Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC H9kjqKsR8NNvYkCXdGzZTSJ S0066-782X2019000100067 S0066-782X2018005018102 10.5935/abc.20190001 Original Article Sex-Related Effects of Prenatal Stress on Region-Specific Expression of Monoamine Oxidase A and β Adrenergic Receptors in Rat Hearts Jevdjovic Tanja 1 Dakic Tamara 1 Kopanja Sonja 2 Lakic Iva 1 Vujovic Predrag 1 Jasnic Nebojsa 1 Djordjevic Jelena 1 University of Belgrade Faculty of Biology Belgrado Sérvia Faculty of Biology - University of Belgrade, Belgrado - Sérvia Medical University of Vienna Department of Pediatrics and Adolescent Medicine Viena Áustria Department of Pediatrics and Adolescent Medicine - Medical University of Vienna, Viena - Áustria Mailing Address: Tanja Jevjdovic, Studentski trg 16, 11000, Belgrade - Sérvia. E-mail: tanja.jevdjovic@bio.bg.ac.rs, tanja.jevdjovic@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research, statistical analysis and writing of the manuscript: Jevjdovic T; acquisition of data: Dakic T, Kopanja S; analysis and interpretation of the data: Jevjdovic T, Dakic T, Kopanja S, Lakic I, Vujovic P; o btaining financing: Djordjevic J; critical revision of the manuscript for intellectual content: Lakic I, Vujovic P, Jasnic N, Djordjevic J.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 13 12 2018 1 2019 112 1 67 75 01 02 2018 14 06 2018 23 07 2018 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Prenatal stress may increase risk of developing cardiovascular disorders in adulthood. The cardiotoxic effects of catecholamines are mediated via prolonged adrenergic receptor stimulation and increased oxidative stress upon their degradation by monoamine oxidase A (MAO-A).

 Objectives:

We investigated long-term effects of prenatal stress on β (1, 2, 3) adrenergic receptors and MAO-A gene expression in the hearts of adult rat offspring.

 Methods:

Pregnant rats were exposed to unpredictable mild stress during the third week of gestation. RNA was isolated from left ventricular apex and base of adult offspring. Quantitative PCR was used to measure gene expression in collected ventricular tissue samples. The level of significance was set to p < 0.05.

 Results:

β3 adrenergic receptor mRNA was undetectable in rat left ventricle. β1 adrenergic receptor was the predominantly expressed subtype at the apical and basal left ventricular myocardium in the control females. Male offspring from unstressed mothers displayed higher apical cardiac β1 than β2 adrenergic receptor mRNA levels. However, β1 and β2 adrenergic receptor mRNAs were similarly expressed at the ventricular basal myocardium in males. Unlike males, prenatally stressed females exhibited decreased β1 adrenergic receptor mRNA expression at the apical myocardium. Prenatal stress did not affect cardiac MAO-A gene expression.

 Conclusions:

Collectively, our results show that prenatal stress may have exerted region- and sex-specific β1 and β2 adrenergic receptor expression patterns within the left ventricle.

 Keywords: Pregnancy Stress, Physiological Oxidative Stress Heart Catecholamines Rats Sex Female Cardiotoxicity Adrenergic beta1 beta2 Receptor Antagonists Ministry of Education, Science and Technological Development, Republic of Serbia 173023 This study was funded by The Ministry of Education, Science and Technological Development, Republic of Serbia (grant number: 173023). Introduction

Emerging data from epidemiological and experimental studies have pointed out that disturbed intrauterine environment is related to the increased risk of developing pathologies later in life. Increased susceptibility to adult hypertension has been observed in offspring prenatally exposed to unbalanced maternal nutrition,1-3 synthetic glucocorticoids,4 or maternal stress.5 It has long been recognized that exposure to prenatal stress results in enhanced hypothalamo-pituitary-adrenal (HPA) axis and sympathetic nervous system (SNS) activity in adulthood.6,7

The hallmark of cardiovascular disorders is dysregulated SNS activity. Hence, it is not surprising that the key pharmaceutical targets in the management of these disorders are mostly modulators of adrenergic receptor activity. Cardiotoxic effects of catecholamines are mainly mediated via persistent or acute over-stimulation of β adrenergic receptors (ADRB).8 A healthy human heart expresses three ADRB subtypes, with ADRB1 being the most and ADRB3 the least abundant.9,10 Downregulation in the ADRB1 subpopulation is one of the molecular features of cardiac pathologies, such as human heart failure.9,11 Furthermore, animal transgenic studies demonstrated that early effects of ADRB2 overexpression led to increased cardiac contractility.12 However, later in life these transgenic animals developed ventricular dysfunction.13 Furthermore, another myocardial pathological condition triggered by high circulating catecholamines is defined by a region-specific, mostly apical, contractile dysfunction within the left ventricle.14

Additionally, cardiotoxicity may result from the production of reactive oxidative species (ROS) upon catecholamine degradation by monoamine oxidase A (MAO-A) in the heart.15 Cardiac MAO-A expression and activity is increased in different animal models of heart failure16-18 and aging.19

Epidemiological studies showed that female and male patients suffering from cardiovascular disease exhibit differential responsiveness to diverse recommended treatments,20,21 emphasizing the necessity to include both sexes in cardiovascular research.

In order to better understand molecular mechanisms by which prenatal stress may potentially contribute to the development of cardiovascular diseases in adulthood, the present study was designed to investigate region-specific gene expression of adrenergic receptor subtypes (ADRB1, ADRB2 and ADRB3) and MAO-A in the left ventricular myocardium of female and male offspring.

 Methods Animals

Three-month-old virgin female Wistar rats (266 ± 11.9 g) were housed with free access to food and water under constant light-dark cycle (12 h) in temperature-controlled conditions (22 ± 1°C) in the animal facility of the Faculty of Biology, University of Belgrade. Sample size was determined by convenience, and each of six pairs of female rats was caged with a sexually experienced male during a whole oestrus cycle. Day 0 of pregnancy was marked by appearance of sperm in vaginal smear. One female remained non-pregnant. To avoid selection bias, pregnant females who were mated with the same male were randomly assigned to control (n = 5) or stressed (n = 6) group and housed individually. All procedures were conducted according to the rules for animal care proposed by the Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA), and approved by the Ethics Committee of the Faculty of Biology, University of Belgrade.

 Prenatal stress protocol

During the third week of gestation (gestational day 13-20, GD13-GD20) pregnant rats were exposed to a chronic unpredictable mild stress (CUMS) protocol that included random and intermittent exposure to a variety of stressors. Detailed CUMS protocol is shown in Table 1. Briefly, animals were exposed to the following stressors in random order twice a day for 1 h or overnight: damp bedding, restraint in a Plexiglas(r) tube, cold room (4°C), cage displacement and noise, overnight illumination, and cage tilt. Control mothers were left undisturbed for the duration of their pregnancies with the exception of general handling. During the entire pregnancy, water and food intake were recorded.

