Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC PRqyQLMs4BG7FztLdCcGdBS S0066-782X2019000200180 S0066-782X2018005021102 10.5935/abc.20180263 Original Article Evaluation of Collagen Fibers, MMP2, MMP9, 8-OHdG and Apoptosis in the Aorta of Ovariectomized LDL Knockout Mice Submitted to Aerobic Exercise Maifrino Laura Beatriz M. 1 Lima Nathalia E. A. de 1 Marques Mara R. 2 Cardoso Clever G. 2 Souza Lidiane B. de 3 Tomé Tabata de Carvalho 3 Quintana Hananiah Tardivo 3 Oliveira Flavia de 3 0000-0001-9930-7747 Reis Beatriz da Costa Aguiar Alves 4 Fonseca Fernando Luiz Affonso 4 Universidade São Judas Tadeu São Paulo SP Brazil Universidade São Judas Tadeu, São Paulo, SP - Brazil Universidade Federal de Goiás Goiânia GO Brazil Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO - Brazil Universidade Federal de São Paulo Departamento de Biociências São Paulo SP Brazil Departamento de Biociências da Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP - Brazil Faculdade de Medicina do ABC Santo André SP Brazil Faculdade de Medicina do ABC, Santo André, SP - Brazil Mailing Address: Beatriz da Costa Aguiar Alves Reis, Av. Príncipe de Gales, 821. Postal Code 09060-650, Santo André, SP - Brazil. E-mail: bcaalves@uol.com.br

Author contributions

Conception and design of the research: Maifrino LBM, Souza LB, Quintana HT, Fonseca FLA; acquisition of data: Maifrino LBM, Lima NEA, Cardoso CG, Souza LB, Oliveira F, Fonseca FLA; analysis and interpretation of the data: Lima NEA, Cardoso CG, Souza LB, Tomé TC, Oliveira F, Reis BCAA; statistical analysis: Marques MR, Quintana HT, Oliveira F; obtaining funding: Maifrino LBM; writing of the manuscript: Maifrino LBM, Lima NEA, Marques MR, Souza LB, Oliveira F, Reis BCAA; critical revision of the manuscript for intellectual content: Maifrino LBM, Marques MR, Cardoso CG, Tomé TC, Reis BCAA, Fonseca FLA.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 17 12 2018 02 2019 112 2 180 188 09 12 2017 04 05 2018 23 07 2018 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited Abstract Background:

In menopause, there is greater cellular exposure to oxidative stress, related to the decreased antioxidative effects of estrogen. These metabolic changes favor the progression of cardiovascular diseases, such as atherosclerosis. Abnormal function of the aorta - the most important artery - is associated with many cardiovascular diseases. Collagen, especially types I and III, is one of the most important aortic wall components and it can be affected by many factors, including menopause. The 8-OHdG is one of the main markers of DNA oxidative damage induced by reactive oxygen species (ROS).

 Objective:

We aimed to investigate effects of moderate aerobic training on the ascending aorta of LDL-knockout (LDL-KO) and ovariectomized female mice.

 Methods:

A total of 15 C57BL/6 mice and 15 LDL-KO mice were divided into experimental groups. The thickness and volume density of types I and III collagen fibers were performed by morphoquantitative analysis, whereas the MMP-2 and MMP-9 and 8-OHdG were detected by immunohistochemistry and apoptosis was detected by the TUNEL assay. The significance level for all tests was p < 0.05.

 Results:

Exercise causes an increase in the thickness of the aorta in LDL-KO groups, particularly accentuated in the ovariectomized groups. The type I collagen fibers showed an increase in volume density influenced by training in both Control groups and in the LDL-KO group. Type III collagen density decreased in both groups. The MMP-2 showed moderade immunostaining in the tunica media in LDL-KO groups, which did not occur in the control groups and the MMP-9 stained irregularly in all tissues. The marker 8-OhdG was stronger in the exercise training groups. Additionally, the ovariectomy, the exercise training and the LDL-KO treatments increased apoptosis.

 Conclusion:

These results suggest that moderate-intensity aerobic exercise in ovariectomized mice associated to an increase in LDL rate possibly increases oxidative stress and apoptosis induction.

 Keywords: Rats Cardiovascuar Diseases Menopause Fibrillar Collagens/analysis Ovariectomy Exercise Cholesterol, LDL Introduction

Menopause is a period during which women suffer changes in metabolic profile due to decreased production of hormones such as estrogen.1-3 These metabolic changes favor the progression of cardiovascular diseases, such as atherosclerosis.4 Abnormal function of the aorta - the most important artery - is associated with many cardiovascular diseases. Collagen, especially types I and III, is one of the most important aortic wall components and it can be affected by many factors, including menopause.5

Physical exercises are recommended for preventing cardiovascular diseases during menopause.6,7 However, moderate-to-high intensity physical activity causes increased oxidative stress in cells and tissues, raising the risk of cardiovascular disease.8-10 The adaptation of the body to oxidative stress may be impaired in individuals with low levels of estrogen, which binds to specific cellular receptors and accelerate the production of various antioxidants by cells.

Little is known about the effects of physical activity on the development of atherosclerosis and metabolic changes that are characteristic of menopause. Relevant data for the elucidation of these effects have been obtained with the use of markers such as 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG), metalloproteinases (MMPs), apoptosis detection and quantification of collagen types III and I. 8-OHdG is one of the main markers of DNA oxidative damage induced by reactive oxygen species (ROS).11,12 MMPs play key roles in the function of various tissues during growth, development and aging of the organism.13-17 The excessive or unbalanced MMP activity is associated with the pathogenesis of many diseases.18,19 among them cardiovascular diseases, such as atherosclerosis.20

The detection of apoptosis in tissues is a marker related to mitochondrial injury, reactive oxygen species production, and oxidative stress. In apoptosis, DNA breakage results in several fragments with free 3’-OH ends. The identification of cells undergoing the process of apoptosis consists in detecting enzymatically the free 3’-OH ends with the addition of nucleotides modified by the TdT enzyme (terminal deoxynucleotidyl transferase).

Thus, we aimed to verify the effects of moderate aerobic training on the ascending aorta of, low-density lipoprotein receptor LDL knockout and ovariectomized female mice.

