Arq Bras CardiolabcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCKTHPX7W3BgxDrFdD8VjH8ZzS0066-782X2018001600578S0066-782X201800501210210.5935/abc.20180156Original ArticlePredictors of Family Enrollment in a Genetic Cascade Screening Program for Familial HypercholesterolemiaSilvaPãmela Rodrigues de Souza1JannesCinthia Elim1OliveiraTheo G. M.1GómezLuz Marina Gómez1KriegerJosé E.1SantosRaul D.2PereiraAlexandre Costa1Universidade de São PauloFaculdade de MedicinaInstituto do CoraçãoSão PauloSPBrazilLaboratório de Genética e Cardiologia Molecular do Instituto do Coração (InCor) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP - BrazilUniversidade de São PauloFaculdade de MedicinaInstituto do CoraçãoSão PauloSPBrazilClínica de Lípides do Instituto do Coração (InCor) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP - BrazilMailing Address: Pãmela Rodrigues de Souza Silva, Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 44. Postal Code 05403-900, Cerqueira César, São Paulo, SP - Brazil. E-mail: pam_r_s@usp.br, pam_r_s@hotmail.com230820181020181114578584051220171804201825042018This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly citedAbstractBackground:
Genetic cascade screening is the most cost-effective method for the identification of individuals with familial hypercholesterolemia (FH), but the best strategies for the enrollment of at-risk individuals in a FH screening program are not fully known.
Objective:
The aim of this study is to identify the best predictors of familial enrollment into genetic screening, using features derived from tested probands.
Methods:
One hundred and eighty-three index-cases (ICs) with a positive genetic result that had relatives screened from 01/2011 to 07/2015 were included. The response variable was the number of relatives for each enrolled IC. All variables in the study were based on ICs’ derived clinical and socioeconomical features. The effect size of predictor variables were obtained through a general linear model using a negative binomial regression link function. Significance was considered with a p < 0.05.
Results:
Mean IC age when enrolling into the program was 50 years old; 78.1% of individuals reported knowledge of relatives with dyslipidemia. Mean baseline LDL-cholesterol level was 316 ± 90 mg/dL. Referral origin through the cascade program website vs. tertiary care, IC LDL-cholesterol and familial history of high LDL-cholesterol levels were independent predictors associated with a higher number of enrolled relatives.
Conclusions:
Our data suggest that FH cascade screening programs can predict family enrollment based on IC features. This information may be useful for devising better and more effective screening approaches for at-risk individuals.
Keywords:Hypelipoproteinemia Type II/geneticsMass ScreeningDyslipidemias/geneticsHypercholesterolemiaGenetic TestingCholesterolIntroduction
Familial hypercholesterolemia (FH) is a genetic disease characterized by elevated blood LDL cholesterol (LDL-C) levels. FH is usually caused by mutations in the gene encoding the LDL receptor (LDLR) and less frequently (~5% of cases) by mutations in genes coding for apolipoprotein-B (APOB) or proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9). Individuals carrying these mutations are exposed to high lipid levels and, thus, have a higher risk of developing early atherosclerotic cardiovascular disease and mortality.1,2
The worldwide prevalence of heterozygous FH ranges between 1:200 and 1:500 individuals, varying in a few countries.3,4 FH is an underdiagnosed disease and, therefore, most affected individuals do not have access to proper treatment until later in life.5
FH diagnosis usually involves the identification of typical clinical signs of the disease such as high levels of LDL-C (> 190 mg/dL), tissue cholesterol deposition (e.g. tendon xanthomas and corneal arcus when detected in individuals less than 45 years old), a family history of high blood cholesterol and or early atherosclerotic disease.6
In many instances, a typical FH index case (IC) is clinically diagnosed after the onset of an atherosclerotic cardiovascular event. Due to its autosomal dominant transmission, FH can and must be diagnosed early in asymptomatic relatives to start LDL-C lowering treatment with the aim of preventing cardiovascular disease onset. Genetic testing is important not only for diagnostic confirmation of index cases and in relatives, but also as a prognostic tool since recent evidence confirmed that the presence of FH-causing mutations implicates in higher cardiovascular risk even in comparison with other hypercholesterolemic individuals.7,8
Currently, cascade genetic screening is the most cost-effective method for FH diagnosis.9-12 The screening begins with the clinical and genetic diagnosis of an IC, of which all first-degree relatives are screened for the same mutation. After the identification of all affected relatives, the cascade gives sequence to all 2nd-degree relatives, and then successively. Most importantly, the higher the number of screened relatives, the more cost-effective the cascade becomes.13,14
Interestingly, despite being recognized as the most cost-effective strategy for population-wide FH identification, little is known about the best strategies for maximizing the enrollment of at-risk individuals in a cascade screening program. One can argue that this information is even more important than devising ways to identify index-cases to be tested from the overall population.. Therefore, the aim of this study is to identify the main predictors of family enrollment into cascade screening using the IC as a starting point.
Methods
The Brazilian FH screening program (HipercolBrasil) is performed by the Laboratory of Genetics and Molecular Cardiology at the Heart Institute (InCor) of the University of São Paulo Medical School Hospital. This study was approved by the institutional ethics committee (CAPPesq 3757/12/013). All participants read and signed an informed consent form authorizing the study.
Participants included in our analysis were previously registered in the HipercolBrasil Program and were referred to the program by institutional physicians or by other collaborators. Individuals that spontaneously contacted the program by phone or website were also included. Once the inclusion criteria were met, participants were referred to molecular genetic testing.