Stress regime
10:00-11:00 14:00-15:00 18:00-08:00
GD14 Restraint Damp bedding Cage tilt
GD15 Cold room (4ºC) Displacement and noise Continuous illumination
GD16 Damp bedding Restraint Cage tilt
GD17 Displacement and noise Cold room (4ºC) Continuous illumination
GD18 Restraint Damp bedding Cage tilt
GD19 Cold room (4ºC) Displacement and noise Continuous illumination
GD20 Damp bedding Restraint Cage tilt

* GD: gestational day.

 Biochemical assays

Before first and after last exposure to the stressor, blood was collected from dam's tail vein in EDTA-containing tubes. Adrenocorticotropic hormone (ACTH) plasma levels were measured with a CLIA kit and glucose levels were measured with an Exac-tech glucose analyzer using Dextrostix reagent strips, both according to the manufacturers' instructions.

 Litters

At birth pups were counted and weighed, and litters were adjusted to eight pups with an equal number of males and females to avoid effects of litter size and litter sex-distribution on development. All pups were raised by their biological mothers. The offspring were weaned at 28 days, separated by gender and housed in groups of two per cage, according to the experimental group (C- offspring from unstressed mothers, PS- offspring from stressed mothers). Offspring's body weight and water and food consumption were recorded during both pre- and post-weaning periods. The offspring were sacrificed by decapitation at two months of age. To avoid oestrus cycle dependent fluctuations, female offspring were sacrificed in dioestrus, as confirmed by vaginal smears.

 RNA isolation

Total RNA from the basal and apical portions of the left ventricles was isolated using TRI Reagent (Sigma, Germany) according to manufacturer instructions. Total RNA concentrations were quantified by absorbance measurements at 260 and 280 nm using a spectrophotometer (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech, USA) according to manufacturer instructions. RNA quality was analyzed on 1.5% agarose gel containing ethidium bromide and visualized by UV transillumination (ChemiDoc-It imager, UVP, Germany).

 cDNA synthesis and quantitative real-time PCR

RNA samples (2 µg) were subjected to DNase I treatment, using rDNase I, according to manufacturer protocol (DNA-free kit, Ambion, USA). Ready-to-go You-Prime First-Strand beads transcription kit (GE Healthcare, USA) was used to generate cDNA for subsequent quantitative real-time PCR. Samples without reverse transcriptase were used to control for possible contamination of gDNA. All reactions were carried out in duplicate, using 1x TaqMan Master Mix (Applied Biosystems) and 1x TaqMan expression assays for each gene (Table 2: Adrb1, Adrb2, Adrb3, MaoA, ActB), with 2 µg of cDNA template in a total volume of 20 µl.

TaqMan expression assays
Gene TaqMan assay ID
Beta 1 adrenergic receptor (Adrb1) Rn00824536_s1
Beta 2 adrenergic receptor (Adrb2) Rn00560650_s1
Beta 3 adrenergic receptor (Adrb3) Rn01478698_g1
Monoamine oxidase A (Maoa) Rn01430955_A1
Beta-actin (Actb) Rn01412977_g1

Real-time PCR reactions were performed on an Applied Biosystem 7900 Real-Time PCR System with standard PCR conditions (50°C for 2 min; 95°C for 10 min; 95°C for 15 s, and 60°C for 1 min for 40 cycles). The relative gene expression levels were determined by comparative 2ˆ(- ΔΔCT) quantification method22 using beta-actin as the reference gene.

 Statistical analysis

Statistical analysis was performed using GraphPad Prism Software-version 6.01 (San Diego, USA). Parameters measured in mothers and offspring were expressed as means ± standard deviation (SD). Data were analyzed by unpaired Student's t-test, unless otherwise indicated. Offspring data obtained by real-time PCR analysis were expressed as median with interquartile range. Two-way ANOVA analysis with Bonferroni's multiple comparison test was used to examine the effect of prenatal stress and pregnancy on maternal serum ACTH levels as well as the effects of prenatal stress on ADRB genes expression patterns in examined regions of offspring's left ventricle. The statistical significance of differences among the real-time PCR data obtained from experimental groups was evaluated by nonparametric Mann-Whitney U-test. The level of significance was set to p < 0.05.

 Results Effects of CUMS on maternal and offspring parameters

In order to determine whether the stress protocol applied activated HPA axis in pregnant females, maternal plasma ACTH levels were evaluated. Prior to the start of the stress protocol (GD13), maternal plasma ACTH levels were not significantly different between experimental groups (Figure 1). Following random and intermittent exposure of the pregnant female rats to a variety of stressors during the third week of gestation (GD13-21), maternal plasma ACTH levels increased compared to control pregnant females (Figure 1, p < 0.001, 2-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test). Additionally, in the group of stressed mothers, following exposure to diverse stressors, plasma ACTH levels increased compared to GD13 suggesting that HPA axis was activated in this experimental group (Figure 1, p < 0.001, 2-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test).

Maternal plasma ACTH concentrations before (GD13) and following (GD21) exposure to CUMS during pregnancy. Data are expressed as mean ± SD, control group (open bars, n =5), stressed group (black bars, n = 6). In the stressed group on GD21 two samples were excluded due to hemolysis. ***p < 0.001, 2-way ANOVA and Bonferroni's multiple comparison test

CUMS did not affect maternal weight gain during the last week of pregnancy (Table 3) or water and food intake throughout pregnancy (data not shown). Maternal blood glucose levels were similar in both experimental groups before and after application of the CUMS protocol (Table 3). There was no effect of prenatal stress on litter size or offspring sex ratio (Table 3). Maternal stress during the last week of pregnancy did not affect offspring birth weight or weight gain during either pre- or post-weaning periods (Table 4).

Maternal weight before treatment, maternal weight gain during last week of pregnancy (GD13-GD21), gestation length, maternal blood glucose level before and after stress exposure, litter size, and sex ratio
Variable Control (n = 5) Stressed (n = 5) p
Maternal weight before treatment (g) 347 ± 37.3 337 ± 40.2 0.6646
Maternal weight gain (g) 62.5 ± 4.43 50.5 ± 11.6 0.0872
Gestation length (days) 22.0 ± 0.71 22.2 ± 0.41 0.6355
Blood glucose levels (mM) before stress (GD13) 5.44 ± 0.21 5.55 ± 1.00 0.8162
Blood glucose levels (mM) after stress (GD21) 5.30 ± 0.42 5.63 ± 0.69 0.3737
Litter size 11.2 ± 2.77 11.8 ± 2.32 0.6891
Sex ratio 1.38 ± 0.4 1.18 ± 0.3 0.3805

GD13: gestational day 13; GD21: gestational day 21; Data are expressed as means ± standard deviation (SD).