 Methods Animals and group formation

The experiments were performed in 15 female mice C57BL/6 and 15 of low-density lipoprotein receptor knockout female mice (LDL-KO) weighing 20-25g, from the Animal House of the São Judas Tadeu University, São Paulo, Brazil. The mice received the standard laboratory chow and water ad libitum. The animals were placed in cages in a room with controlled temperature (22°C) and a 12-h light-dark cycle. All surgical procedures and protocols were approved by the Experimental Animal Use Committee of Universidade São Judas Tadeu (058/2007). After a simple randomization, the mice were divided into six groups (n = 5): sedentary control (S-C), ovariectomized sedentary control (OS-C), ovariectomized trained control (OT-C), sedentary LDL KO (S-LDL KO), ovariectomized sedentary LDL KO (OS-LDL KO) and ovariectomized trained LDL KO (OT-LDL KO). The animals were separated physically and randomly between the groups / boxes.

The sample size definition was performed according to previous data from other authors,21-23 which were based on the instructions of CONCEA (Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal) Normative Instruction N°. 27 and determined by the formula n = (2α/2δ) 2/E24 was used, where n stands for sample size; (2α)2 stands for a critical value that corresponds to the desired degree of confidence, δ stands for the population standard deviation and E stands for the margin of error (difference between the sample mean and the mean of the true population).

 Ovariectomy

At nine months of age, the animals were anesthetized (ketamine 120 mg/kg + xylazine 20 mg/kg), and a small abdominal incision was performed where the ovaries and oviducts were found, sectioned and removed. Then, the skin and muscle wall were sutured.25,26 The efficacy of the ovariectomy was determined by observation of vaginal secretions during four consecutive days.

 Training protocol

Seven days after the ovariectomy, all animals were adapted on the treadmill for ten minutes during three days before initiating the training. The maximal exercise test was performed in all groups at the beginning and at the ending of the training program, providing the basis for the prescription of physical training, and with the purpose to evaluate the physical capacity of the trained animals.

The trained groups were submitted to a moderate physical training protocol on a treadmill, with progressive speed and load (1 hour a day/5 days a week at 50-60% of maximum effort speed) during 4 weeks, as previously described.27

Histological procedures

At the end of the experiment, the animals were weighed and subsequently euthanized by decapitation. Thoracotomy was performed by cutting the ascending aorta at the heart base. The aorta samples were washed (PBS - phosphate buffered saline 0.1M, pH 7.4) and fixed in 10% formaldehyde for 24 hours. Then, they were dehydrated, cleared and embedded in paraffin. The aorta was sectioned transversely (5 µm thick), and the samples were stained in H&E for histomorphometric analysis.7 In order to analyze the effects of aerobic training on the whole aorta, the tunica intima was not separated from the tunica media. Picrosirius staining was used for classification of collagen fibers I and III. The images were captured at 4 points, at 0º, 90º, 180º and 270º, with x10 magnification to measure the aorta thickness, and x40 for other evaluations, and transferred to an image analysis program (Axion Visio Software, Zeiss®). To analyze the volume density of types I and III collagen fibers, the images were captured by light microscope with polarized light, analyzed using a test system of 252 points, and the values were expressed as percentages.

 Immunohistochemical analysis: 8-OHdG, MMP-2 and MMP-9

Five 4-µm cross-sections, mounted on previously silanized slides, were used to show the expression of 8-OHdG, MMP-2 and MMP-9. The slides were then deparaffinized, cleared, hydrated and washed in running water. Then, endogenous peroxidase activity was blocked with 0.3% hydrogen peroxide, protein blocking was performed with 0.3% skim milk diluted in PBS and the slides were incubated overnight with anti-8-OHdG (SC66036 Santa Cruz® Biotechnology, CA, USA) primary antibody, titrated 1:100, and MMP2/72KDa and MMP9/KDa (SC-10436 Santa Cruz® Biotechnology, CA, USA; SC-6840 Santa Cruz® Biotechnology, CA, USA), titrated 1:150 in PBS-BSA 0.1%. All slides were then placed in a humid chamber at 4°C overnight. The material was washed with PBS buffer and incubated with biotinylated secondary antibody. For revelation, the 3-3´diaminobenzidine chromogenic substrate was used at a ratio of 0.06 g per 100 mL of PBS, and 1 mL of 20-volume H2O2 for five minutes at 37°C and counter-stained with Mayer’s hematoxylin for 3 minutes. Finally, the slides were mounted with cover slips and entellan® for analysis under light microscopy.

 Investigation of the apoptotic cell death by TUNEL immunocytochemistry

TUNEL staining was performed using the ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Millipore®, Germany) according to the manufacturer’s instructions.

 Quantification of apoptotic cells

For the quantification of immunostained cells for apoptosis, 30 images of the intima-media layer were captured (10 images/animal; n = 3 animals/group; with x10 magnification to measure the aorta thickness, and x40 for other evaluations, and transferred to an image analysis program (Axion Visio Software, Zeiss®) for each experimental group. For each image, the total number of immunostained cells was obtained as a relative frequency (%) in relation to the total number of cells. The light microscope coupled to a digital camera (Zeiss, Germany) was used to obtain the images, and the photomicrographs were scanned with the AxioVision software (Zeiss®, Germany).

 Statistical analysis

The results were presented as mean and standard deviation. Analysis of variance (ANOVA) and Tukey’s post-hoc tests were properly applied in data analysis. The significance level for all tests was p < 0.05. The data were evaluated using the software Stata 7.0. All continuous variables were normally distributed (Shapiro-Wilk test). To evaluate the normality of the data, the Shapiro-Wilk calculation was used, which found that the data were allocated within the Gaussian curve. Considering a level of significance of 5%, the test assumed the normality hypothesis for the variable with normal distribution.

 Results Histopathological and histomorphometric analysis

The histopathological analysis showed that the animals from the control groups (S-C, OS-C and OT-C) did not exhibit changes in the elastic fiber arrangement and thickness pattern. However, the dyslipidemic groups (S-LDL KO, OS-LDL KO and OT-LDL KO), showed greater spacing between elastic fibers (Figure 1).

Mouse aorta cross-sections showing the arrangement of elastic fibers. The control groups showed a similar pattern of arrangement and thickness of the elastic fibers. The LDL KO groups showed more spaced fibers and thicker vessel walls compared to the controls. Photomicrographs, H&E. Calibration Bar = 100 µm. Sedentary control (S-C), ovariectomized sedentary control (OS-C), ovariectomized trained control (OT-C), sedentary LDL KO (S-LDL KO), ovariectomized sedentary LDL KO (OS-LDL KO) and ovariectomized trained LDL KO (OT- LDL KO).

