Arq Bras CardiolabcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCXfhPV4V4CXznJh9p7DLLnxNS0066-782X2018001400134S0066-782X201800500910310.5935/abc.20180119Original ArticlePersistent Inflammatory Activity in Blood Cells and Artery Tissue from Patients with Previous Bare Metal StentFarskyPedro Silvio1HirataMario H.2ArnoniRenato Tambellini1AlmeidaAntonio Flavio Sanches1IssaMario1LimaPaula Helena Ortiz1HiguchiMaria de Lourdes3Lin-WangHui T2Instituto Dante Pazzanese de CardiologiaSão PauloSPBrazilInstituto Dante Pazzanese de Cardiologia, São Paulo, SP - BrazilInstituto Dante Pazzanese de CardiologiaLaboratório de Investigação Molecular em CardiologiaSão PauloSPBrazilLaboratório de Investigação Molecular em Cardiologia, Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia, São Paulo, SP - BrazilUniversidade de São PauloFaculdade de MedicinaHospital das ClínicasSão PauloSPBrazilInstituto do Coração (InCor) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP - BrazilMailing Address: Pedro Silvio Farsky Rua Alberto Faria, 248. Postal Code 05459-000, Alto de Pinheiros, São Paulo, SP - Brazil. E-mail: pedro.farsky@gmail.com
Author contributions
Conception and design of the research: Farsky PS, Hirata MH, Lima PHO, Lin-Wang HT; Acquisition of data: Farsky PS, Arnoni RT, Almeida AFS, Issa M, Lima PHO, Higuchi ML, Lin-Wang HT; Analysis and interpretation of the data: Farsky PS, Hirata MH, Arnoni RT, Almeida AFS, Issa M, Lima PHO, Higuchi ML, Lin-Wang HT; Statistical analysis: Lin-Wang HT; Obtaining financing: Farsky PS, Lima PHO; Writing of the manuscript: Farsky PS, Lin-Wang HT; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Farsky PS, Hirata MH, Arnoni RT, Almeida AFS, Issa M, Lin-Wang HT.
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
1607201808201811121341412008201723022018This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly citedAbstractBackground:
Studies have pointed out a higher mortality after coronary artery bypass surgery (CABG) in patients with stent.
Objective:
To evaluate inflammatory markers in peripheral blood cells and in coronary artery tissue samples obtained during CABG in patients with stent compared to controls.
Methods:
The case series consisted of two groups, one with previous stent implantation (n = 41) and one control (n = 26). The expression of the LIGHT, IL-6, ICAM, VCAM, CD40, NFKB, TNF, IFNG genes was analyzed in peripheral blood cells collected preoperatively. The coronary artery was evaluated for: interleukin-6, ICAM, VCAM, CD40, NFKB, TNF-alpha and IFN-gamma by immunohistochemistry. A total of 176 tissue samples were grouped for analysis in: A1- arteries with stent (n = 38); A2- native arteries from patients with stent in another artery (n = 68); and A3- arteries without stent from controls undergoing routinely CABG surgery (n = 70). A significance level of 0.05 was adopted.
Results:
Patients with stent showed higher TNF (p = 0.03) and lower CD40 gene expression (p = 0.01) in peripheral blood cells than controls without stent. In coronary artery samples, the TNF-alpha protein staining was higher in the group A1, not only in the intima-media layer (5.16 ± 5.05 vs 1.90 ± 2.27; p = 0.02), but also in the adipose tissue (6.69 ± 3.87 vs 2.27 ± 4.00; p < 0.001). Furthermore, group A1 had a higher interleukin-6 protein staining in adipose tissue than group A3 (p = 0.04).
Conclusion:
We observed a persistently higher systemic TNF expression associated with exacerbated TNF-alpha and interleukin-6 local production in patients with stents. This finding may contribute to a worse clinical outcome.
Retrospective studies have suggested that coronary artery bypass grafting (CABG) surgery after percutaneous coronary intervention (PCI) can impair short and long-term outcomes.1-7 Previous studies have demonstrated that PCI is associated with higher in-hospital mortality, despite the lower risk profile of PCI patients,3 but there is no consensus in the literature.8 An analysis of the MASS study9 has shown that patients who underwent PCI treatment were more likely to develop progression in native coronary arteries, than those undergoing CABG or medical treatment.
During PCI, a focal inflammatory reaction occurs with plaque rupture caused by stent implantation, but there are still controversies if this reaction persists in the long term. There is scarce information about a persistent systemic inflammatory reaction or tissue mediators in coronary artery after stent implantation, as well as about the comparison between coronary arteries with stent, coronary arteries without stent but with stent in another artery and controls patient.
The CABG allows a unique opportunity to collect coronary artery specimen to evaluate local inflammatory reaction long after stent implantation. This study aims to evaluate inflammatory genes expression in peripheral blood cells and inflammatory protein localization in coronary artery tissue obtained during CABG from patients with and without previous stent implantation. It is worth mentioning that CABG represents a unique opportunity to obtain a tiny coronary artery tissue sample to evaluate local inflammatory in humans. Nowadays, patients who receive previous bare metal stent (BMS) implantation and need CABG surgery later represent a significant number of cardiology hospital patients, especially in developing countries. Our results can contribute to clarify the involvement of persistent local and systemic inflammation in the later phase of stent restenosis.
MethodsCase series
The patients admitted to elective CABG with previous stent implantation were consecutively included in this study after signing informed consent. The protocol was approved by the Dante Pazzanese Institute of Cardiology ethics committee (Protocol 4059-2011).
