with HgCl₂: treated Wistar rats.

Table 1 also shows that several organs, including the brain, heart, kidney and lungs, presented similar weights, normalized by body weight, which did not change after mercury treatment.

Indirect SBP measured at day zero in awake rats showed that SHRs had a higher mean arterial pressure compared with Wistar rats (Table 2). However, at the end of the treatment, mercury produced a significant increment of blood pressure only in HgCl₂-treated SHR rats (Table 2).

Table 2 Values of systolic blood pressure (SBP in mmHg) measured by tail plethysmography in Wistar rats and spontaneously hypertensive rats (SHRs) before and after treatment for 30 days with HgCl2.

	Wistar CTn = 5	Wistar Hgn = 5	SHR CTn = 5	SHR Hgn = 5
SBP – Day 0 (mmHg)	123 ± 13	131 ± 15	205 ± 15	198 ± 22
SBP – Day 7 (mmHg)	119 ± 4	132 ± 9	221 ± 18	197 ± 18
SBP – Day 14 (mmHg)	115 ± 10	135 ± 9	219 ± 9	199 ± 29
SBP – Day 21 (mmHg)	132 ± 17	142 ± 14	200 ± 13	199 ± 9
SBP – Day 30 (mmHg)	117 ± 6	143 ± 11	220 ± 21	232 ± 19^#

Results represent the mean ± SD; n: number of animals used. One-way ANOVA, post hoc Tukey’s for all groups.

p < 0.05 vs. SHR treated with mercury at day 0

Arterial blood pressures, ventricular pressures and their respective derivatives, and HR measurements in anaesthetized rats were not different between groups (Table 3), but the LVEDP increased after Hg treatment in the Wistar group, as previously reported.17

Table 3 Hemodynamic parameters from untreated and mercury (HgCl2)-treated Wistar rats and spontaneously hypertensive rats (SHRs)

	Wistar Controln = 6	Wistar HgCl₂-treatedn = 7	SHR Controln = 6	SHR HgCl₂-treatedn = 7
SBP (mmHg)	105 ± 10	97 ± 11	105 ± 7	113 ± 8
DBP (mmHg)	71 ± 10	67 ± 11	58 ± 5	68 ± 11
HR (bpm)	324 ± 88	325 ± 58	343 ± 32	341 ± 34
LVSP (mmHg)	114 ± 20	107 ± 16	117 ± 22	112 ± 8
LVEDP (mmHg)	0.256 ± 1	3.31 ± 1*	1.11 ± 0.2	0.493 ± 0.5
+dP/dt LV (mmHg/s)	8627 ± 3378	8500 ± 2419	7360 ± 1854	7001 ± 1921
-dP/dt LV	-6270 ± 1232	-6249 ± 1234	-7169 ± 1173	-6524 ± 1131
RVSP (mmHg)	32 ± 10	29 ± 5	29 ± 5	33 ± 5
RVEDP (mmHg)	-1.080 ± 1	1.10 ± 2	-0.472 ± 1	0.459 ± 0.3
+dP/dt RV (mmHg/s)	3339 ± 2202	1758 ± 435	2776 ± 1056	2171 ± 405
– dP/dt RV (mmHg/s)	-2560 ± 1553	-1387 ± 469	-1833 ± 478	-1695 ± 368

Changes in systolic (SBP) and diastolic (DBP) pressure, heart rate (HR), left and right ventricle systolic pressure (LVSP, RVSP), left and right ventricle end diastolic pressure (LVEDP, RVEDP) and positive (+dP/dt) and negative first-time derivatives (-dP/dt) from the left and right ventricles of Control and HgCl₂-treated rats. The results represent the mean ± SD. n-Number of animals used. One-way ANOVA, post hoc Tukey’s.

p < 0.05 vs Wistar Control.

It has been reported in animal and human studies that mercury increases free radical production leading to an oxidative stress.4^,24^,30^,31 We then evaluated the oxidant state in the blood and in several other tissues by measuring MDA levels (Table 4). MDA plasma levels were greater in mercury-treated than in untreated Wistar rats but did not change in SHRs. Mercury treatment increased MDA levels in the heart in both Wistar and SHRs. In the aorta, different from plasma, MDA levels were increased in mercury-treated SHRs but not in Wistar rats. For brain and lungs, no changes were observed for MDA levels in mercury-treated Wistar rats, but a reduction occurred in SHRs. For kidneys, mercury treatment reduced MDA levels in both Wistar and SHR mercury-treated groups.

Table 4 Malondialdehyde (MDA) (mM/mg of protein) concentrations in plasma, heart, aorta, lung, brain and kidney of untreated and Mercury (HgCl2)-treated Wistar rats and spontaneously hypertensive rats (SHRs)

	Wistar Controln = 6	Wistar HgCl₂-treatedn = 6	SHR Controln = 6	SHR HgCl₂-treatedn = 7
Plasma	0.93 ± 0.15	1.28 ± 0.44*	0.89 ± 0.22	0.92 ± 0.05
Heart	0.22 ± 0.03	0.28 ± 0.03*	0.45 ± 0.05	0.55 ± 0.05^&
Aorta	0.13 ± 0.03	0.12 ± 0.05	0.96 ± 0.27	1.51 ± 0.37^&
Lung	0.18 ± 0.05	0.14 ± 0.03	0.21 ± 0.03	0.12 ± 0.03^&
Brain	0.13 ± 0.03	0.09 ± 0.03	0.54 ± 0.07	0.34 ± 0.03^&
Kidney	0.38 ± 0.07	0.14 ± 0.03*	0.96 ± 0.07	0.51 ± 0.03^&

Values are expressed in mM/mg of protein (MDA). The results represent the mean ± SD. N-Number of animals used. One-way ANOVA, post hoc Tukey’s.

p < 0.05 vs Wistar Control and

p < 0.05 vs SHR Control.