Thickness of the tunica media - intima (µm)

We observed a significant increase in the thickness of the tunica media and intima in dyslipidemic animals, when compared to the control group animals. The ovariectomy and the exercise in the LDL KO groups were a determining factor for the increase of this variable. In both control and LDL KO groups the training exercise did not reverse this process (Figures 1 and 2).

Thickness of the tunica media-intima (µm) in the studied groups. Values are expressed as M ± SD *p < 0.05 vs. S-C; #p < 0.05 vs. OS- C; +p < 0.05 vs. OT-C; ¹p < 0.05 vs S-LDL KO; 2p < 0.05 vs OS-LDL KO.

Volume density of types I and III collagen fibers in the intima-media and adventitia tunica

Similar behavior of the type III collagen fiber was observed between the intima-media and adventitia tunica. We observed a significant decrease in the volume density of the type III collagen fiber in the LDL KO groups, when compared to the S-C (Figure 3).

Volume density of types I and III collagen fibers (Vv[cf]) in Intima-Media and Adventitia Tunica of ascendant aorta. Values are expressed as M ± SD. *p < 0.05 vs. S-C; #p < 0.05 vs. OS-C; +p < 0.05 vs. OT-S.

The type I collagen fibers of the tunica adventitia and media-intima showed increase in volume density, influenced by training in the Control groups. The dyslipidemia induces an increase in type I collagen fibers in the LDL KO groups when compared to the Control groups and did not undergo any change by ovariectomy, or by training (Figure 3).

 Immunohistochemical analysis

Figure 4 shows the tissue staining caused by the oxidative stress marker 8-OHdG. Note that the immunoexpression of the marker occurred in all groups. The staining was moderate for LDL KO and Control groups, both the Sedentary and the Ovariectomized Sedentary groups. However, for the Ovariectomized and trained groups, the observed staining was intense.

In all control groups (S-C, OS-C and OT-C) the immunoexpression of MMP-2 occurred both in the tunica intima (arrow) and in the tunica adventitia (arrowhead) of the ascending aorta. The LDL groups, in general, showed MMP-2 immunoexpression beyond the tunica intima and adventitia, but also in the tunica media of the aorta (although very slightly), which was not observed in any groups of control animals (Figure 5). The MMP-9 was expressed in all layers of the ascending aorta of all groups; however, the distribution was heterogeneous (Figure 6).

Photomicrographs of cross-sections of the aorta of mice submitted to immunohistochemical reaction for 8-OHdG. The immunoexpression of 8-OHdG was observed in all investigated groups. The staining was moderate for LDL KO and Control groups, both the S and the OS. However, for the O and T groups, the observed staining was intense. Calibration bar = 100 µm.

Photomicrographs of cross-sections of the ascending aorta of mice submitted to immunohistochemical reaction for MMP-2. Note the presence of MMP-2 immunoexpression in the tunica intima (arrow) and adventitia (arrowhead) in all control groups (S-C, OS-C and OT-C). In general, the MMP-2 immunoexpression in the LDL KO groups was observed in the intima and adventitia layers, as well as in the middle layer of the aorta (*), which did not occur in any animal of the control groups. Calibration bar: 100 µm.

Photomicrographs of cross-sections of the ascending aorta of mice submitted to immunohistochemical reaction for MMP-9. Note the presence of immunoexpression in all layers, heterogeneously, in all groups. Calibration bar: 100 µm.

Apoptotic cells were distributed in the media-intima layer of the ascending aorta in all studied groups. The comparation of relative frequency showed that Ovariectomy statistically increased apoptosis in +12,6% in the sedentary group (OS-C) and +19% in physical training group (OT-C) when compared to the apoptosis of the sedentary control group (S-C) (Figure 7). Among the knockout groups, apoptosis rates were higher than the respective controls, regardless if the mice were ovariectomized or not. Thus, the knockout sedentary group increased apoptosis frequency in +28,8% when compared with the control group. Ovariectomy and knockout statistically increased the apoptosis in +24,5% in the sedentary (OS-LDL KO) and +32,3% in the physical training (OT-LDL KO) groups, when compared to the sedentary control group (S-C). No significant change was observed when comparing the knockout sedentary group (S-LDL-KO) to knockout ovariectomy sedentary (OS-LDL KO) or physical training (OT-LDL KO) groups, with decreased apoptosis in -4,3% and improved apoptosis in +3,5%, respectively. However, the relative frequency of ovariectomy, sedentary and physical training knockout groups showed to be statistically increased in +7,8% (Figure 7).

Relative frequency (%) of apoptotic cells in the ascending aorta of the control sedentary group (S-C) vs. the different evaluated groups as evidenced by the TUNEL assay. *p < 0,05 vs. S-C, #p < 0,05 vs. OS-C, +p < 0,05 vs. OS-LDL-KO. Values are expressed as mean ± SD (p < 0,05).

Discussion

The main objective of this study was to verify the effects of moderate aerobic training on the ascending aorta of ovariectomized female mice, knockout for the low-density lipoprotein receptor LDL through the analyses of types I and III collagen fibers, the expression of 8-OHdG oxidative stress markers of MMP-2 and MMP-9 metalloproteinases.

Collagen and elastin are major structural and functional components of the arterial wall. These components actively participate in arterial wall remodeling in response to hemodynamic alterations and during atherogenesis.

The histopathological analysis did not show any morphological changes in the control group. However, the LDL KO group showed increased thickness and larger spacing between the elastic fibers. Some studies have demonstrated an association between an increase in intima-media thickness and the occurrence of cardiac events,28 which confirmed the existence of the association between increased intima-media thickness of the carotid and the presence of cardiovascular risk factors, including infection and inflammation markers. Collagen I is mostly a structural collagen; collagen III, in turn, is more frequent in pathological processes. Our results have shown that the number of cells in apoptosis were significantly lower in the control group and remained constant in the Control groups (OS-C and OT-C) and the LDL knockout groups (S-LDL KO, OS-LDL KO and OT-LDL KO), without significant differences in the percentage of apoptotic cells between the Control or LDL Knockout groups for each parameter used. However, the apoptosis process was greater in animals of LDL knockout groups, when compared with animals of the control groups, regardless if they were ovariectomized or not. This suggests that ovariectomy was not a major factor in the processes of apoptosis induction in the aorta.

