Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC LVh5f3n3zw5sRJLv3nvpD9P S0066-782X2019000200173 S0066-782X2018005020102 10.5935/abc.20180248 Original Article The Effects of Trimetazidine on QT-interval Prolongation and Cardiac Hypertrophy in Diabetic Rats Ramezani-Aliakbari Fatemeh 0000-0003-2290-8565 Badavi Mohammad Dianat Mahin Mard Seyed Ali Ahangarpour Akram Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences Faculty of Medicine Physiology Research Center Ahvaz Iran Physiology Research Center and Department of Physiology, Faculty of Medicine, Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences, Ahvaz - Iran Mailing Address: Mohammad Badavi, Persian Gulf Physiology Research Center, Dept. of Physiology, Faculty of Medicine, Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences, Ahvaz - Iran. E-mail: badavim@yahoo.com

Author contributions

Design and conception of the study: Ramezani-Aliakbari F, Badavi M; Acquisition of data: Dianat M, Mard SA, Ahangarpour A; Analysis and interpretation of the data: Dianat M, Mard SA, Ahangarpour A; Statistical analysis: Ramezani-Aliakbari F, Badavi M; Obtaining financing: Badavi M; Writing of the manuscript: Ramezani-Aliakbari F, Badavi M; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Badavi M.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 17 12 2018 02 2019 112 2 173 178 24 04 2018 23 07 2018 23 07 2018 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited Abstract Background:

Trimetazidine (TMZ) is an anti-ischemic drug. In spite of its protective effects on cardiovascular system, there is no scientific study on the usefulness of TMZ treatment for prolonged QT interval and cardiac hypertrophy induced by diabetes.

 Objectives:

To evaluate the effects of TMZ on QT interval prolongation and cardiac hypertrophy in the diabetic rats.

 Methods:

Twenty-four male Sprague-Dawley rats (200-250 g) were randomly assigned into three groups (n = 8) by simple random sampling method. Control (C), diabetic (D), and diabetic administrated with TMZ at 10 mg/kg (T10). TMZ was administrated for 8 weeks. The echocardiogram was recorded before isolating the hearts and transfer to a Langendorff apparatus. Hemodynamic parameters, QT and corrected QT interval (QTc) intervals, heart rate and antioxidant enzymes were measured. The hypertrophy index was calculated. The results were evaluated by one-way ANOVA and paired t-test using SPSS (version 16) and p < 0.05 was regarded as significant.

 Results:

The diabetic rats significantly indicated increased hypertrophy, QT and QTc intervals and decreased Left ventricular systolic pressure (LVSP), Left ventricular developed pressure (LVDP), rate pressure product (RPP), Max dp/dt, and min dp/dt (±dp/dt max), heart rate, superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) and catalase in the heart. Treatment with TMZ in the diabetic animals was significantly improved these parameters in comparison to the untreated diabetic group.

 Conclusions:

TMZ improves QTc interval prolongation and cardiac hypertrophy in diabetes.

Keywords: Diabetes Mellitus Trimetadizine Cardiomegaly Electrocardiology Oxidative Stress Rats Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences APRC-94-25 This study was funded by Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences (grant No. APRC-94-25). Introduction

Diabetes is associated with cardiovascular disorders and increased mortality rate in diabetic patients.1 The statistic reveals that 30 million people were suffered from diabetes worldwide in 1985 and recently, it is predicted by WHO, there will be 300 million by the year 2025.2

Diabetic cardiomyopathy is known as the structural and functional alterations in the heart induced by diabetes that are associated with cardiac hypertrophy, diastolic and/or systolic dysfunction in the absence of hypertension, valvular and ischemic heart diseases and other cardiac disorders.3,4

QT and QTc intervals are electrocardiographic parameters that regarded as critical predictors of mortality and stroke in diabetic patients.5,6 The pathological QT prolongation is known as a risk factor that increases ventricular arrhythmias and other heart diseases. Moreover, ventricular hypertrophy plays an important role in developing prolonged QT interval-related diabetes.7 A previous study has confirmed the negative effects of hypertrophy and QT interval prolongation on the function of heart in diabetes.8 The homeostasis of energy is effective in decreasing the hypertrophy in the heart.9

Trimetazidine (TMZ) is an anti-angina agent that is known to improve metabolism of energy in the heart subjected to ischemia.10,11 Previous studies have indicated reduced fatty acid oxidation via reducing mitochondrial 3-ketoacyl CoA thiolase (3-KAT) activity in beta-oxidation by TMZ treatment.12 Others also indicated that TMZ has protective effects on cardiac fibrosis resulted from pressure overload.13 In addition, there are some other investigations showing that the treatment with TMZ has positive effects on cardiac function in diabetic individuals with cardiovascular disorders.14 Taken together, these results from related studies make evidence that TMZ has beneficial effects on cardiovascular system. However, the role of TMZ in QT interval prolongation and cardiac hypertrophy improvement in diabetes was still unknown. Therefore, the present study was undertaken to evaluate the effects of TMZ on QT interval prolongation and cardiac hypertrophy in the diabetic animals.

 Methods Chemical

Trimetazidine (TMZ), heparin and alloxan were obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A.) and Ketamine and xylazine purchased from Alfasan Co (Woderen- Holland).

