Abstract

Arq Bras Cardiol

abc

Arquivos Brasileiros de Cardiologia

Arq. Bras. Cardiol.

0066-782X 1678-4170

Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC

bRRJnzWpVKtmJvYv4LZQxHK

S0066-782X2018001400172

S0066-782X2018005008106

10.5935/abc.20180113

Original Article

Physical Exercise and Regulation of Intracellular Calcium in Cardiomyocytes of Hypertensive Rats

Rodrigues

Joel Alves

1 Prímola-Gomes

Thales Nicolau

1 Soares

Leôncio Lopes

1 Leal

Tiago Ferreira

1 Nóbrega

Clara

2 Pedrosa

Danillo Laviola

1 Rezende

Leonardo Mateus Teixeira

1 Oliveira

Edilamar Menezes de

2 Natali

Antonio Jose

1 Universidade Federal de Viçosa

Viçosa MG

Brazil Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa, MG - Brazil 2 Universidade de São Paulo

São Paulo SP

Brazil Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP - Brazil

Mailing Address: Joel Alves Rodrigues, Rua Ana koester, 65 AP 302. Postal Code 36570-000, Centro, Viçosa, MG - Brazil. E-mail: joel.a.rodrigues1@gmail.com, joel.rodrigues@ufv.br

Author contributions

Conception and design of the research: Rodrigues JA, Prímola-Gomes TN, Natali AJ; Acquisition of data: Rodrigues JA, Soares LL, Leal TF, Nóbrega C, Pedrosa DL, Rezende LMT, Oliveira EM, Natali AJ; Analysis and interpretation of the data: Rodrigues JA, Soares LL, Leal TF, Nóbrega C, Oliveira EM, Natali AJ; Statistical analysis: Rodrigues JA, Soares LL, Leal TF, Nóbrega C, Natali AJ; Obtaining financing: Prímola-Gomes TN, Natali AJ; Writing of the manuscript: Rodrigues JA, Natali AJ; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Natali AJ.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

02 07 2018

08 2018

111 2 172 179 27 09 2017 15 03 2018 11 04 2018

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited

Abstract Background:

Regulation of intracellular calcium (Ca²⁺) in cardiomyocytes is altered by hypertension; and aerobic exercise brings benefits to hypertensive individuals.

Objective:

To verify the effects of aerobic exercise training on contractility and intracellular calcium (Ca²⁺) transients of cardiomyocytes and on the expression of microRNA 214 (miR-214) in the left ventricle of spontaneously hypertensive rats (SHR).

Methods:

SHR and normotensive Wistar rats of 16 weeks were divided into 4 groups -sedentary hypertensive (SH); trained hypertensive (TH); sedentary normotensive (SN); and trained normotensive (TN). Animals of the TH and TN groups were subjected to treadmill running program, 5 days/week, 1 hour/day at 60-70% of maximum running velocity for 8 weeks. We adopted a p ≤ 0.05 as significance level for all comparisons.

Results:

Exercise training reduced systolic arterial pressure in hypertensive rats. In normotensive rats, exercise training reduced the time to 50% cell relaxation and the time to peak contraction and increased the time to 50% decay of the intracellular Ca²⁺ transients. In SHR, exercise increased the amplitude and reduced the time to 50% decay of Ca²⁺ transients. Exercise training increased the expression of miR-214 in hypertensive rats only.

Conclusion:

The aerobic training applied in this study increased the availability of intracellular Ca²⁺ and accelerated the sequestration of these ions in left ventricular myocytes of hypertensive rats, despite increased expression of miR-214 and maintenance of cell contractility.

Keywords: Hypertension Exercise Rats Calcium Signaling Intracellular Calcium Sensing Proteins

FAPEMIG

APQ-00876-14

Introduction

Sustained systemic arterial hypertension causes progressive myocardial remodeling. While cardiac function is increased in response to active myocyte hypertrophy in the left ventricle in the compensated phase, left ventricular (LV) remodeling is characterized by the combination of cardiomyocyte hypertrophy and proliferation of other tissues. For example, collagen deposition result in fibrosis of ventricular tissue and consequent myocardial stiffness.1^,2 This has been reported in the initial compensatory phase of hypertension (3-4 months), with preservation of cardiac function.1 Increased proinflammatory markers (e.g. IL-6; TNF-α) have been found in the left ventricle of spontaneously hypertensive rats (SHR) as young as 5-6 months.3^,4

The benefits of aerobic training to hypertensive subjects are well established in the literature.5^,6 Animal models of hypertension - SHR in the compensated stage (~ 6-month-old) - have shown the efficacy of this type of training in attenuating systolic dysfunction and restoring ventricular elasticity in female SHR.7 Aerobic training reduced apoptosis in the myocardium of SHR,4^,8 improved contractile function of cardiomyocytes isolated from the left ventricle, and normalized the expression of proteins involved in the regulation of intracellular calcium cycle, such as the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA2a) and phospholamban.9^-11

In physiological or pathological cardiac hypertrophy, expression of microRNAs (miRNAs) related to cardiac remodeling is altered.12 MicroRNA 214 (miR-214) is involved in cardiac muscle contraction and Ca²⁺ sequestration, due to its negative effect on SERCA-2a expression.13 With respect to physical exercise, resistance training improved cardiomyocyte contractile function, with increased expression of SERCA2a and decreased miRNA-214 expression in normotensive, infarcted rats.13^,14 However, little is known about miR-214 expression in SHR subjected to aerobic training. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of aerobic training on cardiomyocyte contractility and miR-214 expression in the left ventricle in hypertensive rats.

Methods Experimental animals

SHR and normotensive Wistar rats, 16 weeks of age, obtained from the central vivarium of the Biological Science and Health Center of Viçosa Federal University, were divided into four groups (of 13 animals each): sedentary normontensive (SN); trained normotensive (TN), sedentary hypertensive (SH) and trained hypertensive (TH). Sample size was determined by convenience. In each group, 8 animals were used for cardiomyocyte isolation, and 5 for analysis of gene expression. All procedures were carried out following the ethical principles of the Brazilian Society of Laboratory Animal Science (COBEA, Colégio Brasileiro de Experimentação Animal), and approved by the Ethics Committee on Animal Experimentation of Viçosa Federal University (CEUA-UFV; approval number 29/2014). The animals were housed in group cages (4 animals per cage) and allowed free access to water and chow at controlled temperature (mean of 22°C) and lighting (12:12 h light-dark cycle).