Since angiotensin II is reported to increase ROS and mercury increases ACE,32^,33 we investigated whether ACE activity was altered after 30 days of mercury treatment in Wistar and SHR groups. Table 5 shows that plasma ACE levels increased in both groups after mercury treatment. In the hearts of Wistar rats, mercury induced a slight ACE activity increment, but no changes were observed in the aorta, lungs, brain or kidneys. However, in mercury-treated SHRs, ACE activity was reduced in the heart, aorta, lungs, brain and kidneys. Interestingly, ACE activity was higher in the heart, aorta and kidneys and lower in plasma of SHR controls compared with Wistar controls.

Table 5 Angiotensin converting enzyme (ACE) activity levels in plasma, heart, aorta, lung, brain and kidney of untreated and Mercury (HgCl2)-treated Wistar rats and spontaneously hypertensive rats (SHRs)

	Wistar Controln = 6	Wistar HgCl₂-treatedn = 6	SHR Controln = 6	SHR HgCl₂-treatedn = 6
Plasma	187 ± 39.2	235 ± 34.3*	114 ± 27.9*	163 ± 38.7^&
Heart	3.4 ± 0.5	4.1 ± 0.3*	17.9 ± 2.7*	14.8 ± 1.4^&
Aorta	213 ± 53.9	221 ± 61.3	670 ± 39.9*	535 ± 47.0^&
Lung	95 ± 6.1	99.4 ± 11.3	87.6 ± 5.4	75.1 ± 9.8^&
Brain	46.4 ± 7.9	42.6 ± 9.9	40.3 ± 5.6	27.8 ± 4.4^&
Kidney	47.8 ± 16.2	45.4 ± 14.2	80.0 ± 15.4*	61.4 ± 6.9^&

Values are expressed in nmol/mL/min/mg of protein in tissues and in nmol/mL of plasma/min in plasma (ACE). Results represent the mean ± SD. N-Number of animals used. One-way ANOVA, post hoc Tukey’s.

p < 0.05 vs Wistar Control and

p < 0.05 vs SHR Control.

Discussion

The results presented here suggest that Wistar rats and SHRs, submitted to chronic exposure to inorganic mercury for 30 days, have blood concentrations similar to exposed individuals.1^,2 In addition, HgCl₂-treated SHR, but not Wistar rats have increased blood pressure at the end of treatment. The intervention also influenced ACE activity and oxidative stress, by increasing or decreasing them, mainly in SHRs.

Previous reports showed that changes resulting from chronic exposure to mercury have been focused on its toxic effects on the cardiovascular system and the associations with hypertension, carotid atherosclerosis, myocardial infarction and coronary heart disease.9^,10^,34 Mercury exposure, both acute and chronic, affects the heart and endothelial function, reducing NO bioavailability and increasing ACE and NADPH activities.15^,18^,19 Moreover, studies in rats showed that body weight gain and arterial pressure were not affected when chronic exposure was performed,4^,17 suggesting that this treatment was not sufficient, in either amount or time, to produce changes. Our results reproduced those findings, showing no changes in body weight gain; additionally, similar behaviour was observed for the heart, brain, kidneys and lung, reinforcing the suggestion that this treatment is not sufficient to produce these changes, although cardiovascular function began to be affected.

Regarding the hemodynamic evaluation, no changes were observed in the left or right ventricle in Wistar rats or SHRs. Only an increment of LVEDP was observed in normotensive rats treated with mercury, indicating some deleterious effects of mercury on ventricular function.35 Right ventricular pressures were investigated because of our previous report showing that under acute mercury exposure (0.5 mg/kg), there was an increase in right ventricular systolic pressure because of pulmonary hypertension,3^,36^-39 which was not observed with chronic treatment in the present study. The fact that lung ACE activity was unaffected in both Wistar groups, although slightly reduced in HgCl₂-treated SHRs might explain why the right ventricular pressures remained unchanged.

The reduction of NO bioavailability is a hallmark resulting from the increase in ROS generation contributing to the development of cardiovascular diseases such as atherosclerosis and hypertension.10^,11^,34 The interaction of superoxide anion with NO generates peroxynitrite that decreases NO bioavailability increasing vascular reactivity.20^-22 In fact, our previous studies have associated mercury exposure with increased oxidative stress and the reduction of NO bioavailability.15^,19 In addition, it has been shown that an increase of the local ACE activity could increase NADPH oxidase activity^{(16 40)} and ROS in the aortas of normotensive and SHRs. Therefore, we investigated whether mercury effects alter the renin-angiotensin system and oxidative stress in the organs and tissues of hypertensive and normotensive rats. The increase in ACE activity induced by mercury could lead to increased activity of NADPH oxidase, which could, in turn, increase the release of ROS, generating an oxidative stress, as observed in this study.

Considering that both Hg and increased ACE activity can induce oxidative stress, we should observe a correlation between the amount of oxidative stress and ACE activity measured by MDA. An interesting aspect is that ACE activity levels and MDA concentrations showed similar behavior in plasma and organs investigated. Also, it is of note that both ACE activity and MDA concentrations showed more expressive changes in HgCl₂-treated SHRs. Similarly, inorganic mercury treatment aggravated hypertension in SHRs, suggesting that a pre-existing hypertensive condition enhances inorganic mercury action.