This study included 67 patients as follows: 41 patients with previous intracoronary BMS implantation and 26 patients without stent implantation submitted to elective CABG. All patients had stable angina and more than 6 months of the stent implantation, aiming to exclude ongoing restenosis. The exclusion criteria consisted of emergency surgeries, acute coronary syndromes and chronic renal failure in dialysis because of chronic inflammatory reaction.
Peripheral blood sample was collected preoperatively from the antecubital vein, using PAXgene tubes (PreAnalytiX®, BD Company, UK) for systemic gene expression analysis.
During CABG surgery, a tiny fragment of the bypassed coronary artery was obtained at the arteriotomy site, usually 10 mm after the stent implantation site, to evaluate local inflammation markers. All tissue samples were immediately immersed in buffered formalin for further paraffin-embedded block preparation. Some arterial fragments obtained were not adequate for histological analysis, thus, 176 artery samples were included and grouped as follows: A1- arteries with stent (n = 38); A2- native arteries from a patient with a stent in another artery (n = 68); and A3- arteries from patients without previous stent placement (n = 70).
RNA isolation, reverse transcription and real-time polymerase chain reaction (PCR)
Total RNA was extracted from peripheral blood collected in PAXgene tubes (PreAnalytiX®, BD Company, UK) using PAXgene blood RNA kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany), being then quantified using Qubit® 2.0 fluorometer (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY). The RNA integrity was performed using Tapestation® 2200 and R6K Screen Tape (Agilent Technologies, Inc. UK). The cDNA was transcribed from 200 ng of total RNA using High Capacity RNA-to-cDNA Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, USA). Real-time qPCR was carried out in Rotor-Gene® detection system using the TaqMan® Fast Multiplex PCR kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) and primers from Applied Biosystem commercially designed for TaqMan® qPCR (Applied Biosystems, Foster, CA, USA).
The expression of the following genes was evaluated: LIGHT (Hs00542477_m1); IL-6 (Hs00985639_m1); ICAM (Hs00164932_m1); VCAM (Hs00174239_m1); CD40 (Hs01002913_g1); NFKB (Hs00231653_m1); TNF (Hs01113624_g1); IFNG (Hs00989291_m1) and GAPDH (Hs00266705_g1). For all genes, we constructed standard curves and determined the slope to calculate the PCR efficiency. Almost equal efficiency for all primer/probe systems was observed. All samples were tested in duplicate using GAPDH as a reference gene, which was previously chosen between the six most common endogenous myocardium genes using geNorm algorithm.10 The samples amplified after 40 cycles of PCR were considered negative and excluded from further statistical analysis. The expression of the reference GAPDH gene was applied for data normalization, and the relative expression of each mRNA was calculated using the 2 -∆∆CT method.11
Immunohistochemistry staining
Firstly, 4-µm-thick formalin-fixed-paraffin-embedded artery samples were sectioned and fixed in silanized slides, followed by dewaxing at 70°C, in the oven, for 1 hour, and immersion in three xylene baths for 10 minutes. They were then rehydrated in decreasing concentrations (100%, 90%, 75%) of ethyl alcohol. Antigen retrieval was performed using the Trilogy® buffer (Cell Marque, California, USA) at a Decloaker equipment at 90°C for 40 minutes (Biocare Medical, CA, USA). The specific blocking reagents (Erviegas EasyPath, DuraEdge, USA) were applied for endogenous peroxidase and protein blocking. In the next step, the slides were incubated with respective primary antibodies previously titrated and diluted in universal thinner (Erviegas EasyPath, DuraEdge, USA). Primary antibodies against interleukin-6 (IL-6) (ab6672), ICAM (ab2213), VCAM (ab106777), TNF-alpha (ab1793), IFN-gamma (ab9657), CD40 (ab58612), and NFKB (ab16502) from Abcam (Cambridge, MA, UK) were used. The immunoperoxidase reaction was detected using Mach4 Kit Universal HRP Polymer + DAB (Biocare Medical, California, USA), and, finally, the slides were stained with Harris hematoxylin (Erviegas EasyPath, DuraEdge, USA) and assembled by synthetic resin Erv-Mount (Erviegas EasyPath, DuraEdge, USA). The positive control of immunohistochemistry reaction was performed using tissues that have the same constructive antigens as the antigen of interest. After immunohistochemistry processing, the slides were scanned through a Scanscope CS System unit (Aperio Technologies, Inc., CA, USA), with an objective 20x Olympus UPlanSApo with specifications 20x/0.75 attached to the scanner, generating image files in svs format. Scanned images were analyzed using the Aperio ImageScope viewing software (Aperio Technologies, Inc., CA, USA) that reports the percentage of positively stained area in relation to the total tissue area.
Statistical analysis
Continuous variables are reported as mean and standard deviation or median and interquartile interval, depending on the assumption of normality. Categorical variables are reported as absolute and relative frequency. Values between groups were compared by unpaired Student t test after testing for normal distribution by KS test; otherwise, nonparametric Mann-Whitney U tests were used. Fisher exact or chi-square test was used for categorical variables with nominal scales. For comparison of artery tissue markers, Kruskal-Wallis test (or ANOVA, assumption of normality) was used, and, for non-parametric multiple comparisons, Tukey's test. A p-value lower than 0.05 was considered statistically significant. The SPSS version 19 was used.
To detect 3 units with standard deviation of 4, 80% test power, and 5% alpha, the sample size calculation is 105 cases.
