Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC jZ6Bq9WXKpK8m5XB9sPhWqh S0066-782X2018001500400 S0066-782X2018005011103 10.5935/abc.20180152 Original Article Fasting/Refeeding Cycles Prevent Myocardial Dysfunction and Morphology Damage in the Spontaneously Hypertensive Rats Pinotti Matheus Fécchio 1 Matias Amanda Martins 2 Sugizaki Mário Mateus 3 Nascimento André Ferreira do 3 Pai Maeli Dal 1 4 Leopoldo Ana Paula Lima 2 Cicogna Antônio Carlos 1 Leopoldo André Soares 2 Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina Departamento de Clínica Médica Botucatu SP Brazil Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP - Brazil Universidade Federal do Espírito Santo Centro de Educação Física e Desportos Departamento de Desportos Vitória ES Brazil Departamento de Desportos, Centro de Educação Física e Desportos, Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), Vitória, ES - Brazil Universidade Federal de Mato Grosso Cuiabá MT Brazil Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Cuiabá, MT - Brazil Universidade Estadual Paulista Instituto de Biosciências Departamento de Morfologia Botucatu SP Brazil Departamento de Morfologia, Instituto de Biosciências da Universidade Estadual Paulista UNESP, Botucatu, SP - Brazil Mailing Address: André Soares Leopoldo, Avenida Fernando Ferrari, 514. CEP 29075-410, Goiabeiras, Vitória, ES - Brazil. E-mail: andresoaresleopoldo@gmail.com, andre.leopoldo@ufes.br

Author contributions

Conception and design of the research: Pinotti MF, Cicogna AC, Leopoldo AS; Acquisition of data: Pinotti MF, Matias AM, Sugizaki MM, Nascimento AF, Pai MD, Leopoldo APL; Analysis and interpretation of the data: Pinotti MF, Sugizaki MM, Nascimento AF, Pai MD, Leopoldo APL; Statistical analysis: Sugizaki MM, Nascimento AF, Pai MD, Leopoldo APL; Obtaining financing: Cicogna AC; Writing of the manuscript: Pinotti MF, Matias AM, Cicogna AC, Leopoldo AS; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Matias AM, Pai MD, Leopoldo APL, Cicogna AC, Leopoldo AS.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 20 08 2018 09 2018 111 03 400 409 10 11 2017 09 05 2018 09 05 2018 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Caloric restriction is known to impair the cardiac function and morphology in hypertrophied hearts of spontaneously hypertensive rats (SHR); however, the influence of fasting/refeeding (RF) is unknown.

 Objective:

To investigate the fasting/refeeding approach on myocardial remodeling and function. In addition, the current study was designed to bring information regarding the mechanisms underlying the participation of Ca2+ handling and b-adrenergic system.

 Methods:

Sixty-day-old male SHR rats were submitted to food ad libitum (C), 50% food restriction (R50) or RF cycles for 90 days. Cardiac remodeling was assessed by ultrastructure analysis and isolated papillary muscle function. The level of significance considered was 5% (a = 0.05).

 Results:

The RF rats presented lower cardiac atrophy than R50 in relation to C rats. The C rats increased weight gain, R50 maintained their initial body weight and RF rats increased and decreased weight during RF. The RF did not cause functional impairment because the isotonic and isometric parameters showed similar behavior to those of C. The isotonic and isometric cardiac parameters were significantly elevated in RF rats compared to R50 rats. In addition, the R50 rats had cardiac damage in relation to C for isotonic and isometric variables. While the R50 rats showed focal changes in many muscle fibers, the RF rats displayed mild alterations, such as loss or disorganization of myofibrils.

Conclusion:

Fasting/refeeding promotes cardiac beneficial effects and attenuates myocardial injury caused by caloric restriction in SHR rats, contributing to reduce the cardiovascular risk profile and morphological injuries. Furthermore, RF promotes mild improvement in Ca2+ handling and b-adrenergic system.

 Keywords: Rats Hypertension Myocardial/dysfunction Chronic Disease Fasting, Reffeding Caloric Restriction FAPESP 04/04654-6 Sources of Funding This study was funded by FAPESP number 04/04654-6. Introduction

The major causes of chronic non-communicable diseases (NCD)-attributable mortality are cardiovascular disease, cancers, chronic respiratory disease and diabetes.1 These conditions share a small number of behavioral risk factors, which aggravate the NCD and include unhealthy diet, which is closely related to hypertension.

Caloric restriction (CR) has been recognized throughout history for promoting several beneficial effects.2,3 Nevertheless, although CR may prevent cardiac damage in hypertrophied hearts of spontaneously hypertensive rats (SHR),4 it is common to note body weight fluctuations typically referred to as the "yo-yo syndrome" while on a regimented diet, and these fluctuations have shown deleterious cardiovascular effects.5,6 Researches from our laboratory and others have shown that, when dietary restriction is severe, it can promote morphological injuries and impairment of cardiac function in normal or SHR rats.7-12

Recently, intermittent fasting or fasting/refeeding has also shown to extend lifespan and have beneficial health effects as compared to ad libitum food consumption,3,13,14 as it enhances cardiovascular function and improves several risk factors for cardiovascular diseases.15,16 This dietary approach also implies a protective effect against oxidative stress, lower rates of kidney disease,17 prolongation of reproductive function,18 and leads to the normalization of resting energy expenditure and protein synthesis recuperation, but can cause many metabolic disturbances.19,20

In normotensive rats submitted to food restriction, chronic refeeding decreased the incidence of cardiac arrhythmia and reversed the depletion of heart proteins.21,22 Food restriction caused cardiac function disturbances that were almost completely reversed back to normal after chronic refeeding in the isolated rat heart.23 In our laboratory, we observed that fasting/refeeding cycles reversed the mechanical dysfunction and attenuated the structural injuries in papillary muscles caused by CR in normotensive rats.24 Nevertheless, it is not yet clear whether fasting/refeeding cycles are able to promote similar effects and/or reverse the cardiac damage induced by food restriction in SHR rats.7-12 Thus, the objective was to investigate the fasting/refeeding approach on myocardial remodeling and function. In addition, the current study was designed to bring information regarding the mechanisms underlying the participation of Ca2+ handling and b-adrenergic system. Our hypothesis is that fasting/refeeding condition would attenuate the myocardial injury caused by food restriction and would contribute to normal cardiac remodeling in SHR rats without alterations in the Ca2+ handling and b-adrenergic system.

 Methods Animal model and experimental protocol

Sixty-day-old male SHR were distributed into three groups: control (C, n = 7); food-restriction (R50, n = 7); and fasting/refeeding cycles (RF, n = 7). The C group was fed Labina rat chow containing 7.0% fat, 20.55% protein, 62.95% carbohydrate, 5.0% fiber and 4.5% moisture (Agribands, Brazil), and water was provided ad libitum. Table 1 shows the ingredient composition of Labina rat chow. The R50 group received 50% of the amount of food consumed by the C group. The RF group was submitted to cycles of 50% food restriction and refeeding ad libitum weekly. All rats were maintained on this dietary regimen for 90 days and were then euthanized.

Ingredient composition of the Labina rat experimental diet
Ingredient (g/kg)
Starch 397.5
Dextrinized Corn Starch 132.0
Sucrose 100.0
Carbohydrates 629.5
Casein 200.0
L-Cysteine 3.0
Choline bitartrate 2.5
Protein 205.5
Soy oil 70.0
Fat 70.0
Fiber 50.0
Vitamin mix 10.0
Mineral mix 35.0
Total 1000

All animals were housed in individual cages in a room maintained at 23ºC with a 12-hour light/dark cycle and were weighed once a week. Initial and final body weights (IBW and FBW, respectively), the ratios between left and right ventricular weights to final body weight (LVW/FBW and RVW/FBW, respectively) and papillary muscle cross-sectional area (CSA) were also measured. All experiments and procedures were performed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by the United States National Institutes of Health and were approved by the ethics committee of Botucatu School of Medicine, UNESP, São Paulo, Brazil.

 Systolic blood pressure

Systolic blood pressure evaluation was assessed by the non-invasive tail-cuff method with a Narco BioSystems Electro-Sphygmomanometer (International Biomedical, Austin, TX, USA) at the beginning and after the end of the experimental protocol. The average of two pressure readings was recorded for each animal.

 Isolated muscle performance

Cardiac intrinsic contractile performance was evaluated by studying isolated left ventricular (LV) papillary muscle as described previously.9,10,12 Isometric contraction parameters, including peak of developed tension (DT, g/mm2, defined as peak isometric tension minus resting tension), resting tension (RT, g/mm2), time to peak tension (TPT, ms), peak isometric tension development rate (+dT/dt, g/mm2/s) and maximum tension decline rate (-dT/dt, g/mm2/s), time from peak tension to 50% relaxation (RT50, ms) were determined. The isotonic parameters were percentage of shortening (PS, %), time to peak shortening (TPS, ms), maximum shortening velocity (-dL/dt, ML/s) and maximum relaxation velocity (+dL/dt, ML/s).

The mechanical behavior of the papillary muscle was evaluated under baseline conditions at 1.25 mM [Ca2+] and after the following inotropic maneuvers: increase in extracellular Ca2+ concentration from 0.625 to 1.25, 2.5 and 5.2 mM, and b-adrenergic stimulation with 0.01, 0.1 and 1.0 µM isoproterenol. The parameters used to characterize papillary muscle were as follows: length (mm), weight (mg) and CSA (mm2). Muscle length (ML) at peak DT was defined as Lmax in vitro and measured with a Gartner cathetometer (Chicago, IL, USA). To compare the mechanical function between different muscle lengths, isometric and isotonic parameters were normalized to CSA and Lmax.

 Morphological study

For the ultrastructural study (three animals per group), small pieces of the LV papillary muscle were fixed in Karnovsky's fixative in 0.12 M phosphate, pH 7.2, for 1-2 hours and were postfixed in 1% osmium tetroxide in 0.1 M phosphate buffer for 2 hours.25 After dehydration in a graded ethanol series, the samples were embedded in epoxy resin. Ultrathin sections were cut from selected areas with a diamond knife, double-stained with uranyl acetate and lead citrate, and examined using a Philips EM 301 electron microscope. The LV myocyte CSA was measured using a compound microscope attached to a computerized imaging analysis system (Image-Pro Plus 3.0, Media Cybernetics, Silver Springs, MD, USA).