ROS are damped in the plasma of all locations where they are produced, and consequently, it is expected an increase in MDA. We have shown that plasma ACE activity increases after acute exposure to low mercury concentrations and reduces after exposure to high concentrations.18^,39 However, we might speculate that in the SHR group, when exposed to mercury, tissues that produce more ROS, such as the aorta, lung and kidney, ACE activity is reduced. Similarly, in the brain tissue, which concentrates mercury, ACE activity also decreased. LVEDP increments in Wistar rats could be explained by the local increase in ACE activity and oxidative stress in the heart. These two factors might explain the small, but significant increase in LVEDP, probably induced by a calcium overload.

Although we cannot give a proper explanation for all the events, it can be suggested that mercury, even at concentrations that do not affect arterial pressure and weight gain in normotensive rats, affects ACE activity and oxidative stress. However, in hypertensive animals, inorganic mercury actions were more expressive. These findings give rise to questions that are not addressed by our results: can exposure to mercury inhibit ACE activity in situations where it is already increased? Does ACE activity in different organs depend on mercury concentration in each of them? Would a pre-existing cardiovascular disorder be aggravated by exposure to inorganic mercury? These questions can be considered limitations of our study, and issues for further studies.

Conclusions

Results described here allow us to affirm that chronic exposure to inorganic mercury, similarly to that we previously reported, produces blood concentrations compatible with those found in exposed humans, and do represent a cardiovascular risk factor. Such exposure influenced ACE activity, increased oxidative stress and promoted hypertension in SHRs (which had a higher blood pressure increment compared with untreated SHRs), as well as increased the LVEDP in Wistar rats. This controlled exposure affected the cardiovascular system, produced more expressive changes of ACE activity and oxidative stress in SHRs representing a risk factor for the development of cardiovascular disorders in normotensive rats and a contributing factor to pre-existing risks in high blood pressure condition.

Sources of Funding

This study was funded by FAPES, CAPES, CNPq, Ministério da Economia e Competitividade (SAF 2016-80305-P).

Study Association

This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Maylla Ronacher Simões, from Universidade Federal do Espírito Santo

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee on Animal Experiments of the Escola Superior de Ciências da Santa Casa de Misericórdia de Vitória under the protocol number CEUA-EMESCAM 003/2007.

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Artigo Original

Efeitos da Exposição Crônica ao Mercúrio sobre a Atividade da Enzima Conversora de Angiotensina e Estresse Oxidativo em Ratos Normotensos e Hipertensos

Vassallo

Dalton Valentim

1 2

0000-0003-1395-3938

Simões

Maylla Ronacher

1 Giuberti

Karina

1 Azevedo

Bruna Fernandes

1 Ribeiro

Rogerio Faustino

Junior 1 Salaices

Mercedes

3 4 Stefanon

Ivanita

1 Departamento de Ciências Fisiológicas - Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, ES - Brasil 2 Centro de Ciências da Saúde de Vitória - Escola Superior de Ciências da Santa Casa de Misericórdia de Vitória (EMESCAM), Vitória, ES - Brasil 3 Departamento de Farmacologia - Universidade Autônoma de Madri - Espanha Instituto de Investigación Sanitária Hospital La Paz, Madri - Espanha 4 CIBER de Enfermidades Cardiovasculares, Madri - Espanha

Correspondência: Maylla Ronacher Simões • Departamento de Ciências Fisiológicas - Universidade Federal do Espírito Santo - Av. Marechal Campos, 1468. CEP 29043-900, Maruípe, Vitória, ES - Brasil E-mail: yllars@hotmail.com, mayllaronacher@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Vassallo DV, Simões MR, Giuberti K, Stefanon I; obtenção de dados: Giuberti K, Azevedo BF, Ribeiro Junior RF; análise e interpretação dos dados e análise estatística: Vassallo DV, Simões MR, Giuberti K, Azevedo BF, Ribeiro Junior RF, Salaices M, Stefanon I; obtenção de financiamento: Vassallo DV, Salaices M; redação do manuscrito: Vassallo DV, Simões MR; revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Vassallo DV, Simões MR, Salaices M, Stefanon I.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Resumo Fundamento:

Os efeitos deletérios do mercúrio estão associados ao risco cardiovascular aumentado.

Objetivo:

Determinar se a exposição crônica ao mercúrio inorgânico aumenta a atividade da enzima conversora de angiotensina e sua relação com o estresse oxidativo em vários órgãos e tecidos.

Métodos:

Estudamos ratos Wistar e ratos espontaneamente hipertensos (SHR) (3 meses de idade) expostos ou não a HgCl₂ por 30 dias. Ao final do tratamento, investigamos: alterações de peso, parâmetros hemodinâmicos, atividade da enzima conversora de angiotensina (ECA) e estresse oxidativo no coração, aorta, pulmão, cérebro e rim de animais hipertensos comparados a animais normotensos. Um valor de p < 0,05 foi considerado significativo.

Resultados:

A exposição crônica ao HgCl₂ não afetou o ganho de peso em nenhum dos grupos. A pressão arterial sistólica, medida semanalmente, não aumentou em ratos Wistar, mas mostrou um pequeno aumento nos ratos SHR. Também observamos aumentos na pressão diastólica final do ventrículo esquerdo e na atividade da ECA no plasma e no coração de ratos normotensos. No grupo SHR + Hg, a atividade da ECA aumentou no plasma, mas diminuiu no rim, pulmão, coração, cérebro e aorta. O estresse oxidativo foi avaliado indiretamente pela produção de MDA, que aumentou nos ratos tratados com Hg tanto no plasma quanto no coração. No grupo SHR + Hg, o MDA aumentou no coração e na aorta e diminuiu nos pulmões e no cérebro.