The high levels of LDL in the bloodstream may have been the apoptosis-inducing factor in the endothelium and the tunica media of the ascending aorta in LDL knockout groups. The endothelial dysfunction induced by LDL oxidation (ox-LDL) has been associated to the pathogenesis of atherosclerosis and other vascular disorders. It is known that the ox-LDL activates ROS release and has been associated to apoptosis and endothelium damage.29 The apoptosis of vascular smooth muscle cells (VSMC) is associated with the occurrence of vascular diseases. In atherosclerosis, cell apoptosis induction has been associated with atherosclerotic plaque rupture, clotting, vessel remodeling, tunica media atrophy, aneurysm formation and calcification.30 Furthermore, in various human diseases such as Marfan syndrome and cystic necrosis of the tunica media (CMN), the apoptotic processes results in higher breakage of the elastic fibers, abnormal extracellular matrix deposition and tunica media expansion.31 In this environment, the release of interleukin IL1α and IL8, as well as the chemoattractant protein expression of monocytes (MCP-1) occurs during the VSMC apoptosis, which have causes infiltrating macrophages in vivo, increasing the observed tissue damage.32

The animals of the OT-C group showed a higher number of apoptotic cells compared to the OS-C and S-C groups (p < 0,05). Physical activity has been associated with increased apoptosis levels in rats’ thymocyte, mice skeletal muscle and lymphocytes.33,34 Oxidative stress resulting from metabolism in physical activities has been largely associated to apoptosis. In patients with cardiovascular diseases, the deficiency in nitric oxide (NO) production, associated with oxidative stress, results in a decline of NO bioavailability, inducing apoptosis of endothelial cells and therefore, resulting in endothelial dysfunction.35 The ovariectomized animals showed a higher percentage of apoptotic cells than the trained and sedentary control groups (OT-C and OS-C). This suggests that decreased hormone production may be related to a reduction in antioxidative effects on the body.

8-OHdG is one of the main oxidative products of DNA, which is considered a reliable marker of oxidative DNA damage. Thus, 8-OHdG has been widely used as a sensitive biomarker of oxidative stress.36 The immunohistochemical analysis of 8-OHdG showed staining in all groups; however, the trained groups showed higher intensity staining. Goto et al.,9 found that high-intensity exercise increases 8-OHdG levels in the plasma, which explains the higher degree of staining in the trained groups.

There were differences in MMP-2 expression, and the control group showed staining in the intima and adventitia layers, while the LDL KO group showed staining in the tunica media. According to Sakalihasan et al.,37 this occurs because the atherosclerotic lesion causes the migration of MMP-2 at the ends and at a lower quantity in normal tissue, for the tunica media, i.e., the formation of atherosclerotic plaques activates a set of chain reactions, which can increase the amount of MMP-2 present in the tissue. With regard to the MMP-9 expression, all groups showed tissue staining, but without a pattern. No evidence explaining this heterogeneous staining was found.

 Conclusion

The experimental model analyzed shows histomorphometric changes with increased expression of 8-OHdG in trained groups. An increase in the apoptosis rate was observed in the trained groups and the LDL KO ovariectomized group. The groups stained with MMP-2 showed migration and its increased expression in the tunica media of LDL KO groups. However, the MMP-9 staining appeared in all groups, but did not follow a homogeneous pattern. Finally, studies on the expression of metalloproteinases in cardiac muscle tissues with atherosclerosis are very scarce, suggesting the need for further studies to investigate the issue. Thus, the results described herein suggest that moderate-intensity aerobic exercise in ovariectomized mice associated to an increase in LDL rates possibly increases oxidative stress and apoptosis induction.

The evaluation of the parameters under study (MMPs, apoptosis and 8-OHdG) was performed by immunohistochemistry. However, other more sensitive technologies (such as molecular biology ones) could be used in these assessments, leading to more precise results and interpretations.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee on Animal Experiments of the Universidade de São Judas Tadeu under the protocol number 058/2007.

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Maifrino LBM Araújo RC Faccini CC Liberti EA Gama EF Ribeiro AACM Effect of exercise training on aging-induced changes in rat papillary muscle Arq Bras Cardiol 2009 92 5 387 392 24 Triola MF. Introdução à estatística. 7. ed. Rio de Janeiro: LTC; 1999. Triola MF. Introdução à estatística 7. ed Rio de Janeiro LTC 1999 25 Marsh MM, Walker VR, Curtiss LK, Banka CL. Protection against atherosclerosis by estrogen is independent of plasma cholesterol levels in LDL receptor-deficient mice. J Lipid Res. 1999;40(5):893-900. Marsh MM Walker VR Curtiss LK Banka CL. Protection against atherosclerosis by estrogen is independent of plasma cholesterol levels in LDL receptor-deficient mice J Lipid Res 1999 40 5 893 900 26 Irigoyen MC, Paulini J, Flores LJ, Flues K, Bertagnolli M, Moreira ED, et al. Exercise training improves baroreflex sensitivity associated with oxidative stress reduction in ovariectomized rats. Hypertension. 2005;46(4):998-1003. Irigoyen MC Paulini J Flores LJ Flues K Bertagnolli M Moreira ED Exercise training improves baroreflex sensitivity associated with oxidative stress reduction in ovariectomized rats Hypertension 2005 46 4 998 1003 27 Desai KH, Sato R, Schauble E, Barsh GS, Kobilka BK, Bernstein D. Cardiovascular indexes in the mouse at rest and with exercise: new tools to study models of cardiac disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 1997;272(2 Pt 2):H1053-61. Desai KH Sato R Schauble E Barsh GS Kobilka BK Bernstein D. Cardiovascular indexes in the mouse at rest and with exercise: new tools to study models of cardiac disease Am J Physiol Heart Circ Physiol 1997 272 2 Pt 2 H1053 H1061 28 Corrado E, Rizzo M, Tantillo R, Muratori I, Bonura F, Vitale G, et al. Markers of inflammation and infection influence the outcome of patients with baseline symptomatic carotid lesions: a 5-year follow-up study. Stroke. 2006;37(2):482-6. 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A. de 1 Marques Mara R. 2 Cardoso Clever G. 2 Souza Lidiane B. de 3 Tomé Tabata de Carvalho 3 Quintana Hananiah Tardivo 3 Oliveira Flavia de 3 0000-0001-9930-7747 Reis Beatriz da Costa Aguiar Alves 4 Fonseca Fernando Luiz Affonso 4 Universidade São Judas Tadeu, São Paulo, SP - Brasil Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO - Brasil Departamento de Biociências da Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP - Brasil Faculdade de Medicina do ABC, Santo André, SP - Brasil