Study population and inclusion criteria
The inclusion criterion for program enrollment was the presence of a baseline LDL-C value ≥ 210 mg/dL. However, some individuals with LDL-C < 210 mg/dL were also enrolled when suggestive signs of FH were detected by the physicians. All genetic positive ICs (individuals in which a pathogenic or likely pathogenic mutations were identified) who authorized the screening of relatives from January 2011 to July 2015 were included in the present study.
Whole blood was collected after a physical exam was performed and a standardized questionnaire was applied by trained personnel from the HipercolBrasil team. In case of a positive genetic result, the IC was contacted and informed about the importance of the genetic results and the possibility of free family screening. After a comprehensive explanation of the disease risks and early diagnosis benefits, the IC was asked to provide information on all at-risk first-degree relatives. These were then contacted by phone and invited to join the cascade program by trained specialized health professionals. The screening in relatives is restricted to the same mutation found in the IC, despite the presence or not of FH clinical features. All relatives also signed the informed consent form and were submitted to the same standardized questionnaire application.
Study variables
Possible predictor variables from ICs were obtained before the genetic test results were available. The standardized questionnaire consisted of socioeconomic, clinical and biochemical variables.
Information regarding employment status consisted of three categories: employed (working age, individual currently working); unemployed (working age, individual not currently working) and inactive (students, elderly and/or retired individuals and those with special needs unable to work). Educational level was defined as: illiterate, elementary education, high-school education, and college/university.
IC origin was defined according to whom or from where the patient was referred to the program. ICs could have been referred by physicians from the Lipid Clinic of the Heart Institute (the lipids referral center closely associated with the HipercolBrasil program); from partner centers located at other tertiary care institutions; from private physicians; by the patient itself through the program website (www.hipercolesterolemia.com.br); or by a primary health care unit. Enrollment criteria were the same for all ICs regardless of origin. The participation of other partner centers in the study was approved by the institutional ethics committee (CAAE 00594212.0.0000.0068/nº:1.213.994).
Required clinical information was: occurrence of atherosclerotic or familial history of early atherosclerotic cardiovascular disease and/or altered lipid levels; clinical stigmata such as corneal arcus, xanthelasmas or xanthomas. Biochemical exams were obtained from medical records or from previous exams brought by the patient. The following values were recorded: total cholesterol (TC), LDL-C, HDL-C, triglycerides (TG) and fasting glucose. The Dutch Lipid Clinic Network (DLNC) score and Simon Broome criteria were calculated using the available information at the baseline visit. Whenever possible, the baseline value of LDL-C was used. In case of a patient receiving lipid-lowering treatment with unavailable baseline LDL-C values, the current value was used to calculate the score. Those clinical scores were applied only with the intention of collecting and storing data and were not used as criteria for program enrollment.
Genetic testing
IC samples were sequenced for six FH-related genes: LDLR, APOB, PCSK9, LDLRAP1, LIPA and APOE. Target regions were considered as coding exons plus 10bp of introns up and downstream and captured using a specially designed enrichment reagent. Templates were prepared on Ion One Touch System and sequenced in Ion Torrent PGM® platform, with 32 samples per run in a 316v2 Ion Chip. Bioinformatics analyses were performed in CLC Genomics Workbench 9.5 (QIAGEN) in a custom pipeline. Minimum quality requirements for variant call were: Base quality of PhredQ ≥ 20; Target-region coverage ≥ 10x; Frequency of variant allele ≥ 20% and bidirectional presence of variant allele.
After filtering for a MAF ≤ 0.002 with control populations (NHLBI-ESP6500, AbraOM, ExAC and 1000Genomes), all potential mutations were consulted for previous description in ClinVar, Human Genome Mutation Database (HGMD), British Heart Foundation and Jojo Genetics databases. Functional impact prediction was performed with SIFT, PROVEAN and PolyPhen-2 and mutations without a previous description should be indicated as damaging in at least two algorithms to be considered as potentially pathogenic. Individuals with negative results were also screened for large insertions and deletions via MLPA (MRC-Holland). Point mutations found in ICs were screened in relatives through Sanger sequencing, and large insertions/deletions via MLPA.
Statistical analysis
The response variable of this study consisted in the number of family members enrolled in the program by each family, starting from a positive IC. The response variable consists of count data, which would suggest the application of a Poisson model. However, as the dependent variable variance was higher than the mean value, the most adequate model in this situation was the negative binomial model, due to data overdispersion (Figure 1). Predictive variables were based on the IC’s clinical and socioeconomic characteristics. We initially performed a distribution analysis on the response variable and the model that appropriately fit this variable was one using a negative binomial distribution. Thus, the estimate for predictor variables for the number of enrolled relatives was derived through a general linear model using a negative binomial regression link function. The following variables were included in the initial model: age, family history of high cholesterol levels, DLNC score, Simon Broome Score, baseline lipid-lowering treatment, employment situation, baseline LDL-C or highest level during treatment, educational level and origin. The mean and standard deviation were calculated for continuous variables. Significance was considered at a p < 0.05. Statistical analyses were performed with SPSS v19.0 (IBM) and R software (Package gamlss, version 3.3.1).
QQ Plot for the general linear model using a negative binomial distribution.
Results
A total of 183 ICs were analyzed, of which 2316 relatives were contacted and 1605 agreed to enroll in the program (overall enrollment rate of 69.3%). Eighty-seven families were excluded from the study after model adjustment for multiple regression analysis. These were related to 87 ICs that had missing data in at least one of the variables included in the final model. Clinical characteristics of the ICs are shown in Table 1.