Conclusão:

Estes resultados sugerem que a exposição crônica ao mercúrio inorgânico agrava a hipertensão e produz mudanças mais expressivas na atividade da ECA e no estresse oxidativo em SHRs. Essa exposição afeta o sistema cardiovascular, representando um fator de risco para o desenvolvimento de distúrbios cardiovasculares em ratos normotensos e para piorar riscos pré-existentes para hipertensão.

Palavras-chave: Intoxicação por Mercúrio Estresse Oxidativo Peptidil Dipeptidase A Hipertensão Ratos

FAPES

CAPES

CNPq

Ministério da Economia e Competitividade

2016-80305-P

O presente estudo foi financiado pela FAPES, CAPES, CNPq, Ministério da Economia e Competitividade (SAF 2016-80305-P).

Introdução

O mercúrio é um metal tóxico que causa vários efeitos deletérios ao sistema cardiovascular. Níveis sanguíneos em torno de 8 ng/mL são encontrados em indivíduos expostos,1^,2 o que pode ter uma relação com o desenvolvimento da hipertensão.3

Vários estudos demonstraram que o mercúrio induz estresse oxidativo e pode causar danos a órgãos e sistemas.4^-9 Além disso, estudos mostraram associação entre exposição aumentada ao mercúrio e doenças cardiovasculares, tais como hipertensão, aterosclerose carotídea, infarto do miocárdio e doença arterial coronariana.10^,11 Ainda, o estresse oxidativo parece ser um mecanismo eficiente para a geração de lipoproteína de baixa densidade oxidada, e subsequentemente aterosclerose;12^,13 a produção subsequente de produtos finais da glicação avançada e a participação de células inflamatórias promovem a manutenção da injúria vascular.14

Um dos principais efeitos deletérios do mercúrio é a geração de radicais livres de oxigênio. O estímulo da NADPH oxidase e da ciclooxigenase (COX) induzido pelo mercúrio pode estimular a síntese de espécies reativas do oxigênio (EROs).11^,15^,16 Ainda, em modelos animais, a exposição crônica ao mercúrio por 30 dias promoveu disfunção da contratilidade em corações isolados, resultante de atividade reduzida Na+-K+-ATPase (NKA), redução na atividade do trocador de sódio e cálcio NCX e de ATPases transportadoras de cálcio do retículo sarcoplasmático (SERCA), e aumento na expressão da proteína fosfolambano (PLB).17 Apesar de nenhum efeito ter sido relatado do mercúrio sobre a pressão arterial, frequência cardíaca ou pressão sistólica do ventrículo esquerdo, o mercúrio causa um pequeno aumento na pressão diastólica final do ventrículo esquerdo em ratos.17

Além disso, a nível vascular, a resposta vasoconstritora à fenilefrina aumentou nas artérias caudal, mesentérica, coronária e aorta de ratos, efeitos comumente relacionados a menor biodisponibilidade de óxido nítrico (NO) e estresse oxidativo aumentado.4^,18^,19 Ao interagir com NO, o ânion superóxido (O₂-) forma peroxinitrito, diminuindo a disponibilidade de NO para o relaxamento de músculo liso.20^-22

Em estudo prévio,18 relatamos que a administração de mercúrio aumenta a atividade local da enzima conversora da angiotensina (ECA),18 liberando-se mais angiotensina II, a qual aumenta a produção de radicais livres.23 Esses resultados mostram que os efeitos do mercúrio sobre a pressão sanguínea podem ser dependentes da produção de angiotensina II, e estar envolvidos na geração de estresse oxidativo. Estudos anteriores mostraram que o mercúrio pode aumentar a atividade local da ECA e estresse oxidativo com subsequente dano oxidativo em vários órgãos e sistemas,5^,11^,24^-27 mas os efeitos in vivo da exposição crônica ao mercúrio sobre a atividade cardiovascular ainda não foram completamente esclarecidos.

Ainda, estudos sobre os efeitos do mercúrio têm focado principalmente o sistema cardiovascular de animais normotensos. Contudo, há pouca informação sobre os efeitos crônicos de baixas doses de mercúrio inorgânico sobre a atividade da ECA em órgãos e tecidos de animais normotensos e hipertensos. Para investigar esses efeitos, níveis aumentados de mercúrio foram induzidos a concentrações similares às observadas em indivíduos expostos ao metal. Portanto, nosso objetivo foi determinar se a exposição crônica ao mercúrio inorgânico aumenta a atividade da ECA, e a relação dessa exposição com estresse oxidativo no coração, artéria aorta, pulmão, cérebro e rim em ratos hipertensos em comparação a animais normotensos.

Métodos Animais

Ratos Wistar machos, de três meses de idade e ratos espontaneamente hipertensos (do inglês, spontaneously hypertensive rats, SHRs) foram obtidos de colônias conservadas no biotério da Universidade Federal do Espírito Santo. Durante o tratamento, os ratos foram mantidos sob temperatura ambiente e umidade constantes, e ciclo claro/escuro de 12/12 horas. Os animais tinham acesso livre à água e à ração padronizada. Todos os experimentos foram conduzidos seguindo-se as diretrizes para pesquisa biomédica (Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal-CONCEA) e as diretrizes para o cuidado e uso de animais em laboratório dos Institutos Nacionais da Saúde (NIH - National Institutes of Health). Os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Escola Superior de Ciências da Santa Casa de Misericórdia de Vitória, Brasil (CEUA-EMESCAM 003/2007). Ratos Wistar e SHRs foram divididos em quatro grupos: ratos Wistar controles (n = 6) e SHRs (n = 9) tratados com veículo (solução salina, intramuscular) e ratos Wistar (n = 8) e SHR (n = 9) tratados com cloreto de mercúrio (HgCl₂) por 30 dias (primeira dose 4,6 µg/kg, dose subsequente 0,07 µg/kg/dia, intramuscular, para cobrir perdas diárias). Utilizamos o modelo descrito por Wiggers et al.,4 para atingir concentrações sanguíneas (7,97 ng/mL) similares àquelas observadas em indivíduos expostos.