ResultsClinical characteristics of study group
The frequencies of clinical characteristics (Table 1), such as sex, diabetes, dyslipidemia, smoking, previous stroke and heart attack, are similar in both groups. However, the stent group was younger and had a higher prevalence of ventricular dysfunction, characterized by an ejection fraction lower than 50%. The control group had a higher blood platelet count (269,560 ± 74,461) than the stent group (237,355 ± 70,831), but with no statistical significance (p = 0.12). All patients were on statins and acetylsalicylic acid treatment.
Biodemographic data of the studied groups: with previous stent implantation and controls
Variables
Stent Group
Control Group
p value
Cases
41
26
Age (years)
60.2 ± 7.1
6.3 ± 8.69
0.004
Female (%)
13 (31.3)
8 (30.8)
0.58
Blood platelet count
237.355 ± 70.831
269.560 ± 74.461
0.12
Hypertension (%)
35 (85.4)
22 (84.6)
0.60
Diabetes (%)
17 (42.5)
8 (36.4)
0.42
Current smoking (%)
4 (10.5)
3 (14.3)
0.48
Stroke (%)
2 (5.3)
0
0.43
CKD (%)
2 (5.3)
0
0.43
Dyslipidemia (%)
25 (62.5)
16 (64)
0.56
MI (%)
14 (35.9)
5 (22.7)
0.22
LVEF < 50% (%)
14 (41.2)
2 (9.1)
0.009
ASA (%)
41 (100)
26 (100)
1.00
Statins (%)
41 (100)
26 (100)
1.00
CKD: chronic kidney disease; MI: myocardial infarction; LVEF: left ventricular ejection fraction; ASA: acetylsalicylic acid. Age and blood platelet count were expressed as mean ± standard deviation. Sex, hypertension, diabetes, smoking, stroke, CKD, dyslipidemia, MI, LVEF < 50%, ASA use, and statin use are expressed in numbers and percentages of the patients studied. The statistical significance level adopted was p < 0.05.
The time between stent implantation and CABG was over 6 months. Nine patients (22%) had stent implanted within 6 and 12 months, 25 patients (61%) had only one stent, and 16 patients (39%) had two or more stents implanted.
Gene expression in peripheral blood cells by real-time PCR
Total RNA from peripheral blood cells was obtained and the expression of the following genes was evaluated: LIGHT, IL-6, ICAM, VCAM, CD40, NFKB, TNF, IFNG and GAPDH. Of eight genes, the expression of only two differed between the stent and control groups: the expression of TNF was significantly higher (p = 0.0308) in the stent group (Figure 1f-) and that of CD40 was higher in the control group (p = 0.0106) (Figure 1a-). No difference was detected in the expression of IL-6, IFNG, LIGHT, NFKB, ICAM and VCAM genes (Figure 1).
Expression of inflammatory genes in peripheral blood. The expression of the genes CD40 (a), IL-6 (b), INFG (c), LIGHT (d), NFKB (e), TNF (f), ICAM (g) and VCAM (h) was evaluated by real-time PCR using GAPDH gene as internal control to calculate relative expression (2-ΔΔCT). The patients with coronary stent implantation (n = 35) were compared with controls (n = 25) using nonparametric Mann-Whitney U test. The difference is considered significant for p-values < 0.05.
Quantitative analysis by immunohistochemistry
The quantification of proteins staining by immunohistochemistry is presented in Table 2 and illustrated in Figures 2 and 3. The TNF-alpha staining in the arteries of the adipose tissue was higher in group A1 than in group A2 (6.69 ± 3.87 vs 2.27 ± 4.00; p < 0.001) (Figure 2-a). In addition, group A1 had higher TNF-alpha staining in the intima-media region than group A3 did (5.16 ± 5.05 vs 1.90 ± 2.27; p = 0.023) (Figure 2-b). A large amount of TNF-alpha was detected in the cytoplasm of inflammatory cells and around the lipid core (Figure 3-C and D).