Protocol of treadmill exercise training and stress test

Before the training was initiated, animals were adapted to the treadmill during a 5-day period, 10min/day, 0º inclination at 5 m/min. After 48 hours, all animals were subjected to an incremental treadmill test for establishment of the maximal running velocity (MRV), starting at 5 m/min, 0º inclination and increments of 3m/min every 3 minutes until exhaustion. Exhaustion was defined as the time point when the animals could not run at the predetermined speed and, at this point, the test was stopped.

The TN and TH groups were subjected to an exercise training program for 8 weeks, 5 days/week (from Monday to Friday). The training started with treadmill running at 5-6 m/min and 0º inclination for 10 minutes on the first day. In the first week, exercise duration was increased in 5 minutes per day and the intensity was maintained. In the second week, duration continued to be increased in 5 minutes/day, but intensity was increased by 2% of MRV per day, so that from the first day of the third week to the end of the eighth week, the animals ran at 60% of MRV (~18-22 m/min) during a 60-minute period per day.

MRVs of each animal were determined before the training started and at the end of the fourth week in both TN and TH groups for measurement of the time to exhaustion (TTE) and definition of the training intensity. Forty-eight hours after the last training session, the tests were repeated in all animals for analysis of the effects of the physical training on running capacity.

During the experimental period, animals of the sedentary groups (SN and SH) were placed on the treadmill 3 days/week (Mondays, Wednesdays and Fridays), 10 minutes/day, 0º inclination at 5 m/min to subject them to similar conditions of the trained groups.

Systolic arterial pressure (SAP) was measured in the beginning and in the end of the experimental period, i.e., 48 hours after the last exercise training session. The measurements were taken in the mornings, without anesthesia, by tail-cuff plethysmography (LE 5001, Panlab, Harvard Apparatus, Spain). Three measurements were performed, and the intermediate value used for analysis.

Isolation of cardiomyocytes

Forty-eight hours after the last exercise session, isolation of LV myocytes was performed as described by Locatelli et al.15 Briefly, the animals were weighed and euthanized by cervical dislocation. The heart was excised, weighed, cannulated and perfused in the Langendorff's mode with the isolation solution of the following composition (in mM): 130 Na+, 5.4 K+, 1.4 Mg+, 140 Cl−, 0.75 Ca²⁺, 5.0 Hepes, 10 glucose, 20 taurine and 10 creatine, pH 7.3, at room temperature. The heart was then perfused with the calcium-free solution containing 0.1 mM ethylene glycol-bis (ß-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-tetraacetic acid (EGTA), for 4 to 6 min. The perfusion was then changed to a solution containing 1.0 mg/mL collagenase type II (Worthington, USA) and 0.1 mg/mL protease (Sigma-Aldrich, USA) for 10-15 min. All the solutions were oxygenated (O2 100% - White Martins, Brazil) and maintained at 35°C. After perfusion, ventricles were separated from the atria and weighed. The ventricles were placed in a flask containing 5.0 mL of enzymatic solution (collagenase + protease). The flasks were briefly shaken for 5 min in a water bath at 37°C. Next, tissues were removed from the flasks and the remaining content centrifuged (3,000 rpm for 30s). The supernatant was removed, and the cardiomyocytes suspended in the isolation solution and stored in refrigerator (5ºC) until being used.

Measurements of cell contractility

Contractility of isolated myocytes was measured by evaluation of cell length using the motion edge detector (Ionoptix, Milton, MA-USA) mounted on an inverted microscope (Nikon Eclipse - TS100, Japan), as previously described.15 Briefly, myocytes were placed in a chamber with a glass coverslip base and bathed with a buffer solution containing (mM) 136.9 NaCl; 5.4 KCl; 0.37 NaH2PO4; 0.57 MgCl2; 5.0 Hepes = 5; 5.6 glucose and 1.8 CaCl²(pH = 7.4 at room temperature). Cells were visualized on a monitor with a camera (Myocam, Ionoptix, at 240 Hz) attached to a microscope using an image detector system (Ionwizard, Ionoptix). External stimulation was applied at 1.0 Hz (20V) for 5 minutes at room temperature (~25ºC) via platinum electrodes and an electric field stimulator (Myopacer, Ionoptix). Motions of myocyte longitudinal borders were captured by the motion edge detector (Ionwizard, Ionoptix) and stored for posterior analysis. Only myocytes in good conditions, with clear borders and striated sarcomere, relaxed at rest and without voluntary contractions were selected for analysis. Myocyte contractions were analyzed as previously described.15

Measurement of intracellular Ca2+ transients

Intracellular Ca²⁺ transients in isolated cardiomyocytes were measured using fluorescence imaging (Ionoptix, USA), mounted on an inverted microscope (Nikon Eclipse - TS100, USA) equipped with oil immersion objective lens (S Fluor, 40x, Nikon, USA), as described by Natali et al.16 Briefly, the myocytes were incubated with calcium probe (5 µM for 10 minutes) (Fura-2AM, ThermoFisher, Waltham, USA). The ratio of fluorescence emission at 510 nm in response to excitation wavelengths of 340 nm to that in response to 380 nm wavelengths was used as concentration index of intracellular Ca²⁺ transients. The myocytes were electrically stimulated (Myopacer, Field Stimulator, Ionoptix, USA) by a pair of platinum electrodes with a 0.2 ms (20V) supra-threshold pulse, frequency of 1 Hz at room temperature (~25 ºC). Parameters of intracellular Ca²⁺ transients were analyzed using the IonWizard software (IonWizard, 6.3, IonOptix, Milton, USA).