Medidas de pressão sanguínea

Pressão sistólica indireta foi medida no início e no final do tratamento utilizando o pletismógrafo de cauda (IITC Life Science Inc.). Para essa medida, ratos conscientes foram mantidos por 5-10 minutos em uma sala quente e quieta, e submetidos a ciclos de inflação e deflação do manguito por um operador treinado. Em seguida, foi medida pressão arterial sistólica, e a média de três medidas foi registrada.

Medidas dos parâmetros hemodinâmicos

No final do tratamento, ratos controle e tratados com HgCl₂ (n = 26) foram anestesiados com uretana (1,2 g/kg, Sigma, St Louis, MO, EUA). Implantou-se um cateter de polietileno (PE50/Clay-Adams) com salina heparinizada (50 U/mL) na artéria carótida para medir a pressão arterial sistólica (PAS) e pressão arterial diastólica (PAD). O cateter na artéria carótida foi introduzido no ventrículo esquerdo. Foi introduzido um cateter na veia jugular até o ventrículo direito, para medidas da pressão sistólica ventricular esquerda e direita (PSVE e PSVD) e as derivadas temporais positivas e negativas (+dP/dt e -dP/dt, respectivamente), bem como a pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE) e direito (PDFVD). Os registros foram realizados durante 30 minutos com um transdutor de pressão (TSD 104A-Biopac) e com um programa computacional e interface para coleta de dados (MP100A, Biopac System, Inc., Santa Barbara, CA, EUA). A frequência cardíaca (FC) foi determinada nos intervalos entre batimentos.

Medida da produção de malondialdeído (MDA)

Os níveis de MDA no plasma, coração, aorta, rim e pulmões foram medidos utilizando-se o teste de ácido tiobarbitúrico (TBA) modificado.28 Amostras do plasma de tecidos foram misturadas com ácido tricloroacético 20% em HCl 0.6 M (1:1, v/v); os tubos foram mantidos em gelo por 20 minutos para precipitar componentes do plasma e evitar possíveis interferências. As amostras foram centrifugadas a 1500 x g por 15 minutos antes de se adicionar TBA (120 mM em Tris 260 mM, pH 7) ao sobrenadante em uma proporção de 1:5 (v/v); em seguida, a mistura foi aquecida a 97ºC por 30 minutos. Foram obtidas medidas por espectrofotometria a 535 nm a 20ºC.

Teste da atividade da ECA

A atividade da ECA foi medida no plasma, coração, artéria aorta, cérebrp, rim, e pulmões pelo método fluorométrico adaptado de Friedland e Silverstein.29 Em resumo, amostras de tecido e de plasma em triplicata foram incubadas por 15-90 minutos a 37ºC com 40 µL de tampão do ensaio contendo o substrato da ECA 5 mM Hip-His-Leu (Sigma). A reação foi interrompida pela adição de 190 µL de 0,35 M HCl. O produto gerado, His-Leu, foi medido por fluorometria após 10 minutos de incubação com 100 µL de o-ftalaldeído 2% em metanol. As medidas de fluorescência foram obtidas a 37% em um leitor de placa FLUOstar Optima (BMG Labtech, Ofembugo, Alemanha), com excitação de 350 nm e filtros de emissão 520 nm. O leitor de placa de fluorescência foi controlado utilizando-se o programa FLUOstar Optima. Microplacas de poliestireno de 96 poços (Biogen Cientifica, Madri, Espanha) foram usadas. Uma curva de calibração com ECA de pulmão de coelho (Sigma) foi incluída em cada placa.

Análise estatística

Os resultados foram expressos em média ± DP. Todos os parâmetros foram testados quanto à normalidade usando o teste de Kolmogorov-Smirnov para uma amostra. As diferenças foram analisadas pelo teste ANOVA de um fator (one-way ANOVA), seguido do teste post-hoc de Tukey (GraphPad Prism Software, San Diego, CA). Um valor de p < 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

No trigésimo dia de tratamento com mercúrio, os ratos Wistar controle, ratos Wistar tratados, SHRs tratados e não tratados apresentavam peso corporal similares, apesar de os SHRs apresentarem menor peso em comparação aos ratos Wistar (Tabela 1).

Tabela 1 Peso corporal (PC), Cérebro/PC, Coração/PC, Rim/PC, Pulmão/PC, Adrenais/PC, Baço/PC e Fígado/PC de ratos Wistar tratados com HgCl2 e ratos não tratados e ratos espontaneamente hipertensos (SHRs: <italic>spontaneously hypertensive rats</italic>)

	Wistar controlesn = 6	Wistar tratados com HgCl₂n = 8	SHRs controlesn = 9	SHR tratados com HgCl₂n = 9
Peso corporal (PC) (g)	399 ± 58,3	384 ± 18,1	216 ± 20,1* ^†	222 ± 14,4* ^†
Cérebro/PC (mg/g)	4,58 ± 0,7	4,69 ± 0,5	7,48 ± 0,7* ^†	7,41 ± 0,5* ^†
Coração/PC (mg/g)	3,06 ± 0,6	3,43 ± 0,2	3,77 ± 0,2	3,81± 0,2
Rim/PC (mg/g)	6,44 ± 1,7	6,53 ± 0,5	6,78 ± 0,3	6,80 ± 0,6
Pulmão/PC (mg/g)	3,97 ± 1,5	4,53 ± 0,6	6,48 ± 1,2* ^†	7,91 ± 1,2* ^†

Resultados representam média ± DP; n: número de animais usados. One-way ANOVA, teste post hoc de Tukey.

p < 0,05 em comparação a Wistar controles e

^†

p < 0,05 em comparação a ratos Wistar tratados com HgCl₂.