 Animal

Twenty-four adult male Sprague-Dawley rats (250 ± 20 g) were housed under standard conditions (20 ± 5°C, 12-hour light/dark cycle, and free available to water and food) during the study period. All the experimental protocols followed the Consensus Author Guidelines on Animal Ethics and Welfare and the national guidelines for conducting animal studies (Ethics Committee permission No. APRC-94-25 Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences, Ahvaz, Iran).15

The sample size of each group was computed to be eight by the formula:16

n = Z 1 − α / 2 + Z 1 − β 2 × S 1 2 + S 2 2 d 2 = 1 . 96 × 1 . 29 2 × 13 . 52 2 + 9 . 07 2 89 − 70 2 = 7 . 75 ∼ 8

where S12 and S22 are means.

The animals were randomly divided into three groups (n = 8) by simple random sampling method. Control (C), diabetic (D) and diabetic administrated with TMZ at 10 mg/kg (T10).17 TMZ was treated orally by gavage once daily for 8 weeks.

 Diabetic model

Diabetes was induced by intraperitoneal administration of alloxan at 120 mg/kg. After 6 h, the animals were orally treated with 10% glucose solution (10 mL). They were further kept for 24 h on 5% glucose solution to reduce fatal hypoglycemic resulted from alloxan. The rats, indicating fasting blood glucose ≥ 250 mg/dL, reduced body weight, dyslipidemia, increased hepatic enzymes and clear signs of polyuria, polyphagia and polydipsia after 4 days were regarded as diabetic animals and used for the experiment.18

Electrocardiography

The animals were anesthetized by heparin, ketamine and xylazine (1000 U/kg, 50, and 5 mg/kg, respectively), lead II was recorded by Bio Amp and controlled using a Power Lab system (AD Instruments, Australia). QT interval and heart rate were measured. Corrected QT interval (QTc) was calculated by Bazett formula normalized as QTc = QT/(RR/f)1/2, where RR is R-R interval and f = 150 ms.19,20

Isolation of hearts

After echocardiogram (ECG) recording, the cannulation and ventilation of trachea were performed using an animal ventilator (UGO BASILE, model: 7025). The cannulation of aorta was carried out by a central incision in the aorta. The hearts were conveyed to the Langendorff system. The perfusion of heart was carried out by Krebs-Henseleit solution (5% carbon dioxide and 95% oxygen, 37°C, pH = 7.4, 8 ml/min). A latex balloon was inserted in the left ventricle for the measurement of left ventricular pressure (LVP) by Power Lab system (AD Instruments, Australia). Left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) was approximately regulated 5-10 mmHg by the alteration of balloon volume. Left ventricular systolic pressure (LVSP), Max dp/dt, and min dp/dt (±dp/dt max) were measure.21 Left ventricular developed pressure (LVDP) and rate pressure product (RPP) were calculated by following formula:

LVDP = LVSP − LVEDP RPP = LVDP × heart rate Measurement of hypertrophy

After assessment of hemodynamic parameters using the Langendorff system, the hearts were removed and put in saline, then on a paper for assessment of the heart weight. Cardiac hypertrophy index (mg/g) was calculated from the total heart weight (mg) relative to total body weight (g) of the rat.22

Measurement of antioxidant enzymes

After measurement of hypertrophy, 100 mg of heart tissue was frozen in liquid nitrogen and stored at -70°C. The tissue samples were homogenized in phosphate buffered saline (PBS; 50 mM at pH of 7.4) using a Homogenizer (Heidolph Silenterosher M, Germany), and centrifuged at 14000 g for 15 minutes. The assessment of enzyme levels including glutathione peroxidase (GPx), catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) was performed on supernatant. GPx and SOD were measured using Randox kits (Randox Lab, UK) and CAT activity was evaluated using Zellbio kit (Zellbio Lab, Ulm, Germany).

 Statistical analysis

The results were indicated as mean and standard deviation (SD). In the present study, the normal distribution of the results was carried out by Kolmogorov-Smirnov analysis. One-way ANOVA and Least Significant Difference (LSD) test were used for comparison between the various groups. The comparison of pre and post metabolic in each group was performed by paired t-test using SPSS (version 16). A p < 0.05 was regarded statistically significant.

 Results Electrocardiographic parameters

The QT and QTc intervals significantly increased in the diabetic animals in comparison with the control group (100 ± 13.80 vs. 70 ± 8.34, 82.52 ± 13.03 vs. 58.4 ± 7.33, p = 0.007 and p=0.009, respectively). TMZ treatment was associated with a significant reduction in the QT and QTc intervals in comparison with the untreated diabetic rats (80 ± 10.69 vs. 100 ± 13.80, 63.11 ± 7.05 vs. 82.52 ± 13.03, p = 0.043 and p = 0.040, respectively, Figure 1). As shown in Table 1, the diabetic rats indicated a decrease in the heart rate compared to the control rats (198 ± 41.21 vs. 268 ± 27.99, p = 0.002). Obviously, the administration of diabetic group with TMZ significantly increased the heart rate compared to the untreated diabetic rats (263 ± 35.02 vs. 198 ± 41.21, p = 0.006).

QT interval (a), QTc interval (b) values in control (C), diabetic (D) and diabetic treated with TMZ (10 mg/kg, T10) groups eight weeks after treatment in the rats. The results were presented as mean ± SD. <sup>##</sup> p < 0.01 compared to the control group, * p < 0.05 compared to the diabetic group.