Clinical characteristics of Index cases
Variables
n
Age (Mean ± SD)
183
47 ± 18
Male sex (%)
84
45.9
Tendon xanthomas (%)
26
14.2
Corneal Arcus (%)
49
26.8
Early coronary disease (%)*
54
29.5
Family history of early coronary disease (%)†
72
39.3
Family history of increased LDL-C levels(%)‡
98
53.6
Current pharmacological treatment (%)§
145
79.2
DLCN Score (%)
Definitive
74
40.4
Probable
48
26.2
Possible
33
18.0
Simon Broome (%)
Definitive
29
15.8
Probable
124
67.8
Baseline TC// mg/dL (Mean ± SD)
104
405 ± 112
TC mg/dL (Mean±SD) highest level during treatment
64
305 ± 124
Baseline LDL-C mg/dL (Mean ± SD)
104
326 ± 111
LDL-C mg/dL (Mean ± SD) highest level during treatment
64
238 ± 122
Baseline HDL-C mg/dL (Mean ± SD)
102
47 ± 15
HDL-C mg/dL (Mean±SD) highest level during treatment
64
43 ± 10
Baseline TG¶ mg/dL (Mean ± SD)
99
144 ± 63
TG mg/dL (Mean ± SD) highest level during treatment
32
132 ± 77
Coronary disease in men aged < 55 years or women aged < 60 years.
Family history of coronary disease (e.g.. heart attack) in first or second degree relatives (men aged < 55 years and women < 60 years).
First or second degree relatives with TC > 260 mg/dl or LDL > 160 mg/dL in children (> 16 years old) or TC > 290 mg/dL or LDL > 190 mg/dL in adults (pre-treatment levels or the highest level during treatment).
Current use of lipid-lowering drugs (e.g. statins).
Regarding the educational level, 30.6% of ICs had college, 25.1% high-school, 22.4% elementary education and 4.9% were illiterate. The greatest percentage of ICs is currently employed (41.0%). Most of ICs were referred by local physicians (81.4%), followed by 7.7% of patients that reached the program via the website. The other 5% were referred from partner centers located at other tertiary care institutions and 3.3% from private physicians.
Table 2 shows the univariate negative binomial regression calculated for all the variables in the study. Only family history of altered lipid levels and referral of patients via the website were significantly associated with the number of relatives brought into the program.
Parameters associated with relatives’ inclusion in the cascade screening according to univariate negative binomial regression analysis
Predictors
Estimate
Std. Error
p value*
Age (years)
0.005
0.003
0.141
Early coronary disease†
-0.024
0.143
0.867
DLCN‡ Score (Probable)
0.117
0.415
0.777
DLCN Score (Possible)
-0.158
0.600
0.792
Family history of early coronary disease
0.136
0.171
0.425
Family history of increased LDL-C levels
0.395
0.201
0.048
Educational level (Elementary)
0.460
0.326
0.159
Educational level (High School)
0.355
0.324
0.273
Educational level (College)
0.219
0.320
0.494
Employment Situation (Unemployed)
-0.175
0.247
0.479
Employment Situation (Inactive)
-0.204
0.150
0.174
Origin§ (Rio de Janeiro)
-0.751
0.400
0.060
Origin (website//)
-0.745
0.245
0.002
Current pharmacological treatment
0.179
0.190
0.346
LDL-C
0.001
0.000
0.112
p value < 0.05.
Coronary disease in men aged < 55 years or women aged < 60 years.
DLCN: Dutch Lipid Clinic Network.
IC origin was defined according to whom or from where the patient was referred to the program.
Website: by the patient itself via the program website. LDL-C: Low-density lipoprotein cholesterol.
Results after model adjustment are outlined in Table 3. Family history of high LDL-C levels was an independent predictor associated with a higher number of enrolled relatives, with an increasing estimate of 1.76-fold when comparing ICs with and without family history of dyslipidemia. IC baseline LDL-Cvalues were also associated with a higher number of enrolled relatives.
Parameters associated with relatives’ inclusion in the cascade screening according to multiple negative binomial regression analysis
Predictors
Estimate
Std. Error
p value*
Origin (website)†
-0.846
0.339
0.012
Family history of increased LDL-C levels
0.565
0.210
0.007
LDL-C
0.002
0.000
0.004
p value < 0.05.
IC origin was defined according to whom or from where the patient was referred to the program. Website: by the patient itself via the program website. LDL-C: Low-density lipoprotein cholesterol.
The IC referral origin also significantly influenced the number of relatives in the program. When comparing the origin of ICs, for those enrolled via website the expected number of relatives decreased by 0.42-fold when compared to ICs referred from inside a referral center.
Discussion
The present study is, to the best of our knowledge, the first to assess the predictors that might influence enrollment of relatives in a genetic FH cascade screening program, considering clinical, demographic and socioeconomic features of ICs as the main source. Currently, for every IC with a pathogenic variant identified by molecular genetic testing, around 69.3% of eligible relatives are enrolled in our cascade screening program. For each positive IC we identified 1.8 affected relatives.13
Based on ICs’ characteristics, the factor that most influences the inclusion of relatives in the program is a reported family history of dyslipidemia. High levels of LDL-C in ICs also contributed to the enrollment of relatives in the cohort, suggesting that some measure of the IC dyslipidemia severity also modulates the relatives’ willingness to enroll in disease screening.