A Tabela 1 também mostra que o peso de vários órgãos, normalizado pelo peso corporal, foi similar, incluindo cérebro, coração, rim e pulmões, fato que não mudou após o tratamento com mercúrio.

PAS indireta no dia zero em ratos acordados mostrou que SHRs apresentaram maior pressão arterial média em comparação a ratos Wistar (Tabela 2). No entanto, ao final do tratamento, o mercúrio produziu aumento significativo da pressão arterial nos SHRs tratados com HgCl₂ (Tabela 2).

Tabela 2 Valores de pressão arterial sistólica (PAS em mmHg) medidos por pletismógrafo de cauda em ratos Wistar e ratos espontaneamente hipertensos (SHRs: <italic>spontaneously hypertensive rats</italic>) antes e após tratamento om HgCl2 por 30 dias

	Wistar CT n = 5	Wistar Hg n = 5	SHR CT n = 5	SHR Hg n = 5
PAS – Dia 0 (mmHg)	123 ± 13	131 ± 15	205 ± 15	198 ± 22
PAS – Dia 7 (mmHg)	119 ± 4	132 ± 9	221 ± 18	197 ± 18
PAS – Dia 14 (mmHg)	115 ± 10	135 ± 9	219 ± 9	199 ± 29
PAS – Dia 21 (mmHg)	132 ± 17	142 ± 14	200 ± 13	199 ± 9
PAS – Dia 30 (mmHg)	117 ± 6	143 ± 11	220 ± 21	232 ± 19^#

Resultados representam média ± DP; n: número de animais usados. One-way ANOVA, teste post hoc de Tukey para todos os grupos.

p < 0,05 vs. SHR tratado com mercúrio no dia 0

Valores de pressão arterial, pressão ventricular e seus respectivos derivados, bem como as medidas de FC nos ratos anestesiados não foram diferentes entre os grupos (Tabela 3). Porém, a PDFVE aumentou após o tratamento com mercúrio no grupo Wistar, em concordância com o descrito anteriormente.17

Tabela 3 Parâmetros hemodinâmicos de ratos Wistar e ratos espontaneamente hipertensos (SHRs, <italic>spontaneously hypertensive rats</italic>) tratados com mercúrio (HgCl2)

	Wistar Controlesn = 6	Wistar tratados com HgCl₂-n = 7	SHR Controlesn = 6	SHRs tratados com HgCl₂n = 7
PAS (mmHg)	105 ± 10	97 ± 11	105 ± 7	113 ± 8
PAD (mmHg)	71 ± 10	67 ± 11	58 ± 5	68 ± 11
FC (bpm)	324 ± 88	325 ± 58	343 ± 32	341 ± 34
PSVE (mmHg)	114 ± 20	107 ± 16	117 ± 22	112 ± 8
PDFVE (mmHg)	0,256 ± 1	3,31 ± 1*	1,11 ± 0,2	0,493 ± 0,5
+dP/dt VE (mmHg/s)	8627 ± 3378	8500 ± 2419	7360 ± 1854	7001 ± 1921
-dP/dt VE	-6270 ± 1232	-6249 ± 1234	-7169 ± 1173	-6524 ± 1131
PSVD (mmHg)	32 ± 10	29 ± 5	29 ± 5	33 ± 5
PDFVD (mmHg)	-1,080 ± 1	1,10 ± 2	-0,472 ± 1	0,459 ± 0,3
+dP/dt VD (mmHg/s)	3339 ± 2202	1758 ± 435	2776 ± 1056	2171 ± 405
– dP/dt VD (mmHg/s)	-2560 ± 1553	-1387 ± 469	-1833 ± 478	-1695 ± 368

Mudanças na pressão arterial sistólica (PAS) e pressão arterial diastólica (PAD), frequência cardíaca (FC), pressão sistólica do ventrículo direito e esquerdo (PSVD e PSVE, respectivamente), pressão diastólica final do ventrículo direito e esquerdo (PDFVD e PDFVE, respectivamente) , e primeiras derivadas temporais positiva e negativa (-dP/dt, respectivamente), do ventrículo direito e esquerdo de ratos controles e ratos tratados com mercúrio. Resultados representam média ± DP. N: número de ratos. One-way ANOVA, teste post hoc de Tukey.

p < 0,05 vs. Wistar controles.

Estudos prévios com animais e humanos relataram que o mercúrio aumenta a síntese de radicais livres, levando ao estresse oxidativo.4^,24^,30^,31 Em seguida, avaliamos o estado oxidante no sangue e em vários outros tecidos pela medida dos níveis de MDA (Tabela 4). Níveis plasmáticos de MDA foram maiores nos ratos Wistar tratados com mercúrio em comparação àqueles não tratados, mas não houve diferença entre SHRs tratados e não tratados com mercúrio. Mercúrio aumentou os níveis de MDA no coração de ratos Wistar e SHRs. Na aorta, diferentemente do plasma, os níveis de MDA foram maiores nos SHRs tratados com mercúrio, mas não nos ratos Wistar. Em relação a cérebro e pulmões, nenhuma diferença foi observada nos níveis de MDA nos ratos Wistar tratados e não tratados com mercúrio; nos SHRs, contudo, a intervenção com mercúrio reduziu os níveis de MDA nesses órgãos. Nos rins, o tratamento com mercúrio reduziu os níveis de MDA nos ratos tratados com mercúrio, Wistar e SHRs.