Gene expression analysis

For analysis of gene expression after euthanasia, LV samples were collected and stored at -80ºC. LV total RNA was isolated in 1 mL of Trizol (Invitrogen) following the manufacturer’s recommendations and stored at -70ºC. RNA samples were diluted 1:100 with water and analyzed by spectrophotometry at 260-280 nm.

Analysis of the miRNA-214 gene expression was performed using the Taqman MicroRNA Assays (Applied Biosystems) following the manufacturers’ recommendations. Gene expression quantification was performed in two stages: first, complementary DNA (cDNA) was obtained from reverse transcription of the total RNA sample using a stem-looped primer for reverse transcription to detect the miRNA analyzed and the TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit; second, by real-time polymerase chain reaction, PCR products were amplified from the cDNA samples previously obtained using the TaqMan® MicroRNA Assay and the TaqMan® Universal PCR Master Mix II. The U6 snRNA normalizer was used as control, and analysis was performed using the ABI 7500 Real Time-PCR Systems (Applied Biosystems).

Statistical analysis

Analysis of variance (ANOVA) assumptions regarding homogeneity of variances between the groups and normality of observations were checked and no violations of the assumptions were detected. The variables had normal and continuous distribution. The Levene’s test, the chi-square test and the Kolmogorov test were used for analysis. Comparisons between initial and final SAP and TTE in each group were performed by the paired student’s t-test. Two-way ANOVA followed by Tukey post-hoc test was used for comparisons between the four groups. Analysis was performed using the SigmaPlot software (Systat Software, Inc., San Jose, CA, USA) and significance level was set at 5%. Results are expressed as mean ± standard deviation (SD).

Results

The physical training program increased TTE of both normotensive and hypertensive animals (Figure 1A). Figure 1B shows running velocity of these animals during training.

Figure 1 (A) Time to exhaustion of normotensive and hypertensive before (pre) and after (post) training. (B) Running velocity during training sessions. TN: trained normotensive; TH: trained hypertensive. Data are expressed as mean ± SD of 8 animals in each group. * compared with TN (pre); # compared with TH (pre) (p < 0.05).

As compared with normotensive animals, hypertensive animals showed lower body weight (BW), similar LV weight (LVW), higher LVW/BW, whereas TH animals showed higher ventricular weight (VW)/BW (Table 1). Physical training had no effect on these parameters.

Table 1 Body weight and ventricular weight in the study groups

	SN (n = 8)	TN (n = 8)	SH (n = 8)	TH (n = 8)	p-value
BW (g)	411.30 ± 21.51	447.10 ± 43.94	350.60 ± 21.97* ^&	338.90 ± 30.67* ^&	0.001
VW (g)	1.62 ± 0.20	1.49 ± 0.25	1.47 ± 0.17	1.66 ± 0.23	0.954
LVW (g)	1.12 ± 0.13	1.08 ± 0.13	1.18 ± 0.14	1.25 ± 0.15	0.265
VW/BW (mg/g)	3.97 ± 0.62	3.46 ± 0.47	4.19 ± 0.45	4.93 ± 0.80* ^&	0.000
LVW/BW (mg/g)	2.75 ± 0.42	2.42 ± 0.23	3.39 ± 0.39* ^&	3.72 ± 0.48* ^&	0.000

SN: sedentary normotensive; TN: trained normotensive; SH: sedentary hypertensive; TH: trained hypertensive; VW: ventricular weight; LVW: left ventricular weight; n: number of animals;

compared with SN;

compared with TN (p < 0.05).

Results of SAP are presented in Figure 2. As compared with pre-training values, although the physical training program had no effect on SAP in normotensive animals, a reduction in SAP was observed in hypertensive animals (Figure 2A).

Figure 2 Systolic arterial pressure (SAP) in normotensive animals and hypertensive animals. (A) SAP pre-training vs. post-training). (B) Final SAP of the groups. SN: sedentary normotensive; TN: trained normotensive; SH: sedentary hypertensive; TH: trained hypertensive. Data are expressed as mean ± SD of 8 animals in each group. * compared with TN (pre) (A) SN (B); & compared with TN (post) (A) TN (B); # compared with TH (pre) (A) SN (B); * compared with TH-post (A) TH (B) (p < 0.05).

Cell contractility data are depicted in Figure 3. Contraction amplitude was not affected by hypertension or by physical training (Figure 3 A); and time to peak contraction did not change in any of the groups (Figure 3B). However, physical training reduced time to relaxation by 50% (Figure 3C) in normotensive, but not in hypertensive animals.

Figure 3 Cardiomyocyte contractility in normotensive and hypertensive animals. (A) Contraction amplitude expressed as percentage of change in cell length at rest (%c.l.r.) after electrical stimulation at 1HZ; (B) time to peak concentration; (C) time to 50% of relaxation; SN, sedentary normotensive; TN, trained normotensive; SH, sedentary hypertensive; TH, trained hypertensive. Data as mean ± SD of 60-80 cells in each group. * compared with SN; # compared with SN; + compared with TH (p < 0.05).

Figure 4 shows that after training, [Ca²⁺]_i amplitude did not change in normotensive animals, but increased in the TH group as compared with SH animals. In addition, physical exercise decreased the time to peak [Ca²⁺]_i in TN animals as compared with the SN group, but had no effect on this parameter in hypertensive animals. Longer time to a 50% decay of [Ca²⁺]_i was observed in TN than SN group. In hypertensive animals, however, this parameter was decreased after physical training (p < 0.05).

Figure 4 Intracellular Ca2+ transient levels in cardiomyocytes of normotensive and hypertensive animals. (A) Amplitude of intracellular calcium. (B) Time to peak intracellular calcium. (C) Time to 50% decay of intracellular calcium. SN, sedentary normotensive; TN, trained normotensive; SH, sedentary hypertensive; TH, trained hypertensive. Data as mean ± SD of 40-50 cells in each group. * compared with SN; & compared with TN; # compared with SN; + compared with TH (p < 0.05).

Although the physical training had no effect on mir-214 expression in normotensive animals (Figure 5), increased expression was found in TH as compared with SH and the other groups.