Quantification of CD40, ICAM, VCAM, MHC-II, TNF-alpha, NFKB, IL-6 and IFN-gamma proteins in arterial intima-media layer, adventitia and adipose tissue by immunohistochemistry
Protein
Artery layers
Group A1
Group A2
Group A3
p value (α = 0.05)
n
mean
Std. dev
n
mean
Std. dev
n
mean
Std. dev
3 groups
1 vs 2
1 vs 3
2 vs 3
CD40
intima-media
16
1.37
2.02
27
1.51
1.73
23
1.11
1.56
0.55
ns
ns
ns
Adventitia
13
0.70
0.77
26
0.82
0.71
19
1.27
1.66
0.58
ns
ns
ns
Adipose tissue
3
0.73
0.12
6
0.62
0.58
9
0.58
0.74
0.45
ns
ns
ns
ICAM
intima-media
18
3.27
3.00
27
3.47
3.77
20
2.81
4.23
0.16
ns
ns
ns
Adventitia
14
4.07
3.67
25
4.22
4.82
19
3.99
5.39
0.76
ns
ns
ns
Adipose tissue
1
5.93
-
7
1.99
1.37
5
1.52
1.64
0.22
ns
ns
ns
VCAM
intima-media
14
11.88
16.01
24
10.33
9.64
23
7.88
6.12
0.76
ns
ns
ns
Adventitia
11
4.69
8.39
19
4.09
4.74
21
2.56
2.26
0.68
ns
ns
ns
Adipose tissue
2
4.31
5.28
4
1.76
1.22
4
0.32
0.36
0.10
ns
ns
ns
MHC II
total area
7
0.74
0.59
8
0.47
0.12
30
0.75
0.52
0.307
ns
ns
ns
TNF-alpha
intima-media
15
5.16
5.05
24
3.11
3.01
21
1.90
2.27
0.03
ns
0.023
ns
Adventitia
14
4.05
2.82
21
2.28
2.24
20
3.57
5.95
0.10
ns
ns
ns
Adipose tissue
4
6.69
3.88
4
1.27
0.84
9
2.27
4.00
0.05
0.001
ns
ns
NFKB
intima-media
14
1.11
1.14
24
0.93
0.88
20
0.92
1.07
0.96
ns
ns
ns
Adventitia
14
0.64
0.61
21
0.83
0.78
19
0.76
0.55
0.65
ns
ns
ns
Adipose tissue
2
1.18
0.87
6
0.52
0.44
6
1.63
2.58
0.66
ns
ns
ns
Interleukin-6
intima-media
16
1.15
1.12
23
1.27
1.61
21
0.66
0.88
0.17
ns
ns
ns
Adventitia
15
1.65
2.04
20
1.65
2.02
21
0.91
0.74
0.69
ns
ns
ns
Adipose tissue
4
1.12
1.03
3
2.29
1.96
11
0.28
0.33
0.01
ns
0.061
0.048
IFN-gamma
intima-media
14
0.67
0.70
25
0.66
0.69
22
0.56
0.84
0.36
ns
ns
ns
Adventitia
12
0.52
0.41
20
0.59
0.54
21
0.40
0.46
0.36
ns
ns
ns
Adipose tissue
3
0.54
0.53
4
0.14
0.10
7
0.10
0.11
0.13
ns
ns
ns
The comparison was performed among groups (Kruskal-Wallis test or ANOVA): A1 (arteries with stent), A2 (native arteries from patients with a stent in another artery), and A3 (control, patients without previous stent placement). The statistical significance level adopted was p < 0.05.
Comparison of the staining of TNF-alpha and IL-6 proteins in different layers of arterial tissue. The analysis was performed comparing three groups: A1 (arteries with stent), A2 (native arteries from patient with a stent in another artery) and A3 (control, patients without previous stent placement). TNF-alpha protein staining was higher in the adipose tissue of group A1 (6.69 ± 3.87 vs 2.27 ± 4.00; p < 0.001) (a), as well as in the intima-media layer (5.16 ± 5.05 vs 1.90 ± 2.27; p = 0.02) (b). The IL-6 protein staining was also higher in the adipose tissue from group A1 than that from group A3 (2.29 ± 1.96 vs 0.28 ± 0.33; p = 0.048) (c). The Kruskall-Wallis test and nonparametric Tukey’s multiple comparisons test were used for statistical analysis. The difference is considered significant for p-values < 0.05.
Panoramic (left side) and high-power view (right side) of immunostained arterial intima-media layer from individuals with previous stent implantation. Panels A and B show MHCII-positive cells, with morphology of macrophages (arrows), surrounding the lipid core (LC). Panels C and D show a large amount of TNF-alpha in the cytoplasm of inflammatory cells (arrows) and in the lipid core (LC). Panels E and F exhibit fewer inflammatory cells positive for IL-6 protein in similar sites (arrows).
Higher IL-6 was detected in arteries of the adipose tissue of group A1 than in those of group A3 (2.29 ± 1.96 vs 0.28 ± 0.33; p = 0.048) (Figure 2-c), also observed under the microscope (Figure 3-E and F). There was no difference between groups in the quantification of the CD40, ICAM, VCAM, NFKB and IFN-gamma staining.
On histological examination, we identified major histocompatibility complex class II (MHCII) positive cells surrounding the lipid core, probably macrophages (Figure 3-A and B). These infiltrate cells also stained for TNF-alpha, being detected in adipose tissue and in intima layer (Figure 3-C and D). Fewer IL-6-positive infiltrate cells were also observed in the same layer of artery tissue (Figure 3-E and F).
Discussion
This study analyzed both the gene expression in peripheral blood cells and the protein localization in coronary artery tissues, to evaluate simultaneous systemic and local inflammation. A persistently higher TNF-alpha systemic expression was observed in peripheral blood cells, in addition to a local exacerbated TNF-alpha and IL-6 production in coronary arteries.
Our study evaluated, in stable patients, local coronary and systemic inflammation after stent implantation as compared to controls. All patients included had undergone PCI more than 6 months before and had CABG indication. Regarding stent implantation time, 9 of 41 patients (22%) were within one year from PCI, and 32 patients (78%) had it more than one year before. A former study showed that the inflammatory reaction inherent to PCI no longer exists in this period.12 No patient with drug-eluted stent (DES) was enrolled in the present study. On the basis of previous literature, a higher number of T lymphocytes and macrophages is observed in DES lesions than in BMS lesions, suggesting the mechanism of restenosis after DES implantation may be different from that observed after BMS implantation.13
In this study, the gene expression in peripheral blood cells and the protein localization in coronary artery tissues were carried out to evaluate systemic and local inflammation, respectively. It is worth mentioning that CABG surgery represents a rare opportunity to obtain coronary tissue samples for research without harm to patients, that is why few previous studies worked with this kind of biological sample. In most of them, samples were obtained from the atherosclerotic plaque by endarterectomy.14,15
Blood Analysis
The analysis of mRNA expression from circulating blood cells pointed out a significant higher expression of the TNF gene in the group with previous stent implantation than in controls (Figure 1-f), suggesting a greater activation of this gene in leukocytes from stented patients. This gene encodes a pleiotropic cytokine involved in a broad range of biological activities, including inflammation, cell survival, cell proliferation, and, paradoxically, cell death.16
We also observed a significantly lower CD40 gene expression in blood cells from the stent group than from controls (Figure 1-a). The CD40 is the receptor for CD40L, being present in platelets. Gerdes et al.17 have demonstrated in knockout mice for CD40 and ApoE that platelet plays a crucial role in inflammation by stimulating leukocyte and endothelial cells activation, thereby promoting atherosclerosis.