Once enrolled in the program, ICs are provided with systematic recommendations about the importance of family screening, mainly due to the possible identification of at-risk individuals, which makes genetic testing of great importance. Genetic testing not only confirms the ICs’ clinical diagnosis, but also elucidates the family history of dyslipidemia and the existence of at-risk relatives.15
Relatives frequently underestimate the disease risks and are not aware of their condition, increasing the chance of early atherosclerotic cardiovascular event onset.16-18 Sometimes, even though embodied with knowledge of the importance of genetic testing, they remain reluctant to participate due to the lack of motivation.19
The cascade effectiveness depends on the ICs’ agreement to recruit relatives through the program and on the actual enrollment of these relatives, so that the ideal scenario is the enrolment of all eligible individuals.20,21 To find the best strategy for familial enrollment in a cascade screening program is relevant and impacts the overall cascade’s cost-effectiveness. The Dutch FH cohort reported the obstacles in recruiting relatives after 5 years of cascade screening,22 even with a relatively efficient rate of enrollment. Some of the most important raised points are the social and ethical questions surrounding genetic testing, but also the fact that many participants died before having the chance to enroll in the cascade. Many countries have already implemented this form of detection, revealing its feasibility9,13,14,22 which is considered the gold-standard method referred by the NICE guidelines.16
Recruiting ICs via website was a factor that decreased the chance of familial enrollment when compared to ICs referred from the Lipid Clinic of the Heart Institute, a tertiary referral center. This result is probably related to both the amount of information that ICs receive and the severity of the ICs’ condition. Those recruited by specialists of tertiary health centers are more conscious about their risks as well as for their relatives. On the other hand, those recruited via website are only guided by the screening program. Therefore, the amount of information delivered by the screening program only might not be enough for the ICs to understand the importance of family enrollment, suggesting that awareness should be emphasized even after several visits.
Unexpectedly, we did not observe a significant effect of the educational level on family enrollment prediction. This observation deserves further study, since it may suggest new ways for educational and awareness programs to be developed.
One limitation of our study is that it is based on a genetic-screening cascade and that the identified predictors may not apply to biochemical-based cascades, since the genetic cascade is only performed for those individuals with a pathogenic variant of FH.
Conclusions
Early diagnosis through cascade screening is important for the prevention of risk factors, because over time individuals would be diagnosed early in their lives or even in childhood, thus allowing adequate treatment and prevention of additional risks. With cascade screening, the relatives are diagnosed at a younger age, which is the main factor that characterizes the effectiveness of this diagnostic method. We conclude that after four years of screening, family history of dyslipidemia, as well as high LDL-C levels are the factors that most influenced the inclusion of relatives in the genetic cascade. A professional approach certainly plays an important role in family adherence and our results laid the foundations for the planning of specific intervention trials designed to test new approaches for increasing family enrollment.
The funding of Sociedade Hospital Samaritano and Ministério da Saúde (PROADI-SUS; SIPAR: 25000.180.672/2011-81) and FAPESP (grant n. 2013/17368-0) are gratefully acknowledged.
Acknowledgments
The authors would like to thank all the patients who participated in the cohort and the entire professional staff of Laboratory of Genetics and Molecular Cardiology of the Heart Institute (InCor)/University of São Paulo Medical School Hospital.
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M.1GómezLuz Marina Gómez1KriegerJosé E.1SantosRaul D.2PereiraAlexandre Costa1Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular do Instituto do Coração (InCor) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP - BrasilClínica de Lípides do Instituto do Coração (InCor) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP - BrasilCorrespondência: Pãmela Rodrigues de Souza Silva, Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 44. CEP 05403-900, Cerqueira César, São Paulo, SP - Brasil. E-mail: pam_r_s@usp.br, pam_r_s@hotmail.comResumoFundamento:
O rastreamento genético em cascata é o método mais economicamente viável para a identificação de indivíduos com hipercolesterolemia familiar, mas as melhores estratégias para o recrutamento de indivíduos em risco em um programa de rastreamento deste tipo não são inteiramente conhecidas.
Objetivo:
Identificar os melhores preditores de recrutamento familiar em rastreamento genético, usando características derivadas de probandos testados.
Métodos:
Foram inscritos 183 casos índices com resultado genético positivo, que tiveram familiares rastreados de janeiro de 2011 a julho de 2015. A variável de resposta foi o número de familiares para cada caso índice inscrito. Todas as variáveis do estudo foram baseadas em características clínicas e socioeconômicas derivadas dos casos índices. O tamanho do efeito das variáveis preditoras foi obtido de modelo linear geral utilizando função de associação de regressão binomial negativa. A significância foi considerada com p < 0,05.
Resultados:
A média de idade dos casos índices ao ingressar no programa foi de 50 anos; 78,1% dos indivíduos relataram conhecimento de familiares com dislipidemia. O nível médio de LDL-colesterol inicial foi de 316 ± 90 mg/dL. Origem de referência por meio do site do programa em cascata vs. cuidados terciários, LDL-colesterol do caso índice e história familiar de níveis elevados de LDL-colesterol foram preditores independentes associados a um maior número de familiares inscritos.
Conclusões:
Programas de rastreamento genético em cascata da hipercolesterolemia familiar podem prever o recrutamento da família com base nas características do caso índice. Esta informação pode ser útil para criar abordagens de rastreamento melhores e mais eficazes para indivíduos em risco.