Figure 5 MicroRNA-214 expression in the left ventricle in normotensive and hypertensive animals. SN: sedentary normotensive; TN: trained normotensive; SH: sedentary hypertensive; TH: trained hypertensive. Data as mean ± SD of 5 animals in each group. * compared with SN; & compared with TN; # compared with SN (p < 0.05).

Discussion

In the present study, the authors evaluated the effects of physical activity on contractility and intracellular Ca²⁺ transients in myocytes and miR-214 expression in the left ventricle in hypertensive rats. The results showed that the aerobic training not only reduced SAP in hypertensive animals, but also increased the amplitude of miR-214. No effect on LV myocyte contractility was observed.

The efficacy of the physical training applied in the study groups was confirmed by the higher physical capacity, indicated by the TTE, in trained animals as compared with controls. Such increase in physical capacity in response to aerobic training has been previously demonstrated.10^,17,18 More importantly, physical training reduced SAP in hypertensive animals, and such effect is well established in the literature.11^,19

Regarding LV cardiomyocyte contractility, although a reduction in the cell relaxation time in response to physical training was observed in normotensive animals, in SHR, cell contractility of trained animals was not different than that in sedentary animals.

Although cardiomyocyte contractility in SHR was not affected by exercise, higher amplitude and shorter 50% decay time of intracellular Ca²⁺ transient levels were seen in trained animals as compared with sedentary controls. This suggests higher availability of Ca²⁺ in the cytosol and faster removal of calcium from the cytosol, which in turn brings about relaxation.20 These findings corroborate those of another study,21 that showed increased expression of SERCA2a, which is the main determinant of Ca²⁺ removal from the cytosol into sarcoplasmic reticulum.20

With respect to miR-214, which antagonizes the effects of SERCA2a, our results contradict existing data in the literature, since the physical exercise program increased the expression of this microRNA in the left ventricle of hypertensive animals. We expected that aerobic training would reduce the expression of miR-214, which would justify de shorter time to 50% of decay in intracellular concentration of Ca²⁺ transients in LV cardiomyocytes of SHR due to an expected increase in SERCA2a expression. Although SERCA2a expression in the left ventricle was not evaluated in the present study, it was previously demonstrated14 that the left ventricle of normotensive rats subjected to resistance training showed reduced miR-214 expression and increased SERCA2a expression. These adaptations were associated with faster relaxation of myocytes isolated from the left ventricle of trained animals. Similar results showing reduction in miR-214 expression and elevated SERCA2a expression were also reported in infarcted rats subjected to resistance training.13 Therefore, little is known about the effects of aerobic exercise on hypertensive cardiomyocytes, and further studies are needed to investigate other possible changes associated with intracellular Ca²⁺ regulation in the cardiomyocytes of hypertensive rats subjected to aerobic training.

Conclusion

The aerobic training applied in the present study increased the availability of intracellular Ca²⁺ in the myocytes of the left ventricle of hypertensive rats, despite the increased expression of miR-214 and maintenance of cell contractility.

Sources of Funding

This study was funded by FAPEMIG (APQ-00876-14).

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Joel Alves Rodrigues, from Universidade Federal de Viçosa.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee on Animal Experiments of the Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) under the protocol number 29/2014.

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19 Petriz BA, Almeida JA, Gomes CP, Ernesto C, Pereira RW, Franco OL. Exercise performed around MLSS decreases systolic blood pressure and increases aerobic fitness in hypertensive rats. BMC Physiol. 2015 Mar 14;15:1.

Petriz

Almeida

Gomes

Ernesto

Pereira

Franco

Exercise performed around MLSS decreases systolic blood pressure and increases aerobic fitness in hypertensive rats

BMC Physiol 2015 03 14 15 1 1

20 Bers DM. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 2002;415(6868):198-205.

Bers

Cardiac excitation-contraction coupling

Nature 2002 415 6868 198 205

21 Carneiro-Junior MA, Primola-Gomes TN, Quintao-Junior JF, Drummond LR, Lavorato VN, Drummond FR, et al. Regional effects of low-intensity endurance training on structural and mechanical properties of rat ventricular myocytes. J Appl Physiol (1985). 2013;115(1):107-15.

Carneiro-Junior

Primola-Gomes

Quintao-Junior

Drummond

Lavorato

Drummond

Regional effects of low-intensity endurance training on structural and mechanical properties of rat ventricular myocytes

J Appl Physiol (1985) 2013 115 1 107 115

Artigo Original

Exercício Físico e Regulação de Cálcio Intracelular em Cardiomiócitos de Ratos Hipertensos

Rodrigues

Joel Alves

1 Prímola-Gomes

Thales Nicolau

1 Soares

Leôncio Lopes

1 Leal

Tiago Ferreira

1 Nóbrega

Clara

2 Pedrosa

Danillo Laviola

1 Rezende

Leonardo Mateus Teixeira

1 Oliveira

Edilamar Menezes de

2 Natali

Antonio Jose

1 Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa, MG - Brasil 2 Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP - Brasil

Correspondência: Joel Alves Rodrigues, Rua Ana koester, 65 AP 302. CEP 36570-000, Centro, Viçosa, MG – Brasil. E-mail: joel.a.rodrigues1@gmail.com, joel.rodrigues@ufv.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Rodrigues JA, Prímola-Gomes TN, Natali AJ; Obtenção de dados: Rodrigues JA, Soares LL, Leal TF, Nóbrega C, Pedrosa DL, Rezende LMT, Oliveira EM, Natali AJ; Análise e interpretação dos dados: Rodrigues JA, Soares LL, Leal TF, Nóbrega C, Oliveira EM, Natali AJ; Análise estatística: Rodrigues JA, Soares LL, Leal TF, Nóbrega C, Natali AJ; Obtenção de financiamento: Prímola-Gomes TN, Natali AJ; Redação do manuscrito: Rodrigues JA, Natali AJ; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Natali AJ.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Resumo Fundamento:

A regulação intracelular de cálcio (Ca²⁺) em cardiomiócitos é alterada pela hipertensão, e o exercício físico aeróbico traz benefícios para hipertensos.