Coronary artery tissue samples
We analyzed the arterial tissue separated in three layers (adventitia, intima-media and adipose tissue) by hematoxylin-eosin and immunohistochemistry staining. It is worth pointing that, although only few samples collected contained adipose tissue, due to the difficulty to obtain all layers in such small fragments, we could discriminate a greater amount of TNF-alpha and IL-6proteins in the adipose tissue from groups A1 and A2 than in that from controls (Figure 2-a and 2-c). The white adipose tissue is considered to be an endocrine gland, and the main feature is insulin and leptin resistance, as well as the production of inflammatory cytokines (TNF-alpha and IL-6) and monocyte chemoattractant protein,18,19 which are involved in atherogenesis.20,21 Interestingly, on the histological study, we observed activated immune cells, with MHCII expressed in membrane (Figure 3), surrounding the lipid core. Furthermore, these cells were colocalized with TNF-alpha and IL-6 staining, suggesting a greater inflammatory response in the adipose tissue around the artery from individuals with previous stent placement.
The TNF-alpha protein was also expressed in higher quantity in intima-media layer from group A1 than from groups A2 and A3 (Figure 2-b). Probably immune cells migrated from circulation to that layer, mainly macrophages, which are responsible for the production of that cytokine. Those are also MHCII-positive cells, primarily responsible for presenting antigenic peptides to T cells of the immune system.
Interleukin-6 is a multifunctional cytokine playing a central role in inflammation and tissue injury.22 Interleukin-6 activates platelet receptor GPIIb/IIIa and leukocyte-platelet interaction, thus favoring the prothrombotic and atherogenic formation. Previous studies have shown that the increased circulating IL-6 is associated with the risk of coronary restenosis and de novo coronary artery lesions,23 as well as the severity of stenosis.24 The increase in IL-6 mRNA and protein has been observed in human arterial atherosclerotic wall. In this study, our data showed a significant higher amount of IL-6 protein in the coronary tissue of patients with previous stent placement than in that of controls, suggesting that local arterial inflammation is intensified by stent placement.
Our finding indicated the presence of persistent systemic and local chronic inflammation in individuals with previous stent implantation and can probably contribute to the worst outcome described in a previous meta-analysis study.7
It is known that persistent inflammatory response may result in several complications, such as atherosclerotic plaque formation in arterial vessels. In a substudy of the MASS II Trial,9 consecutive angiographic results were compared with the progression of coronary artery atherosclerosis in medical treatment (MT), CABG and angioplasty. The authors have observed a greater progression in at least one native vessel in angioplasty patients than in CABG and MT patients, concluding that angioplasty treatment has the worst progression in native coronary arteries, especially in the left anterior descending territories. Our result also showed inflammation process in native arteries from individuals with previous stent implantation.
Limitations
This study was limited to BMS. We had very few DES with restenosis and CABG indication. Because of the tiny size of the samples, only a small number of adipose tissue samples was obtained in group A2. Unfortunately, because of the tiny size, many samples collected were inadequate for analysis, and some had insufficient material for analysis. It is worth mentioning that the surgeon primarily ensures the patient’s safety.
The arterial sample was collected at the least affected segment, for best surgical results in graft implantation, distal to the stent, place of possible less inflammation and less affected by the stent.
Restenosis is associated with a local and systemic inflammatory reaction that could be related to obstructive lesions in stented arteries. However, only nine patients were operated upon in less than 365 days, and the arterial samples were taken at least 10 mm after the stent implantation, which reduces its influence on the results.
Statin, which has known anti-inflammatory activity, can influence partially on this result, but it was minimized because all patients were under this therapeutic procedure that has a class I indication.
Conclusion
In conclusion, the persistently higher systemic expression of TNF in association with the local exacerbated TNF-alpha and IL-6 production in coronary arteries with previous BMS implantation may contribute to worse clinical outcomes after CABG surgery.
Sources of Funding
This study was funded by FAPESP.
Study Association
This article is part of the thesis of Post-Doctoral submitted by Pedro Silvio Farsky, from Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia / Universidade de São Paulo.
Ethics approval and consent to participate
This study was approved by the Ethics Committee of the Instituto de Cardiologia Dante Pazzanese under the protocol number 4059-2011. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.
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E-mail: pedro.farsky@gmail.com
Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa: Farsky PS, Hirata MH, Lima PHO, Lin-Wang HT; Obtenção de dados: Farsky PS, Arnoni RT, Almeida AFS, Issa M, Lima PHO, Higuchi ML, Lin-Wang HT; Análise e interpretação dos dados: Farsky PS, Hirata MH, Arnoni RT, Almeida AFS, Issa M, Lima PHO, Higuchi ML, Lin-Wang HT; Análise estatística: Lin-Wang HT; Obtenção de financiamento: Farsky PS, Lima PHO; Redação do manuscrito: Farsky PS, Lin-Wang HT; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Farsky PS, Hirata MH, Arnoni RT, Almeida AFS, Issa M, Lin-Wang HT.