Hemodynamic parameters in the heart
Groups C D T10 P valueD VS. C P valueT10 VS. D
Heart rate (beats/min) 268 ± 27.99 198 ± 41.21 263 ± 35.02 0.002## 0.006**
LVSP (mmHg) 75 ± 20.91 60.78 ± 16.76 79.75 ± 10.16 0.041# 0.028*
LVDP (mmHg) 74.37 ± 18.76 56 ± 18.37 74.25 ± 9.93 0.030# 0.031*
RPP (mmHg) 14965 ± 5582 10184 ± 4589 14099 ± 3859 0.041# 0.049*
Max +dp/dt(mmHg) 2294 ± 255.27 1035 ± 370.33 1727 ± 410.60 < 0.001### 0.001**
Min -dp/dt (mmHg) -1220 ± 229.09 -594.77 ± 210 -962 ± 194 < 0.001### 0.002**

(Mean ± SD, n = 8) in control (C), diabetic (D) and diabetic treated with TMZ (T10), (one-way ANOVA followed by LSD post hoc test). LVSP: left ventricular systolic pressure; LVDP: left ventricular developed pressure; RPP: rate pressure product.

 Markers of cardiac function

At the end of the experiment, LVSP, LVDP, ±dp/dt max and RPP were observed significantly lower in the diabetic group than control group. However, TMZ administration for 8 weeks was associated with a significant increase in these parameters in comparison with the untreated diabetic rats (Table 1).

 Effect of TMZ on myocardial hypertrophy

As indicated, the hypertrophy index increased significantly in the diabetic rats on 8 weeks compared to the control group (56.62 ± 6.50 vs. 48.62 ± 7.90, p = 0.039). According to our findings, in the diabetic rats, administration with TMZ remarkably decreased the hypertrophy index when compared to the diabetic rats (41.87 ± 7.50 vs. 56.62 ± 6.50, p < 0.001, Figure 2).

Hypertrophy value in control (C), diabetic (D) and diabetic treated with TMZ (T10) groups eight weeks after treatment in the rats. The results were presented as mean ± SD. <sup>#</sup> p < 0.05 compared with control group, ***p < 0.001 compared to the untreated diabetic group.

Effect of TMZ on antioxidant enzymes

As indicated in Table 2, antioxidant enzymes, GPx, CAT and SOD significantly decreased in the heart of diabetic animals as compared to the control group (p < 0.001, p = 0.002, respectively). However, oral administration with TMZ was significantly improved GPx, CAT and SOD (p < 0.001, p < 0.049, respectively).

Antioxidant enzymes activities
Groups C D T10 P value D vs. C P valueT10 vs. D
SOD (U/dl) 8.46 ± 1.51 5.86 ± 0.69 7 ± 1.54 0.002## 0.049*
CAT (U/ dl) 10.52 ± 0.60 1.90 ± 4.08 10.71 ± 0.50 0.002## < 0.001***
GPx (U/ dl) 28.50 ± 2.67 13.22 ± 0.95 24.03 ± 1.73 < 0.001### < 0.001***

(Mean ± SD, n = 8) in control (C), diabetic (D) and diabetic treated with TMZ (T10), (one-way ANOVA followed by LSD post hoc test). SOD: superoxide dismutase. CAT: catalase; GPx: glutathione peroxidase.

 Discussion

Our results indicated that alloxan injection significantly increased QT and QTc intervals and decreased heart rate, LVSP, LVDP, RPP, ±dp/dt max, and cardiac hypertrophy, SOD, GPx and CAT in the heart of the diabetic rats when compared with control group. However, treatment with TMZ was able to improve QT and QTc intervals, heart rate, hemodynamic parameters, SOD, CAT and hypertrophy significantly. Previous studies have demonstrated that diabetes is associated with the alterations of electromechanical and prolonged QTc interval in the heart.23

Diastolic and systolic dysfunctions are the earliest manifestations in the development of diabetic cardiomyopathy.24 The ±dp/dt max, LVSP, LVDP, RPP, cardiac diastolic and systolic indexes, are widely used to evaluate cardiac function. The alloxan-induced diabetic rats progressed cardiac dysfunction as demonstrated by a significant decrease in ±dp/dt LVSP, LVDP, RPP. TMZ treatment in turn improved each of these parameters.

In our model of type 1 diabetes, ECG indicated prolonged QTc, a finding that is consistent with previous studies. Treatment with TMZ significantly decreased these QT and QTc dispersions. This result is in agreement with previous reports which indicated that TMZ treatment improved QT prolongation in individuals with kidney disorders.25,26

In the present study, we also observed that diabetes led to bradycardia in the diabetic animals. It is revealed that in the diabetic rats heart rate tends to decrease after eight weeks.27 On the other hand, diabetes increases vagal tone and decreases sympathetic tone in diabetic rats.28 In addition, treatment with TMZ improves autonomic tone in individuals with acute coronary syndrome.29 Improved sympathetic and parasympathetic tone can partly explain the increased heart rate in the diabetic rats treated with TMZ.

Diabetic cardiomyopathy is associated with cardiac hypertrophy and dysfunction. High blood glucose and oxidative stress maybe considered to be critical factors that involved in hypertrophy and dysfunction of the heart.30 In the present study, the diabetic rats showed cardiac hypertrophy demonstrated by the increased heart wieght/body wieght ratio. Similar results have been indicated in previous studies.31 It is well established that, increased VLDL-c and decreased HDL-c levels can result in reduction in anti-oxidant defense system.27 In a previous study, it was indicated that the impairment of lipid profile levels in diabetic animals could be attributed to increased lipid breakdown and release of a large amount of free fatty acids.17 The released free fatty acids are susceptible to oxidation which result in decreased anti-oxidant level and anti-oxidant defense system.32 Increased level of fatty acid oxidation in the diabetic heart leads to lipid accumulation and cardiac hypertrophy.33 Reduction in fatty acid oxidation and oxidative stress by TMZ treatment can partly attribute to improvement of cardiac hypertrophy.