 Statistical analysis

Statistical analyses were performed using SigmaStat 3.5 software (SYSTAT Software Inc., San Jose, CA, USA). Normally distributed variables from general characteristics and myocardial function at baseline condition were reported as means ± standard deviation (SD). Comparisons between groups were performed using one-way analysis of variance (ANOVA) for independent samples. A repeated-measures two-way ANOVA was utilized to evaluate the body weight evolution and the positive and negative inotropic effects on myocardial function. When significant differences were found (p < 0.05), post hoc Tukey's or Bonferroni's test for multiple comparisons was carried out. The level of significance considered was 5%.

The sample size (n) was performed using the equation: n = 1 + [2C * (s/d)2], where C (z score a + z score b)2 is dependent on the values chosen for statistical power of the test (90%; type II error) and level of significance (0.05; type I error); the standard deviation value (s) adopted was 0.25, and the minimal difference between groups (d) was 0.5. The sample size needed to detect a significant difference between groups is 6.25 rats per group; however, we decided to use 7 animals per group for most of the analyses.

 Results General and morphological characteristics of rats

Significantly higher values of FBW, LVW, RVW, LVW/FBW and RVW/FBW were found in C compared to R50 and RF rats (Table 2). After 12 weeks, fasting/refeeding cycles promoted a substantial elevation of FBW and food consumption that were significantly greater than those in the R50 group. In relation to cardiac parameters, the RF and R50 groups presented different behavior. Specifically, the LVW (RF: 12.12% and R50: 48.5%; p < 0.05), RVW (RF: 19.04% and R50: 47.62%; p < 0.05), LVW/FBW (RF: 6.64% and R50: 19.2%; p < 0.05) and RVW/FBW (RF: 12.06% and R50: 18.96%; p < 0.05) were reduced in percentage in the RF and R50 rats as compared to C rats. Nevertheless, the fasting/refeeding cycles presented lower cardiac atrophy than R50 rats in relation to C rats.

General characteristics of rats
Parameters Groups
C R50 RF
IBW (g) 247 ± 15 248 ± 12 249 ± 13
FBW (g) 366 ± 14 236 ± 17* 342 ± 21*†
FC (g/week) 159 ± 23 77 ± 4* 130 ± 55†
SBP initial (mmHg) 177 ± 8 177 ± 5 181 ± 7
SBP final (mmHg) 163 ± 13 157 ± 15 156 ± 5
LVW (g) 0.99 ± 0.04 0.51 ± 0.01* 0.87 ± 0.08*†
RVW (g) 0.21 ± 0.02 0.11 ± 0.01* 0.17 ± 0.02*†
LVW/FBW (mg/g) 2.71 ± 0.05 2.19 ± 0.16* 2.53 ± 0.08*†
RVW/FBW (mg/g) 0.58 ± 0.04 0.47 ± 0.05* 0.51 ± 0.05*

C: control group; R50: animals with food restriction of 50%; RF: animals with alternation between food restriction of 50% and refeeding; IBW: initial body weight; FBW: final body weight; FC: food consumption; SBP: systolic blood pressure; LVW: left ventricle weight; RVW: right ventricle weight. Values are means ± SD (n = 7).

significant at p < 0.05 vs. C; † p < 0.05 vs. R50. One-way ANOVA and post hoc Tukey’s test.

In addition, C rats experienced increasing weight gain, while R50 rats maintained their IBW after 12 weeks of experimental protocol (Figure 1). On the other hand, RF rats gained weight dependent on food intake, with body weight increasing and decreasing during refeeding and fasting, respectively (Figure 1).

Changes in body weight after 90 days of treatment. Control (C; closed squares, n = 7), animals with food restriction of 50% (R<sub>50</sub>; closed triangles, n = 7) and animals with alternation between food restriction of 50% and refeeding (RF; open circles, n = 7). Values are means ± SD; * significant at p < 0.05, R<sub>50</sub>vs. C; <sup>†</sup> p < 0.05, RF vs. R<sub>50</sub>; <sup>#</sup>p < 0.05, C vs. RF. Repeated measures two-way ANOVA; post hoc Bonferroni's test. Source: Research team.

Isolated muscle performance

Fasting/refeeding cycles did not cause functional impairment (Tables 3 and 4). Nevertheless, the isotonic [-dL/dt, TPS, and RT50)] and isometric parameters (TPT, +dT/dt, -dT/dt, RT50) were significantly elevated in RF rats compared to those in the R50 group, indicating that fasting/refeeding cycles preserves the contraction and relaxation phase of cardiac function. Furthermore, the R50 rats presented cardiac damage in relation to the C group for isotonic and isometric variables. In addition, the papillary muscle CSA showed no difference among groups.

Isotonic contraction of groups at baseline condition
Groups
C R50 RF
PS (%) 19 ± 3 18 ± 3 20 ± 2
-dL/dt (ML/s) 1.89 ± 0.40 1.60 ± 0.36 2.19 ± 0.45†
TPS (ms) 168 ± 26 205 ± 14* 161 ± 14†
+dL/dt (ML/s) 4.28 ± 1.26 4.13 ± 1.11 4.79 ± 0.86
RT50 (ms) 58 ± 10 76 ± 12* 53 ± 9†
CSA (mm2) 0.95 ± 0.22 0.85 ± 0.17 0.91 ± 0.18

C: control group; R50: animals with food restriction of 50%; RF: animals with alternation between food restriction of 50% and refeeding; PS: percentage of shortening; -dL/dt: maximum shortening velocity; TPS: time to peak shortening; + dL/dt: maximum relaxation velocity; RT50: time from peak tension to 50% relaxation; CSA - muscle cross-sectional area. Values are means ± SD (n = 7) at basal calcium concentration (1.25 mM);

significant at p < 0.05 vs. C; † p < 0.05 vs. R50. One‑way ANOVA and post hoc Tukey’s test

Isometric contraction of groups at baseline condition
Groups
C R50 RF
DT (g/mm2) 6.17 ± 1.24 6.37 ± 1.14 7.18 ± 1.20
RT (g/mm2) 1.06 ± 0.12 1.12 ± 0.31 1.07 ± 0.17
+dT/dt (g/mm2/s) 77 ± 17 63 ± 13 93 ± 18†
TPT (ms) 146 ± 27 184 ± 19* 128 ± 25†
-dT/dt (g/mm2/s) 29 ± 5 22 ± 4 33 ± 9†
RT50 (ms) 174 ± 40 224 ± 32* 171 ± 21†
CSA (mm2) 0.95 ± 0.22 0.85 ± 0.17 0.91 ± 0.18

C: control group; R50: animals with food restriction of 50%; RF: animals with alternation between food restriction of 50% and refeeding; DT: peak developed tension; RT: resting tension; TPT: time to peak tension; +dT/dt: maximum tension development rate; -dT/dt: maximum tension decline rate; RT50: time from peak tension to 50% relaxation; CSA: muscle cross-sectional area. Values are means ± SD (n = 7) at basal calcium concentration (1.25 mM);

significant at p < 0.05 vs. C; † p < 0.05 vs. R50. One-way ANOVA and post hoc Tukey’s test.

Calcium stimulation

After baseline condition, the increases in extracellular Ca2+ concentrations from 0.625 to 5.2 mM resulted in a positive inotropic effect in myocytes from all groups (Figures 2A-F). However, the results shown in Figures 2B, C and E indicate that extracellular Ca2+ (1.25 and 2.5 mM) induced a greater response in +dT/dt (RF: 99.1 ± 23.6; 132.1 ± 36.2 g/mm2/s vs. R50: 63.2 ± 12.8; 91.5 ± 22.0 g/mm2/s; p < 0.05, respectively), -dT/dt (RF: 30.6 ± 5.9; 35.9 ± 5.8 g/mm2/s vs. R50: 22.0 ± 4.4; 28.5 ± 6.1 g/mm2/s; p < 0.05, respectively) and -dL/dt (RF: 2.19 ± 0.45; 2.77 ± 0.51 ML/s vs. R50: 1.47 ± 0.24; 1.99 ± 0.31 ML/s; p < 0.05, respectively) in the RF rats than in the R50 rats. In addition, -dT/dt and -dL/dt were significantly diminished in the R50 myocardium at Ca2+ concentration of 5.2 mM when compared to those in the RF group. When submitted to inotropic maneuvers, DT, PS and +dL/dt were similar between RF and R50. In relation to the cardiac function of C rats after Ca2+stimulation, the fasting/refeeding cycles presented similar behavior (Figures 2A-F). The only significant result between C and R50 was noted in the highest Ca2+ concentration (5.2 mM); -dL/dt was significantly lower in R50 than in C group (C: 2.66 ± 0.35 vs. R50: 2.18 ± 0.33 ML/s, p < 0.05) (Figure 2E).

Effects of increased extracellular calcium on myocardial isotonic and isometric parameters in papillary muscles from control (C = black bars), animals with food restriction of 50% (R<sub>50</sub> = gray bars) and animals with alternation between food restriction of 50% and refeeding (RF = white bars). Extracellular calcium experiment: 7 animals each group. Isometric parameters: A: DT (peak developed tension normalized per cross-sectional area); B: +dT/dt (peak isometric tension development rate normalized per cross-sectional area); C: -dT/dt, g/mm<sup>2</sup>/s (maximum tension decline rate normalized per cross-sectional area). Isotonic parameters: D: PS (percentage of shortening); E: -dL/dT (maximum shortening velocity); F: +dL/dT (maximum relaxation velocity). L<sub>max</sub>: muscle length at peak DT. Values are means ± SD; * significant at p < 0.05 vs. C; <sup>†</sup> p < 0.05 vs. R<sub>50</sub>. Repeated measures two-way ANOVA and post hoc Tukey's test. Source: Research team.

Isoproterenol stimulation

The fasting/refeeding cycles increased +dT/dt, -dT/dt and -dL/dt at the highest isoproterenol concentration (1 µM) compared to those in the R50 group, indicating a positive inotropic effect in myocytes. In contrast, the RF group promoted a reduction in +dL/dt than the R50 group at the same isoproterenol concentration (Figure 3F). In addition, the similar effects were noted in +dT/dt and -dT/dt at 1µM isoproterenol of the C group when compared to the R50 (Figures 3B and C). Furthermore, RF rats presented higher +dL/dt at baseline and isoproterenol concentrations (0.01 µM) in comparison to C group (Figure 3F). There were no significant differences in mechanical data (DT and PS) under inotropic stimulation with isoproterenol among the groups (Figures 3A and D).