Objetivo:

Verificar os efeitos do treinamento físico aeróbico sobre a contratilidade e a concentração intracelular de Ca²⁺ transitória em miócitos e a expressão do microRNA 214 no ventrículo esquerdo (VE) de ratos espontaneamente hipertensos (SHR).

Métodos:

SHR e ratos Wistar normotensos com 16 semanas de idade foram divididos em 4 grupos de 13 animais cada: hipertenso sedentário (HS); hipertenso treinado (HT); normotenso sedentário (NS); normotenso treinado (NT). Os animais dos grupos HT e NT foram submetidos a um programa de treinamento progressivo de corrida em esteira, 5 dias/semana, 1 hora/dia, em intensidade de 60-70% da velocidade máxima de corrida, durante 8 semanas. Adotou-se p ≤ 0,05 como nível de significância em todas as comparações.

Resultados:

O treinamento físico reduziu a pressão arterial sistólica nos animais hipertensos. Nos animais normotensos, o treinamento físico reduziu o tempo para 50% de relaxamento celular e o tempo para o pico de contração celular, mas aumentou o tempo para 50% de decaimento da concentração intracelular de Ca²⁺ transitória. Nos animais SHR, o treinamento físico aumentou a amplitude e reduziu o tempo para 50% de decaimento da concentração intracelular de Ca²⁺ transitória, sem alterar a contratilidade celular. O treinamento físico aumentou a expressão do miR-214 apenas nos animais hipertensos.

Conclusão:

O treinamento aeróbico utilizado aumenta a disponibilidade e acelera o sequestro de Ca²⁺ intracelular em miócitos do VE de ratos hipertensos, apesar do aumento da expressão de miR-214 e da manutenção da contratilidade celular.

Palavras-chave: Hipertensão Exercício Ratos Sinalização do Cálcio Proteínas Sensoras de Cálcio Intracelular

Introdução

A hipertensão arterial sustentada leva ao remodelamento progressivo do miocárdio. Enquanto a função cardíaca é aumentada em resposta ao processo hipertrófico ativo dos miócitos do ventrículo esquerdo (VE) durante a fase compensada, o remodelamento do VE é caracterizado pela combinação de hipertrofia de cardiomiócitos e proliferação de outros tecidos. Por exemplo, há aumento da deposição de colágeno, o que resulta em fibrosamento do tecido ventricular e, consequentemente, enrijecimento do miocárdio.1^,2 Este quadro tem sido observado no início da fase compensatória da hipertensão (ex. 3 - 4 meses), mas a função cardíaca é preservada.1 Aumento de marcadores pró-inflamatórios (ex. IL-6; TNFα) tem sido observado no VE de ratos espontaneamente hipertensos (SHR, do inglês spontaneously hypertensive rats) com apenas 5 a 6 meses de idade.3^,4

Os benefícios do treinamento físico aeróbico para hipertensos estão bem estabelecidos na literatura.5^,6 No modelo animal para esta doença - SHR na fase compensada (~ 6 meses de idade) - este tipo de treinamento físico tem se mostrado eficaz em atenuar a disfunção sistólica e restaurar a elasticidade ventricular em SHR fêmeas.7 No miocárdio de SHR, o treinamento aeróbico reduziu apoptose,4^,8 aumentou a função contrátil de cardiomiócitos isolados do VE e normalizou a expressão de proteínas reguladoras do ciclo intracelular de cálcio, dentre elas a cálcio ATPase do retículo sarcoplasmático (SERCA2a) e a fosfolambam.9^-11

Na hipertrofia cardíaca fisiologia ou patológica, os microRNAs (miRNAs) sofrem alterações na sua expressão relacionada ao remodelamento cardíaco.12 O microRNA 214 (miR-214) está envolvido no processo de contração muscular do tecido cardíaco e sequestro de Ca²⁺ pelo retículo sarcoplasmático, pois regula negativamente a expressão da SERCA-2a.13 Em relação ao exercício físico, melhoras na função contrátil de cardiomiócitos, com aumento da proteína SERCA-2a e redução da expressão de miR-214, foi observada em ratos normotensos e infartados em resposta ao treinamento resistido.13^,14 Entretanto, pouco se sabe sobre a expressão do miR-214 em animais SHR submetidos ao treinamento físico aeróbico. Assim, o objetivo deste estudo é verificar os efeitos do treinamento aeróbico sobre a contratilidade de cardiomiócitos e a expressão de miR-214 no VE de ratos hipertensos.

Métodos Animais experimentais

SHR e normotensos (Wistar), com 16 semanas de idade, obtidos no Biotério Central do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de Viçosa, foram divididos em grupos de 13 animais cada: NS (normotenso sedentário); NT (normotenso treinado); HS (hipertenso sedentário); e HT (hipertenso treinado). O tamanho da amostra foi definido por conveniência, sendo que em cada grupo, 8 animais foram utilizados para isolamento de cardiomiócitos e 5 para análise de expressão gênica. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os Princípios Éticos elaborados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foram aprovados pela Comissão de Ética para Uso de Animais (CEUA-UFV; processo n° 29/2014). Os animais foram alojados em gaiolas coletivas (4 animais por gaiola), receberam água e ração comercial ad libitum sendo mantidos em ambiente com temperatura média de 22°C e regime de luminosidade de doze horas de escuridão e doze horas de claridade.

Protocolo de treinamento físico e teste de esforço em esteira rolante

Antes do início do treinamento, os animais foram adaptados à esteira rolante durante 5 dias, 10 min/dia, 0º de inclinação, na velocidade de 5 m/min. Após 48 horas, todos os animais foram submetidos a um teste progressivo em esteira rolante para determinar a velocidade máxima de corrida (VMC), começando a 5 m/mim, 0° de inclinação, com incrementos de 3 m/min a cada 3 minutos até a fadiga de cada animal. A fadiga foi definida e o teste interrompido quando os animais não mantiveram a corrida de acordo com a velocidade da esteira.