Tabela 4 Concentrações de malondialdeído (MDA) no plasma, coração, aorta, pulmões, cérebro e rins de ratos Wistar e ratos espontaneamente hipertensos (SHRs, <italic>spontaneously hypertensive rats</italic>) tratados com mercúrio (HgCl2) e não tratados

	Wistar Controlesn = 6	Wistar tratados com HgCl₂-n = 6	SHR Controlesn = 6	SHRs tratados com HgCl₂n = 7
Plasma	0,93 ± 0,15	1,28 ± 0,44*	0,89 ± 0,22	0,92 ± 0,05
Coração	0,22 ± 0,03	0,28 ± 0,03*	0,45 ± 0,05	0,55 ± 0,05^&
Aorta	0,13 ± 0,03	0,12 ± 0,05	0,96 ± 0,27	1,51 ± 0,37^&
Pulmões	0,18 ± 0,05	0,14 ± 0,03	0,21 ± 0,03	0,12 ± 0,03^&
Cérebro	0,13 ± 0,03	0,09 ± 0,03	0,54 ± 0,07	0,34 ± 0,03^&
Rins	0,38 ± 0,07	0,14 ± 0,03*	0,96 ± 0,07	0,51 ± 0,03^&

Valores expressos em mM//mg de proteína (MDA). Resultados representam média ± DP. N: número de animais. One-way ANOVA, teste post hoc de Tukey.

p < 0,05 vs Wistar controles e

< 0,05 vs SHRs controles.

Uma vez que a angiotensina II parece aumentar os níveis de EROs, e que o mercúrio aumenta a atividade da ECA,32^,33 investigamos se a atividade da ECA foi alterada após 30 dias de tratamento com mercúrio nos animais Wistar e SHRs. A Tabela 5 mostra que a atividade da ECA aumentou em ambos os grupos após o tratamento com mercúrio. Nos corações dos ratos Wistar, o mercúrio causou um pequeno aumento na atividade da ECA, mas não foram observadas mudanças na aorta, nos pulmões, no cérebro ou nos rins. No entanto, em SHRs tratados com mercúrio, a atividade da ECA foi reduzida no coração, aorta, pulmões, cérebro e rins. Um resultado interessante foi o fato de atividade da ECA ser maior no coração, aorta e rins, e mais baixa no plasma de SHRs controle em comparação a ratos Wistar controles.

Tabela 5 Níveis de atividade da enzima conversora de angiotensina (ECA) no plasma, coração, aorta, pulmões, e rins de ratos Wistar e ratos espontaneamente hipertensos (SHRs, <italic>spontaneously hypertensive rats</italic>) tratados com mercúrio (HgCl2) e não tratados

	Wistar Controlesn = 6	Wistar tratados com HgCl₂-n = 6	SHR Controlesn = 6	SHRs tratados com HgCl₂n = 6
Plasma	187 ± 39,2	235 ± 34,3*	114 ± 27,9*	163 ± 38,7^&
Coração	3,4 ± 0,5	4,1 ± 0,3*	17,9 ± 2,7*	14,8 ± 1,4^&
Aorta	213 ± 53,9	221 ± 61,3	670 ± 39,9*	535 ± 47,0^&
Pulmões	95 ± 6,1	99,4 ± 11,3	87,6 ± 5,4	75,1 ± 9,8^&
Cérebro	46,4 ± 7,9	42,6 ± 9,9	40,3 ± 5,6	27,8 ± 4,4^&
Rins	47,8 ± 16,2	45,4 ± 14,2	80,0 ± 15,4*	61,4 ± 6,9^&

Valores expressos em nmol/mL/min/mg de proteína em tecidos e nmol/mL de plasma/min no plasma (ACE). Resultados representam média ± DP. N: número de animais. One-way ANOVA, teste post hoc de Tukey.

p < 0,05 vs Wistar controles e

p < 0,05 vs SHRs controles.

Discussão

Os resultados aqui apresentados sugerem que os ratos Wistar e os SHRs, submetidos à exposição crônica ao mercúrio inorgânico por 30 dias apresentam concentrações sanguíneas similares a de seres humanos expostos ao metal.1^,2 Além disso, SHR, mas não ratos Wistar tratados com HgCl₂, apresentaram pressão sanguínea aumentada no final do tratamento. A intervenção também teve influência sobre a atividade da ECA e o stress oxidativo, aumentando-os ou diminuindo-os, principalmente em SHRs.

Estudos prévios relataram que mudanças resultantes da exposição crônica ao mercúrio abordaram seus efeitos tóxicos sobre o sistema cardiovascular e associações com hipertensão, aterosclerose carotídea, infarto do miocárdio e doença arterial coronariana.9^,10^,34 A exposição ao mercúrio, tanto agudo como crômico, afeta o coração e a função endotelial, reduzindo a biodisponibilidade de NO e aumentando as atividades de ECA e NADPH.15^,18^,19 Além disso, experimentos com ratos demonstraram que o ganho de peso corporal e a pressão arterial não foram afetados com a exposição crônica,4^,17 sugerindo que tal intervenção não foi suficiente, quanto à quantidade ou ao tempo, para produzir mudanças. Nossos resultados reproduziram esses achados, mostrando ausência de mudanças no peso corporal; ainda, comportamento similar foi observado para coração, cérebro, rins, e pulmão, reforçando a hipótese de que esse tratamento não seja suficiente para produzir tais mudanças, apesar de um início de alteração na função cardiovascular.