Effects of isoproterenol stimulation on myocardial function in papillary muscles from control (C = black bars), animals with food restriction of 50% (R<sub>50</sub> = gray bars) and animals with alternation between food restriction of 50% and refeeding (RF = white bars). Isoproterenol stimulation experiment: 7 animals each group. Isometric parameters: A: DT (peak developed tension normalized per cross-sectional area); B: +dT/dt (peak isometric tension development rate normalized per cross-sectional area); C: -dT/dt, g/mm<sup>2</sup>/s (maximum tension decline rate normalized per cross-sectional area). Isotonic parameters: D: PS (percentage of shortening); E: -dL/dt (maximum shortening velocity at L<sub>max</sub>); F: +dL/dt (maximum relaxation velocity at L<sub>max</sub>). L<sub>max</sub>: muscle length at peak DT. Values are means ± SD; * significant at p < 0.05 vs. C; <sup>†</sup> p < 0.05 vs. R<sub>50</sub>.Repeated measures two-way ANOVA and post hoc Tukey's test. Source: Research team.

Myocardial morphology

The C group rats showed normal morphological characteristics, with myofibrils filling the entire sarcoplasm, well-defined sarcomeres, mitochondria with lamellar cristae, sarcoplasmic membranes with regular aspect, sarcoplasmic reticulum among myofibrils and nuclei with uncondensed chromatin (Figures 4A and B). The R50 group presented focal changes, including disorganization or absence of myofibrils, some polymorphic mitochondria with a decreased number of cristae and areas of sarcoplasmic reticulum dilation (Figures 4C, D and E). In RF rats, the only change observed was a loss of mitochondrial cristae in some organelles. Most of the fibers had normal morphology (Figures 4F and G).

Ultrastructural study of LV papillary muscle (n = 3 per group). Photographs A and B correspond to the control group, photographs C, D and E to the food-restriction (R<sub>50</sub>) group and photographs F and G to the refeeding group (RF) group. The control group showed preserved ultrastructure with normal myofibrils (M), sarcoplasmic reticulum (arrowhead), mitochondria (mi), nuclear membrane (N) and plasma membrane (arrow). Food restriction rats showed cellular changes, including polymorphic mitochondria (*), myofibril disorganization (**), and infolding of the plasma membrane (arrow). The papillary muscle during refeeding showed preserved myofibrils (M), mitochondria (mi), and plasma membranes (arrow), polymorphic mitochondria (*) and capillary (C). Source: Research team.

Discussion

Interestingly, little information is available on the relationship between cardiac function and morphology during fasting/refeeding in SHR hypertrophied hearts. Within this context, this dietary regimen has become the subject of considerable scientific interest for weight loss and improving cardiometabolic health. Thus, the main finding of this study was that fasting/refeeding attenuated the damage caused by CR. The results reveal that fasting/refeeding showed increased isotonic and isometric parameters at baseline, as well as improved the myocardial inotropic response to calcium and isoproterenol. In addition, fasting/refeeding prevented cardiac atrophy and morphological injuries.

Less body weight gain was observed in the RF group than in the C group (Table 1, Figure 1), but more body weight gain than in the R50 group. According to literature, body weight reduces approximately 13% when the animals are submitted to 48 hours of fasting.25 This result appears to be mediated by hormones, such as leptin that acts regulating appetite and weight gain. A rapid inhibition of ob gene expression in the white adipose tissue occurs in fasting, and this effect can be reversed by refeeding.25,26

Cardiac hypertrophy, a major pathological process involved in cardiac remodeling, initially serves as a compensatory mechanism to preserve cardiac output.27 Cardiac remodeling may be regarded as a first step in the sequence of adaptive responses of the heart to stress caused by a large number of physiological and pathological conditions, such as changes in volume and pressure loads and/or metabolic alterations.28 Current study revealed that fasting/refeeding induced cardiac atrophy visualized by reduced total heart and left ventricle, as well as in the LVW/FBW. A decrease in left ventricle weight relative to body weight is very common in small animals submitted to food restriction22 and fasting/refeeding.29 Inhibition of myocardial protein synthesis and reduction in average protein half-lives are possible explanations for reduced cardiac mass under starvation.30 Protein synthesis, an anabolic process, is required for cardiac hypertrophy. Two major pathways regulating protein synthesis are inhibited by AMPK, a primary regulator of metabolic pathways, which plays an essential role in a wide variety of cellular processes to protect against cardiac hypertrophy.31 Therefore, cardiac atrophy could be regulated by the common signaling pathway of AMPK in the hypothalamus.

In the ultrastructural analysis, food restriction caused focal morphological damage in most papillary muscle fibers. The same alterations were less intense in the intermittent refeeding condition. Intermittent refeeding seems to aid in the attenuation of the mechanisms responsible for this damage and seems to act by enhancing protein anabolism and retarding protein degradation. Recent findings suggest that the beneficial effects of refeeding result from a reduction in oxidative injury and an increase in cellular stress resistance.2,32 One possible mechanism for our result may be linked to the expression of atrogin-1, an E3 ubiquitin ligase also known as muscle atrophy F-box (MAFbx). E3-ligases are part of the ubiquitin proteasome pathway utilized for protein degradation during muscle atrophy. The literature has shown that atrogin-1/MAFbx expression results in muscle atrophy during catabolic condition.33 In cardiac muscle, atrogin-1/MAFbx expression increases during heart failure and pressure overload.33,34

The isolated papillary muscle analysis showed that food restriction promotes cardiac dysfunction, but refeeding condition prevents the state. These stimuli provide evidence that the improvement of myocardial function assigned to fasting/refeeding cycles was related to changes in intracellular Ca2+ handling, mainly in the recapture and/or extrusion of cytosolic Ca2+, and b-adrenergic system. Nevertheless, the lower response of food restricted rats to the increase of extracellular Ca2+ concentration can be related to changes in the general mechanisms involved in Ca2+ cycling such as sarcolemmal Na+/Ca2+ exchanger, sarcolemmal L-type channel, sarcoplasmic reticulum (SR), ryanodine receptor, SR Ca2+ uptake pump, and the myofilament Ca2+ sensitivity.35 In relation to RF, this process may be faster and more balanced, but no study was found to support this statement and show the activity and protein expression of Ca2+ handling regulatory proteins.

Another explanation could be related to the role of cytokine in intermittent fasting mediated cardioprotection. The influx of inflammatory cells and production of pro-inflammatory mediators contribute to myocardial injury.36 Nevertheless, adiponectin can protect myocardial cells against ischemic injury by activating the cyclic AMP-dependent protein kinase - Akt pathway, being the latter mediated, in part, by caloric restriction.37 Thus, the beneficial effects of fasting/refeeding may function through anti-inflammatory cytokine pathways.

Few studies have evaluated the b-adrenergic components in experimental models of fasting/refeeding.25,35 Some studies have shown that cardiac function impairment is related to b-adrenergic system changes,35 while other researchers have not reported reduced b-adrenergic response.25 The literature shows that a decrease in cardiac b-receptor number has been reported in several hypertensive models known to be associated with an increase in sympathetic nerve activity, including SHR.38 Thus, the association between increased sympathetic activity and cardiac b-receptor downregulation is sufficiently close to suggest that the finding of decreased b-receptor number after starvation and refeeding is indicative of persistently elevated cardiac sympathetic drive. However, in the current study, there is no damage of b-system in the RF rats, since the cardiac function was similar to that of the C group. The present data tend to support the hypothesis that isoproterenol stimulation reveals that the b-adrenergic system and cAMP phosphorylation of proteins related to Ca2+ handling were preserved in refeeding rats.

Thus, fasting/refeeding cycles have become the subject of considerable scientific interest as a potential dietary approach for weight-loss and improving cardiometabolic health. The beneficial effects of the intermittent fasting result from at least two mechanisms: the oxidative stress and the stress resistance hypothesis.39 According to literature, during the intermittent fasting, there are fewer free radicals produced in the mitochondria of cells and, therefore, less oxidative damage to the cells.39 Another hypothesis is the resistance to stress that is associated with increased resistance of cells in many different tissues to injury induced by oxidative, genotoxic and metabolic insults. The conservation of stress resistance responses to intermittent fasting across a range of species provides strong evidence that this mechanism contributes to the lifespan-extending action of dietary restriction.39

It is worth noting that according to studies in rodents and humans, intermittent food restriction is capable of promoting weight loss and/or favorably influence an array of cardiometabolic health indices, with equal or greater efficacy than conventional continuous energy restriction approaches, such as food restriction.29 Fasting/refeeding cycles increase cardiac tolerance to ischemic injury and can affect the development of cardiovascular disease, preventing postinfarct cardiac remodeling, and impending chronic heart failure.29 Comparing the two dietary approaches, studies show that caloric restriction may exert its beneficial effects primarily by reducing oxidative stress, whereas RF may act primarily by a stress resistance mechanism,40 which can have a cardioprotective effect.

Study limitations

The study did not investigate the activity and protein expression of Ca2+ handling regulatory proteins known to affect myocardial contraction and relaxation. In addition, the current study did not evaluate the involvement of anti-inflammatory cytokines, free-radical production and cellular stress response, which could help and consolidate the beneficial effects of intermittent fasting.

 Conclusion

We demonstrated that fasting/refeeding promotes cardiac beneficial effects and attenuates myocardial injury caused by CR in SHR rats, contributing to the reduction of cardiovascular risk profile and morphological injuries. Furthermore, RF promotes mild improvement in the Ca2+ handling and b-adrenergic system.

Sources of Funding This study was funded by FAPESP number 04/04654-6.

Study Association This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Ethics approval and consent to participate This study was approved by the Ethics Committee on Animal Experiments of the Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP under the protocol number 439/2004.