 Offspring weight at birth, postnatal day 28 (PND28) and 60 (PND60)
Variable C PS p
Birth weight (g) Group 6.67 ± 0.904 6.39 ± 0.685 0.1562
Weight at PND28 (g) Group 94.5 ± 11.4 96.9 ± 13.2 0.6360
Male 96.8 ± 12.3 94.5 ± 10.3 0.7286
Female 92.2 ± 11.1 99.3 ± 16.2 0.3924
Weight at PND60 (g) Group 316 ± 50.9 317 ± 70.5 0.9790
Male 355 ± 29.7 377 ± 42.7 0.3354
Female 277 ± 33.6 257 ± 21.7 0.2454

C: offspring from unstressed mothers; PS: offspring from stressed mothers; PND28: postnatal day 28; PND60: postnatal day 60; Number of animals (n): n = 5-8 per group. Data are expressed as means ± standard deviation (SD).

 Effects of prenatal stress on regional ADRB subtype gene expression in left ventricle of female and male

Using quantitative PCR analysis, relative mRNA levels of ADRB1, ADRB2, and ADRB3 were examined at the apical and the basal region of left ventricle harvested from control (C) and prenatally stressed (PS) adult female and male offspring.

ADRB3 mRNA was undetectable at the examined regions of the left ventricle in male and female offspring.

We detected higher ADRB1 mRNA expression at the apex and the base of left ventricle from control female offspring, in comparison to ADRB2 mRNA levels (Figure 2A and 2C, approx. ADRB1:ADRB2 = 73%:23%, p < 0.01). Decreased apical ADRB1 mRNA levels were detected in PS females compared to control animals (Figure 2A, p = 0.048). Additionally, in PS females, we observed a trend of increase in apical ADRB2 mRNA levels compared with control. Since these changes resulted in the loss of differential ADRB subtype expression levels at the apical myocardium of PS females, two-way ANOVA analysis was performed. ANOVA test revealed significant interaction between prenatal treatment and receptor subtype expression levels (F(1,20) = 6.817, p = 0.0167). Altogether, these results indicate that prenatal stress differently affected ADRB1 and ADRB2 at the apical myocardium of female animals. Furthermore, we observed a trend of decrease in basal ADRB1 mRNA levels of PS females compared with control (Figure 2C p = 0.3434), such that basal myocardium of PS females did not display differential ADRB1 and ADRB2 mRNA expression pattern compared with control animals. One cannot exclude the effect of limited sample size to detect significant differences in ADRB gene expression between control and PS groups. Further research will be necessary to obtain a more detailed understanding of the underlying mechanisms resulting in altered gene expression pattern of basal cardiac adrenergic receptors of PS females.

Effects of prenatal stress on expression of beta 1 (ADRB1) and beta 2 (ADRB2) adrenergic receptors mRNA at the apex and base of the left ventricle in the offspring (LV). Results are presented for female (A and C) and male (B and D) offspring from unstressed (control-C) and stressed mothers (prenatal stress-PS). Data are expressed as median with interquartile range (number of animals per group, n = 5-8 per group). *p < 0.05; **p < 0.01, Mann-Whitney U-test

Male offspring from unstressed mothers, similar to female offspring, displayed higher ADRB1 than ADRB2 mRNA levels at the apex of left ventricle (Figure 2B, p = 0.0087). However, differently from female offspring, prenatal stress did not affect the predominant apical ADRB1 mRNA expression pattern of left ventricle in male offspring (Figure 2B). On the other hand, we detected similar ADRB1 and ADRB2 mRNA expression levels at the base of the left ventricle in control and PS male offspring (Figure 2D).

 Effects of prenatal stress on regional MAO-A gene expression in left ventricle of female and male offspring

Prenatal stress did not significantly affect MAO-A mRNA expression at either apical or basal region of left ventricle in female and male offspring (Figure 3). Based on our results we observed a trend toward higher relative expression of MAO-A at the basal myocardium compared to the apical region of the left ventricle in male offspring (approximately 35-fold in control and 17.5-fold in PS animals, Figure 3B, D). Additionally, basal cardiac MAO-A demonstrated a trend toward higher expression in males than in females (Figure 3C, D, approximately, 4.7-fold between control groups and 5.1-fold between PS groups).

Effects of prenatal stress on monoamine oxidase A (MAO-A) mRNA at the apex and base of the left ventricle (LV) in the offspring. Results are presented for female (A and C) and male (B and D) offspring from unstressed (control-C) and stressed mothers (prenatal stress-PS). Data are expressed as median with interquartile range (number of animals per group, n = 5-8).

Discussion

Cardiovascular diseases are the leading cause of morbidity and mortality worldwide.23 It has been shown that various disturbances of fetal development may contribute to development of cardiovascular disorders in adulthood. Offspring from stressed mothers or mothers undergoing glucocorticoid therapy during pregnancy display various neuroendocrine and behavioral alterations during adulthood.24-26

This study examined expression of ADRB subtypes and MAO-A in different regions of the left ventricle in the offspring of both sexes prenatally exposed to maternal stress.

We applied stress protocol to pregnant rat females that could potentially mimic everyday life stress that pregnant females are exposed to. Our stress protocol involved chronic exposure to various mild stressors which prevents habituation, which can be observed after repeated exposure to the same stressor.27 Plasma ACTH level was increased in stressed mothers compared to pregnant unstressed rats, which indicated that HPA axis activity of pregnant females was increased by the CUMS protocol, which is consistent with previous studies.28,29 We did not observe any significant difference in metabolic parameters such as maternal weight gain during pregnancy, water and food consumption, or blood glucose level between stressed and unstressed mothers. Nor did maternal stress during the last week of pregnancy affect litter size or birth weight. Taken together, these results imply that our model of CUMS was potent enough to induce a stress response in pregnant rats but did not affect offspring weight, which is known to be one of the risk factors for development of adult cardiovascular disorders.2

To the best of our knowledge, this is the first study to report relative gene expression levels of beta-adrenergic receptor subtypes in two different regions within rat left ventricle. Our results show that ADRB1 is the predominantly expressed subtype of the cardiac ADRB population at apical and basal myocardium of left ventricle in female rat offspring from unstressed mothers. We also detected higher expression of ADRB1 compared to ADRB2 mRNA levels at the apical ventricular region in the control male offspring. Indeed, several human and other animal studies have demonstrated higher ADRB1 than ADRB2 density in left ventricle.30-34 However, our results are not in accordance with the findings reported by Paur et al.,35 who used radioligand binding-displacement assays. They demonstrated increased ADRB2:ADRB1 ratio in the apical cardiomyocytes isolated from adult male Sprague Dawley rats. This discrepancy may be accounted for by different methods and model systems. Differently from in female offspring, ADRB1 and ADRB2 mRNA levels were similarly expressed in the left ventricular basal myocardium in male rat offspring. We did not detect ADRB3 mRNA in rat left ventricle.