Palavras-chave:Hiperlipoproteinemia Tipo II/genéticaProgramas de RastreamentoDislipidemias / genéticaHipercolesterolemiaTestes GenéticosColesterolIntrodução
A Hipercolesterolemia Familiar (HF) é uma doença genética caracterizada por níveis elevados de Lipoproteína de Baixa Densidade-Colesterol (LDL-c) no sangue. É geralmente causada por mutações no gene que codifica o Receptor do LDL (LDLR) e menos frequentemente (~ 5% dos casos) por mutações em genes que codificam a Apolipoproteína-B (APOB) ou da Pró-Proteína Convertase Subtilisina/Kexina Tipo 9 (PCSK9). Indivíduos portadores destas mutações são expostos a altos níveis lipídicos e apresentam maior risco de desenvolver doença cardiovascular aterosclerótica e mortalidade precoces.1,2
A prevalência mundial da HF em sua forma heterozigótica está entre 1:200 e 1:500 indivíduos, variando em alguns países.3,4 A HF é uma doença subdiagnosticada, e os indivíduos mais afetados não têm acesso ao tratamento adequado até mais tarde na vida.5
O diagnóstico da HF geralmente envolve a identificação de sinais clínicos típicos da doença, como níveis elevados de LDL-c (> 190 mg/dL), deposição de colesterol nos tecidos (por exemplo, xantomas tendinosos e arcos corneais quando detectados em indivíduos com menos de 45 anos), história familiar de altos níveis de colesterol e/ou doença aterosclerótica precoce.6
Muitas vezes, um Caso Índice (CI) típico de HF é diagnosticado clinicamente após o início de um evento cardiovascular aterosclerótico. Devido à sua transmissão autossômica dominante, a HF pode e deve ser diagnosticada precocemente em familiares assintomáticos para iniciar o tratamento de redução do LDL-c, com o objetivo de prevenir o início da doença cardiovascular. Testes genéticos são importantes não apenas para confirmação diagnóstica de casos índice e em familiares, mas também como ferramenta prognóstica, uma vez que evidências recentes confirmam que a presença de mutações causadoras de HF implica maior risco cardiovascular, mesmo em comparação com outros indivíduos hipercolesterolêmicos.7,8
Atualmente, o rastreamento genético em cascata é o método mais custo-efetivo para o diagnóstico da HF.9-12 Ele tem início com o diagnóstico clínico e genético de um CI; em seguida, todos os familiares de primeiro grau são rastreados para a mesma mutação. Após a identificação de todos os familiares afetados, a cascata dá sequência a todos os familiares de segundo grau, e assim sucessivamente. Mais importante ainda, quanto maior o número de familiares rastreados, mais custo-efetiva a cascata se torna.13,14
Curiosamente, apesar de ser reconhecida como a estratégia mais eficaz, em termos de custo para a identificação da HF em toda a população, pouco se sabe sobre as melhores estratégias para maximizar o recrutamento de indivíduos em risco em um programa de rastreamento em cascata. Pode-se argumentar que esta informação é ainda mais importante do que planejar formas de identificar casos índices a serem testados da população geral.
O objetivo deste estudo foi identificar os principais preditores de recrutamento familiar em um rastreamento em cascata, utilizando o CI como ponto de partida.
Métodos
O programa de rastreamento genético em cascata para HF no Brasil (Hipercol Brasil) é realizado pelo Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular do Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética institucional (CAPPesq 3757/12/013). Todos os participantes leram e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Informado autorizando o estudo.
Os participantes inscritos em nossa análise foram previamente cadastrados no programa Hipercol Brasil, tendo sido encaminhados por médicos institucionais ou por outros colaboradores. Indivíduos que contataram espontaneamente o programa por telefone ou pelo site também foram inscritos. Quando os critérios de inclusão foram atendidos, os participantes foram encaminhados para testes genéticos moleculares.
População do estudo e critérios de inclusão
O critério de inclusão para participar do programa foi a presença de um valor de LDL-c basal ≥ 210 mg/dL. No entanto, alguns indivíduos com LDL-c < 210 mg/dL também foram inscritos, quando sinais sugestivos de HF foram detectados pelos médicos. Todos os CI com testes genéticos positivos (indivíduos nos quais foram identificadas mutações patogênicas ou prováveis mutações patogênicas) que autorizaram o rastreamento de seus familiares de janeiro de 2011 a julho de 2015 foram inscritos no presente estudo.
Uma amostra de sangue total foi coletada após o exame físico, e um questionário padronizado foi aplicado por pessoal treinado da equipe do Hipercol Brasil. No caso de um resultado genético positivo, o CI foi contatado e informado da importância dos resultados genéticos e da possibilidade de rastreamento familiar livre de custo. Após explicação abrangente dos riscos da doença e dos benefícios do diagnóstico precoce, solicitou-se ao CI que fornecesse informações sobre todos os familiares de primeiro grau em risco. Estes foram, então, contatados por telefone e convidados a participar do programa em cascata por profissionais de saúde especializados e treinados. O rastreamento em familiares é restrito à mesma mutação encontrada no CI, apesar da presença ou não de características clínicas da HF. Todos os familiares também assinaram o Termo de Consentimento Livre e Informado e foram submetidos à aplicação do mesmo questionário padronizado.
Variáveis do estudo
Possíveis variáveis preditoras dos CIs foram obtidas antes que os resultados dos testes genéticos estivessem disponíveis. O questionário padronizado consistiu em variáveis socioeconômicas, clínicas e bioquímicas.
As informações sobre a situação de emprego consistiam em três categorias: empregado (idade ativa, indivíduo atualmente trabalhando); desempregados (idade ativa, indivíduos que não trabalham atualmente) e inativos (estudantes, idosos e/ou aposentados, e pessoas portadoras de necessidades especiais, impossibilitados de trabalhar). O nível educacional foi definido como analfabeto, Ensino Fundamental, Ensino Médio e Ensino Superior.