 References 1 World Health Organization. (WHO). Noncommunicable doenças WHO. [Cited in 2016 Sep 26]. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs355/en/ World Health Organization Noncommunicable doenças WHO 2016 Sep 26 Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs355/en/ 2 Han X, Turdi S, Hu N, Guo R, Zhang Y, Ren J. Influence of long-term caloric restriction on miocardial and cardiomyocyte contractile function and autophagy in mice. J Nutr Biochem. 2012;23(12):1592-9. Han X Turdi S Hu N Guo R Zhang Y Ren J Influence of long-term caloric restriction on miocardial and cardiomyocyte contractile function and autophagy in mice. J Nutr Biochem 2012 23 12 1592 1599 3 Martin B, Mattson MP, Maudsley S. Caloric restriction and intermittent fasting: two potential diets for successful brain aging. Ageing Res Rev. 2006;5(3):332-53. Martin B Mattson MP Maudsley S Caloric restriction and intermittent fasting: two potential diets for successful brain aging Ageing Res Rev 2006 5 3 332 353 4 Dolinsky VW, Morton JS, Oka T, Robillard-Frayne I, Bagdan M, Lopaschuk GD, et al. Calorie restriction prevents hypertension and cardiac hypertrophy in the spontaneously hipertensive rat. Hypertension. 2010;56(3):412-21. Dolinsky VW Morton JS Oka T Robillard-Frayne I Bagdan M Lopaschuk GD Calorie restriction prevents hypertension and cardiac hypertrophy in the spontaneously hipertensive rat Hypertension 2010 56 3 412 421 5 Keenan KP, Laroque P, Ballam GC, Ballam GC, Soper KA, Dixit R, et al. The effects of diet, ad libitum overfeeding, and moderate dietary restriction on the rodent bioassay: the uncontrolled variable in safety assessment. Toxicol Pathol. 1996;24(6):757-68. Keenan KP Laroque P Ballam GC Ballam GC Soper KA Dixit R The effects of diet, ad libitum overfeeding, and moderate dietary restriction on the rodent bioassay: the uncontrolled variable in safety assessment Toxicol Pathol 1996 24 6 757 768 6 Cicogna AC, Padovani CR, Okoshi K, Aragon FF, Okoshi MP. Myocardial function during chronic food restriction in isolated hypertrophied cardiac muscle.. Am J Med Sci. 2000;320(4):244-8. Cicogna AC Padovani CR Okoshi K Aragon FF Okoshi MP Myocardial function during chronic food restriction in isolated hypertrophied cardiac muscle Am J Med Sci 2000 320 4 244 248 7 Haddad F, Bodel PW, McCue SA, Herrick PE, Baldwin KM. Food restriction-induced transformations in cardiac functional and biochemical properties in rats. J Appl Physiol (1985). 1993;74(2):606-12. Haddad F Bodel PW McCue SA Herrick PE Baldwin KM Food restriction-induced transformations in cardiac functional and biochemical properties in rats J Appl Physiol (1985) 1993 74 2 606 612 8 Melo DS, Costa-Pereira LV, Santos CS, Mendes BF, Costa KB, Santos CF, et al. Severe calorie restriction reduces cardiometabolic risk factors and protects rat hearts from ischemia/reperfusion injury. Front Physiol. 2016 Apr 8;7:106. Melo DS Costa-Pereira LV Santos CS Mendes BF Costa KB Santos CF Severe calorie restriction reduces cardiometabolic risk factors and protects rat hearts from ischemia/reperfusion injury. Front Physiol. 08 04 2016 7 106 106 9 Okoshi K, Matsubara LS, Okoshi MP, Cicogna AC, Fioretto JR, Padovani CR, et al. Food restriction-induced myocardial disfunction demonstrated by the combination of in vivo and in vitro studies. Nutr Res. 2002;22(11):1353-64. Okoshi K Matsubara LS Okoshi MP Cicogna AC Fioretto JR Padovani CR Food restriction-induced myocardial disfunction demonstrated by the combination of in vivo and in vitro studies Nutr Res 2002 22 11 1353 1364 10 Cicogna AC, Padovani CR, Okoshi K, Matsubara LS, Aragon FF, Okoshi MP. The influence of temporal food restriction on the performance of isolated cardiac muscle. Nutr Res. 2001;21(4):639-48. Cicogna AC Padovani CR Okoshi K Matsubara LS Aragon FF Okoshi MP The influence of temporal food restriction on the performance of isolated cardiac muscle Nutr Res 2001 21 4 639 648 11 Gut AL, Okoshi MP, Padovani CR, Aragon FF, Cicogna AC. Myocardial dysfunction induced by food restriction is related to calcium cycling and beta-adrenergic system changes. Nutr Res. 2003;23(7):911-9. Gut AL Okoshi MP Padovani CR Aragon FF Cicogna AC Myocardial dysfunction induced by food restriction is related to calcium cycling and beta-adrenergic system changes Nutr Res 2003 23 7 911 919 12 Okoshi MP, Okoshi K, Pai VD, Pai-Silva MD, Matsubara LS, Cicogna AC. Mechanical, biochemical, and morphological changes in the heart from chronic food-restricted rats. Can J Physiol Pharmacol. 2001;79(9):754-60. Okoshi MP Okoshi K Pai VD Pai-Silva MD Matsubara LS Cicogna AC Mechanical, biochemical, and morphological changes in the heart from chronic food-restricted rats Can J Physiol Pharmacol 2001 79 9 754 760 13 Ahmet I, Wan R, Mattson M, Lakatta EG, Talan MI. Chronic alternate-day fasting results in reduced diastolic compliance and diminished systolic reserve in rats. J Card Fail. 2010;16(10): 843-53. Ahmet I Wan R Mattson M Lakatta EG Talan MI Chronic alternate-day fasting results in reduced diastolic compliance and diminished systolic reserve in rats J Card Fail 2010 16 10 843 853 14 Longo VD, Mattson PM. Fasting: molecular mechanisms and clinical applications. Cell Metab. 2014;19(2):181-92. Longo VD Mattson PM Fasting: molecular mechanisms and clinical applications Cell Metab 2014 19 2 181 192 15 Fann DY, Ng GY, Poh L, Arumugam TV. Positive effects of intermittent fasting in ischemic stroke. Exp Gerontol. 2017 Mar;89:93-102. Fann DY Ng GY Poh L Arumugam TV Positive effects of intermittent fasting in ischemic stroke Exp Gerontol. 03 2017 89 93 102 16 Snorek M, Hodyc D, Sedivý V, Durišová J, Skoumalová A, Wilhelm J, et al. Short-term fasting reduces the extent of myocardial infarction and incidence of reperfusion arrhythmias in rats. Physiol Res. 2012;61(6):567-74. Snorek M Hodyc D Sedivý V Durišová J Skoumalová A Wilhelm J Short-term fasting reduces the extent of myocardial infarction and incidence of reperfusion arrhythmias in rats Physiol Res 2012 61 6 567 574 17 Wiggins JE, Goyal M, Sanden SK, Wharram BL, Shedden KA, Misek DE, et al. Podocyte hypertrophy, "adaptation," and "decompensation" associated with glomerular enlargement and glomerulosclerosis in the aging rat: prevention by calorie restriction. J Am Soc Nephrol. 2005;16(10):2953-66. Wiggins JE Goyal M Sanden SK Wharram BL Shedden KA Misek DE Podocyte hypertrophy, "adaptation," and "decompensation" associated with glomerular enlargement and glomerulosclerosis in the aging rat: prevention by calorie restriction J Am Soc Nephrol 2005 16 10 2953 2966 18 Gouw AM, Efe G, Barakat R, Preecha A, Mehdizadeh M, Garan AS, et al. Roles of estrogen receptor-alpha in mediating life span: the hypothalamic deregulation hypothesis. Physiol Genomics. 2017;49(2):88-95. Gouw AM Efe G Barakat R Preecha A Mehdizadeh M Garan AS Roles of estrogen receptor-alpha in mediating life span: the hypothalamic deregulation hypothesis Physiol Genomics 2017 49 2 88 95 19 Winter TA, O'Keefe SJ, Callanan M, Marks T. The effect of severe undernutrition and subsequent refeeding on the whole-body metabolism and protein synthesis in human subjects. JPEN J Parenter Enteral Nutr. 2005;29:221-8. Winter TA O'Keefe SJ Callanan M Marks T The effect of severe undernutrition and subsequent refeeding on the whole-body metabolism and protein synthesis in human subjects JPEN J Parenter Enteral Nutr 2005 29 221 228 20 Ševela S, Novák F, Kazda A, Brodská H. [Refeeding syndrome]. Cas Lek Cesk. 2016;155(2):34-40. Ševela S Novák F Kazda A Brodská H Refeeding syndrome Cas Lek Cesk 2016 155 2 34 40 21 Young EA, Cantu TL, Harris MM. Gastrointestinal and cardiac response to refeeding after low-calorie semistarvation. Am J Clin Nutr. 1989;50(5):922-9. Young EA Cantu TL Harris MM Gastrointestinal and cardiac response to refeeding after low-calorie semistarvation Am J Clin Nutr 1989 50 5 922 929 22 Ameredes BT, Daood MJ, Watchko JF. Refeeding reverses cardiac myosin shifts induced by undernutrition in aged rats: modulation by growth hormone. J Mol Cell Cardiol. 1998;30(8):1525-33. Ameredes BT Daood MJ Watchko JF Refeeding reverses cardiac myosin shifts induced by undernutrition in aged rats: modulation by growth hormone J Mol Cell Cardiol 1998 30 8 1525 1533 23 Freund HR, Holroyde J. Cardiac function during protein malnutrition and refeeding in the isolated rat heart. JPEN J Parenter Enteral Nutr. 1986;10(5):470-3. Freund HR Holroyde J Cardiac function during protein malnutrition and refeeding in the isolated rat heart JPEN J Parenter Enteral Nutr 1986 10 5 470 473 24 Pinotti MF, Leopoldo AS, Silva MD, Sugizaki MM, do Nascimento AF, Lima-Leopoldo AP, et al. A comparative study of myocardial function and morphology during fasting/refeeding and food restriction in rats. Cardiovasc Pathol. 2010;19(5):175-82. Pinotti MF Leopoldo AS Silva MD Sugizaki MM do Nascimento AF Lima-Leopoldo AP A comparative study of myocardial function and morphology during fasting/refeeding and food restriction in rats Cardiovasc Pathol 2010 19 5 175 182 25 Pinotti MF, Silva MD, Sugizaki MM, Diniz YS, Sant'Ana LS, Aragon FF, et al. Effect of unsaturated fatty acids on myocardial performance, metabolism and morphology. Braz J Med Biol Res. 2006;39(2):305-12. Pinotti MF Silva MD Sugizaki MM Diniz YS Sant'Ana LS Aragon FF Effect of unsaturated fatty acids on myocardial performance, metabolism and morphology Braz J Med Biol Res 2006 39 2 305 312 26 Trayhurn P, Thomas ME, Duncan JS, Rayner DV. Effects of fasting and refeeding on ob gene-expression in white adipose-tissue of lean and obese (ob/ob) mice. FEBS Lett. 1995;368(3):488-90. Trayhurn P Thomas ME Duncan JS Rayner DV Effects of fasting and refeeding on ob gene-expression in white adipose-tissue of lean and obese (ob/ob) mice FEBS Lett 1995 368 3 488 490 27 Tham YK, Bernardo BC, Ooi JY, Weeks KL, McMullen, JR. Pathophysiology of cardiac hypertrophy and heart failure: signaling pathways and novel therapeutic targets. Arch Toxicol. 2015;89(9):1401-38. Tham YK Bernardo BC Ooi JY Weeks KL McMullen JR Pathophysiology of cardiac hypertrophy and heart failure: signaling pathways and novel therapeutic targets Arch Toxicol 2015 89 9 1401 1438 28 Wu QQ, Xiao Y, Yuan Y, Ma ZG, Liao HH, Liu C, et al. Mechanisms contributing to cardiac remodelling. Clin Sci (Lond). 2017;131(18):2319-45. Wu QQ Xiao Y Yuan Y Ma ZG Liao HH Liu C Mechanisms contributing to cardiac remodelling Clin Sci Lond 2017 131 18 2319 2345 29 Lee SR, Ko TH, Kim HK, Marquez J, Ko KS, Rhee BD, et al. Influence of starvation on heart contractility and corticosterone level in rats. Pflugers Arch. 2015;467(11):2351-60. Lee SR Ko TH Kim HK Marquez J Ko KS Rhee BD Influence of starvation on heart contractility and corticosterone level in rats Pflugers Arch 2015 467 11 2351 2360 30 Samarel AM, Parmacek MS, Magid NM, Decker RS, Lesch M. Protein synthesis and degradation during starvation-induced cardiac atrophy in rabbits. Circ Res. 1987;60(6):933-41. Samarel AM Parmacek MS Magid NM Decker RS Lesch M Protein synthesis and degradation during starvation-induced cardiac atrophy in rabbits Circ Res 1987 60 6 933 941 31 Feng Y, Zhang Y, Xiao H. AMPK and cardiac remodelling. Sci China Life Sci. 2018;61(1):14-23. Feng Y Zhang Y Xiao H AMPK and cardiac remodelling Sci China Life Sci. 2018 61 1 14 23 32 Mattson MP, Longo VD, Harvie M. Impact of intermittent fasting on health and disease processes. Ageing Res Rev. 2017 Oct;39:46-58. Mattson MP Longo VD Harvie M Impact of intermittent fasting on health and disease processes Ageing Res Rev 10 2017 39 46 58 33 Carvalho RF, Castan EP, Coelho CA, Lopes FS, Almeida FL, Michelin A, et al. Heart failure increases atrogin-1 and MuRF1 gene expression in skeletal muscle with fiber type-specific atrophy. J Mol Histol. 2010;41(1):81-7. Carvalho RF Castan EP Coelho CA Lopes FS Almeida FL Michelin A Heart failure increases atrogin-1 and MuRF1 gene expression in skeletal muscle with fiber type-specific atrophy J Mol Histol 2010 41 1 81 87 34 Razeghi P, Baskin KK, Sharma S, Young ME, Stepkowski S, Essop MF, et al. Atrophy, hypertrophy, and hypoxemia induce transcriptional regulators of the ubiquitin proteasome system in the rat heart. Biochem Biophys Res Commun. 2006;342(2):361-4. Razeghi P Baskin KK Sharma S Young ME Stepkowski S Essop MF Atrophy, hypertrophy, and hypoxemia induce transcriptional regulators of the ubiquitin proteasome system in the rat heart Biochem Biophys Res Commun 2006 342 2 361 364 35 Gut AL, Sugizaki MM, Okoshi MP, Carvalho RF, Pai-Silva MD, Aragon FF, et al. Food restriction impairs myocardial inotropic response to calcium and beta-adrenergic stimulation in spontaneously hipertensive rats. Nutr Res. 2008;28(10):722-7. Gut AL Sugizaki MM Okoshi MP Carvalho RF Pai-Silva MD Aragon FF Food restriction impairs myocardial inotropic response to calcium and beta-adrenergic stimulation in spontaneously hipertensive rats Nutr Res 2008 28 10 722 727 36 Souza Junior AL, Malfitano C, Figueroa D, de Souza LE, Ignotti E, Irigoyen MC, et al. Effect of fasting and refeeding on the consequences of myocardial infarction in rats. Integr Mol Med. 2015;31(1):478-83. Souza AL Junior Malfitano C Figueroa D de Souza LE Ignotti E Irigoyen MC Effect of fasting and refeeding on the consequences of myocardial infarction in rats Integr Mol Med 2015 31 1 478 483 37 Dogan S, Ray A, Cleary MP. The influence of different calorie restriction protocols on serum pro-inflammatory cytokines, adipokines and IGF-I levels in female C57BL6 mice: short term and long term diet effects. Meta Gene. 2017 Jun;12:22-32. Dogan S Ray A Cleary MP The influence of different calorie restriction protocols on serum pro-inflammatory cytokines, adipokines and IGF-I levels in female C57BL6 mice: short term and long term diet effects Meta Gene. 06 2017 12 22 32 38 Stiles GL, Lefkowitz RJ. Cardiac adrenergic receptors. Ann Rev Med. 1984;35:149-64. Stiles GL Lefkowitz RJ Cardiac adrenergic receptors Ann Rev Med 1984 35 149 164 39 Sohal RS, Weindruch R. Oxidative stress, caloric restriction, and aging. Science. 1996;273(5271):59-63. Sohal RS Weindruch R Oxidative stress, caloric restriction, and aging Science 1996 273 5271 59 63 40 Mattson MP. Energy intake, meal frequency and health: a neurobiological perspective. Annu Rev Nutr. 2005;25:237-60. Mattson MP Energy intake, meal frequency and health: a neurobiological perspective Annu Rev Nutr 2005 25 237 260 Artigo Original Ciclos de Jejum/Realimentação Previnem Disfunção Miocárdica e Danos Morfológicos em Ratos Espontaneamente Hipertensos Pinotti Matheus Fécchio 1 Matias Amanda Martins 2 Sugizaki Mário Mateus 3 Nascimento André Ferreira do 3 Pai Maeli Dal 1 4 Leopoldo Ana Paula Lima 2 Cicogna Antônio Carlos 1 Leopoldo André Soares 2 Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP - Brasil Departamento de Desportos, Centro de Educação Física e Desportos, Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), Vitória, ES - Brasil Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Cuiabá, MT - Brasil Departamento de Morfologia, Instituto de Biosciências da Universidade Estadual Paulista UNESP, Botucatu, SP - Brasil Correspondência: André Soares Leopoldo, Avenida Fernando Ferrari, 514. CEP 29075-410, Goiabeiras, Vitória, ES - Brasil. E-mail: andresoaresleopoldo@gmail.com, andre.leopoldo@ufes.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Pinotti MF, Cicogna AC, Leopoldo AS; Obtenção de dados: Pinotti MF, Matias AM, Sugizaki MM, Nascimento AF, Pai MD, Leopoldo APL; Análise e interpretação dos dados: Pinotti MF, Sugizaki MM, Nascimento AF, Pai MD, Leopoldo APL; Análise estatística: Sugizaki MM, Nascimento AF, Pai MD, Leopoldo APL; Obtenção de financiamento: Cicogna AC; Redação do manuscrito: Pinotti MF, Matias AM, Cicogna AC, Leopoldo AS; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Matias AM, Pai MD, Leopoldo APL, Cicogna AC, Leopoldo AS.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