Potencial conflito de interesses
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
ResumoFundamento:
Estudos relataram maior mortalidade após cirurgia de revascularização miocárdica (RVM) em pacientes com stent.
Objetivo:
Avaliar marcadores inflamatórios em células do sangue periférico e em amostras de tecido de artéria coronária obtidas durante cirurgia de RVM em pacientes com stent e compará-los aos de controles.
Métodos:
A casuística consistiu de dois grupos, um com prévia implantação de stent (n = 41) e um controle (n = 26). Em células do sangue periférico coletadas no pré-operatório, analisou-se a expressão dos seguintes genes: LIGHT, IL-6, ICAM, VCAM, CD40, NFKB, TNF, IFNG. A artéria coronária foi avaliada por imuno-histoquímica para: interleucina-6, ICAM, VCAM, CD40, NFKB, TNF-alfa e IFN-gama. No total, 176 amostras de tecido arterial coronariano foram assim agrupadas para análise: A1- artérias com stent (n = 38); A2- artérias nativas de paciente com stent em outra artéria (n = 68); e A3- artérias de controles sem stent submetidos a cirurgia de RVM de rotina (n = 70). Adotou-se o nível de significância de 0,05.
Results:
Pacientes com stent apresentaram maior expressão do gene TNF (p = 0,03) e menor do CD40 (p = 0,01) em células do sangue periférico do que controles sem stent. Nas amostras de artéria coronária, a coloração da proteína TNF-alfa foi maior no grupo A1, não apenas na camada médio-intimal (5,16 ± 5,05 vs 1,90 ± 2,27; p = 0,02), mas também no tecido adiposo (6,69 ± 3,87 vs 2,27 ± 4,00; p < 0,001). Além disso, o grupo A1 apresentou maior coloração para interleucina-6 no tecido adiposo do que o grupo A3 (p = 0,04).
Conclusão:
Observou-se expressão sistêmica de TNF persistentemente maior em associação com produção local exacerbada de TNF-alfa e IL-6 em pacientes com stent. Isso pode contribuir para pior desfecho clínico.
Palavras-chave:Intervenção Coronária PercutâneaCélulas SanguíneasInflamaçãoStentsReação em Cadeia de PolimeraseImuno-HistoquímicaFator de Necrse Tumoral AlphaInterleucina-6Introdução
Estudos retrospectivos sugeriram que a cirurgia de revascularização miocárdica (RVM) após intervenção coronariana percutânea (ICP) possa comprometer os desfechos de curto e longo prazo.1-7 Estudos prévios demonstraram que a ICP associa-se com maior mortalidade hospitalar, a despeito do perfil de menor risco dos pacientes submetidos a ICP,3 mas não há consenso na literatura.8 Uma análise do estudo MASS9 mostrou que pacientes submetidos a ICP apresentavam maior probabilidade de progressão da doença nas artérias coronárias nativas do que aqueles submetidos a cirurgia de RVM ou tratamento clínico.
Durante a ICP, ocorre reação inflamatória focal com ruptura de placa causada pela implantação de stent, mas há controvérsia quanto à persistência dessa reação a longo prazo. Há pouca informação quanto à presença de reação inflamatória sistêmica persistente ou mediadores tissulares na artéria coronária após implantação de stent, assim como quanto à comparação entre artérias coronárias com stent, artérias coronárias sem stent mas tendo o paciente stent em outra artéria e controles.
A cirurgia de RVM propicia a oportunidade única de coletar amostras de artérias coronárias para avaliar a reação inflamatória local muito tempo após a implantação de stent. Este estudo visa avaliar a expressão de genes inflamatórios nas células do sangue periférico e a localização da proteína inflamatória em tecido de artéria coronária obtido durante cirurgia de RVM em pacientes com e sem implantação prévia de stent. Vale mencionar que a cirurgia de RVM representa uma oportunidade única de se obter uma diminuta amostra de tecido arterial coronariano para avaliar a reação inflamatória local em seres humanos. Hoje, pacientes submetidos a implantação prévia de stent convencional (SC) e que precisam de cirurgia de RVM mais tarde representam um número significativo dos pacientes em hospitais cardiológicos, em especial em países em desenvolvimento. Nossos resultados podem contribuir para esclarecer a persistência de inflamação local e sistêmica na fase tardia da reestenose de stent.
MétodosCasuística
Os pacientes admitidos para cirurgia eletiva de RVM com implantação prévia de stent foram consecutivamente incluídos neste estudo após assinar o termo de consentimento livre e esclarecido. O protocolo foi aprovado pelo comitê de ética do Instituto de Cardiologia Dante Pazzanese (Protocolo 4059-2011).
Este estudo incluiu 67 pacientes submetidos a cirurgia eletiva de RVM como se segue: 41 pacientes com prévia implantação intracoronariana de SC e 26 pacientes sem implantação de stent. Todos os pacientes tinham angina estável e mais de 6 meses de implantação de stent, visando a excluir reestenose em andamento. Os critérios de exclusão consistiram em cirurgias de emergência, síndromes coronarianas agudas e insuficiência renal crônica em uso de diálise devido a reação inflamatória crônica.