A origem dos CI foi definida de acordo com quem encaminhou o paciente para o programa ou de onde ele foi encaminhado. Os CI podiam ter sido encaminhados por médicos da Clínica de Lipídeos do Instituto do Coração, que é um centro de referência de lipídeos estreitamente associado ao programa Hipercol Brasil; de centros parceiros localizados em outras instituições de atendimento terciário; de médicos particulares; pelo próprio paciente, por meio do site do programa (www.hipercolesterolemia.com.br); ou por uma unidade de cuidados primários de saúde. Os critérios de recrutamento foram os mesmos para todos os CI, independentemente da origem. A participação de outros centros parceiros no estudo foi aprovada pelo comitê de ética institucional (CAAE 00594212.0.0000.0068/n:1.213.994).
A informação clínica solicitada foi: ocorrência de história de doença aterosclerótica ou de doença cardiovascular aterosclerótica precoce familiar e/ou alteração dos níveis lipídicos; sinais clínicos, como arco córneo, xantelasmas ou xantomas. Os resultados de exames bioquímicos foram obtidos de prontuários médicos ou de exames prévios trazidos pelo paciente. Os seguintes valores foram registrados: Colesterol Total (CT), LDL-c, Lipoproteína de Alta Densidade-Colesterol (HDL-c), Triglicerídeos (TG) e glicemia de jejum. O escore Dutch Lipid Clinic Network (DLNC) e os critérios de Simon Broome foram calculados utilizando as informações disponíveis na consulta inicial. Sempre que possível, o valor basal do LDL-c foi utilizado. No caso de um paciente recebendo tratamento hipolipemiante com valores basais de LDL-c indisponíveis, o valor atual foi utilizado para calcular o escore. Esses escores clínicos foram aplicados apenas com a intenção de coletar e armazenar dados, não tendo sido utilizados como critérios para inclusão no programa.
Testes genéticos
Amostras de CI foram sequenciadas para seis genes relacionados à HF: LDLR, APOB, PCSK9, LDLRAP1, LIPA e APOE. As regiões-alvo foram consideradas como éxons de codificação mais 10pb de íntrons upstream e downstream, e capturadas utilizando reagente enriquecedor especialmente criado. Os modelos foram preparados no sistema Ion OneTouch e sequenciados na plataforma Ion Torrent PGM, com 32 amostras por corrida em um Ion Chip 316v2. As análises de bioinformática foram realizadas em um CLC Genomics Workbench 9.5 (QIAGEN) utilizando pipeline personalizado. Os requisitos mínimos de qualidade para a identificação das variantes foram: qualidade de base de PhredQ ≥ 20; cobertura da região-alvo ≥ 10 vezes; frequência do alelo variante ≥ 20% e presença bidirecional do alelo variante.
Após a filtragem utilizando MAF (frequência do alelo menos comum) ≤ 0,002 com populações-controle (NHLBI-ESP6500, AbraOM, ExAC e 1000Genomes), todas as mutações potenciais foram consultadas em relação à sua descrição prévia nas bases de dados ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/), Human Genome Mutation Database (HGMD®; http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php), British Heart Foundation (https://www.bhf.org.uk) e Jojo Genetics (http://www.jojogenetics.nl/wp/). A predição do impacto funcional foi realizada com SIFT (http://sift.jcvi.org), Protein Variation Effect Analyzer (PROVEAN) e Polymorphism Phenotyping v2 (PolyPhen-2), e mutações sem descrição prévia precisavam ser indicadas como danosas em pelo menos dois algoritmos para serem consideradas potencialmente patogênicas. Indivíduos com resultados negativos também foram examinados para a presença de grandes inserções e deleções via Amplificação Multiplex de Sondas Dependente de Ligação (MLPA; MRC-Holland). Mutações de ponto encontradas em CI foram rastreadas em familiares por meio do sequenciamento de Sanger e grandes inserções/deleções via MLPA.
Análise estatística
A variável de resposta deste estudo consistiu no número de familiares inscritos no programa por cada família, a partir de um CI positivo. A variável de resposta consiste em dados de contagem, o que sugere a aplicação de um modelo de Poisson. Porém, como a variância da variável dependente foi maior do que a média, o modelo mais adequado nessa situação foi o binomial negativo, devido à superdispersão dos dados (Figura 1). As variáveis preditivas foram baseadas nas características clínicas e socioeconômicas do CI. Inicialmente, realizamos análise de distribuição da variável resposta, e o modelo que se ajustou adequadamente a essa variável foi um que utilizou uma distribuição binomial negativa. Assim, a estimativa de variáveis preditoras para o número de familiares inscritos foi derivada de um modelo linear geral utilizando função de associação de regressão binomial negativa. As seguintes variáveis foram incluídas no modelo inicial: idade, história familiar de níveis elevados de colesterol, escore DLNC, critérios de Simon Broome, tratamento basal hipolipemiante, situação de emprego, nível basal de LDL-c ou nível mais alto durante o tratamento, nível educacional e origem. A média e o desvio padrão foram calculados para variáveis contínuas. A significância foi considerada com valor de p < 0,05. As análises estatísticas foram realizadas com os softwares Statistical Package for Social Science (SPSS), versão 19.0 (IBM) e R (Package gamlss, versão 3.3.1).
Gráfico de QQ-plot para o modelo linear geral utilizando distribuição binomial negativa.