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Maifrino LBM, Souza LB, Quintana HT, Fonseca FLA; obtenção de dados: Maifrino LBM, Lima NEA, Cardoso CG, Souza LB, Oliveira F, Fonseca FLA; análise e interpretação dos dados: Lima NEA, Cardoso CG, Souza LB, Tomé TC, Oliveira F, Reis BCAA; análise estatística: Marques MR, Quintana HT, Oliveira F; obtenção de financiamento: Maifrino LBM; redação do manuscrito: Maifrino LBM, Lima NEA, Marques MR, Souza LB, Oliveira F, Reis BCAA; revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Maifrino LBM, Marques MR, Cardoso CG, Tomé TC, Reis BCAA, Fonseca FLA.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

Na menopausa, há maior exposição celular ao estresse oxidativo, relacionada à diminuição dos efeitos antioxidantes do estrogênio. Essas alterações metabólicas favorecem a progressão das doenças cardiovasculares, como a aterosclerose. A função anormal da aorta - a artéria mais importante - está associada a muitas doenças cardiovasculares. O colágeno, especialmente os tipos I e III, é um dos mais importantes componentes da parede da aorta e pode ser afetado por muitos fatores, incluindo a menopausa. Por sua vez, 8-OHdG é um dos principais marcadores de danos oxidativos do DNA induzidos por espécies reativas de oxigênio (EROS).

 Objetivo:

Investigar os efeitos do treinamento aeróbico moderado na aorta ascendente de camundongos fêmeas, nocaute para LDL (LDL-KO) e ovariectomizadas.

 Métodos:

Um total de 15 animais C57BL/6 e 15 animais LDL-KO foram divididos em grupos experimentais. A espessura e a densidade de volume das fibras de colágeno tipos I e III foram realizadas por análise morfoquantitativa; MMP-2 e MMP-9 e 8-OHdG foram detectadas por imunohistoquímica; e a apoptose foi detectada pelo ensaio TUNEL. O nível de significância adotado para todos os testes realizados foi p < 0,05.

 Resultados:

o exercício causa aumento da espessura da aorta em grupos LDL-KO, particularmente acentuada em grupos ovariectomizados. As fibras de colágeno de tipo I mostraram aumento da densidade de volume influenciado pelo treinamento em animais controle e LDL-KO. A densidade do colágeno tipo III diminuiu em ambos os grupos. A MMP-2 mostrou imunomarcação moderada na túnica média em animais LDL-KO; em grupos controle, a MMP-9 marcou irregularmente em todos os tecidos. O marcador 8-OHdG foi mais forte nos grupos de treinamento de exercícios. Além disso, a ovariectomia, o treinamento físico e os tratamentos de LDL-KO aumentaram a apoptose.

 Conclusão:

Esses resultados sugerem que exercícios aeróbicos de intensidade moderada em camundongos ovariectomizados associados ao aumento da taxa de LDL, possivelmente, aumentam o estresse oxidativo e a indução da apoptose.

Palavras-chave: Ratos Doenças Cardiovasculares Menopausa Colágenos Fibrilares/análise Ovariectomia Exercício LDL-Colesterol Introdução

A menopausa é um período durante o qual as mulheres sofrem alterações no perfil metabólico devido à diminuição da produção de hormônios como o estrogênio.1-3 Essas alterações metabólicas favorecem a progressão de doenças cardiovasculares, como a aterosclerose.4 A função anormal da aorta - a artéria mais importante - está associada a muitas doenças cardiovasculares. O colágeno, especialmente os tipos I e III, é um dos mais importantes componentes da parede da aorta e pode ser afetado por vários fatores, incluindo a menopausa.5

Exercícios físicos são recomendados para prevenção de doenças cardiovasculares durante a menopausa.6,7 No entanto, a atividade física de intensidade moderada a alta provoca aumento do estresse oxidativo em células e tecidos, elevando o risco de doença cardiovascular.8-10 A adaptação do corpo ao estresse oxidativo pode estar prejudicada em indivíduos com baixos níveis de estrogênio, que se liga a receptores celulares específicos e acelera a produção de vários antioxidantes pelas células.

Pouco se sabe sobre os efeitos da atividade física no desenvolvimento da aterosclerose e alterações metabólicas características da menopausa. Dados relevantes para a elucidação destes efeitos foram obtidos com o uso de marcadores como a 8-hidroxidesoxiguanosina (8-OHdG), metaloproteinases (MMPs), detecção de apoptose e quantificação de colágeno tipos III e I. A 8-OHdG é um dos principais marcadores de dano oxidativo do DNA induzido por espécies reativas de oxigênio (EROs).11,12 As MMPs desempenham papéis-chave na função de vários tecidos durante o crescimento, desenvolvimento e envelhecimento do organismo.13-17 A atividade excessiva ou desequilibrada das MMPs está associada à patogênese de muitas doenças,18,19 dentre elas, doenças cardiovasculares, como a aterosclerose.20

A detecção de apoptose em tecidos é um marcador relacionado à lesão mitocondrial, à produção de EROs e ao estresse oxidativo. Na apoptose, a quebra do DNA resulta em vários fragmentos com terminais 3’-OH livres. A identificação das células submetidas ao processo de apoptose consiste em detectar enzimaticamente os terminais 3’-OH livres com a adição de nucleotídeos modificados pela enzima TdT (terminal desoxinucleotidil transferase).

Assim, nosso objetivo foi verificar os efeitos do treinamento aeróbio moderado na aorta ascendente de camundongos fêmeas nocaute para receptor de lipoproteína de baixa densidade - LDL e ovariectomizados.

 Métodos Animais e formação dos grupos

Os experimentos foram realizados em 15 camundongos fêmeas C57BL/6 e 15 camundongos fêmeas nocaute para receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL-KO), pesando 20-25 g, doo Biotério da Universidade São Judas Tadeu, São Paulo, Brasil. Os camundongos receberam a ração padrão de laboratório e água ad libitum. Os animais foram colocados em gaiolas em uma sala com temperatura controlada (22°C) e ciclo claro-escuro de 12 horas. Todos os procedimentos e protocolos cirúrgicos foram aprovados pelo Comitê do Uso Experimental de Animais da Universidade São Judas Tadeu (058/2007). Após uma randomização simples, os camundongos foram divididos em seis grupos (n = 5): controle sedentário (CS), controle sedentário ovariectomizado (CSO), controle treinado ovariectomizado (CTO), LDL KO sedentário (S-LDL KO), LDL KO sedentário ovariectomizado (SO-LDL KO) e LDL KO treinado ovariectomizado (TO-LDL KO). Os animais foram separados fisicamente e aleatoriamente entre os grupos/caixas.