A restrição calórica compromete a função e a morfologia cardíacas em corações hipertrofiados de ratos espontaneamente hipertensos (SHR). No entanto, a influência de ciclo de jejum/Realimentação é desconhecida.

 Objetivo:

Investigar o efeito de ciclos de jejum/realimentação sobre a remodelação e função miocárdica. Além disso, o presente estudo foi desenhado para avaliar os mecanismos subjacentes à participação do trânsito de cálcio (Ca+2) e sistema beta-adrenérgico.

 Métodos:

Neste estudo, SHR machos de 60 dias de idade foram submetidos a alimento ad libitum (grupo C), 50% de restrição alimentar (grupo R50) ou ciclos de RF (grupo RF) por 90 dias. A remodelação cardíaca foi avaliada por meio da análise ultraestrutural e função do músculo papilar isolado. Adotou-se o nível de significância de 5% (a = 0,05).

 Resultados:

Os ratos do grupo RF apresentaram menor atrofia cardíaca do que os do grupo R50 em relação aos do grupo C. Os ratos do grupo C aumentaram peso corporal, os ratos do grupo R50 mantiveram seu peso corporal inicial e os ratos do grupo RF aumentaram e reduziram seu peso durante o ciclo RF. O ciclo RF não causou comprometimento funcional, pois os parâmetros isotônicos e isométricos apresentaram comportamento similar aos dos ratos do grupo C. Os parâmetros cardíacos isotônicos e isométricos mostraram-se significativamente elevados nos ratos do grupo RF em comparação aos dos ratos do grupo R50. Além disso, os ratos do grupo R50 apresentaram dano cardíaco em comparação aos ratos do grupo C quanto às variáveis isotônicas e isométricas. Os ratos do grupo R50 apresentaram alterações focais em muitas fibras musculares, enquanto os ratos do grupo RF apresentaram leves alterações, como perda ou desorganização de miofibrilas.

 Conclusão:

Ciclos de Jejum/Realimentação promovem efeitos benéficos cardíacos e atenuam o dano miocárdico causado por restrição calórica em SHR, contribuindo para reduzir o risco cardiovascular e os danos morfológicos. Além disso, o ciclo de jejum/realimentação promove leve melhora do trânsito do Ca2+ e do sistema beta-adrenérgico.

 Palavras-chave: Ratos Hipertensão Miocárdio/disfunção Doença Crônica Realimentação Restrição Calórica FAPESP 04/04654-6 O presente estudo foi financiado pela FAPESP número 04/04654-6. Introdução

As principais causas de mortalidade por doenças crônicas não-transmissíveis (DCNTs) são doença cardiovascular, câncer, doença respiratória crônica e diabetes.1 Essas condições compartilham um pequeno número de fatores de risco comportamentais, que agravam as DCNTs e incluem dieta não saudável, intimamente relacionada com hipertensão.