Resultados
Um total de 183 CI foram analisados, dos quais 2.316 familiares foram contatados e 1.605 concordaram em participar do programa (taxa total de inclusão de 69,3%). Foram excluídas do estudo 87 famílias, após ajuste do modelo para análise de regressão múltipla. Elas eram relacionadas a 87 CI que possuíam dados faltantes em pelo menos uma das variáveis incluídas no modelo final. As características clínicas dos CI são mostradas na tabela 1. Em relação ao nível educacional, 30,6% dos CI cursaram o Ensino Superior, 25,1% o Ensino Médio, 22,4% o Ensino Fundamental e 4,9% eram analfabetos. A maior porcentagem de CI estava empregada (41,0%). A maioria dos CI foi encaminhada por médicos locais (81,4%), seguidos por 7,7% dos pacientes que chegaram ao programa por meio do site. Os outros 5% foram encaminhados de centros parceiros localizados em outras instituições de atendimento terciário e 3,3% de médicos particulares.
Características clínicas dos casos índice
Variáveis
n
Idade
183
(47 ± 18)
Sexo masculino
84
(45,9)
Xantomas tendinosos
26
(14,2)
Arco córneo
49
(26,8)
Doença coronariana precoce*
54
(29,5)
História familiar de doença coronariana precoce†
72
(39,3)
História familiar de níveis de LDL-c aumentados‡
98
(53,6)
Tratamento farmacológico atual§
145
(79,2)
Escore DLCN
Definitivo
74
(40,4)
Provável
48
(26,2)
Possível
33
(18,0)
Critérios Simon Broome
Definitivos
29
(15,8)
Prováveis
124
(67,8)
CT mg/dL basal (Média ± DP)
104
(405 ± 112)
CT mg/dL no nível mais alto durante o tratamento
64
(305 ± 124)
LDL-c mg/dL basal (Média ± DP)
104
(326 ± 111)
LDL-c mg/dL no nível mais alto durante o tratamento
64
(238 ± 122)
HDL-c mg/dL basal (Média ± DP)
102
(47 ± 15)
HDL-c mg/dL no nível mais alto durante o tratamento
64
(43 ± 10)
TG mg/dL basal (Média ± DP)
99
(144 ± 63)
TG mg/dL no nível mais alto durante o tratamento
32
(132 ± 77)
Doença coronária em homens com idade < 55 anos ou mulheres com idade < 60 anos
história familiar de doença coronariana (por exemplo, ataque cardíaco) em familiares de primeiro ou segundo grau (homens com < 55 anos e mulheres < 60 anos)
familiares de primeiro ou segundo grau com CT > 260 mg/dL ou LDL >160 mg/dL em crianças (> 16 anos) ou CT > 290 m /dL ou LDL > 190 mg/dL em adultos (níveis pré-tratamento ou o nível mais alto durante o tratamento)
uso atual de medicamentos hipolipemiantes (por exemplo, estatinas). DP: desvio padrão; LDL-c: lipoproteína de baixa densidade-colesterol; DLCN: Dutch Lipid Clinic Network; CT: colesterol total; HDL-c: lipoproteína de alta densidade-colesterol; TG: triglicerídeos.
A tabela 2 mostra a regressão binomial negativa univariada calculada para todas as variáveis do estudo. Apenas a história familiar de níveis alterados de lipídeos e o encaminhamento de pacientes por meio do site foram significativamente associados ao número de familiares inscritos no programa.
Parâmetros associados à inclusão de familiares no rastreamento em cascata, de acordo com a análise de regressão binomial negativa univariada
Preditores
Estimativa
Erro-padrão
Valor de p*
Idade, anos
0,005
0,003
0,141
Doença coronariana precoce†
-0,024
0,143
0,867
Escore DLCN provável
0,117
0,415
0,777
Escore DLCN possível
-0,158
0,600
0,792
História familiar de doença coronariana precoce
0,136
0,171
0,425
História familiar de níveis de LDL-c aumentados
0,395
0,201
0,048
Ensino Fundamental
0,460
0,326
0,159
Ensino Médio
0,355
0,324
0,273
Ensino Superior
0,219
0,320
0,494
Desempregado
-0,175
0,247
0,479
Inativo
-0,204
0,150
0,174
Rio de Janeiro‡
-0,751
0,400
0,060
Website§
-0,745
0,245
0,002
Tratamento farmacológico atual
0,179
0,190
0,346
LDL-c
0,001
0,000
0,112
Valor de p < 0,05
doença coronariana em homens com idade < 55 anos ou mulheres com idade < 60 anos
a origem do caso índice foi definida de acordo com quem encaminhou o paciente/de onde o paciente foi encaminhado ao programa
website: pelo próprio paciente, por meio do website do programa. DLCN: Dutch Lipid Clinic Network; LDL-c: lipoproteína de baixa densidade-colesterol
Os resultados após o ajuste do modelo são mostrados na tabela 3. A história familiar de níveis elevados de LDL-c foi preditor independente associado a maior número de familiares inscritos, com estimativa crescente de 1,76 vez quando se compararam os CI com e sem história familiar de dislipidemia. Os valores de LDL-c basais dos CI também foram associados a um maior número de familiares inscritos.