Previous studies have indicated that SOD level reduced in type 1 diabetes and it is mostly demonstrated that increased reactive oxygen species (ROS) negatively associated with the enzyme antioxidant values such as SOD and GPx.34 SOD quickly alters O2 to H2O2, which is further destroyed via GPx and CAT. The antioxidant enzyme levels are sensitive to the oxidative stress, and enhanced or reduced values have been indicated in various pathologies in which an increase of ROS is a cause or result of the disorder such as diabetes.35,36 In addition, superoxide anions and ROS have also been indicated to be contributed to cardiac hypertrophy resulted from various stimuli; therefore, SOD is a primary defense against oxidative stress that involves in the hypertrophy of the heart.37 Our findings indicated that SOD and CAT levels in hearts from TMZ treated diabetic rats was significantly higher than that in the untreated diabetic animals. GPx values was slightly but not significantly more in the hearts from TMZ treated diabetic animals compared to the diabetic rats.

Taken together, these findings indicated that the diabetic rats showed hypertrophy and dysfunction in the heart as well as increased cardiac oxidative damage in comparison with the control animals, showing that these undesirable factors are connected. TMZ probably improved these factors by antioxidant effects. Based on the results of present study, more studies require to be carried out to assessment mechanisms involved in the improvement of hypertrophy and cardiovascular disorders resulted from diabetes using TMZ treatment.

 Conclusions

All these observations show that TMZ treatment contributes to the improvement of impaired function and electrical activity as well as hypertrophy of the heart in diabetic cardiomyopathy in rats. Improvements observed in TMZ treatment is associated with decrease oxidative stress.

Sources of Funding

This study was funded by Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences (grant No. APRC-94-25).

Study Association

This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Fatemeh Ramezani-Aliakbari, from Physiology Research Center of Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee on Animal Experiments of the Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences under the protocol number APRC-94-25.

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Vinik AI Erbas T Diabetic autonomic neuropathy Handb Clin Neurol 2013 117 279 294 29 Zhang J, He S, Wang X, Wang D. Effect of trimetazidine on heart rate variability in elderly patients with acute coronary syndrome. Pak J Med Sci. 2016;32(1):75-8. Zhang J He S Wang X Wang D Effect of trimetazidine on heart rate variability in elderly patients with acute coronary syndrome Pak J Med Sci 2016 32 1 75 78 30 Adebiyi AO, Adebiyi OO, Owira PM. Naringin Mitigates Cardiac Hypertrophy by Reducing Oxidative Stress and Inactivating c-Jun Nuclear Kinase-1 Protein in Type I Diabetes. J Cardiovasc Pharmacol. 2016;67(2):136-44. Adebiyi AO Adebiyi OO Owira PM Naringin Mitigates Cardiac Hypertrophy by Reducing Oxidative Stress and Inactivating c-Jun Nuclear Kinase-1 Protein in Type I Diabetes J Cardiovasc Pharmacol 2016 67 2 136 144 31 Al-Rasheed NM, Al-Rasheed NM, Hasan IH, Al-Amin MA, Al-Ajmi HN, Mahmoud AM. Sitagliptin attenuates cardiomyopathy by modulating the JAK/STAT signaling pathway in experimental diabetic rats. Drug Des Devel Ther. 2016 Jun 28;10:2095-107. Al-Rasheed NM Al-Rasheed NM Hasan IH Al-Amin MA Al-Ajmi HN Mahmoud AM Sitagliptin attenuates cardiomyopathy by modulating the JAK/STAT signaling pathway in experimental diabetic rats Drug Des Devel Ther 2016 06 28 10 2095 2107 32 Prisacaru AE. Effect of antioxidants on polyunsaturated fatty acids - review. Acta Sci Pol Technol Aliment. 2016;15(2):121-9. Prisacaru AE Effect of antioxidants on polyunsaturated fatty acids - review Acta Sci Pol Technol Aliment 2016 15 2 121 129 33 Nishikawa T, Edelstein D, Du XL, Yamagishi S, Matsumura T, Kaneda Y, et al. Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage. Nature. 2000;404(6779):787-90. Nishikawa T Edelstein D Du XL Yamagishi S Matsumura T Kaneda Y Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage Nature 2000 404 6779 787 790 34 Carillon J, Rugale C, Rouanet JM, Cristol JP, Lacan D, Jover B. Endogenous antioxidant defense induction by melon superoxide dismutase reduces cardiac hypertrophy in spontaneously hypertensive rats. Int J Food Sci Nutr. 2014;65(5):602-9. Carillon J Rugale C Rouanet JM Cristol JP Lacan D Jover B Endogenous antioxidant defense induction by melon superoxide dismutase reduces cardiac hypertrophy in spontaneously hypertensive rats Int J Food Sci Nutr 2014 65 5 602 609 35 Navarro-Arevalo A, Canavate C, Sanchez-del-Pino MJ. Myocardial and skeletal muscle aging and changes in oxidative stress in relationship to rigorous exercise training. Mech Ageing Dev. 1999;108(3):207-17. Navarro-Arevalo A Canavate C Sanchez-del-Pino MJ Myocardial and skeletal muscle aging and changes in oxidative stress in relationship to rigorous exercise training Mech Ageing Dev 1999 108 3 207 217 36 Ulker S, McMaster D, McKeown PP, Bayraktutan U. Impaired activities of antioxidant enzymes elicit endothelial dysfunction in spontaneous hypertensive rats despite enhanced vascular nitric oxide generation. Cardiovasc Res. 2003;59(2):488-500. Ulker S McMaster D McKeown PP Bayraktutan U Impaired activities of antioxidant enzymes elicit endothelial dysfunction in spontaneous hypertensive rats despite enhanced vascular nitric oxide generation Cardiovasc Res 2003 59 2 488 500 37 Peixoto EB, Pessoa BS, Biswas SK, Lopes de Faria JB. Antioxidant SOD mimetic prevents NADPH oxidase-induced oxidative stress and renal damage in the early stage of experimental diabetes and hypertension. Am J Nephrol. 2009;29(4):309-18. Peixoto EB Pessoa BS Biswas SK Lopes de Faria JB Antioxidant SOD mimetic prevents NADPH oxidase-induced oxidative stress and renal damage in the early stage of experimental diabetes and hypertension Am J Nephrol 2009 29 4 309 318 Artigo Original Os Efeitos da Trimetazidina no Prolongamento do Intervalo QT e na Hipertrofia Cardíaca em Ratos Diabéticos Ramezani-Aliakbari Fatemeh 0000-0003-2290-8565 Badavi Mohammad Dianat Mahin Mard Seyed Ali Ahangarpour Akram Centro de Pesquisas em Fisiologia e Departamento de Fisiologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Ciências Médicas Ahvaz Jundishapur, Ahvaz - Irã Correspondência: Mohammad Badavi, Centro de Pesquisa em Fisiologia do Golfo Pérsico, Departamento de Fisiologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Ciências Médicas Ahvaz Jundishapur, Ahvaz - Irã. E-mail: badavim@yahoo.com