Em relação à avaliação hemodinâmica, não foram observadas mudanças no ventrículo esquerdo ou direito em ambos os grupos. Observou-se somente um aumento na PDFVE nos ratos normotensos tratados com mercúrio, indicando que efeitos deletérios do mercúrio sobre a função ventricular.35 Investigamos também a pressão ventricular direita devido a nossos achados prévios mostrando que, sob exposição aguda do mercúrio (0,5 mg/kg), houve um aumento na pressão sistólica ventricular direita devido à hipertensão pulmonar.3^,36^-39 Esses achados não foram observados com o tratamento crônico utilizado no presente estudo. O fato de que a atividade da ECA nos pulmões não ter sido afetada em ambos os grupos de ratos Wistar, apesar de ligeiramente reduzida nos SHRs tratados com HgCl₂ pode explicar por que a pressão ventricular direita manteve-se inalterada.

A redução da biodisponibilidade do NO é um marco, resultante do aumento da geração de EROs, contribuindo ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares, tais como aterosclerose e hipertensão.10^,11^,34 A interação do ânion superóxido com NO gera peroxinitrito que diminui a biodisponibilidade de NO, aumentando a reatividade vascular.20^-22 De fato, nossos estudos anteriores mostraram uma associação do mercúrio com aumento do estresse oxidativo e a redução da biodisponibilidade de NO.15^,19 Ainda, foi demonstrado que um aumento da atividade local da ECA poderia aumentar a atividade de NADPH oxidase16^,40 e EROs nas artérias aortas de ratos normotensos e de SHRs. Assim, nós investigamos se os efeitos do mercúrio alteram o sistema renina-angiotensina e o estresse oxidativo em órgãos e tecidos de ratos hipertensos e normotensos. O aumento na atividade da ECA induzida pelo mercúrio poderia levar à atividade aumentada da NADPH oxidase, que, por sua vez, aumenta a liberação de EROs, gerando um estresse oxidativo, conforme observado no presente estudo.

Considerando que tanto o mercúrio como a atividade aumentada da ECA podem induzir o estresse oxidativo, devemos observar uma correlação entre o grau de estresse oxidativo e a atividade da ECA medida pelo MDA. Um fator interessante é que os níveis de atividade da ECA e as concentrações de MDA apresentaram comportamento similar no plasma e nos órgãos analisados. Ainda, deve-se destacar que tanto a atividade da ECA como concentrações de MDA apresentaram mudanças mais expressivas nos SHRs tratados com HgCl₂. De maneira similar, o tratamento com mercúrio inorgânico agravou hipertensão em SHRs, sugerindo que uma condição pré-existente de hipertensão melhora a ação do mercúrio inorgânico.

EROs estão reduzidas no plasma de todos os locais em que são produzidas e, consequentemente, espera-se um aumento nos níveis de MDA. Mostramos que a atividade da ECA aumenta após exposição aguda a baixas concentrações de mercúrio, e reduz após exposição a altas concentrações.18^,39 No entanto, podemos especular que no grupo de SHRs, quando expostos ao mercúrio, nos tecidos que produzem mais EROs, tais como aorta, pulmões e rins, a atividade da ECA está reduzida. Similarmente, no tecido cerebral, que concentra mercúrio, a atividade da ECA também está diminuída. Aumentos da PDFVE em ratos Wistar poderiam ser explicados pelo aumento local na atividade da ECA e no estresse oxidativo no coração. Esses dois fatores poderiam explicar o pequeno, mas significativo aumento na PDFVE, provavelmente induzido por uma sobrecarga de cálcio.

Embora não possamos dar uma explicação adequada para todos os eventos, pode-se sugerir que o mercúrio, mesmo em concentrações que não afetam a pressão arterial e o peso corporal em ratos normotensos, tem efeitos na atividade da ECA e no estresse oxidativo. Contudo, em animais hipertensos, as ações do mercúrio inorgânico foram mais expressivas. Esses achados levantam algumas questões que não foram abordadas no presente estudo: a exposição ao mercúrio inibiria a atividade da ECA em situações em que ela já se encontra aumentada? A atividade da ECA em diferentes órgãos depende da concentração de mercúrio em cada um deles? Uma doença cardiovascular pré-existente seria agravada pela exposição a mercúrio inorgânico? Essas questões podem ser consideradas limitações de nosso estudo, e questões para estudos futuros.

Conclusões

Os resultados aqui descritos nos permitem afirmar que a exposição crônica ao mercúrio inorgânico, similar ao descrito anteriormente, produz concentrações sanguíneas compatíveis àquelas encontradas em indivíduos expostos, e representa um fator de risco cardiovascular. Tal exposição influenciou a atividade da ECA, aumentou o estresse oxidativo e promoveu hipertensão em SHRs (os quais apresentaram maior aumento na pressão sanguínea em comparação a SHRs não tratados), bem como aumentou a PDFVE em ratos Wistar. Essa exposição controlada ao mercúrio afetou o sistema cardiovascular, causou mudanças mais expressivas da atividade da ECA e de estresse oxidativo em SHRs, representando um fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares em ratos normotensos e um fator contribuinte para aumentar riscos pré-existentes em condição de hipertensão.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela FAPES, CAPES, CNPq, Ministério da Economia e Competitividade (SAF 2016-80305-P).

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Maylla Ronacher Simões pela Universidade Federal do Espírito Santo.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Escola Superior de Ciências da Santa Casa de Misericórdia de Vitória sob o número de protocolo CEUA-EMESCAM 003/2007.