A definição do tamanho da amostra foi realizada segundo dados anteriores de outros autores,21-23 baseada nas recomendações da Instrução Normativa nº 27 do CONCEA (Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal) e determinada pela fórmula n = (2α / 2δ) 2 / E,24 onde n representa o tamanho da amostra; (2α)2 representa um valor crítico que corresponde ao grau de confiança desejado, δ representa o desvio padrão da população e E representa a margem de erro (diferença entre a média da amostra e a média da população verdadeira).

 Ovariectomia

Aos nove meses de idade, os animais foram anestesiados (cetamina 120 mg/kg + xilazina 20 mg/kg), e uma pequena incisão abdominal foi realizada, onde os ovários e ovidutos foram encontrados, seccionados e removidos. Em seguida, a pele e a parede muscular foram suturadas.25,26 A eficácia da ovariectomia foi determinada pela observação das secreções vaginais durante quatro dias consecutivos.

 Protocolo de treinamento

Sete dias após a ovariectomia, todos os animais foram adaptados na esteira por dez minutos durante três dias antes de iniciar o treinamento. O teste de esforço máximo foi realizado em todos os grupos no início e no final do programa de treinamento, fornecendo a base para a prescrição do treinamento físico e com o objetivo de avaliar a capacidade física dos animais treinados.

Os grupos treinados foram submetidos a um protocolo de treinamento físico moderado em esteira ergométrica, com velocidade e carga progressivas (1 hora ao dia / 5 dias por semana a 50-60% da velocidade máxima de esforço) durante 4 semanas, conforme descrito anteriormente.27

Procedimentos histológicos

Ao final do experimento, os animais foram pesados e subsequentemente submetidos a eutanásia por decapitação. A toracotomia foi realizada cortando-se a aorta ascendente na base do coração. As amostras da aorta foram lavadas (PBS - solução salina tamponada com fosfato 0,1M, pH 7,4) e fixadas em formaldeído a 10% por 24 horas. Eles então foram desidratadas, limpas e embebidas em parafina. A aorta foi seccionada transversalmente (5µm de espessura), e as amostras foram coradas com H&E para análise histomorfométrica.7 Para analisar os efeitos do treinamento aeróbico na aorta inteira, a túnica íntima não foi separada da túnica média. A coloração de Picrosirius foi utilizada para classificação das fibras de colágeno I e III. As imagens foram capturadas em 4 pontos, a 0º, 90º, 180º e 270º, com ampliação de 10x para medir a espessura da aorta e 40x para outras avaliações, e transferidas para um programa de análise de imagens (Axion Visio Software, Zeiss®). Para analisar a densidade volumétrica das fibras colágenas tipos I e III, as imagens foram obtidas em microscópio ótico com luz polarizada, analisadas em sistema teste de 252 pontos, e os valores expressos em porcentagens.

 Análise imunohistoquímica: 8-OHdG, MMP-2 e MMP-9

Cinco seções transversais de 4 µm, montadas em lâminas previamente silanizadas, foram utilizadas para demonstrar a expressão de 8-OHdG, MMP-2 e MMP-9. As lâminas foram então desparafinizadas, limpas, hidratadas e lavadas em água corrente. Em seguida, a atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio a 0,3%, o bloqueio de proteínas foi realizado com leite desnatado a 0,3% diluído em PBS e as lâminas foram incubadas durante a noite com anticorpo primário anti-8-OHdG (SC66036 Santa Cruz® Biotechnology, CA, EUA), titulado a 1:100 e MMP2/72KDa e MMP9/KDa (SC-10436 Santa Cruz® Biotechnology, CA, EUA; SC-6840 Santa Cruz® Biotechnology, CA, EUA),titulado a 1: 150 em PBS-BSA 0,1%. Todas as lâminas foram então colocadas numa câmara úmida a 4°C durante a noite.

O material foi lavado com tampão PBS e incubado com anticorpo secundário biotinilado. Para revelação, o substrato cromogênico 3-3’ diaminobenzidina foi utilizado na proporção de 0,06 g por 100 mL de PBS, e 1 mL de H2O2 a 20 volumes por cinco minutos a 37 °C e contra-corado com hematoxilina de Mayer por 3 minutos. Finalmente, as lâminas foram montadas com lamínula e Entellan® para análise sob microscopia ótica.

 Investigação da morte celular por apoptose pelo método imunocitoquímico de TUNEL

A coloração TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) foi realizada utilizando-se o kit ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection (Millipore®, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.

 Quantificação de células apoptóticas

Para a quantificação das células imunomarcadas para apoptose, foram capturadas 30 imagens da camada íntima-média (10 imagens/animal; n = 3 animais/grupo), com aumento de 10x para medir a espessura da aorta e 40x para outras avaliações, e transferidas para um programa de análise de imagens (Axion Visio Software, Zeiss®) para cada grupo experimental.

Para cada imagem, o número total de células imunomarcadas foi obtido como uma frequência relativa (%) em relação ao número total de células. O microscópio ótico acoplado a uma câmera digital (Zeiss, Alemanha) foi utilisado para obter as imagens, e as fotomicrografias foram digitalizadas com o software AxioVision (Zeiss®, Alemanha).

 Análise estatística

Os resultados foram apresentados como média e desvio padrão. A análise de variância (ANOVA) e os testes post-hoc de Tukey foram aplicados adequadamente na análise dos dados. O nível de significância para todos os testes foi de p < 0,05. Os dados foram avaliados utilizando-se o software Stata 7.0. Todas as variáveis contínuas estavam distribuídas normalmente (teste de Shapiro-Wilk). Para avaliar a normalidade dos dados, foi utilizado o cálculo de Shapiro-Wilk, que mostrou que os dados estavam alocados dentro da curva de Gauss. Considerando-se um nível de significância de 5%, o teste assumiu a hipótese de normalidade para a variável com distribuição normal.

 Resultados Análise histopatológica e histomorfométrica

A análise histopatológica mostrou que os animais dos grupos controle (CS, CSO e CTO) não apresentaram alterações no arranjo das fibras elásticas e no padrão de espessura. No entanto, os grupos dislipidêmicos (S-LDL KO, SO-LDL KO e TO-LDL KO) apresentaram maior espaçamento entre as fibras elásticas (Figura 1).