Our results suggest that there are sex- and region-specific gene expression representations of ADRB subpopulations within left ventricular rat myocardium. Additionally, data from our study indicate that prenatal stress may have affected ARB1 and ARB2 gene expression pattern at the apical region of the left ventricle in female offspring, but not in male offspring. Disturbed representation of cardiac adrenergic receptors subtypes has been described in cardiovascular pathologies. Heart failure is characterized by altered ADRB1:ADRB2 ratio, in part due to the decreased ADRB1 protein and mRNA within left ventricle.11,36 The nonselective reduction of beta-adrenergic receptor subpopulations was also observed in the heart of both aged animals37 and elderly patients.31,34 Our results indicate that prenatal stress resulted in decreased apical ADRB1 mRNA expression suggesting that apical myocardial region of the female rat offspring might be sensitive to stress exposure during fetal life. Interestingly, higher sensitivity of the apical region within left ventricle to stress during adulthood has been described in Takotsubo (stress-induced) cardiomyopathy.35,38 Moreover, this syndrome is predominantly diagnosed in women.38

Another protein that is involved in the sympathetic modulation of cardiac function is MAO-A. This enzyme catalyses the oxidation of monoamines during which ROS is produced and may contribute to the pathogenesis of cardiovascular diseases.15 To the best of our knowledge this is the first study to investigate the effects of prenatal stress on cardiac MAO-A gene expression in the offspring. In the present study we did not detect significant changes in the MAO-A mRNA levels in the prenatally stressed heart of either sex.

There are several limitations to this study. As mentioned above we cannot exclude the effect of limited sample size on detecting additional significant differences in region specific gene expression of myocardial beta-adrenergic receptor subpopulations. The mechanism for decreased apical myocardial ADRB1 mRNA expression in prenatally stressed female, but not male, offspring is unknown. We can only hypothesize based on available literature that sex hormones might have an effect. Thus, it would be of interest to investigate earlier developmental stages of prenatally stressed offspring. Furthermore, we did not compare cardiac expression levels of MAO-A between male and female offspring. However, based on the relative expression levels of MAO-A, we can hypothesize that our results suggest that cardiac MAO-A exhibits a sex dimorphic gene expression pattern, which is likely expressed more abundantly in the heart of male rats than in female rats. As MAO-A is a main source of hydrogen peroxide in the heart, our observation would be in agreement with the reported lower production of hydrogen peroxide in cardiac mitochondria of female, compared to male Wistar rats.39

Conclusions

In summary, our data suggest that prenatal stress may exert, already at young adult age, sex-specific changes in apical and basal cardiac adrenergic receptor subpopulations in offspring. Whether these changes correlate with diminished cardiac performance and predispose organisms to develop cardiovascular diseases during their lifetime remains to be determined in future experiments.

Sources of Funding

This study was funded by The Ministry of Education, Science and Technological Development, Republic of Serbia (grant number: 173023).

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Tanja Jevjdovic, from Faculty of Biology, University of Belgrade.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee on Animal Experiments of the FELASA), and approved by the Ethics Committee of the Faculty under the Protocol number is EK-BF-2015/25.

Erratum

In “Sex–Related Effects of Prenatal Stress on Region- Specific Expression of Monoamine Oxidase A and B Adrenergic Receptors in Rat Hearts”, consider Tanja Jevdjovic as the correct form for the name of the author Tanja Jevjdovic.

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Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 2008;5(1):22-9. Lyon AR Rees PS Prasad S Poole-Wilson PA Harding SE Stress (Takotsubo) cardiomyopathy--a novel pathophysiological hypothesis to explain catecholamine-induced acute myocardial stunning Nat Clin Pract Cardiovasc Med 2008 5 1 22 29 39 Colom B, Oliver J, Roca P, Garcia-Palmer FJ. Caloric restriction and gender modulate cardiac muscle mitochondrial H2O2 production and oxidative damage. Cardiovasc Res. 2007;74(3):456-65. Colom B Oliver J Roca P Garcia-Palmer FJ Caloric restriction and gender modulate cardiac muscle mitochondrial H2O2 production and oxidative damage Cardiovasc Res 2007 74 3 456 465 Artigo Original Efeitos Sexo-Específicos de Estresse Pré-Natal na Expressão Região-Específica de Monoamina Oxidase A e Receptores Adrenérgicos Β no Coração de Ratos Jevjdovic Tanja 1 Dakic Tamara 1 Kopanja Sonja 2 Lakic Iva 1 Vujovic Predrag 1 Jasnic Nebojsa 1 Djordjevic Jelena 1 Faculty of Biology - University of Belgrade, Belgrado - Sérvia Department of Pediatrics and Adolescent Medicine - Medical University of Vienna, Viena - Áustria Correspondência: Tanja Jevjdovic, Studentski trg 16, 11000, Belgrado - Sérvia. E-mail: tanja.jevdjovic@bio.bg.ac.rs, tanja.jevdjovic@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa, análise estatística e redação do manuscrito: Jevjdovic T; obtenção de dados: Dakic T, Kopanja S; análise e interpretação dos dados: Jevjdovic T, Dakic T, Kopanja S, Lakic I, Vujovic P; obtenção de financiamento: Djordjevic J; revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Lakic I, Vujovic P, Jasnic N, Djordjevic J.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

Estresse pré-natal pode aumentar os riscos de desenvolver doenças cardiovasculares na idade adulta. Os efeitos cardiotóxicos de catecolaminas são mediados pela estimulação prolongada dos receptores adrenérgicos e pelo aumento do estresse oxidativo após sua degradação pela monoamina oxidase A (MAO-A).

 Objetivos:

Investigamos os efeitos a longo prazo de estresse pré-natal nos receptores β (1, 2, 3) adrenérgicos e na expressão do gene MAO-A nos corações da prole adulta de ratos.

 Método:

Ratas prenhes foram expostas a estresse crônico moderado imprevisível durante a terceira semana de gestação. O RNA foi isolado do ápice e da base do ventrículo esquerdo da prole adulta. Utilizou-se PCR quantitativa em tempo real para medir a expressão gênica nas amostras de tecido ventricular coletadas. O nível de significância foi estabelecido em p < 0,05.