Contribuições do autores

Concepção e concepção do estudo: Ramezani-Aliakbari F, Badavi M; Aquisição de dados: Dianat M, Mard SA, Ahangarpour A; Análise e interpretação dos dados: Dianat M, Mard SA, Ahangarpour A; Análise estatística: Ramezani-Aliakbari F, Badavi M; Obtenção de financiamento: Badavi M; Redação do manuscrito: Ramezani-Aliakbari F, Badavi M; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual: Badavi M.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

A trimetazidina (TMZ) é uma droga anti-isquêmica. Apesar de seus efeitos protetores sobre o sistema cardiovascular, não há estudos científicos sobre a utilidade do tratamento com TMZ para o intervalo QT prolongado e a hipertrofia cardíaca induzida pelo diabetes.

 Objetivo:

Avaliar os efeitos da TMZ no prolongamento do intervalo QT e na hipertrofia cardíaca em ratos diabéticos.

 Métodos:

Vinte e quatro ratos machos Sprague-Dawley (200-250 g) foram distribuídos aleatoriamente em três grupos (n = 8) pelo método de amostragem aleatória simples. Controle (C), diabético (D) e diabético administrado com TMZ a 10 mg/kg (T10). A TMZ foi administrada por 8 semanas. O ecocardiograma foi registrado antes de isolar os corações e transferir para um aparelho de Langendorff. Foram medidos os parâmetros hemodinâmicos, intervalo QT e intervalo QT corrigido (QTc), frequência cardíaca e enzimas antioxidantes. O índice de hipertrofia foi calculado. Os resultados foram avaliados pelo one-way ANOVA e pelo teste t pareado pelo SPSS (versão 16) e p < 0,05 foi considerado significativo.

 Resultados:

Os ratos diabéticos indicaram hipertrofia aumentada, intervalos QT e QTc e diminuição da pressão sistólica no ventrículo esquerdo (PSVE), pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (PDVE), duplo produto (DP), Max dp/dt e min dp/dt (± dp/dt max), frequência cardíaca, superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e catalase no coração. O tratamento com TMZ nos animais diabéticos melhorou significativamente esses parâmetros em comparação com o grupo diabético não tratado.

 Conclusões:

A TMZ melhora o prolongamento do intervalo QTc e a hipertrofia cardíaca no diabetes.

 Palavras-chave: Diabetes Mellitus Trimetazidina Cardiomegalia Eletrocardiografia Estresse Oxidativo Ratos Introdução

O diabetes está associado a distúrbios cardiovasculares e aumento da mortalidade em pacientes diabéticos.1 A estatística revela que 30 milhões de pessoas sofriam de diabetes em todo o mundo em 1985 e, recentemente, prevê-se, pela OMS, que haverá 300 milhões em 2025.2

A cardiomiopatia diabética é conhecida como alterações estruturais e funcionais do coração induzidas por diabetes, associadas à hipertrofia cardíaca, disfunção diastólica e/ou sistólica na ausência de hipertensão arterial, doenças cardíacas valvares e isquêmicas e outras alterações cardíacas.3,4

Os intervalos QT e QT corrigido (QTc) são parâmetros eletrocardiográficos considerados como preditores críticos de mortalidade e acidente vascular cerebral em pacientes diabéticos.5,6 O prolongamento patológico do intervalo QT é conhecido como um fator de risco que aumenta as arritmias ventriculares e outras doenças cardíacas. Além disso, a hipertrofia ventricular desempenha um papel importante no desenvolvimento do diabetes relacionado ao intervalo do QT prolongado.7 Um estudo anterior confirmou os efeitos negativos da hipertrofia e do prolongamento do intervalo QT na função do coração no diabetes.8 A homeostase energética é eficaz na diminuição da hipertrofia no coração.9

A trimetazidina (TMZ) é um agente antianginoso que é conhecido por melhorar o metabolismo de energia no coração submetido à isquemia.10,11 Estudos anteriores indicaram oxidação reduzida de ácidos graxos por meio da redução da atividade 3-cetoacil-CoA tiolase mitocondrial (3-KAT) na beta-oxidação pelo tratamento com TMZ.12 Outros também indicaram que a TMZ tem efeitos protetores na fibrose cardíaca resultante da sobrecarga de pressão.13 Além disso, há outras investigações mostrando que o tratamento com TMZ tem efeitos positivos sobre a função cardíaca em diabéticos com desordens cardiovasculares.14 Tomados em conjunto, estes resultados de estudos relacionados evidenciam que a TMZ tem efeitos benéficos no sistema cardiovascular. No entanto, o papel da TMZ no prolongamento do intervalo QT e na melhora da hipertrofia cardíaca no diabetes ainda é desconhecido. Portanto, o presente estudo foi realizado para avaliar os efeitos da TMZ no prolongamento do intervalo QT e hipertrofia cardíaca nos animais diabéticos.