Há muito a restrição calórica (RC) é conhecida por promover vários efeitos benéficos.2,3 No entanto, embora a RC possa evitar o dano cardíaco em corações hipertrofiados de ratos espontaneamente hipertensos (SHR),4 é comum notar-se flutuação do peso corporal tipicamente denominada "síndrome do iô-iô" durante uma dieta rígida, tendo tal flutuação mostrado efeitos cardiovasculares deletérios.5,6 Pesquisas de nosso laboratório e de outros mostraram que a restrição alimentar severa pode causar danos morfológicos e comprometimento da função cardíaca em ratos normais e SHR.7-12

Recentemente, jejum intermitente ou ciclos de jejum/realimentação também mostrou ser capaz de prolongar a vida e apresentar efeitos benéficos para a saúde quando comparado ao consumo de alimento ad libitum,3,13,14 pois melhora a função cardiovascular e vários fatores de risco de doenças cardiovasculares.15,16 Essa abordagem alimentar implica também em efeito protetor contra estresse oxidativo, menores taxas de doença renal,17 prolongamento da função reprodutiva,18 normalização do gasto energético de repouso e recuperação da síntese proteica, mas pode causar muitos distúrbios metabólicos.19,20

Em ratos normotensos submetidos à restrição alimentar, a realimentação diminuiu a incidência de arritmia cardíaca e reverteu a depleção de proteínas cardíacas.21,22 A restrição alimentar causou distúrbios na função cardíaca, que foram quase que completamente revertidos ao normal após realimentação, em coração de rato isolado.23 No nosso laboratório, observamos que ciclos de jejum/realimentação reverteram a disfunção mecânica e atenuaram os danos estruturais nos músculos papilares causados por RC em ratos normotensos.24 No entanto, ainda não está claro se os ciclos de jejum/realimentação podem promover efeitos similares e/ou reverter o dano cardíaco induzido por restrição alimentar em SHR.7-12 Portanto, este estudo teve por objetivo investigar a abordagem jejum/realimentação sobre a remodelação e função miocárdica. Além disso, o presente estudo foi projetado para obter informação quanto aos mecanismos subjacentes à participação do trânsito do Ca2+ e do sistema beta-adrenérgico. Nossa hipótese é que a condição jejum/realimentação atenuaria o dano miocárdico causado pela restrição alimentar e contribuiria para o remodelamento cardíaco normal em SHR sem alterações do trânsito do Ca2+ e do sistema beta-adrenérgico.

 Métodos Modelo animal e protocolo experimental

Neste estudo, SHR machos de 60 dias de idade foram distribuídos em três grupos: controle (grupo C, n = 7); restrição alimentar (grupo R50, n = 7); e ciclos de jejum/realimentação (grupo RF, n = 7). O grupo C foi alimentado com água ad libitum e ração Labina com a seguinte composição: 7,0% de gordura; 20,55% de proteína; 62,95% de carboidrato; 5,0% de fibra e 4,5% de teor de umidade (Agribands, Brasil). A Tabela 1 mostra a composição da ração Labina. O grupo R50 recebeu 50% da quantidade de alimento consumida pelo grupo C. O grupo RF foi submetido a ciclos de restrição alimentar de 50% e realimentação ad libitum semanalmente. Todos os ratos foram mantidos neste regime alimentar por 90 dias, sendo então sacrificados.

Composição da ração Labina
Ingredientes (g/kg)
Amido 397,5
Amido de milho dextrinizado 132,0
Sacarose 100,0
Carboidratos 629,5
Caseína 200,0
L-Cisteína 3,0
Bitartarato de colina 2,5
Proteína 205,5
Óleo de soja 70,0
Gordura 70,0
Fibra 50,0
Mistura de vitaminas 10,0
Mistura de minerais 35,0
Total 1000

Todos os animais foram alojados em gaiolas individuais em uma sala à temperatura de 23ºC e com ciclos de 12 horas claro/escuro, sendo pesados uma vez por semana. Os pesos corporais inicial e final (PCI e PCF, respectivamente), as razões entre os pesos ventriculares esquerdo e direito e o peso corporal final (VE/PCF e VD/PCF, respectivamente) e a área seccional (AS) do músculo papilar foram medidos. Todos os experimentos e procedimentos foram realizados de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo United States National Institutes of Health, sendo aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, São Paulo, Brasil.

 Pressão arterial sistólica

Avaliou-se a pressão arterial sistólica pelo método não invasivo do manguito de cauda com um eletro-esfigmomanômetro Narco BioSystems (International Biomedical, Austin, TX, EUA) no início e ao final do protocolo experimental. Registrou-se a média de duas leituras de pressão para cada animal.

 Desempenho do músculo isolado

O desempenho contrátil intrínseco do coração foi avaliado estudando-se o músculo papilar isolado do ventrículo esquerdo (VE), conforme como anteriormente descrito.9,10,12 Foram determinados parâmetros de contração isométrica, incluindo tensão desenvolvida (TD, g/mm2, definida como tensão isométrica menos tensão de repouso), tensão de repouso (TR, g/mm2), tempo para atingir o pico da tensão desenvolvida (TPT, ms), velocidade máxima de variação da tensão desenvolvida (+dT/dt, g/mm2/s) e velocidade máxima de variação de decréscimo da tensão desenvolvida (-dT/dt, g/mm2/s). Os parâmetros isotônicos foram porcentagem de encurtamento (PS, %), tempo para encurtamento máximo (TPS, ms), velocidade máxima de encurtamento (-dL/dt, ML/s) e velocidade máxima de relaxamento (+dL/dt, ML/s), onde ML/s é o comprimento muscular por segundo.

O comportamento mecânico do músculo papilar foi avaliado sob condições basais de concentração de Ca2+ de 1,25 mM e após as seguintes manobras inotrópicas: aumento da concentração de Ca2+ extracelular de 0,625 para 1,25, 2,5 e 5,2 mM, e estimulação beta-adrenérgica com 0,01, 0,1 e 1,0 µM de isoproterenol. Os parâmetros usados para caracterizar o músculo papilar foram: comprimento (mm), peso (mg) e AS (mm2). O comprimento muscular associado à TD máxima foi definido como Lmax in vitro e medido com um catetômetro Gartner (Chicago, IL, EUA). Para comparar a função mecânica entre diferentes comprimentos musculares, parâmetros isométricos e isotônicos foram normalizados pela AS e pelo Lmax.

 Estudo morfológico

Para o estudo ultraestrutural (três animais por grupo), pequenos fragmentos do músculo papilar VE foram fixados em solução de Karnovsky em 0,12 M fosfato, pH de 7,2 por 1-2 horas e pós-fixados em 1% tetróxido de ósmio em 0,1 M tampão fosfato por 2 horas.25 Após desidratação em uma série graduada de etanol, as amostras foram incluídas em resina de epóxi. Cortes ultrafinos de áreas selecionadas foram feitos com navalhas de diamante, submetidos a duplo contraste com acetato de uranila e citrato de chumbo, e examinados em microscópio eletrônico Philips EM 301. A AS do miócito VE foi medida com microscópio composto ligado a sistema computadorizado de análise de imagem (Image-Pro Plus 3.0, Media Cybernetics, Silver Springs, MD, EUA).

 Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas usando o programa SigmaStat 3.5 (SYSTAT Software Inc., San Jose, CA, EUA). As variáveis das características gerais e da função miocárdica em condição basal com distribuição normal foram expressas como médias ± desvio-padrão (DP). Os grupos foram comparados usando-se análise de variância (ANOVA) de uma via para amostras independentes. Utilizou-se ANOVA de duas vias para medidas repetidas para avaliar a evolução do peso corporal e os efeitos inotrópicos positivos e negativos na função miocárdica. Quando houve diferença significativa (p < 0,05), usou-se os testes post hoc de Tukey ou Bonferroni para comparações múltiplas. Adotou-se o nível de significância de 5%.

Determinou-se o tamanho da amostra (n) com a equação: n = 1 + [2C * (s/d)2], onde C (z score a + z score b)2 depende dos valores escolhidos para poder estatístico do teste (90%; erro tipo II) e nível de significância (0,05; erro tipo I); o valor do desvio-padrão (s) adotado foi 0,25, sendo a mínima diferença entre os grupos (d) de 0,5. O tamanho de amostra necessário para detectar uma diferença significativa entre os grupos foi de 6,25 ratos por grupo. Entretanto, decidimos usar 7 animais por grupo para a maioria das análises.

 Resultados Características gerais e morfológicas dos ratos

Valores significativamente elevados de PCF, VE, VD, VE/PCF e VD/PCF foram encontrados no grupo C em comparação aos grupos R50 e RF (Tabela 2). Após 12 semanas, os ciclos de jejum/realimentação promoveram substancial elevação do PCF e do consumo alimentar que foram significativamente maiores do que aqueles no grupo R50. Em relação aos parâmetros cardíacos, os grupos RF e R50 apresentaram comportamento diferente. Especificamente, o VE (RF: 12,12% e R50: 48,5%; p < 0,05), o VD (RF: 19,04% e R50: 47,62%; p < 0,05), o VE/PCF (RF: 6,64% e R50: 19,2%; p < 0,05) e o VD/PCF (RF: 12,06% e R50: 18,96%; p < 0,05) apresentaram redução percentual nos ratos dos grupos RF e R50 em comparação àqueles do grupo C. Entretanto, os ratos submetidos aos ciclos de jejum/realimentação apresentaram menos atrofia cardíaca do que os do grupo R50 em relação aos do grupo C.

Características gerais dos ratos
Parâmetros Grupos
C R50 RF
PCI (g) 247 ± 15 248 ± 12 249 ± 13
PCF (g) 366 ± 14 236 ± 17* 342 ± 21*†
CA (g/semana) 159 ± 23 77 ± 4* 130 ± 55†
PAS inicial (mmHg) 177 ± 8 177 ± 5 181 ± 7
PAS final (mmHg) 163 ± 13 157 ± 15 156 ± 5
VE (g) 0,99 ± 0,04 0,51 ± 0,01* 0.87 ± 0.08*†
VD (g) 0,21 ± 0,02 0,11 ± 0,01* 0.17 ± 0.02*†
VE/PCF (mg/g) 2,71 ± 0,05 2,19 ± 0,16* 2.53 ± 0.08*†
VD/PCF (mg/g) 0,58 ± 0,04 0,47 ± 0,05* 0.51 ± 0.05*

C: grupo controle; R50: animais com restrição alimentar de 50%; RF: animais com alternância entre restrição alimentar de 50% e realimentação; PCI: peso corporal inicial; PCF: peso corporal final; CA: consumo alimentar; PAS: pressão arterial sistólica; VE: peso do ventrículo esquerdo; VD: peso do ventrículo direito. Valores expressos como média ± DP (n = 7).

significativo para p < 0,05 vs. C; † p < 0,05 vs. R50. ANOVA de uma via e teste de Tukey post hoc.