 Resultados:

Foi indetectável o mRNA do receptor adrenérgico β3 no ventrículo esquerdo dos ratos. O receptor adrenérgico β1 foi o subtipo mais expresso no miocárdio ventricular esquerdo apical e basal nas fêmeas controle. A prole masculina das mães não estressadas apresentou níveis cardíacos apicais de mRNA do receptor adrenérgico β1 mais altos do que os de β2. Porém, mRNAs dos receptores adrenérgicos β1 e β2 foram expressos de forma semelhante no miocárdio basal ventricular na prole masculina em geral. Ao contrário da prole masculina, a prole feminina exposta ao estresse pré-natal exibiu uma expressão diminuída do mRNA do receptor adrenérgico β1 no miocárdio apical. O estresse pré-natal não afetou a expressão gênica de MAO-A cardíaca.

 Conclusões:

Coletivamente, nossos resultados mostram que estresse pré-natal pode ter exercido padrões de expressão região- e sexo-específica dos receptores adrenérgicos β1 e β2 no ventrículo esquerdo.

 Palavras-chave: Gravidez Estresse Fisiológico Estresse Oxidativo Coração Catecolaminas Ratos Sexo Feminino Cardiotoxicidade Antagonistas dos Receptores B1 B2 Ministério da Educação, Ciência e Desenvolvimento Tecnológico, República da Sérvia 173023 O presente estudo foi financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Desenvolvimento Tecnológico, República da Sérvia (número da bolsa: 173023). Introdução

Dados recentes de estudos epidemiológicos e experimentais apontam que distúrbios no ambiente intrauterino estão relacionados ao aumento do risco de desenvolver patologias mais tarde na vida. Observou-se um aumento na suscetibilidade à hipertensão adulta em prole prenatalmente exposta a nutrição materna desequilibrada,1-3 glicocorticóides sintéticos,4 ou estresse materno.5 Reconhece-se há muito tempo que exposição a estresse pré-natal resulta em aumento na atividade do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) e do sistema nervoso simpático (SNS) na idade adulta6,7

Atividade desregulada do SNS é uma característica marcante de distúrbios cardiovasculares. Portanto, não é surpreendente que os principais alvos farmacêuticos no manejo desses distúrbios sejam principalmente moduladores da atividade dos receptores adrenérgicos. Os efeitos cardiotóxicos das catecolaminas são mediados principalmente por superestimulação persistente ou aguda dos receptores adrenérgicos β (ADRB).8 São presentes três subtipos de ADRB no coração humano saudável, sendo o ADRB1 o mais comum e ADRB3 o menos.9,10 Na subpopulação ADRB1, a regulação negativa é uma das características moleculares das patologias cardíacas, como a insuficiência cardíaca humana.9,11 Além disso, estudos com animais transgênicos demonstram que os efeitos iniciais da superexpressão do ADRB2 levam ao aumento da contratilidade cardíaca.12 Porém, mais tarde na vida esses animais transgênicos desenvolveram disfunção ventricular.13 Além disso, outra condição patológica miocárdica desencadeada por catecolaminas circulantes elevadas é definida por uma disfunção contrátil específica da região, principalmente apical, dentro do ventrículo esquerdo.14

Adicionalmente, a cardiotoxicidade pode resultar da produção de espécies reativas do oxigênio (ROS) na degradação de catecolaminas pela monoamina oxidase A (MAO-A) no coração.15 Aumenta-se a expressão e atividade de MAO-A cardíaca em vários modelos animais de insuficiência cardíaca16-18 e envelhecimento.19 Estudos epidemiológicos mostram que pacientes femininos e masculinos de doença cardiovascular apresentam respostas diferenciais a diversos tratamentos recomendados.20,21 Este fato enfatiza a necessidade de incluir os dois sexos em pesquisa cardiovascular.

Para entender melhor os mecanismos moleculares pelos quais o estresse pré-natal pode contribuir ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares na vida adulta, o presente estudo foi desenvolvido para investigar a expressão gênica região-específica dos subtipos de receptores adrenérgicos (ADRB1, ADRB2 e ADRB3) e do MAO-A no miocárdio ventricular esquerdo de prole feminina e masculina.

 Métodos Animais

Ratas Wistar virgens (266 ± 11,9 g), com três meses de idade, foram alojadas no biotério da Faculdade de Biologia da Universidade de Belgrado, com livre acesso a alimento e água, sob ciclo claro-escuro constante (12/12 h) em condições de temperatura controladas (22 ± 1°C). O tamanho da amostra foi determinado por conveniência. Cada um dos seis pares de ratas foi enjaulado com um rato macho sexualmente experiente durante o ciclo do estro. Indicou-se o dia 0 da gestação com o aparecimento de espermatozóides no esfregaço vaginal. Uma rata não emprenhou-se. Para evitar viés de seleção, as fêmeas prenhes que acasalaram com o mesmo macho foram aleatoriamente designadas para o grupo controle (n = 5) ou estressado (n = 6) e alojadas individualmente. Conduziram-se todos os procedimentos de acordo com as normas de cuidados com animais propostos pela Federação Europeia das Associações de Ciência em Animais de Laboratório (FELASA) e aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Biologia da Universidade de Belgrado.

 Protocolo de estresse pré-natal

Durante a terceira semana da gestação (dia gestacional 13-20, GD13-GD20), as ratas prenhes foram expostas a um protocolo de estresse crônico moderado imprevisível (ECMI) que incluiu exposição aleatória e intermitente a uma variedade de estressores. O protocolo detalhado do ECMI é mostrado na Tabela 1. Resumidamente, os animais foram expostos aos seguintes estressores em ordem aleatória duas vezes ao dia durante 1 h ou durante a noite: cama úmida, contenção dentro de um tubo de Plexiglas(r), ambiente frio (4°C), deslocamento da gaiola e barulho, iluminação durante a noite e inclinação da gaiola. Mães de controle não foram perturbadas durante a gestação, com exceção do manejo geral. Durante toda a gestação, a ingestão de água e alimentos foi registrada.

Regime de estresse
10:00-11:00 14:00-15:00 18:00-08:00
GD14 Contenção Cama úmida Inclinação da gaiola
GD15 Ambiente frio (4°C) Deslocamento e barulho Iluminação contínua
GD16 Cama úmida Contenção Inclinação da gaiola
GD17 Deslocamento e barulho Ambiente frio (4°C) Iluminação contínua
GD18 Contenção Cama úmida Inclinação da gaiola
GD19 Ambiente frio (4°C) Deslocamento e barulho Iluminação contínua
GD20 Cama úmida Contenção Inclinação da gaiola

* GD: Dia da gestação.

 Exames bioquímicos

Antes da primeira e depois da última exposição aos estressores, coletou-se o sangue na veia caudal das ratas prenhes em tubos com EDTA. Os níveis plasmáticos do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) foram medidos com CLIA e os níveis de glicose foram medidos com um analisador de glicose Exac-tech com tiras de reagente Dextrostix, de acordo com as instruções dos fabricantes em todos os casos.