Cortes transversais de aorta do camundongo mostrando o arranjo das fibras elásticas. Os grupos controle mostraram um padrão similar de arranjo e espessura das fibras elásticas. Os grupos LDL KO mostraram fibras mais espaçadas e paredes dos vasos mais espessas em comparação com os controles. Fotomicrografias, H&E. Barra de Calibração = 100 µm. Controle sedentário (CS), controle sedentário ovariectomizado (CSO), controle treinado ovariectomizado (CTO), grupo sedentário LDL KO (S-LDL KO), grupo sedentário ovariectomizado LDL KO (SO-LDL KO) e grupo treinado ovariectomizado LDL KO (TO-LDL KO).

Espessura da túnica íntima-média (µm)

Observamos um aumento significativo na espessura da túnica íntima-média em animais dislipidêmicos, quando comparados aos animais dos grupos controle. A ovariectomia e o exercício nos grupos LDL KO foram determinantes para o aumento dessa variável. Tanto no grupo controle quanto no grupo LDL KO o exercício de treinamento não reverteu esse processo (Figuras 1 e 2).

Espessura da túnica íntima-média (µm) nos grupos estudados. Os valores são expressos como M ± DP * p < 0,05 vs. S-C; #p < 0,05 vs. OS-C; + p < 0,05 vs. OT-C; < p < 0,05 vs S-LDL KO; 2p < 0,05 vs OS-LDL KO.

Densidade de volume das fibras de colágeno tipos I e III na túnica íntima-média e adventícia

Comportamento semelhante da fibra de colágeno tipo III foi observado entre a túnica íntima-média e a adventícia. Observamos uma diminuição significativa na densidade de volume da fibra de colágeno tipo III nos grupos LDL KO, quando comparados com o CS (Figura 3).

Densidade de volume das fibras de colágeno tipos I e III (Vv [fc]) na Túnica íntima-média e na adventícia da aorta ascendente. Os valores são expressos como M ± DP. *p < 0,05 vs. CS; #p < 0,05 vs. CSO; + p < 0,05 vs. STO.

As fibras de colágeno tipo I da túnica adventícia e da íntima-média apresentaram aumento na densidade de volume, influenciado pelo treinamento nos grupos Controle. A dislipidemia induz a um aumento das fibras de colágeno tipo I nos grupos LDL KO quando comparado aos grupos Controle e não sofreram nenhuma alteração causada pela ovariectomia ou pelo treinamento (Figura 3).

 Análise imunohistoquímica

A Figura 4 mostra a coloração do tecido causada pelo marcador de estresse oxidativo 8-OHdG. Observe que a imunoexpressão do marcador ocorreu em todos os grupos. A coloração foi moderada para os grupos LDL KO e Controle, tanto Sedentário quanto Ovariectomizado. No entanto, para os grupos Ovariectomizados e treinados, a coloração observada foi intensa.

Fotomicrografias de cortes transversais da aorta de camundongos submetidos à reação imuno-histoquímica para 8-OHdG. A imunoexpressão de 8-OHdG foi observada em todos os grupos investigados. A coloração foi moderada para os grupos LDL KO e Controle, tanto o S como o SO. No entanto, para os grupos O e T, a coloração observada foi intensa. Barra de calibração = 100µm.

Em todos os grupos controle (CS, CSO e CTO), a imunoexpressão de MMP-2 ocorreu tanto na túnica íntima (seta) quanto na adventícia (cabeça de seta) da aorta ascendente. Os grupos LDL, em geral, mostraram imunoexpressão da MMP-2 além das túnicas íntima e adventícia, mas também na túnica média da aorta (embora muito levemente), o que não foi observado em nenhum grupo de animais controle (Figura 5). A MMP-9 foi expressa em todas as camadas da aorta ascendente de todos os grupos; no entanto, a distribuição foi heterogênea (Figura 6).

Fotomicrografias de cortes transversais da aorta ascendente de camundongos submetidos a reação imunohistoquímica para MMP-2. Observe a presença de imunoexpressão para MMP-2 nas camadas íntima (seta) e adventícia (cabeça de seta) em todos os grupos de controle (CS, CSO e CTO). Em geral, a imunoexpressão de MMP-2 nos grupos LDL KO foi observada nas camadas íntima e adventícia, bem como na camada média da aorta (*), o que não ocorreu em nenhum animal dos grupos controle. Barra de calibração: 100 µm

Fotomicrografias de cortes transversais da aorta ascendente de camundongos submetidos a reação imuno-histoquímica para MMP-9. Observe a presença de imunoexpressão em todas as camadas, de forma heterogênea, em todos os grupos. Barra de calibração: 100 µm.

Células apoptóticas estavam distribuídas na camada íntima-média da aorta ascendente em todos os grupos estudados. A comparação da frequência relativa mostrou que a ovariectomia aumentou estatisticamente a apoptose em + 12,6% no grupo sedentário (CSO) e + 19% no grupo treinamento físico (CTO) quando comparado à apoptose do grupo CS (Figura 7). Entre os grupos nocaute, as taxas de apoptose foram maiores que os respectivos controles, independentemente se os camundongos fossem ovariectomizados ou não. Assim, o CSO nocaute apresentou aumento da frequência de apoptose em + 28,8% quando comparado ao grupo controle. A ovariectomia e nocaute aumentaram estatisticamente a apoptose em +24,5% nos grupos sedentário (SO-LDL KO) e + 32,3% no treinamento físico (TO-LDL KO), quando comparados ao grupo CS. Nenhuma mudança significativa foi observada quando se comparou o grupo sedentário nocaute (S-LDL-KO) com os grupos nocaute sedentário ovariectomizados (SO-LDL KO) ou com treinamento físico (TO-LDL KO), com diminuição da apoptose em -4,3% e melhora apoptose em + 3,5%, respectivamente. No entanto, a frequência relativa de grupos nocaute com ovariectomia, sedentarismo e treinamento físico mostrou-se estatisticamente aumentada em +7,8% (Figura 7).

Frequência relativa (%) de células apoptóticas na aorta ascendente do grupo controle sedentário (CS) versus os diferentes grupos avaliados, conforme evidenciado pelo ensaio TUNEL. * p < 0,05 vs. CS, # p < 0,05 vs. CSO, + p < 0,05 vs. SO-LDL-KO. Os valores são expressos como média ± DP (p < 0,05).