Coletou-se amostra de sangue periférico no período pré-operatório da veia antecubital, usando tubos PAXgene (PreAnalytiX®, BD Company, RU) para a análise da expressão sistêmica do gene.
Durante a cirurgia de RVM, obteve-se, no local da arteriotomia, um diminuto fragmento das artérias coronárias que receberam a ponte, em geral 10 mm depois do sítio de implantação do stent, para avaliar os marcadores de inflamação locais. Todas as amostras de tecido foram imediatamente imersas em solução de formol tamponado para posterior inclusão em blocos de parafina. Alguns dos fragmentos arteriais obtidos não eram adequados para análise histológica, e, portanto, 176 amostras arteriais foram incluídas e agrupadas como se segue: A1- artérias com stent (n = 38); A2- artérias nativas de paciente com stent em outra artéria (n = 68); e A3- artérias de pacientes sem implantação prévia de stent (n = 70).
Isolamento de RNA, transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real
Extraiu-se o RNA total do sangue periférico coletado em tubos PAXgene (PreAnalytiX®, BD Company, RU) usando o kit PAXgene blood RNA (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha), com posterior quantificação pelo fluorímetro Qubit® 2,0 (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY). A integridade do RNA foi analisada com o sistema Tapestation® 2200 e R6K Screen Tape (Agilent Technologies, Inc. RU). O cDNA foi transcrito a partir de 200 ng do RNA total usando High Capacity RNA-to-cDNA Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Realizou-se qPCR em tempo real no sistema de detecção Rotor-Gene® usando-se o kit TaqMan® Fast Multiplex PCR (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) e primers do sistema Applied Biosystem comercialmente disponibilizado por TaqMan® qPCR (Applied Biosystems, Foster, CA, EUA).
Avaliou-se a expressão dos seguintes genes: LIGHT (Hs00542477_m1); IL-6 (Hs00985639_m1); ICAM (Hs00164932_m1); VCAM (Hs00174239_m1); CD40 (Hs01002913_g1); NFKB (Hs00231653_m1); TNF (Hs01113624_g1); IFNG (Hs00989291_m1) e GAPDH (Hs00266705_g1). Para todos os genes, foram construídas curvas-padrão e determinada a inclinação para calcular a eficiência da PCR. Observou-se eficiência quase igual para todos os sistemas primer/sonda. Todas as amostras foram testadas em duplicata usando-se GAPDH como gene de referência, previamente escolhido entre os seis genes mais comuns do miocárdio endógeno com o algoritmo geNorm.10 As amostras amplificadas após 40 ciclos da PCR foram consideradas negativas e excluídas da analise estatística. A expressão do gene de referência GAPDH foi aplicada para normalização de dados, sendo a relativa expressão de cada mRNA calculada usando-se o método 2-∆∆CT.11
Reação imuno-histoquímica
Primeiramente, amostras arteriais fixadas em formol e incluídas em parafina foram cortadas com 4-µm de espessura e fixadas em lâminas silanizadas. Seguiram-se desparafinação a 70°C, em forno, por 1 hora, e imersão em três banhos de xilol por 10 minutos. As amostras foram então reidratadas em concentrações decrescentes (100%, 90%, 75%) de álcool etílico. A recuperação do antígeno foi realizada usando-se o tampão Trilogy® (Cell Marque, California, EUA) em equipamento Decloaker a 90°C por 40 minutos (Biocare Medical, CA, EUA). Os bloqueadores específicos (Erviegas EasyPath, DuraEdge, EUA) foram aplicados para bloqueio de peroxidase endógena e proteínas. Na próxima etapa, as lâminas foram incubadas com os respectivos anticorpos primários previamente titulados e diluídos em diluente universal (Erviegas EasyPath, DuraEdge, EUA). Usaram-se os anticorpos primários para interleucina-6 (IL-6) (ab6672), ICAM (ab2213), VCAM (ab106777), TNF-alfa (ab1793), IFN-gama (ab9657), CD40 (ab58612) e NFKB (ab16502) de Abcam (Cambridge, MA, RU). A reação de imunoperoxidase foi realizada com Mach4 Kit Universal HRP Polymer + DAB (Biocare Medical, California, EUA), sendo, por fim, as lâminas coradas com hematoxilina de Harris (Erviegas EasyPath, DuraEdge, EUA) e montadas em resina sintética Erv-Mount (Erviegas EasyPath, DuraEdge, EUA). O controle positivo da reação de imuno-histoquímica foi realizado usando-se tecidos com os mesmos antígenos construtivos do antígeno de interesse. Após o processamento de imuno-histoquímica, as lâminas foram digitalizadas em unidade de Scanscope CS System (Aperio Technologies, Inc., CA, EUA), com uma objetiva 20x Olympus UPlanSApo com especificações 20x/0,75 acoplada ao scanner, gerando arquivos de imagem em formato svs. As imagens digitalizadas foram analisadas com o programa de visualização Aperio ImageScope (Aperio Technologies, Inc., CA, EUA), que informa a porcentagem de áreas coradas positivamente em relação à área total do tecido.
Análise estatística
As variáveis contínuas foram expressas como média e desvio-padrão ou mediana e intervalo interquartil, dependendo da suposição de normalidade. As variáveis categóricas foram expressas como frequências absoluta e relativa. Os valores entre os grupos foram comparados pelo teste t de Student não pareado após avaliar-se a distribuição quanto à normalidade com o teste Kolmogorov-Smirnov; de outro modo, usou-se o teste U de Mann-Whitney não paramétrico. O teste exato de Fisher ou o qui-quadrado foi usado para as variáveis categóricas com escalas nominais. Para a comparação dos marcadores do tecido arterial, usou-se o teste de Kruskal-Wallis (ou ANOVA, suposição de normalidade), deixando-se o teste de Tukey para as comparações múltiplas não paramétricas. Adotou-se um valor de p < 0,05 como estatisticamente significativo. Usou-se a versão 19 do SPSS.