Os animais dos grupos NT e HT foram submetidos a um programa de treinamento físico por oito semanas, 5 dias/semana (segunda a sexta-feira). Eles iniciaram correndo em esteira, em intensidade de 5 a 6 m/min, 0º de inclinação e duração de 10 minutos no primeiro dia. Nesta primeira semana, a duração foi aumentada em 5 minutos por dia e a intensidade foi mantida. Na segunda semana, a duração continuou sendo aumentada em 5 minutos/dia e a intensidade em 2% da VMC por dia, de maneira que a partir do primeiro dia da 3ª até o final da 8ª semana, os animais correram a uma intensidade de 60% da VMC (~ 18 a 22 m/min), durante 60 minutos por dia.

Os testes na esteira rolante para determinação da VMC foram realizados em cada animal dos grupos experimentais antes do treinamento, e no final da 4ª semana nos animais dos grupos treinados (NT e HT) para avaliação do tempo total de exercício até a fadiga (TTF) e redefinição da intensidade de treinamento. Quarenta e oito horas após a última sessão de treino, os testes foram repetidos em todos os animais dos grupos experimentais para avaliação dos efeitos do treinamento físico sobre a capacidade de corrida.

Durante o período experimental, os animais dos grupos sedentários NS e HS foram manuseados e colocados na esteira rolante 3 dias/semana (segundas, quartas e sextas-feiras), 10 min/dia, 0° de inclinação à intensidade de 5 m/min para expô-los a condições experimentais similares àquelas dos grupos treinados.

A pressão arterial sistólica (PAS) foi aferida no início e ao final do período experimental, isto é, 48 horas após a última sessão de exercício. As medidas foram realizadas pela manhã, sem anestesia, por meio de pletismografia de cauda (LE 5001, Panlab, Harvard Apparatus, Espanha), sendo realizadas três medidas para adoção do valor intermediário.

Isolamento do cardiomiócito

Quarenta e oito horas após a última sessão de exercício, miócitos do VE foram isolados conforme descrito por Locatelli et al.15 Resumidamente, os animais foram pesados e sacrificados por deslocamento cervical, sendo o coração removido e pesado. Em seguida, foi canulado via artéria aorta em um sistema Langendorff e perfundido com solução de isolamento [composição (mM): 130 Na+; 5,4 K+; 1,4 Mg⁺; 140 Cl-; 0,75 Ca²⁺; 5,0 Hepes; 10 glicose; 20 taurina; e 10 creatina; pH = 7,3 em temperatura ambiente]. Em seguida, o coração foi perfundido com solução livre de cálcio contendo 0,1 mM de ethylene glycol-bis (ß-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-tetraacetic acid (EGTA), por um período de 4-6 min. Na sequência, o coração foi perfundido com a solução de isolamento contendo 1,0 mg/mL de colagenase tipo 2 (Worthington, EUA) e 0,1 mg/mL de protease (Sigma-Aldrich, EUA) por 15 a 20 min. As soluções utilizadas foram oxigenadas (O2 100% - White Martins, Brasil) e mantidas em temperatura de 35°C. Após perfusões, os ventrículos foram separados dos átrios e pesados. Em seguida, o VE foi colocado em frasco contendo 5,0 mL da solução enzimática (colagenase + protease). O frasco foi agitado moderadamente durante 05 min, em banho-maria a 37°C, após o qual o tecido foi retirado do frasco e o restante foi centrifugado (3.000 rpm) por 30s. O sobrenadante foi removido e os cardiomiócitos foram suspendidos na solução de isolamento e armazenados em refrigerador (5°C) até serem utilizados.

Medida da contratilidade celular

As contrações dos miócitos isolados foram medidas por meio da técnica de alteração do comprimento dos cardiomiócitos usando-se o sistema de detecção de bordas (Ionoptix, Milton, MA-EUA) montado num microscópio invertido (Nikon Eclipse - TS100, Japão), conforme descrito previamente.15 Resumidamente, os miócitos foram acomodados em uma câmara experimental com a base de vidro e banhados por solução tampão com a seguinte composição (em mM): 136,9 NaCl; 5,4 KCl; 0,37 NaH2PO4; 0,57 MgCl2; 5,0 Hepes = 5; 5,6 Glicose e 1,8 CaCl² (pH = 7,4 em temperatura ambiente). Os miócitos foram visualizados em um monitor através de uma câmera (Myocam, Ionoptix, frequência de 240 Hz) acoplada ao microscópio utilizando-se um programa de detecção de imagens (Ionwizard, Ionoptix). Os cardiomiócitos foram estimulados externamente na frequência de 1,0 Hz (20 Volts, duração de 5 min), em temperatura ambiente (~25°C), utilizando-se um par de eletrodos de platina e um estimulador elétrico de campo (Myopacer, Ionoptix). Os movimentos das bordas longitudinais dos miócitos foram capturados pelo sistema de detecção de bordas (Ionwizard, Ionoptix) e armazenados para análise posterior. Foram utilizados para as medidas de contração somente os cardiomiócitos que estavam em boas condições, com as bordas e as estriações sarcoméricas bem definidas, relaxados em repouso, sem apresentar contrações voluntárias. As contrações foram analisadas conforme descrito previamente.15

Medida da concentração intracelular de Ca2+ transitória

As medidas da concentração intracelular de Ca²⁺ transitória nos cardiomiócitos isolados foram realizadas por meio de sistema de fluorescência (Ionoptix, EUA) montado em um microscópio invertido (Nikon Eclipse - TS100, EUA) equipado com uma lente objetiva de imersão em óleo (S Fluor, 40x, Nikon, EUA), conforme descrito por Natali et al.16 Em resumo, os miócitos foram incubados com uma sonda de Ca²⁺ (5 µM por 10 min) (Fura-2AM, ThermoFisher, Waltham, EUA). A razão entre a fluorescência emitida a 510 nm em resposta a excitações a 340 nm e a emitida em resposta a excitações a 380 nm foi usada como índice da concentração intracelular de Ca²⁺ transitória. Os miócitos foram estimulados eletricamente (Myopacer, Field Stimulator, Ionoptix, EUA) por um par de eletrodos de platina com um pulso supra-limiar de 0,2 ms (20V), na frequência de 1 Hz, em temperatura ambiente (~ 25°C). Os parâmetros da concentração intracelular de Ca²⁺ transitória foram analisados usando-se o software IonWizard (IonWizard, 6.3, IonOptix, Milton, EUA).