Além disso, os ratos do grupo C apresentaram ganho corporal crescente, enquanto aqueles do grupo R50 mantiveram seu PCI após 12 semanas de protocolo experimental (Figura 1). Por outro lado, os ratos do grupo RF ganharam peso dependendo da ingestão de alimento, com aumento e redução de peso corporal durante as fases de realimentação e jejum, respectivamente (Figura 1).

Alterações do peso corporal após 90 dias de tratamento. Grupos: controle (C, quadrados, n = 7); animais submetidos a restrição alimentar de 50% (R<sub>50</sub>, triângulos, n = 7); e animais submetidos a alternância de restrição alimentar de 50% e realimentação (RF, círculos, n = 7). Valores expressos como média ± DP; * significativo para p < 0,05, R<sub>50</sub> vs. C; <sup>†</sup> p < 0,05, RF vs. R<sub>50</sub>; <sup>#</sup>p < 0,05, C vs. RF. ANOVA de duas vias para medidas repetidas; teste de Bonferroni post hoc. Fonte: grupo de pesquisa.

Desempenho do músculo isolado

Os ciclos de jejum/realimentação não causaram comprometimento funcional (Tabelas 3 e 4). Entretanto, os parâmetros isotônicos [-dL/dt, TPS, TR50] e isométricos (TPT, +dT/dt, -dT/dt, TR50) mostraram-se significativamente elevados nos ratos do grupo RF em comparação àqueles do grupo R50, indicando que os ciclos de jejum/realimentação preservam a fase de contração e relaxamento da função cardíaca. Além disso, os ratos do grupo R50 apresentaram dano cardíaco em relação aos do grupo C para as variáveis isotônicas e isométricas. A AS do músculo papilar não diferiu entre os grupos.

Contração isotônica dos grupos na condição basal
Grupos
C R50 RF
PS (%) 19 ± 3 18 ± 3 20 ± 2
-dL/dt (ML/s) 1,89 ± 0,40 1,60 ± 0,36 2,19 ± 0,45†
TPS (ms) 168 ± 26 205 ± 14* 161 ± 14†
+dL/dT (ML/s) 4,28 ± 1,26 4,13 ± 1,11 4,79 ± 0,86
TR50 (ms) 58 ± 10 76 ± 12* 53 ± 9†
AS (mm2) 0,95 ± 0,22 0,85 ± 0,17 0,91 ± 0,18

C: grupo controle; R50: animais com restrição alimentar de 50%; RF: animais com alternância entre restrição alimentar de 50% e realimentação; OS: porcentagem de encurtamento; -dL/dt: velocidade máxima de encurtamento; TPS: tempo para encurtamento máximo; +dL/dt: velocidade máxima de relaxamento; TR50: tempo para tensão desenvolvida decrescer 50% de seu valor máximo; AS: área seccional do músculo. Valores expressos como média ± DP (n = 7) na concentração basal de cálcio (1,25 mM);

significativo para p < 0,05 vs. C; † p < 0,05 vs. R50. ANOVA de uma via e teste de Tukey post hoc.

Contração isométrica dos grupos na condição basal
Grupos
C R50 RF
DT (g/mm2) 6,17 ± 1,24 6,37 ± 1,14 7,18 ± 1,20
TR (g/mm2) 1,06 ± 0,12 1,12 ± 0,31 1,07 ± 0,17
+dT/dt (g/mm2/s) 77 ± 17 63 ± 13 93 ± 18†
TPT (ms) 146 ± 27 184 ± 19* 128 ± 25†
-dT/dt (g/mm2/s) 29 ± 5 22 ± 4 33 ± 9†
TR50 (ms) 174 ± 40 224 ± 32* 171 ± 21†
AS (mm2) 0,95 ± 0,22 0,85 ± 0,17 0,91 ± 0,18

C: grupo controle; R50: animais com restrição alimentar de 50%; RF: animais com alternância entre restrição alimentar de 50% e realimentação; TD: tensão desenvolvida; TR: tensão de repouso; TPT: tempo para atingir o pico de tensão; +dT/dt: velocidade máxima de variação da tensão desenvolvida; -dT/dt: velocidade máxima de variação de decréscimo da tensão desenvolvida; TR50: tempo para tensão desenvolvida decrescer 50% de seu valor máximo; AS: área seccional do músculo. Valores expressos como média ± DP (n = 7) na concentração basal de cálcio (1.25 mM);

significativo para p<0,05 vs. C; † p < 0,05 vs. R50. ANOVA de uma via e teste de Tukey post hoc.

Estimulação com cálcio extracelular

As elevações da concentração de Ca2+ extracelular de 0,625 para 5,2 mM resultaram em efeito inotrópico positivo nos miócitos de todos os grupos (Figuras 2A-F). Entretanto, os resultados mostrados nas Figuras 2B, C e E indicam que o Ca2+ extracelular (1,25 e 2,5 mM) induziu maior resposta em +dT/dt (RF: 99,1 ± 23,6; 132,1 ± 36,2 g/mm2/s vs. R50: 63,2 ± 12,8; 91,5 ± 22,0 g/mm2/s; p < 0,05, respectivamente), -dT/dt (RF: 30,6 ± 5,9; 35,9 ± 5,8 g/mm2/s vs. R50: 22,0 ± 4,4; 28,5 ± 6,1 g/mm2/s; p < 0,05, respectivamente) e -dL/dt (RF: 2,19 ±0,45; 2,77 ± 0,51 ML/s vs. R50: 1,47 ± 0,24; 1,99 ± 0,31 ML/s; p < 0.05, respectivamente) nos ratos do grupo RF do que nos do grupo R50. Além disso, -dT/dt e -dL/dt estavam significativamente reduzidos no miocárdio de ratos do grupo R50 em concentração de Ca2+ de 5,2 mM se comparados aos do grupo RF. Quando submetidos às manobras inotrópicas, TD, PS e +dL/dt foram semelhantes nos grupos RF e R50. Em relação à função cardíaca de ratos do grupo C após estimulação com Ca2+, aqueles submetidos a ciclos de jejum/realimentação apresentaram comportamento similar (Figuras 2A-F). O único resultado significativo entre os grupos C e R50 foi observado na mais alta concentração de Ca2+ (5,2 mM); -dL/dt foi significativamente mais baixa no grupo R50 do que no grupo C (C: 2,66 ± 0,35 vs. R50: 2,18 ± 0,33 ML/s, p < 0,05) (Figura 2E).

Efeitos do aumento do cálcio extracelular nos parâmetros miocárdicos isotônicos e isométricos nos músculos papilares do grupo controle (C = barras pretas), de animais com restrição alimentar de 50% (R<sub>50</sub> = barras de cor cinza) e de animais submetidos a alternância de restrição alimentar de 50% e realimentação (RF = barras brancas). Experimento do cálcio extracelular: 7 animais em cada grupo. Parâmetros isométricos: A: TD (tensão desenvolvida normalizada para área seccional); B: +dT/dt, g/mm<sup>2</sup>/s (velocidade máxima de variação da tensão desenvolvida normalizada para área seccional); C: -dT/dt, g/mm<sup>2</sup>/s (velocidade máxima de variação de decréscimo da tensão desenvolvida normalizada para área seccional). Parâmetros isotônicos: D: PS (porcentagem de encurtamento); E: -dL/dT (velocidade máxima de encurtamento); F: +dL/dT (velocidade máxima de relaxamento. L<sub>max</sub>: comprimento muscular no pico de TD. Valores expressos como média ± DP; * significativo para p < 0,05 vs. C; <sup>†</sup> p < 0,05 vs. R<sub>50</sub>. ANOVA de duas vias para medidas repetidas e teste de Tukey post hoc. Fonte: grupo de pesquisa.

Estimulação com isoproterenol

Os ciclos de jejum/realimentação elevaram +dT/dt, -dT/dt e -dL/dt na concentração mais alta de isoproterenol (1 µM) em comparação aos valores do grupo R50, indicando um efeito inotrópico positivo nos miócitos. Em contraste, o grupo RF apresentou redução de +dL/dt em comparação ao grupo R50 para a mesma concentração de isoproterenol (Figura 3F). Além disso, efeitos similares foram observados em +dT/dt e -dT/dt a 1µM de isoproterenol no grupo C quando comparado ao R50 (Figuras 3B e C). Ademais, os ratos do grupo RF apresentaram maior +dL/dt na condição basal e concentrações de isoproterenol (0,01 µM) em comparação aos do grupo C (Figura 3F). Não houve diferença significativa nos dados mecânicos (TD e PS) sob estimulação inotrópica com isoproterenol entre os grupos (Figuras 3A e D).

Efeitos do estímulo com isoproterenol na função miocárdica nos músculos papilares do grupo controle (C = barras pretas), de animais com restrição alimentar de 50% (R<sub>50</sub> = barras de cor cinza) e de animais submetidos a alternância de restrição alimentar de 50% e realimentação (RF = barras brancas). Experimento de estímulo com isoproterenol: 7 animais em cada grupo. Parâmetros isométricos: A: TD (tensão desenvolvida normalizada para área seccional); B: +dT/dt, g/mm<sup>2</sup>/s (velocidade máxima de variação da tensão desenvolvida normalizada para área seccional); C: -dT/dt, g/mm<sup>2</sup>/s (velocidade máxima de variação de decréscimo da tensão desenvolvida normalizada para área seccional). Parâmetros isotônicos: D: PS (porcentagem de encurtamento); E: -dL/dt (velocidade máxima de encurtamento); F: +dL/dt (velocidade máxima de relaxamento). L<sub>max</sub>: comprimento muscular no pico de TD. Valores expressos como média ± DP; * significativo para p < 0,05 vs. C; <sup>†</sup> p < 0,05 vs. R<sub>50</sub>. ANOVA de duas vias para medidas repetidas e teste de Tukey post hoc. Fonte: grupo de pesquisa.