 Ninhadas

Ao nascimento, os filhotes foram contados e pesados e as ninhadas foram ajustadas para oito filhotes com um número igual de machos e fêmeas para evitar os efeitos de tamanho e distribuição sexual da ninhada no desenvolvimento. Todos os filhotes foram criados por suas mães biológicas. Os filhotes foram desmamados aos 28 dias, separados por sexo e alojados em grupos de dois por gaiola, de acordo com o grupo experimental (C- prole de mães não-estressadas, PS- prole de mães estressadas). O peso corporal e o consumo de alimentos e de água foram registrados durante os períodos pré- e pós-desmame. A prole foi sacrificada por decapitação aos dois meses de idade. Para evitar flutuações dependentes do ciclo estrogênico, a prole feminina foi sacrificada em diestro, que foi verificado por esfregaços vaginais.

 Isolação de RNA

O RNA total das porções basais e apicais dos ventrículos esquerdos foi isolado com o reagente TRI (Sigma, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações totais de RNA foram quantificadas por medidas de absorvância a 260 e 280 nm utilizando um espectrofotômetro (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade de RNA foi analisada gel de agarose a 1,5 % com brometo de etídio e observada por transiluminação UV (ChemiDoc-It imager, UVP, Alemanha).

 Síntese do cDNA e PCR quantitativa em tempo real

Amostras de RNA (2 µg) foram submetidas ao tratamento de DNase I, utilizando rDNase I, de acordo com o protocolo do fabricante (DNA-free kit, Ambion, EUA). Esferas Ready-to-go You-Prime First-Strand (GE Healthcare, USA) foram utilizadas para gerar cDNA para subsequente PCR quantitativa em tempo real. Amostras sem transcriptase reversa foram utilizadas para controlar a possível contaminação com gDNA. Todas as reações foram realizadas em duplicado utilizando TaqMan Master Mix (Applied Biosystems) uma vez e TaqMan expression assays uma vez para cada gene (Tabela 2: Adrb1, Adrb2, Adrb3, MaoA, ActB), com 2 µg de cDNA dentro de um volume total de 20 µl. Reações de PCR em tempo real foram realizadas no Applied Biosystem 7900 Real-Time PCR System, utilizando condições padrões de PCR (50°C durante 2 min; 95°C durante 10 min; 95°C durante 15 s e 60°C durante 1 min para 40 ciclos). Os níveis relativos de expressão gênica foram determinados pelo método 2ˆ(- ΔΔCT) de quantificação comparativa,22 usando beta-actina como gene de referência.

Ensaios de expressão TaqMan
Gene TaqMan ID de ensaio
Receptor adrenérgico beta 1 (Adrb1) Rn00824536_s1
Receptor adrenérgico beta 2 (Adrb2) Rn00560650_s1
Receptor adrenérgico beta 3 (Adrb3) Rn01478698_g1
Monoamina oxidase A (Maoa) Rn01430955_A1
Beta-actina (Actb) Rn01412977_g1
Análise estatística

Realizou-se análise estatística utilizando GraphPad Prism Software-version 6.01 (San Diego, EUA). Os parâmetros medidos nas mães e na prole foram expressos como média ± desvio padrão (DP). Os dados foram analisados pelo teste t de Student não pareado, a menos que indicado de outra forma. Os dados da prole obtidos por análise de PCR em tempo real foram expressos como mediana com intervalo interquartílico. Utilizou-se análise ANOVA two-way com teste de comparação múltipla de Bonferroni para examinar os efeitos de estresse pré-natal e de gestação nos níveis ACTH no plasma materno e os efeitos do estresse pré-natal nos padrões de expressão dos genes ADRB nas regiões examinadas do ventrículo esquerdo da prole. Avaliou-se a significância estatística das diferenças entre os dados de PCR em tempo real obtidos dos grupos experimentais com o teste U de Mann-Whitney não paramétrico. O nível de significância foi estabelecido em p < 0,05.

 Resultados Efeitos do ECMI nos parâmetros das mães e da prole

Para determinar se o protocolo de estresse aplicado ativou o eixo HPA nas ratas prenhes, os níveis plasmáticos maternos de ACTH foram avaliados. Antes do início do protocolo de estresse (GD13), os níveis plasmáticos maternos de ACTH não foram significativamente diferentes entre os grupos experimentais (Figura 1). Após exposição aleatória e intermitente a uma variedade de estressores durante a terceira semana da gestação (GD13-21), os níveis plasmáticos maternos de ACTH aumentaram em comparação com controle (Figura 1, p < 0,001, ANOVA two-way com teste de comparação múltipla de Bonferroni). Adicionalmente, no grupo de mães estressadas, após a exposição a diversos estressores, os níveis plasmáticos de ACTH aumentaram em comparação com GD13, sugerindo que o eixo HPA foi ativado neste grupo experimental (Figura 1, p < 0,001, ANOVA two-way com teste de comparação múltipla de Bonferroni).

Concentrações de ACTH no plasmo materno antes (GD13) e depois (GD21) da exposição ao ECMI durante a gestação. Os dados são expressos em média ± SD, grupo controle (barras brancas, n = 5), grupo estressado (barras pretas, n = 6). No grupo estressado, no GD21, duas amostras foram excluídas devido à hemólise. ***p < 0,001, ANOVA two-way com teste de comparação múltipla de Bonferroni.

A ECMI não afetou o ganho de peso materno na última semana da gestação (Tabela 3) ou o consumo de água e de alimentos durante a gestação (dados não mostrados). Os níveis de glicose materna foram semelhantes nos dois grupos experimentais antes e depois da aplicação do protocolo de ECMI (Tabela 3). O estresse pré-natal não acarretou um efeito no tamanho das ninhadas ou na relação machos/fêmeas na prole (Tabela 3). O estresse materno durante a última semana de gestação não afetou o peso ao nascimento ou o ganho de peso dos filhos durante os períodos pré ou pós-desmame (Tabela 4).