Análise de expressão gênica

Para as análises de expressão gênica, após eutanásia, fragmentos do VE foram coletados e armazenados em Freezer a -80°C. O RNA total do VE foi isolado em 1 mL de Trizol (Invitrogen) conforme indicação do fabricante e armazenado a -70°C. As amostras de RNA foram diluídas na proporção de 1:100 em água, e analisadas por espectrofotometria em 260 a 280 nm.

Para análise da expressão gênica do miRNA-214 foi utilizado o kit Taqman MicroRNA Assays (Applied Biosystems) seguindo as indicações do fabricante. A quantificação da expressão gênica foi feita em dois passos: primeiro, o DNA complementar específico (cDNA) foi obtido através da transcrição reversa da amostra de RNA total utilizando-se um primer específico para o miRNA analisado do tipo stem-loop e TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit; e segundo, por reação de Real Time-PCR, os produtos de PCR foram amplificados da amostra de cDNA obtida anteriormente, utilizando TaqMan® MicroRNA Assay e TaqMan® Universal PCR Master Mix II. Foi utilizado como controle o normalizador U6 snRNA. As análises foram feitas em equipamento ABI 7500 Real Time-PCR Systems (Applied Biosystems).

Análise estatística

As pressuposições da análise de variância (ANOVA) - homogeneidade de variâncias entre os grupos e de normalidade das observações, foram checadas e não foram detectadas violações que merecessem atenção. As variáveis se apresentam normais e contínuas. Foi utilizado os testes de Levene, Qui quadrado e Kolmogorov-Smirnov. As comparações entre os valores iniciais e finais de PAS e de TTF de cada grupo experimental foram feitas usando-se o teste t de Student pareado. Para as comparações entre os quatro grupos, usou-se ANOVA two-way, seguida do post-hoc de Tukey. Utilizou-se o programa SigmaPlot (Systat Software, Inc., San Jose, CA, EUA) e adotou-se como nível de significância 5%. Os resultados são apresentados como média ± desvio-padrão da média (DP).

Resultados

O programa de treinamento físico aplicado aumentou o TTF dos animais normotensos e hipertensos (Figura 1A). A figura 1B apresenta a velocidade de corrida desses animais durante os treinamentos.

Figura 1 (A) Tempo total até a fadiga dos animais normotensos e hipertensos antes (pré) e após (pós) o treinamento. (B) Velocidade de corrida durante os treinamentos. NT, normotenso treinado. HT hipertenso treinado. Dados são media ± DP de 8 animais em cada grupo. *diferente NT-Pré; # diferente HT-Pré (p < 0.05).

Os animais hipertensos apresentaram menor peso corporal (PC), igualdade no peso de VE (PVE), maior PVE/PC e nos animais HT maior peso dos ventrículos (PV)/PC em relação aos normotensos (Tabela 1). O treinamento físico aplicado não afetou estes parâmetros.

Tabela 1 Peso corporal e dos ventrículos nos grupos experimentais

	NS (n = 8)	NT (n = 8)	HS (n = 8)	HT (n = 8)	Valor de p
PC (g)	411,30 ± 21,51	447,10 ± 43,94	350,60 ± 21,97* ^&	338,90 ± 30,67* ^&	0,001
PV (g)	1,62 ± 0,20	1,49 ± 0,25	1,47 ± 0,17	1,66 ± 0,23	0,954
PVE (g)	1,12 ± 0,13	1,08 ± 0,13	1,18 ± 0,14	1,25 ± 0,15	0,265
PV/PC (mg/g)	3,97 ± 0,62	3,46 ± 0,47	4,19 ± 0,45	4,93 ± 0,80* ^&	0,000
PVE/PC (mg/g)	2,75 ± 0,42	2,42 ± 0,23	3,39 ± 0,39* ^&	3,72 ± 0,48* ^&	0,000

NS: normotenso sedentário; NT: normotenso treinado; HS: hipertenso sedentário; HT: hipertenso treinado; PC: peso corporal; PV: peso dos ventrículos; PVE: peso do ventrículo esquerdo; n, número de animais;

diferente NS;

diferente NT (p < 0.05).

Os resultados referentes à PAS são apresentados na Figura 2. O programa de exercício físico aplicado não alterou a PAS nos animais normotensos em relação ao pré-treinamento; por outro lado, no grupo experimental hipertenso, o treinamento físico reduziu a PAS em relação ao pré-treinamento (Figura 2A).

Figura 2 Pressão arterial sistólica (PAS) dos animais normotensos e hipertensos. (A) PAS pré-treinamento vs. pós-treinamento). (B) PAS final de todos os grupos experimentais. NS, normotenso sedentário. NT, normotenso treinado. HS, hipertenso sedentário. HT, hipertenso treinado. Dados são media ± DP de 8 animais em cada grupo. * diferente NT-Pré (A) NS(B); & diferente NT-Pós (A) NT (B); # diferente HT-Pré (A) NS(B); + diferente HT-Pós (A) HT (B)(p < 0.05).

A figura 3 apresenta os dados da contratilidade celular. A amplitude de contração não foi afetada pela hipertensão nem pelo treinamento físico (Figura 3A). Da mesma forma, o tempo para o pico de contração não foi alterado em nenhum dos grupos experimentais (Figura 3B). Entretanto, o treinamento físico foi capaz de diminuir o tempo para 50% de relaxamento (Figura 3C) nos animais normotensos, mas não nos hipertensos.