 Métodos Químico

A TMZ, a heparina e a aloxana foram obtidas da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, E.U.A.) e a cetamina e xilazina adquiridas à Alfasan Co. (Woderen-Holland).

 Animal

Vinte e quatro ratos Sprague-Dawley machos adultos (250 ± 20 g) foram alojados sob condições padrão (20 ± 5°C, ciclo claro/escuro de 12 horas e com água e comida disponíveis) durante o período do estudo. Todos os protocolos experimentais seguiram as Diretrizes do Autor de Consenso sobre Ética e Bem-Estar Animal e as diretrizes nacionais para a realização de estudos com animais (Autorização do Comitê de Ética No. APRC-94-25 da Universidade de Ciências Médicas de Ahvaz Jundishapur, Ahvaz, Irã).15

O tamanho da amostra de cada grupo foi computado em oito pela fórmula:16

n = Z 1 − α / 2 + Z 1 − β 2 × S 1 2 + S 2 2 d 2 = 1 , 96 × 1 , 29 2 × 13 , 52 2 + 9 , 07 2 89 − 70 2 = 7 , 75 ∼ 8

onde S12 e S22 são os meios.

Os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos (n = 8) pelo método de amostragem aleatória simples. Controle (C), diabético (D) e diabético administrado com TMZ a 10 mg/kg (T10).17 A TMZ foi tratada oralmente por gavagem uma vez ao dia por 8 semanas.

 Modelo diabético

O diabetes foi induzido por administração intraperitoneal de aloxana a 120 mg/kg. Após 6 h, os animais foram tratados oralmente com solução de glicose a 10% (10 ml). Eles foram mantidos por 24 h em solução de glicose a 5% para reduzir os resultados hipoglicêmicos fatais de aloxana. Os ratos, indicando glicemia de jejum ≥ 250 mg/dl, redução do peso corporal, dislipidemia, aumento de enzimas hepáticas e sinais claros de poliúria, polifagia e polidipsia após 4 dias, foram considerados animais diabéticos e utilizados para o experimento.18

Eletrocardiografia

Os animais foram anestesiados por heparina, cetamina e xilazina (1000 U/kg, 50 e 5 mg/kg, respectivamente), o chumbo II foi registado por Bio Amp e controlado utilizando um sistema Power Lab (AD Instruments, Austrália). O intervalo QT e a frequência cardíaca foram medidos. Os intervalos QT e QTc foram calculados pela fórmula de Bazett normalizada como QTc = QT / (RR/f) 1/2, onde RR é o intervalo R - R e f = 150 ms.19,20

Isolamento dos corações

Após o registro do ecocardiograma (ECG), a canulação e a ventilação da traqueia foram realizadas com um ventilador de animais (UGO BASILE, modelo: 7025). A canulação da aorta foi realizada por uma incisão central na aorta. Os corações foram transportados para o sistema Langendorff. A perfusão do coração foi realizada por solução de Krebs-Henseleit (5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio, 37°C, pH = 7,4, 8 ml/min). Um balão de látex foi inserido no ventrículo esquerdo para a medição da pressão ventricular esquerda (PVE) pelo sistema Power Lab (AD Instruments, Austrália). A pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE) foi aproximadamente regulada em 5-10 mmHg pela alteração do volume do balão. A pressão sistólica do ventrículo esquerdo (PSVE), Max dp/dt e min dp/dt (± dp/dt máx) foram medidas.21 A pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (PDVE) e o duplo produto (DP) foram calculados pela seguinte fórmula:

PDVE = PSVE − PDFVE DP = PDVE × frequ ê ncia card í aca Medição de hipertrofia

Após avaliação dos parâmetros hemodinâmicos pelo sistema de Langendorff, os corações foram removidos e colocados em soro fisiológico, em seguida, em papel para avaliação do peso do coração. O índice de hipertrofia cardíaca (mg/g) foi calculado a partir do peso total do coração (mg) em relação ao peso corporal total (g) do rato.22

Medição de enzimas antioxidantes

Após a medição da hipertrofia, 100 mg de tecido cardíaco foram congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -70°C. As amostras de tecido foram homogeneizadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS; 50 mM a pH de 7,4) utilizando um Homogeneizador (Heidolph Silenterosher M, Alemanha) e centrifugadas a 14000 g durante 15 minutos. A avaliação dos níveis de enzimas incluindo glutationa peroxidase (GPx), catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) foi realizada no sobrenadante. A GPx e a SOD foram medidas usando kits Randox (Randox Lab, UK) e a atividade da CAT foi avaliada usando o kit Zellbio (Zellbio Lab, Ulm, Alemanha).