Peso materno antes do tratamento, ganho de peso materno durante a última semana da gestação (GD13-GD21), duração da gestação, níveis séricos de glicose antes e depois do estresse, tamanho da ninhada e relação machos/fêmeas
Variável Controle (n = 5) Estressado (n = 5) p
Peso materno antes do tratamento (g) 347 ± 37,3 337 ± 40,2 0,6646
Ganho de peso materno (g) 62,5 ± 4,43 50,5 ± 11,6 0,0872
Duração da gestação (dias) 22,0 ± 0,71 22,2 ± 0,41 0,6355
Níveis séricos de glicose (mM) antes do estresse (GD13) 5,44 ± 0,21 5,55 ± 1,00 0,8162
Níveis séricos de glicose (mM) após estresse (GD21) 5,30 ± 0,42 5,63 ± 0,69 0,3737
Tamanho da ninhada 11,2 ± 2,77 11,8 ± 2,32 0,6891
Relação machos/fêmeas 1,38 ± 0,4 1,18 ± 0,3 0,3805

GD13: dia 13 da gestação; GD21: dia 21 da gestação; os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP)

 Peso da prole ao nascimento, no 28° dia pós-natal 28 (PND28) e no 60° dia pós-natal (PND60)
Variável C PS p
Peso ao nascimento (g) Grupo 6,67 ± 0,904 6,39 ± 0,685 0,1562
Peso no PND28 (g) Grupo 94,5 ± 11,4 96,9 ± 13,2 0,6360
Masculina 96,8 ± 12,3 94,5 ± 10,3 0,7286
Feminina 92,2 ± 11,1 99,3 ± 16,2 0,3924
Peso no PND60 (g) Grupo 316 ± 50,9 317 ± 70,5 0,9790
Masculina 355 ± 29,7 377 ± 42,7 0,3354
Feminina 277 ± 33,6 257 ± 21,7 0,2454

C: prole de mães não estressadas; PS: prole de mães estressadas; PND28: 28° dia pos-natal; PND60: 60° dia pos-natal; número de animais (n): n = 5-8 per grupo. Os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP)

 Efeitos do estresse pré-natal na expressão gênica regional do subtipo ADRB no ventrículo esquerdo da prole feminina e masculina

Utilizou-se análise de PCR quantitativo para examinar os níveis relativos de ADRB1, ADRB2 e ADRB3 nas regiões apicais e basais dos ventrículos coletados do controle (C) e da prole de adultos femininos e masculinos prenatalmente estressados (PS).

Foi indetectável o mRNA de ADRB3 nas regiões examinadas do ventrículo esquerdo da prole feminina e masculina.

No ápice e na base do ventrículo esquerdo do controle feminino, detectou-se maior expressão de mRNA de ADRB1 em comparação com os níveis de mRNA de ADRB2. (Figura 2A e 2C, aprox. ADRB1/ADRB2 = 73%/23%, p < 0,01). Níveis diminuídos de mRNA de ADRB1 apical foram detectados na prole feminina PS em comparação com animais controle (Figura 2A, p = 0,048). Adicionalmente, na prole feminina PS, observou-se uma tendência de aumento nos níveis de mRNA de ADRB2 apical em comparação com o controle. Visto que estas alterações resultaram na perda dos níveis de expressão diferenciais do subtipo ADRB no miocárdio apical da prole feminina PS, realizou-se a análise ANOVA two-way. A análise ANOVA revelou interação significativa entre o tratamento pré-natal e os níveis de expressão do subtipo de receptor (F(1,20) = 6,817, p = 0,0167). Vistos em conjunto, estes resultados indicam que o estresse pré-natal afetou ADRB1 e ADRB2 diferentemente no miocárdio apical de animais femininos. Além disso, observou-se uma tendência à diminuição nos níveis basais de mRNA de ADRB1 da prole feminina PS em comparação com controle (Figura 2C p = 0.3434), de tal forma que o miocárdio basal da prole feminina PS não exibiu padrão de expressão diferencial de mRNA de ADRB1 e ADRB2 em comparação com animais de controle. Não se pode excluir o efeito do tamanho limitado da amostra para detectar diferenças significativas na expressão gênica de ADRB entre os grupos controle e PS. Pesquisas futuras serão necessárias para alcançar uma compreensão mais detalhada dos mecanismos subjacentes que resultam em um padrão alterado de expressão gênica de receptores adrenérgicos cardíacos basais da prole feminina PS.

Efeitos do estresse pré-natal na expressão do mRNA de receptores adrenérgicos beta 1 (ADRB1) e beta 2 (ADRB2) no ápice e na base do ventrículo esquerdo (VE) da prole. Apresentam-se resultados para prole feminina (A e C) e masculina (B e D) de mães não estressadas (controle-C) e estressadas (estresse pré-natal-PS). Dados são expressos como mediana com intervalo interquartílico (número de animais per grupo, n = 5-8). *p < 0,05; **p < 0,01, teste U de Mann-Whitney.

A prole masculina das mães não estressadas, de maneira semelhante à prole feminina, apresentou níveis de mRNA de ADRB1 mais altos que de ADRB2 no ápice do ventrículo esquerdo. (Figura 2B, p = 0,0087). Porém, diferentemente da prole feminina, na prole masculina o estresse pré-natal não afetou o padrão de expressão apical predominante de mRNA de ADRB1 no ventrículo esquerdo (Figura 2B). Por outro lado, detectaram-se níveis similares de expressão de mRNAm de ADRB1 e ADRB2 na base do ventrículo esquerdo na prole masculina prenatalmente estressada e controle (Figura 2D).

 Efeitos do estresse pré-natal na expressão gênica regional de MAO-A no ventrículo esquerdo da prole feminina e masculina

O estresse pré-natal não afetou significativamente a expressão de mRNA de MAO-A na região apical ou basal do ventrículo esquerdo na prole feminina e masculina (Figura 3). Com base nos nossos resultados, observa-se uma tendência de maior expressão relativa de MAO-A no miocárdio basal em comparação com a região apical do ventrículo esquerdo na prole masculina (aproximadamente 35 vezes no controle e 17,5 vezes nos animais do PS, Figura 3B e 3D). Adicionalmente, a MAO-A cardíaca basal demonstrou uma tendência de maior expressão na prole masculina que na feminina (Figura 3C e 3D, aprox. 4,7 vezes entres os grupos controle e 5,1 vezes entre grupos PS).

Efeitos do estresse pré-natal no mRNA de monoamina oxidase A (MAO-A) no ápice e na base do ventrículo esquerdo (VE) da prole. Apresentam-se resultados para prole feminina (A e C) e masculina (B e D) de mães não estressadas (controle-C) e estressadas (estresse pré-natal-PS). Dados são expressos como mediana com intervalo interquartílico (número de animais per grupo, n = 5-8).

Discussão

As doenças cardiovasculares são a principal causa de morbidade e mortalidade no mundo.23 Demonstrou-se que vários distúrbios no desenvolvimento fetal podem contribuir para o desenvolvimento de distúrbios cardiovasculares na vida adulta. Prole de mães que sofrem estresse ou mães submetidas a terapia com glicocorticóides durante a gestação apresentam várias alterações neuroendócrinas e comportamentais durante a vida adulta.24-26 O presente estudo examinou a expressão de subtipos de ADRB e MAO-A em diferentes regiões do ventrículo esquerdo de prole feminina e masculina prenatalmente exposta a estresse materno.