Parâmetros associados à inclusão de familiares no rastreamento em cascata, de acordo com a análise de regressão binomial negativa múltipla
Preditores
Estimativa
Erro-padrão
Valor de p*
Origem website†
-0,846
0,339
0,012
História familiar de níveis de LDL-c aumentados
0,565
0,210
0,007
LDL-c
0,002
0,000
0,004
Valor de p < 0,05
a origem do caso índice foi definida de acordo com quem encaminhou o paciente/de onde o paciente foi encaminhado ao programa. Website: pelo próprio paciente, por meio do website do programa. LDL-c: lipoproteína de baixa densidade-colesterol.
A origem de encaminhamento do CI também influenciou significativamente no número de familiares no programa. Ao comparar a origem dos CI, o número esperado de familiares diminuiu 0,42 vez para os registrados pelo website quando comparado aos CI encaminhados dentro de um centro de referência.
Discussão
O presente estudo é, até onde sabemos, o primeiro a avaliar os preditores que podem influenciar no recrutamento de familiares em um programa de rastreamento genético em cascata da HF, considerando as características clínicas, demográficas e socioeconômicas dos CI como a principal fonte. Atualmente, para cada CI com uma variante patogênica identificada por testes genéticos moleculares, cerca de 69,3% dos familiares elegíveis estão inscritos em nosso programa de rastreamento em cascata. Para cada CI positivo, identificamos 1,8 familiar afetado.13
Com base nas características dos CI, o fator que mais influencia na inclusão de familiares no programa é a história familiar de dislipidemia. Altos níveis de LDL-c nos CI também contribuíram para o recrutamento de familiares na coorte, sugerindo que alguma medida da gravidade da dislipidemia do CI também modula a disposição dos familiares de se inscreverem no programa de rastreamento da doença.
Uma vez inscritos no programa, os CI recebem recomendações sistemáticas sobre a importância do rastreamento familiar, principalmente devido à possível identificação de indivíduos em risco, o que torna o teste genético de grande importância. O teste genético não apenas confirma o diagnóstico clínico dos CI, mas também esclarece a história familiar de dislipidemia e a existência de familiares em risco.15
Os familiares frequentemente subestimam os riscos da doença e não estão cientes de sua condição, aumentando a chance de início precoce de eventos cardiovasculares ateroscleróticos.16-18 Às vezes, embora tenham conhecimento da importância do teste genético, eles permanecem relutantes em participar, devido à falta de motivação.19
A efetividade da cascata depende da concordância dos CI para recrutar familiares por meio do programa e da real inclusão destes, de modo que o cenário ideal é a inscrição de todos os indivíduos elegíveis.20,21 Encontrar a melhor estratégia para a inclusão familiar em um programa de rastreamento em cascata é relevante e tem impacto no custo-benefício da cascata geral. A coorte do DLCN em HF relatou os obstáculos encontrados no recrutamento de familiares após 5 anos de rastreamento em cascata,22 mesmo com taxa relativamente eficiente de inscritos.
Alguns dos pontos levantados mais importantes são as questões sociais e éticas que cercam os testes genéticos, mas há também o fato de que muitos participantes morreram antes de terem a chance de se inscrever na cascata. Muitos países já implementaram esta forma de detecção, demonstrando sua viabilidade,9,13,14,22 que é considerada o método padrão-ouro relatado pelas diretrizes do National Institute fot Health and Care Excellence (NICE).16
O recrutamento de CI pelo website foi um fator que diminuiu a chance de inscrição familiar quando comparado aos CI encaminhados pela Clínica de Lipídeos do Instituto do Coração. Este resultado provavelmente está relacionado à quantidade de informações que os CI recebem e à gravidade das condições deles. Aqueles recrutados por especialistas de centros terciários de saúde estão mais conscientes de seus riscos, bem como para seus familiares. Por outro lado, os recrutados pelo website são orientados apenas pelo programa de rastreamento. Portanto, a quantidade de informações fornecidas pelo programa de rastreamento pode não ser suficiente para que os CI compreendam a importância da inscrição da família, sugerindo que a conscientização deve ser enfatizada mesmo após várias consultas.
Inesperadamente, não observamos um efeito significativo do nível educacional na predição de inscrições familiares. Esta observação merece um estudo mais aprofundado, pois pode sugerir novas formas de desenvolvimento de programas educacionais e de conscientização.
Uma limitação do nosso estudo é que ele é baseado em um programa de rastreamento genético em cascata, e que os preditores identificados podem não se aplicar a cascatas baseadas em bioquímica, uma vez que a cascata genética é realizada apenas em indivíduos com uma variante patogênica da HF.
Conclusão
O diagnóstico precoce por meio do rastreamento em cascata é importante para a prevenção de fatores de risco, pois, ao longo do tempo, os indivíduos seriam diagnosticados precocemente em suas vidas ou mesmo na infância, permitindo tratamento adequado e prevenção de riscos adicionais. Com o rastreamento em cascata, os familiares são diagnosticados em uma idade mais jovem, que é o principal fator que caracteriza a eficácia deste método diagnóstico. Após 4 anos de rastreamento, a história familiar de dislipidemia e os níveis elevados de LDL-c são os fatores que mais influenciaram na inclusão de familiares na cascata genética. Uma abordagem profissional certamente desempenha um papel importante na adesão da família, e nossos resultados lançaram as bases para o planejamento de estudos de intervenção específicos destinados a testar novas abordagens para aumentar a inclusão familiar.
O apoio financeiro da Sociedade Hospital Samaritano e do Ministério da Saúde (PROADI-SUS; SIPAR: 25000.180.672/2011-81) e da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), concessão nº 2013/17368-0, é reconhecido com agradecimentos.
Agradecimentos
A todos os pacientes da coorte e a toda equipe profissional do Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular do Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.