Figura 3 Contratilidade de cardiomiócitos dos animais normotensos e hipertensos. (A) Amplitude de contração é expressa como percentual de variação do comprimento celular de repouso (% c.c.r) após o estímulo elétrico a 1HZ; (B) Tempo para o pico de contração; (C) Tempo para 50% de relaxamento; NS: normotenso sedentário; NT: normotenso treinado; HS: hipertenso sedentário; HT: hipertenso treinado. Dados são media ± DP de 60 a 80 células de 8 animais em cada grupo. * diferente NS; # diferente NS; + diferente HT (p < 0.05).

A Figura 4A mostra que o treinamento físico não modificou a amplitude de [Ca²⁺]_i nos animais normotensos. Porém, o treinamento físico aumentou a amplitude do [Ca²⁺]_i no grupo HT, comparado ao HS. O treinamento físico também diminuiu o tempo para o pico do [Ca²⁺]_i nos animais do grupo NT, em relação aos do grupo NS (Figura 4B), mas não nos animais hipertensos. O tempo para 50% de decaimento do [Ca²⁺]_i (Figura 4C) foi aumentado no grupo NT em relação ao NS. Nos animais hipertensos, todavia, o treinamento físico reduziu este parâmetro (p < 0,05).

Figura 4 Concentração intracelular de cálcio transitória em cardiomiócitos de animais normotensos e hipertensos. (A) Amplitude do cálcio intracelular. (B) Tempo para o pico de cálcio intracelular. (C) Tempo para 50% de decaimento do cálcio intracelular. NS: normotenso sedentário; NT: normotenso treinado; HS: hipertenso sedentário; HT: hipertenso treinado. Dados são media ± DP de 40-50 células de 8 animais em cada grupo). * diferente NS; & diferente NT; # diferente NS; + diferente HT (p < 0.05).

O protocolo de treinamento físico aplicado não causou nenhuma modificação na expressão de mir-214 nos animais normotensos (Figura 5). Entretanto, nos animais hipertensos houve aumento no grupo HT em relação ao HS e aos demais grupos.

Figura 5 Expressão de microRNA 214 no ventrículo esquerdo dos animais normotensos e hipertensos. NS: normotenso sedentário; NT: normotenso treinado; HS: hipertenso sedentário; HT: hipertenso treinado. Dados são media ± DP de 5 animais em cada grupo. * diferente NS; & diferente NT; # diferente NS (p < 0.05).

Discussão

Neste estudo, verificaram-se os efeitos do treinamento aeróbico sobre a contratilidade e a concentração intracelular de Ca²⁺ transitória em miócitos e a expressão do miR-214 no VE de ratos hipertensos. Os resultados mostram que o treinamento aeróbico aplicado, além de reduzir a PAS dos animais hipertensos, aumentou amplitude e reduziu o tempo para 50% de decaimento da concentração intracelular de Ca²⁺ transitória, assim como aumentou a expressão de miR-214. Todavia, a contratilidade de miócitos isolados do VE não foi alterada.

A eficiência do programa de treinamento físico usado no presente estudo foi confirmada quando os animais treinados apresentaram uma maior capacidade física, representada pelo TTF, comparada aos seus respectivos controles. Esta maior capacidade física de SHR em resposta ao treinamento aeróbico já foi demonstrada em estudos prévios.10^,17^,18 Mais importante, o treinamento físico reduziu a PAS nos animais hipertensos, e esse efeito está bem estabelecido na literatura.11^,19

No presente estudo, em relação à contratilidade de cardiomiócitos do VE, apesar do treinamento físico aeróbico reduzir o tempo de relaxamento celular nos animais normotensos, nos animais SHR a contratilidade celular nos animais treinados foi mantida nos mesmos níveis dos sedentários.

Embora a contratilidade dos cardiomiócitos dos SHR não tenha sido afetada pelo treinamento físico, a concentração intracelular de Ca²⁺ transitória apresentou maior amplitude e menor tempo de decaimento nos animais treinados que seus controles sedentários. Isso indica maior disponibilidade de Ca²⁺ no citosol, assim como maior velocidade de remoção desse íon e consequente relaxamento celular.20 Tais achados corroboram os de outro estudo,21 o qual demonstrou aumento da expressão de SERCA2a, principal responsável pela remoção do Ca²⁺ do citosol para dentro do retículo sarcoplasmático.20

Em relação ao miR-214, regulador antagônico da SERCA2a, os resultados deste estudo são contraditórios aos existentes na literatura, pois o exercício físico utilizado causou aumento na expressão deste microRNA no VE dos animais hipertensos. Esperava-se que o treinamento físico aeróbico reduzisse a expressão de miR-214, o que justificaria a redução do tempo para 50% de decaimento da concentração intracelular de Ca²⁺ transitória nos cardiomiócitos do VE dos SHR, em função de um esperado aumento na expressão de SERCA2a. Apesar da expressão de SERCA2a no VE não ter sido avaliada no presente estudo, um estudo14 demostrou que o VE de ratos normotensos submetidos a treinamento físico resistido apresentou redução na expressão de miR-214 e aumento na expressão de SERCA2a. Tais adaptações estavam associadas à maior velocidade de relaxamento dos miócitos isolados do VE dos animais treinados. Resultados similares apresentando redução na expressão de miR-214 e aumento na expressão de SERCA2a também foram observados em ratos infartados submetidos ao treinamento físico resistido.13 Assim, pouco se sabe sobre os efeitos do exercício aeróbico sobre as propriedades do cardiomiócito hipertenso, e estudos futuros são necessários para investigar outras possíveis alterações associadas à regulação intracelular de Ca²⁺ em cardiomiócitos de ratos hipertensos submetidos ao treinamento físico aeróbico.

Conclusão

O treinamento físico aeróbico utilizado aumentou a disponibilidade intracelular e acelera o sequestro de Ca²⁺ em miócitos do VE de ratos hipertensos, apesar do aumento da expressão de miR-214 e da manutenção da contratilidade celular.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela FAPEMIG (APQ-00876-14).

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Joel Alves Rodrigues pela Universidade Federal de Viçosa.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) sob o número de protocolo 29/2014.