Aplicou-se um protocolo de estresse a ratas prenhes que pudesse imitar o estresse da vida cotidiana ao qual as mulheres grávidas são expostas. Nosso protocolo de estresse envolveu exposição crônica a vários estressores moderados. Isto impede a habituação que pode ser observada após exposição repetida ao mesmo estressor.27 Níveis séricos de ACTH são elevados nas mães estressadas quando comparadas com ratas não estressadas, o que indica que atividade no eixo HPA de fêmeas gestantes foi aumentada pelo protocolo ECMI e isto é consistente com estudos anteriores.(28, 29) Não observaram-se diferenças significativas em parâmetros metabólicos, como ganho de peso materno durante a gestação, consumo de água e alimentos, ou nível sérico de glicose entre mães estressadas e sem estresse. O estresse materno durante a última semana de gestação também não afetou o tamanho da ninhada ou o peso ao nascimento. Vistos em conjunto, estes resultados sugerem que nosso modelo de ECMI foi potente o suficiente para induzir uma resposta de estresse em ratas prenhes, mas não afetou o peso da prole, o qual é conhecido como um dos fatores de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares em adultos.2

Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a relatar níveis relativos de expressão gênica de subtipos de receptores beta-adrenérgicos em duas regiões diferentes do ventrículo esquerdo de ratos. Nossos resultados mostram que o ADRB1 é o subtipo predominantemente expresso na população de ADRB cardíaco no miocárdio apical e basal do ventrículo esquerdo da prole de ratas não estressadas. Detectou-se também maior expressão nos níveis de mRNA de ADRB1 em comparação com os de ADRB2 na região ventricular apical na prole masculina controle. De fato, vários estudos em humanos e em outros animais demonstraram maior ADRB1 que ADRB2 no ventrículo esquerdo.30-34 Porém, os nossos resultados não são consistentes com os achados relatados por Paur et al.,35 que usou ensaios de ligação radioligante. Eles demonstraram um aumento na relação ADRB2/ADRB1 nos cardiomiócitos apicais isolados de ratos Sprague-Dawley machos adultos. Essas discrepâncias podem ser explicadas por diferenças de método e de sistemas de modelo. Diferentemente da prole feminina, na prole masculina os níveis de mRNA de ADRB1 e ADRB2 foram expressos de forma semelhante no miocárdio basal do ventrículo esquerdo. Não detectou-se mRNA de ADRB3 no ventrículo esquerdo dos ratos.

Os nossos resultados sugerem que há representações de expressão gênica sexo- e região-específicas de subpopulações de ADRB no miocárdio do ventrículo esquerdo de ratos. Adicionalmente, os dados do nosso estudo indicam que o estresse pré-natal pode ter afetado o padrão da expressão gênica de ADRB1 e ADRB2 na região apical do ventrículo esquerdo na prole feminina, mas não na prole masculina. A representação perturbada de subtipos de receptores adrenérgicos cardíacos tem sido descrita em patologias cardiovasculares. A insuficiência cardíaca é caracterizada pela alteração da relação ADRB1/ADRB2, em parte devido à diminuição da proteína ADRB1 e do mRNA no ventrículo esquerdo.11,36 A redução não seletiva de subpopulações de receptores beta-adrenérgicos também observou-se nos corações de animais envelhecidos37 e de pacientes idosos.31,34 Nossos resultados indicam que o estresse pré-natal resultou na diminuição da expressão apical do mRNA de ADRB1, sugerindo que a região do miocárdio apical da prole feminina pode ser sensível à exposição ao estresse durante a vida fetal. É de interesse que, na cardiomiopatia induzida por estresse, também conhecida por cardiomiopatia de Takotsubo, descreve-se uma maior sensibilidade na região apical do ventrículo esquerdo ao estresse durante a vida adulta.35,38 Além disso, essa síndrome é predominantemente diagnosticada em mulheres.38

Outra proteína envolvida na modulação simpática da função cardíaca é a MAO-A. Esta enzima catalisa a oxidação de monoaminas durante a qual espécies reativas do oxigênio são produzidas e pode contribuir para a patogênese das doenças cardiovasculares.15 Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a investigar os efeitos de estresse pré-natal na expressão gênica de MAO-A cardíaca na prole. O presente estudo não detectou alterações significativas nos níveis de mRNA da MAO-A no coração pré-natal feminino ou masculino.

Há várias limitações neste estudo. Como mencionado acima, não podemos desconsiderar o efeito do tamanho de amostra limitado na detecção de diferenças significativas adicionais na expressão gênica região-específica de subpopulações de receptor beta-adrenérgico miocárdico. Desconhece-se o mecanismo responsável pela expressão diminuída de mRNA de ADRB1 no miocárdio apical na prole feminina prenatalmente estressada, mas não na masculina. Podemos apenas formar a hipótese, baseada na literatura, que hormônios sexuais possam exercitar um efeito. Seria, portanto, interessante investigar os estágios iniciais de desenvolvimento da prole prenatalmente estressada. Além disso, não comparamos os níveis de expressão cardíaca de MAO-A entre a prole masculina e a feminina. Porém, com base nos níveis relativos de expressão de MAO-A, podemos supor que nossos resultados sugerem que a MAO-A cardíaca exibe um padrão de expressão gênica de maneira dimórfica, provavelmente sendo mais abundante no coração de ratos machos do que em fêmeas. Considerando que MAO-A é a principal fonte de peróxido de hidrogênio no coração, a nossa observação seria consistente com a produção diminuída de peróxido de hidrogênio relatada em mitocôndrias cardíacas de ratos Wistar fêmeas, em comparação com machos.39

Conclusões

Em resumo, os nossos dados sugerem que estresse pré-natal pode exercer, já na idade adulta jovem, alterações sexo-específicas nas subpopulações de receptores adrenérgicos cardíacos apicais e basais em prole. Pesquisas futuras serão necessárias para determinar se essas mudanças são correlacionadas com o desempenho cardíaco diminuído e se essas predispõem organismos a desenvolver doenças cardiovasculares durante a vida.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Desenvolvimento Tecnológico, República da Sérvia (número da bolsa: 173023).

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Tanja Jevjdovic pela Faculty of Biology, University of Belgrade.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Biologia da Universidade de Belgrado sob o número de protocolo EK-BF-2015/25.

Errata

No artigo “Efeitos Sexo-Específicos de Estresse Pré-Natal na Expressão Região Específica de Monoamina Oxidase A e Receptores Adrenérgicos B no Coração de Ratos”, considerar como correta a grafia Tanja Jevdjovic para o nome da autora Tanja Jevjdovic.