 Análise estatística

Os resultados foram indicados como média e desvio padrão (DP). No presente estudo, a distribuição normal dos resultados foi realizada pela análise de Kolmogorov-Smirnov. O teste one-way ANOVA e o teste Least Significant Difference (LSD) foram usados para comparação entre os vários grupos. A comparação de pré e pós-metabólicas em cada grupo foi realizada pelo teste t pareado usando o SPSS (versão 16). P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

 Resultados Parâmetros eletrocardiográficos

Os intervalos QT e QTc aumentaram significativamente nos animais diabéticos em comparação com o grupo controle (100 ± 13,80 vs. 70 ± 8,34, 82,52 ± 13,03 vs. 58,4 ± 7,33, p = 0,007 e p = 0,009, respectivamente). O tratamento com TMZ foi associado com uma redução significativa nos intervalos QT e QTc em comparação com os ratos diabéticos não tratados (80 ± 10,69 vs. 100 ± 13,80, 63,11 ± 7,05 vs. 82,52 ± 13,03, p = 0,043 e p = 0,040, respectivamente, Figura 1). Como mostrado na Tabela 1, os ratos diabéticos indicaram uma diminuição na frequência cardíaca em comparação com os ratos de controlo (198 ± 41,21 vs. 268 ± 27,99, p = 0,002). Obviamente, a administração do grupo diabético com TMZ aumentou significativamente a frequência cardíaca em comparação com os ratos diabéticos não tratados (263 ± 35,02 vs. 198 ± 41,21, p = 0,006).

Valores do Intervalo QT (a) e do intervalo QTc (b) nos grupos controle (C), diabético (D) e diabético tratado com TMZ (10 mg/kg, (T10)) oito semanas após o tratamento nos ratos. Os resultados foram apresentados como média ± DP. ## p < 0,01 comparado ao grupo controle, * p < 0,05 comparado ao grupo diabético.

Parâmetros hemodinâmicos no coração
Grupos C D T10 Valor de p D vs. C Valor de p T10 vs. D
Frequência cardíaca (batimentos/min) 268 ± 27,99 198 ± 41,21 263 ± 35,02 0,002## 0,006*
PSVE (mmHg) 75 ± 20,91 60,78 ± 16,76 79,75 ± 10,16 0,041# 0,028*
PDVE (mmHg) 74,37 ± 18,76 56 ± 18,37 74,25 ± 9,93 0,030# 0,031*
DP (mmHg) 14.965 ± 5.582 10.184 ± 4.589 14.099 ± 3.859 0,041# 0,049*
Max +dp/dt(mmHg) 2.294 ± 255,27 1.035 ± 370,33 1.727 ± 410,60 < 0,001### 0,001**
Min -dp/dt (mmHg) -1.220 ± 229,09 -594,77 ± 210 -962 ± 194 < 0,001### 0,002**

(média ± DP, n = 8) no controle (C), diabético (D) e diabético tratado com TMZ (T10), (one-way ANOVA seguido de teste post hoc de LSD). PSVE: pressão sistólica do ventrículo esquerdo; PDVE: pressão desenvolvida do ventrículo esquerdo (PDVE); DP: duplo produto pressórico; DP: desvio-padrão.

 Marcadores da função cardíaca

No final do experimento, PSVE, PDVE, ± dp/dt max e DP foram observados significativamente menores no grupo diabético que no grupo controle. No entanto, a administração da TMZ durante 8 semanas foi associada a um aumento significativo destes parâmetros em comparação com os ratos diabéticos não tratados (Tabela 1).

 Efeito da TMZ na hipertrofia miocárdica

Como indicado, o índice de hipertrofia aumentou significativamente nos ratos diabéticos em 8 semanas em comparação com o grupo controle (56,62 ± 6,50 vs. 48,62 ± 7,90, p = 0,039). De acordo com nossos achados, nos ratos diabéticos, a administração com TMZ diminuiu notavelmente o índice de hipertrofia quando comparado aos ratos diabéticos (41,87 ± 7,50 vs. 56,62 ± 6,50, p < 0,001, Figura 2).

Valor da hipertrofia nos grupos controle (C), diabético (D) e diabético tratado com TMZ (T10) oito semanas após o tratamento nos ratos. Os resultados foram apresentados como média ± DP. # p < 0,05 comparado ao grupo controle, *** p < 0,001 comparado ao grupo diabético não tratado.

Efeito da TMZ nas enzimas antioxidantes

Como indicado na Tabela 2, enzimas antioxidantes, GPx, CAT e SOD diminuíram significativamente no coração de animais diabéticos em comparação com o grupo controle (p < 0,001, p = 0,002, respectivamente). No entanto, a administração oral com TMZ foi significativamente melhorada GPx, CAT e SOD (p < 0,001, p < 0,049, respectivamente).

Atividades das enzimas antioxidantes
Grupos C D T10 Valor de p D vs. C Valor de p T10 vs. D
SOD (U/dl) 8,46 ± 1,51 5,86 ± 0,69 7 ± 1,54 0,002## 0,049*
CAT (U/ dl) 10,52 ± 0,60 1,90 ± 4,08 10,71 ± 0,50 0,002## < 0,001***
GPx (U/ dl) 28,50 ± 2,67 13,22 ± 0,95 24,03 ± 1,73 < 0,001### < 0,001***

(Média ± DP, n = 8) no controle (C), diabético (D) e diabético tratado com TMZ (T10), (one-way ANOVA seguido de teste post hoc de LSD). SOD: superóxido dismutase; CAT: catalase; GPx: glutationa peroxidase.