Discussão

O principal objetivo desse estudo foi verificar os efeitos do treinamento aeróbico moderado na aorta ascendente de camundongos ovariectomizados, nocaute para o receptor de lipoproteína de baixa densidade - LDL, através da análise de fibras de colágeno tipos I e III, a expressão de 8-OHdG e marcadores de estresse oxidativo das MMP-2 e MMP-9.

O colágeno e a elastina são importantes componentes estruturais e funcionais da parede arterial. Esses componentes participam ativamente do remodelamento da parede arterial em resposta a alterações hemodinâmicas e durante a aterogênese.

A análise histopatológica não mostrou alterações morfológicas no grupo controle. No entanto, o grupo LDL KO apresentou maior espessura e maior espaçamento entre as fibras elásticas. Alguns estudos demonstraram uma associação entre o aumento da espessura intima-média e a ocorrência de eventos cardíacos,28 o que confirmou a existência da associação entre o aumento da espessura intima-média da carótida e a presença de fatores de risco cardiovascular, incluindo marcadores de infecção e inflamação. O colágeno I é principalmente um colágeno estrutural; o colágeno III, por sua vez, é mais frequente em processos patológicos. Nossos resultados mostraram que o número de células em apoptose foi significativamente menor no grupo controle e se manteve constante nos grupos Controle (CSO e CTO) e nos grupos nocaute LDL (S-LDL KO, SO-LDL KO e TO-LDL KO), sem diferenças significativas na porcentagem de células apoptóticas entre os grupos controle ou nocaute LDL para cada parâmetro utilizado. No entanto, o processo de apoptose foi maior nos animais dos grupos nocaute LDL, quando comparados aos animais dos grupos controle, independentemente de terem sido ovariectomizados ou não. Isso sugere que a ovariectomia não foi um fator importante nos processos de indução de apoptose na aorta.

Os altos níveis de LDL na corrente sanguínea podem ter sido o fator indutor de apoptose no endotélio e na túnica média da aorta ascendente nos grupos nocaute LDL. A disfunção endotelial induzida pela oxidação da LDL (ox-LDL) tem sido associada à patogênese da aterosclerose e outros distúrbios vasculares. Sabe-se que a LDL-ox ativa a liberação de EROs e tem sido associada a apoptose e dano ao endotélio.29 A apoptose de células musculares lisas vasculares (CMLV) está associada à ocorrência de doenças vasculares. Na aterosclerose, a indução da apoptose celular tem sido associada à ruptura da placa aterosclerótica, coagulação, remodelação vascular, atrofia da túnica média, à formação de aneurismas e calcificação.30 Além disso, em várias doenças humanas, como a síndrome de Marfan e a necrose cística da túnica média (NCM), os processos apoptóticos resultam em maior quebra das fibras elásticas, deposição anormal da matriz extracelular e expansão da túnica média.31 Nesse ambiente, a liberação de interleucina IL-1α e IL-8, assim como a expressão da proteína quimioatrativa de monócitos (MCP-1) ocorre durante a apoptose de CMLV, que causa infiltração de macrófagos in vivo, aumentando o dano tecidual observado.32

Os animais do grupo CTO apresentaram maior número de células apoptóticas em relação aos grupos CSO e CS (p < 0,05). A atividade física tem sido associada ao aumento dos níveis de apoptose em timócitos de ratos, músculo esquelético e linfócitos de camundongos.33,34 O estresse oxidativo resultante do metabolismo em atividades físicas tem sido amplamente associado com a apoptose. Em pacientes com doenças cardiovasculares, a deficiência na produção do óxido nítrico (NO), associada ao estresse oxidativo, resulta em um declínio da biodisponibilidade do NO, induzindo a apoptose das células endoteliais e, consequentemente, resultando em disfunção endotelial.35 Os animais ovariectomizados apresentaram maior porcentagem de células apoptóticas do que os grupos controle treinados e sedentários (CTO e CSO). Isso sugere que a diminuição da produção de hormônios pode estar relacionada à redução dos efeitos antioxidantes no organismo.

O 8-OHdG é um dos principais produtos oxidativos do DNA, que é considerado um marcador confiável de danos oxidativos ao DNA. Assim, o 8-OHdG tem sido amplamente utilizado como um biomarcador sensível de estresse oxidativo.36 A análise imunohistoquímica do 8-OHdG mostrou coloração em todos os grupos; no entanto, os grupos treinados apresentaram maior intensidade de coloração. Goto et al.,9 em 2003, descobriram que o exercício de alta intensidade aumenta os níveis de 8-OHdG no plasma, o que explica o maior grau de coloração nos grupos treinados.

Houve diferenças na expressão de MMP-2, e o grupo controle mostrou coloração nas camadas íntima e adventícia, enquanto o grupo LDL KO mostrou coloração na camada média. De acordo com Sakalihasan et al.,37 em 1996, isso ocorre porque a lesão aterosclerótica causa a migração da MMP-2 nas extremidades e em menor quantidade no tecido normal, para a camada média, ou seja, a formação de placas ateroscleróticas ativa um conjunto de reações em cadeia, o que pode aumentar a quantidade de MMP-2 presente no tecido. Com relação à expressão da MMP-9, todos os grupos apresentaram coloração tecidual, mas sem um padrão. Nenhuma evidência foi encontrada que explicasse essa coloração heterogênea.

 Conclusão

O modelo experimental analisado mostra alterações histomorfométricas com aumento da expressão de 8-OHdG nos grupos treinados. Um aumento na taxa de apoptose foi observado nos grupos treinados e no grupo ovariectomizado LDL KO. Os grupos corados com MMP-2 mostraram migração e aumento de expressão na túnica média dos grupos LDL KO. No entanto, a coloração de MMP-9 apareceu em todos os grupos, mas não seguiu um padrão homogêneo. Por fim, estudos sobre a expressão de MMPs em tecidos musculares cardíacos com aterosclerose são muito escassos, sugerindo a necessidade de mais estudos para investigar o assunto. Assim, os resultados aqui descritos sugerem que o exercício aeróbico de intensidade moderada em camundongos ovariectomizados, associado a um aumento nas taxas de LDL, possivelmente aumenta o estresse oxidativo e a indução de apoptose.

A avaliação dos parâmetros em estudo (MMPs, apoptose e 8-OHdG) foi realizada por imunohistoquímica. No entanto, outras tecnologias mais sensíveis (como as de biologia molecular) poderiam ser utilizadas nessas avaliações, levando a resultados e interpretações mais precisos.

Fontes de financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Universidade de São Judas Tadeu sob o número de protocolo 058/2007.