Morfologia miocárdica

Os ratos do grupo C mostraram características morfológicas normais, com miofibrilas preenchendo todo o sarcoplasma, sarcômeros bem definidos, mitocôndrias com cristas lamelares, membranas sarcoplasmáticas com aspecto regular, retículo sarcoplasmático entre as miofibrilas e núcleos com cromatina não condensada (Figuras 4A e B). O grupo R50 apresentou alterações focais, como desorganização ou ausência de miofibrilas, algumas mitocôndrias polimórficas com número reduzido de cristas e áreas de dilatação do retículo sarcoplasmático (Figuras 4C, D e E). Nos ratos do grupo RF, a única alteração observada foi a perda das cristas mitocondriais em algumas organelas. A maioria das fibras apresentou morfologia normal (Figuras 4F e G).

Estudo ultraestrutural do músculo papilar do ventrículo esquerdo (n = 3 por grupo). Fotos A e B correspondem ao grupo controle, fotos C, D e E ao grupo com restrição alimentar (R<sub>50</sub>) e fotos F e G ao grupo de realimentação (RF). O grupo controle apresentou preservação da ultraestrutura com miofibrilas (M), retículo sarcoplasmático (ponta da seta), mitocôndria (mi), membrana nuclear (N) e membrana plasmática (seta) normais. Os ratos do grupo R<sub>50</sub> mostraram alterações celulares, como mitocôndrias polimórficas (*), desorganização miofibrilar (**) e pregueamento da membrana plasmática (seta). Durante realimentação, o músculo papilar mostrou preservação de miofibrilas (M), mitocôndrias (mi) e membranas plasmáticas (seta), mitocôndrias polimórficas (*) e capilar (C). Fonte: grupo de pesquisa.

Discussão

Há pouca informação disponível sobre a relação entre função e morfologia cardíacas durante jejum/realimentação em corações hipertrofiados de SHR. Nesse contexto, esse regime alimentar tornou-se assunto de considerável interesse científico para perda de peso e melhora da saúde cardiometabólica. Assim, o principal achado deste estudo foi que ciclos de jejum/realimentação atenuam o dano causado pela RC. Os resultados revelam que o ciclo jejum/realimentação apresentou elevação dos parâmetros isotônicos e isométricos na condição basal, assim como melhorou a resposta inotrópica miocárdica ao cálcio e isoproterenol. Além disso, o ciclo jejum/realimentação reduziu a atrofia cardíaca e as injúrias morfológicas.

Observou-se menor ganho de peso corporal no grupo RF do que no grupo C (Tabela 1, Figura 1), porém maior ganho de peso corporal do que no grupo R50. De acordo com a literatura, ocorre redução de cerca de 13% do peso corporal quando os animais são submetidos a 48 horas de jejum.25 Esse resultado parece ser mediado por hormônios, como leptina que regula o apetite e o ganho de corporal. Uma rápida inibição da expressão do gene ob no tecido adiposo branco ocorre no jejum, e tal efeito pode ser revertido pela realimentação.25,26

Hipertrofia cardíaca, um importante processo patológico envolvido no remodelamento cardíaco, serve inicialmente como um mecanismo compensatório para preservar o débito cardíaco.27 O remodelamento cardíaco pode ser considerado o primeiro passo na sequência de respostas adaptativas do coração ao estresse causado por um grande número de condições fisiológicas e patológicas, como alterações de cargas de volume e pressão e/ou alterações metabólicas.28 Um estudo recente revelou que o ciclo jejum/realimentação induziu atrofia cardíaca visualizada como uma redução do coração como um todo e do ventrículo esquerdo, assim como da relação VE/PCF. A diminuição do peso do ventrículo esquerdo em relação ao peso corporal é muito comum em pequenos animais submetidos a restrição alimentar22 e jejum/realimentação.29 Inibição da síntese proteica miocárdica e redução na meia-vida média de proteínas são possíveis explicações para a reduzida massa cardíaca na inanição.30 A síntese proteica, um processo anabólico, é necessária para a hipertrofia cardíaca. Duas importantes vias reguladoras da síntese proteica são inibidas pela AMPK, um regulador primário das vias metabólicas, que desempenha papel essencial em uma ampla variedade de processos celulares de proteção contra hipertrofia cardíaca.31 Logo, atrofia cardíaca poderia ser regulada pela via de sinalização comum da AMPK no hipotálamo.

Na análise ultraestrutural, a restrição alimentar causou dano morfológico focal na maioria das fibras dos músculos papilares. As mesmas alterações foram menos intensas na condição de realimentação intermitente. Tal condição parece auxiliar na atenuação dos mecanismos responsáveis por esse dano e atuar através da melhora do anabolismo proteico e retardo da degradação proteica. Achados recentes sugerem que os efeitos benéficos da realimentação resultam de redução na injúria oxidativa e aumento da resistência celular ao estresse.2,32 Um possível mecanismo para o nosso resultado pode estar ligado à expressão de atrogina-1, uma E3 ubiquitina-ligase, também conhecida como MAFbx (muscle atrophy F-box). As E3-ligases são parte do sistema ubiquitina-proteassoma utilizado para degradação proteica durante atrofia muscular. A literatura mostra que a expressão de atrogina-1/MAFbx resulta em atrofia muscular durante condição catabólica.33 No músculo cardíaco, a expressão de atrogina-1/MAFbx aumenta na insuficiência cardíaca e sobrecarga de pressão.33,34

A análise do músculo papilar isolado mostrou que a restrição alimentar promove disfunção cardíaca, mas a realimentação previne essa situação. Tais estímulos evidenciam que a melhora da função miocárdico atribuída a ciclos de jejum/realimentação relaciona-se a alterações no trânsito do Ca2+ intracelular, em especial na recaptura e/ou extrusão do Ca2+ citosólico, e sistema beta-adrenérgico. Entretanto, a menor resposta dos ratos privados de alimento ao aumento da concentração de Ca2+ extracelular pode estar relacionada com alterações nos mecanismos gerais do ciclo do Ca2+, como trocador de Na+/Ca2+ sarcolemal, canal de Ca2+ do tipo L sarcolemal, retículo sarcoplasmático, receptor de rianodina, bomba de Ca2+ do retículo sarcoplasmático e sensibilidade dos miofilamentos ao Ca+2.35 Em relação aos ciclos de jejum/realimentação, esse processo pode ser mais rápido e equilibrado, mas não foram encontrados estudos que confirme essa afirmação nem demonstre a atividade e a expressão das proteínas reguladoras do trânsito do Ca2+.

Outra explicação poderia estar relacionada ao papel da citocina na cardioproteção mediada pelo jejum intermitente. O influxo de células inflamatórias e a produção de mediadores pró-inflamatórios contribuem para a injúria miocárdica.36 Entretanto, a adiponectina pode proteger as células miocárdicas contra a injúria isquêmica ao ativar a via da proteína quinase dependente de AMP cíclico - via Akt, sendo a última parcialmente mediada por restrição calórica.37 Assim, os efeitos benéficos de ciclos de jejum/realimentação podem funcionar através das vias das citocinas anti-inflamatórias.

Poucos estudos avaliaram os componentes beta-adrenérgicos em modelos experimentais de jejum/realimentação.25,35 Alguns estudos mostraram que o comprometimento da função cardíaca está relacionado às alterações do sistema beta-adrenérgico,35 enquanto outros não relataram redução da resposta beta-adrenérgica.25 A diminuição no número de beta-receptores cardíacos foi mostrada em vários modelos de hipertensão conhecidos por sua associação com uma elevação na atividade nervosa simpática, incluindo SHR.38 Assim, a associação entre elevação da atividade simpática e infrarregulação de beta-receptores cardíacos é próxima o suficiente para sugerir que a redução no número de beta-receptores após privação alimentar e realimentação indica persistente aumento da atividade simpática cardíaca. No entanto, neste estudo, não houve dano do sistema beta-adrenérgico nos ratos do grupo RF, pois a função cardíaca foi similar àquela do grupo C. Esses dados tendem a embasar a hipótese de que a estimulação com isoproterenol preserva o sistema beta-adrenérgico e a fosforilação do AMP-cíclico de proteínas relacionadas ao trânsito do Ca2+ nos ratos realimentados.

Os ciclos de jejum/realimentação tornaram-se tema de considerável interesse científico como uma abordagem dietética potencial para perda de peso corporal e aperfeiçoamento da saúde cardiometabólica. Os efeitos benéficos do jejum intermitente resultam de pelo menos dois mecanismos: estresse oxidativo e hipótese de resistência ao estresse.39 De acordo com a literatura, durante jejum intermitente, há menor produção de radicais livres nas mitocôndrias e, consequentemente, menor dano oxidativo para as células.39 Outra hipótese é a resistência ao estresse, associada com a elevação da resistência de células de diferentes tecidos à injúria induzida pelos insultos oxidativos, genotóxicos e metabólicos. A conservação da resistência ao estresse em resposta ao jejum intermitente em uma variedade de espécies fornece forte evidência de que esse mecanismo, no caso da restrição alimentar, contribua para prolongar a vida.39

É importante notar que, conforme estudos em roedores e seres humanos, a restrição alimentar intermitente pode promover perda de peso e/ou influenciar favoravelmente vários índices de saúde cardiometabólica, com eficácia igual ou superior à de abordagens convencionais de restrição energética contínua, como a restrição alimentar.29 Os ciclos de jejum/realimentação aumentam a tolerância cardíaca à injúria isquêmica e podem afetar o desenvolvimento de doença cardiovascular, evitando o remodelamento cardíaco pós-infarto e a iminente insuficiência cardíaca crônica.29 Comparando-se as duas abordagens dietéticas, alguns estudos mostraram que a restrição calórica pode exercer seus efeitos benéficos primariamente através da redução do estresse oxidativo, enquanto que os ciclos de jejum/realimentação podem atuar primariamente através do mecanismo de resistência ao estresse,40 que pode ter efeito cardioprotetor.

Limitações do estudo

Este estudo não investigou a atividade e a expressão das proteínas reguladoras do trânsito de Ca2+ conhecidas por afetar a contração e o relaxamento miocárdico. Além disso, este estudo não avaliou o envolvimento das citocinas anti-inflamatórias, a produção de radicais livres e a resposta celular ao estresse, que poderiam auxiliar a consolidar os efeitos benéficos do jejum intermitente.

 Conclusão

Ciclos de jejum/realimentação promovem efeitos benéficos cardíacos e atenuam o dano miocárdico causado por RC em SHR, contribuindo para reduzir o risco cardiovascular e os prejuízos morfológicos. Além disso, o ciclo de jejum/realimentação promove leve melhora do trânsito do Ca2+ e do sistema beta-adrenérgico.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela FAPESP número 04/04654-6.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP sob o número de protocolo 439/2004.