 Discussão

Nossos resultados indicaram que a injeção de aloxana aumentou significativamente os intervalos QT e QTc e diminuiu a frequência cardíaca, PSVE, PDVE, DP, ± dp/dt max e hipertrofia cardíaca, SOD, GPx e CAT no coração dos ratos diabéticos quando comparado com o grupo controle. No entanto, o tratamento com TMZ foi capaz de melhorar significativamente os intervalos QT e QTc, frequência cardíaca, parâmetros hemodinâmicos, SOD, CAT e hipertrofia. Estudos prévios demonstraram que o diabetes está associado às alterações do intervalo QTc eletromecânico e prolongado no coração.23

As disfunções diastólica e sistólica são as manifestações mais precoces no desenvolvimento da cardiomiopatia diabética.24 Os índices ± dp/dt máx, PSVE, PDVE, DP, diastólica e sistólica cardíaca são amplamente utilizados para avaliar a função cardíaca. Os ratos diabéticos induzidos por aloxana progrediram disfunção cardíaca como demonstrado por uma diminuição significativa em ± dp/dt, PSVE, PDVE e DP. O tratamento com TMZ, por sua vez, melhorou cada um desses parâmetros.

Em nosso modelo de diabetes tipo 1, o ECG indicou QTc prolongado, um achado que é consistente com estudos anteriores. O tratamento com TMZ diminuiu significativamente essas dispersões de QT e QTc. Esse resultado está de acordo com relatos anteriores que indicam que o tratamento com TMZ melhora o prolongamento do intervalo QT em indivíduos com distúrbios renais.25,26

No presente estudo, também observamos que o diabetes levou à bradicardia nos animais diabéticos. É revelado que nos ratos diabéticos a frequência cardíaca tende a diminuir após oito semanas.27 Por outro lado, o diabetes aumenta o tônus vagal e diminui o tônus simpático em ratos diabéticos.28 Além disso, o tratamento com TMZ melhora o tônus autonômico em indivíduos com a SCA.29 A melhora nos tônus simpático e parassimpático pode explicar parcialmente o aumento da frequência cardíaca em ratos diabéticos tratados com TMZ.

A cardiomiopatia diabética está associada à hipertrofia e disfunção cardíaca. A glicemia elevada e o estresse oxidativo podem ser considerados fatores críticos que envolvem a hipertrofia e a disfunção do coração.30 No presente estudo, os ratos diabéticos apresentaram hipertrofia cardíaca demonstrada pelo aumento da relação coração-peso/peso corporal. Resultados semelhantes têm sido indicados em estudos anteriores.31 Está bem estabelecido que, o aumento do VLDL-c e a diminuição dos níveis de HDL-c podem resultar em redução do sistema de defesa antioxidante.27 Em um estudo anterior, foi indicado que o comprometimento dos níveis do perfil lipídico em animais diabéticos podem ser atribuídos ao aumento da degradação lipídica e a liberação de grande quantidade de ácidos graxos livres.17 Os ácidos graxos livres liberados são suscetíveis à oxidação, resultando em diminuição do nível de antioxidantes e do sistema de defesa antioxidante.32 O aumento do nível de oxidação de ácidos graxos no coração diabético leva ao acúmulo de lipídios e hipertrofia cardíaca.33 A redução na oxidação de ácidos graxos e no estresse oxidativo pelo tratamento com TMZ pode parcialmente atribuir à melhora da hipertrofia cardíaca.

Estudos anteriores mostraram que o nível de SOD reduziu no diabetes tipo 1 e foi demonstrado que o aumento das espécias reativas de oxigênio (ERO) está negativamente associado com os valores das enzimas antioxidantes, como o SOD e GPx.34 O SOD altera rapidamente O2 para H2O2, o que é ainda mais destruído através da GPx e CAT. Os níveis de enzimas antioxidantes são sensíveis ao stress oxidativo, e os valores melhorados ou reduzidos foram indicados em várias patologias, em que um aumento das ERO é uma causa ou resultado do distúrbio, tais como diabetes.35,36 Além disso, os ânions superóxidos e as ERO também foram indicados para contribuir para hipertrofia cardíaca resultante de vários estímulos; portanto o SOD é uma defesa primária contra o estresse oxidativo que envolve a hipertrofia do coração.37 Os nossos resultados indicaram que os níveis de SOD e CAT em corações de ratos diabéticos tratados com TMZ foi significativamente maior do que nos animais diabéticos não tratados. Os valores de GPx foram ligeiramente, mas não significativamente mais, nos corações de animais diabéticos tratados com TMZ em comparação com os ratos diabéticos.

Em conjunto, esses achados indicaram que os ratos diabéticos mostraram hipertrofia e disfunção no coração, bem como aumento do dano oxidativo cardíaco em comparação com os animais controle, mostrando que esses fatores indesejáveis estão conectados. A TMZ provavelmente melhorou esses fatores pelos efeitos antioxidantes. Com base nos resultados do presente estudo, mais estudos precisam ser realizados para avaliar os mecanismos envolvidos na melhora da hipertrofia e distúrbios cardiovasculares decorrentes da diabetes usando o tratamento com TMZ.

 Conclusões

Todas estas observações mostram que o tratamento com TMZ contribui para a melhoria da função prejudicada e da atividade elétrica, bem como hipertrofia do coração na cardiomiopatia diabética em ratos. Melhorias observadas no tratamento com TMZ estão associadas à diminuição do estresse oxidativo.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pelo Centro de Pesquisas em Fisiologia da Universidade de Ciências Médicas de Ahvaz Jundishapur (No. APRC-94-25).

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Fatemeh Ramezani-Aliakbari pela Physiology Research Center of Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences sob o número de protocolo APRC-94-25.