Para detectar 3 unidades com desvio-padrão de 4, poder de teste de 80% e alfa de 5%, o tamanho da amostra foi calculado em 105 casos.
ResultadosCaracterísticas clínicas dos grupos do estudo
As frequências das características clínicas (Tabela 1), como sexo, diabetes, dislipidemia, tabagismo, acidente vascular encefálico prévio e infarto do miocárdio, foram semelhantes nos dois grupos. Entretanto, o grupo de stent apresentou idade menor e maior prevalência de disfunção ventricular, caracterizada por fração de ejeção menor do que 50%. O grupo controle apresentou maior contagem de plaquetas (269.560 ± 74.461) do que o grupo de stent (237.355 ± 70.831), porém sem significância estatística (p = 0,12). Todos os pacientes eram tratados com estatinas e ácido acetilsalicílico.
Dados biodemográficos dos grupos estudados: com prévia implantação de stent e controle
Variáveis
Grupo Stent
Grupo Controle
p valor
Casos
41
26
Idade (anos)
60,2 ± 7,1
6,3 ± 8,69
0,004
Sexo feminino (%)
13 (31,3)
8 (30,8)
0,58
Contagem de plaquetas
237.355 ± 70.831
269.560 ± 74.461
0,12
Hipertensão (%)
35 (85,4)
22 (84,6)
0,60
Diabetes (%)
17 (42,5)
8 (36,4)
0,42
Tabagismo atual (%)
4 (10,5)
3 (14,3)
0,48
AVE (%)
2 (5,3)
0
0,43
Doença renal crônica (%)
2 (5,3)
0
0,43
Dislipidemia (%)
25 (62,5)
16 (64)
0,56
Infarto do miocárdio (%)
14 (35,9)
5 (22,7)
0,22
FEVE < 50% (%)
14 (41,2)
2 (9,1)
0,009
AAS (%)
41 (100)
26 (100)
1,00
Estatinas (%)
41 (100)
26 (100)
1,00
AVE: acidente vascular encefálico; FEVE: fração de ejeção ventricular esquerda; AAS: ácido acetilsalicílico. Idade e contagem de plaquetas expressas como média ± desvio-padrão. Sexo, hipertensão, diabetes, tabagismo, AVE, doença renal crônica, dislipidemia, infarto do miocárdio, FEVE < 50%, uso de AAS e de estatina expressos em números e porcentagens dos pacientes estudados. Adotou-se o nível de significância estatística de p < 0,05.
O tempo decorrido entre a implantação de stent e a cirurgia de RVM foi superior a 6 meses. Nove pacientes (22%) receberam a implantação de stent entre 6 e 12 meses, 25 pacientes (61%) receberam apenas um stent, sendo que 16 pacientes (39%) receberam dois ou mais stents.
Expressão do gene em células do sangue periférico através de PCR em tempo real
Obteve-se o RNA total das células do sangue periférico, avaliando-se ainda a expressão dos seguintes genes: LIGHT, IL-6, ICAM, VCAM, CD40, NFKB, TNF, IFNG e GAPDH. Dos oito genes, a expressão de apenas dois diferiu entre os grupos de stent e controle: a expressão de TNF foi significativamente maior (p = 0,0308) no grupo de stent (Figura 1-f), sendo a de CD40 maior no grupo controle (p = 0,0106) (Figura 1-a). Não se detectou diferença na expressão dos genes IL-6, IFNG, LIGHT, NFKB, ICAM e VCAM (Figura 1).
Expressão de genes inflamatórios no sangue periférico. A expressão dos genes CD40 (a), IL-6 (b), INFG (c), LIGHT (d), NFKB (e), TNF (f), ICAM (g) e VCAM (h) foi avaliada por PCR em tempo real usando o gene GAPDH como controle interno para calcular a expressão relativa (2-ΔΔCT). Os pacientes com implantação coronária de stent (n = 35) foram comparados com os controles (n=25) usando o teste não paramétrico de Mann-Whitney. A diferença foi considerada significativa para p-valores < 0,05.
Análise quantitativa por imuno-histoquímica
A quantificação da coloração das proteínas por imuno-histoquímica é apresentada na Tabela 2 e ilustrada nas Figuras 2 e 3. Os resultados mostraram maior coloração para TNF-alfa nas artérias do tecido adiposo do grupo A1 do que do A2 (6,69 ± 3,87 vs 2,27 ± 4,00; p < 0,001) (Figura 2-a). O grupo A1 apresentou maior coloração TNF-alfa na região médio-intimal do que o A3 (5,16 ± 5,05 vs 1,90 ± 2,27; p = 0,023) (Figura 2-b). Além disso, detectou-se grande quantidade de TNF-alfa no citoplasma das células inflamatórias e em torno do núcleo lipídico (Figura 3-C e D).
Quantificação das proteínas CD40, ICAM, VCAM, MHC-II, TNF-alfa, NFKB, IL-6 e IFN-gama na camada arterial médio-intimal, adventícia e tecido adiposo por imuno-histoquímica
Proteína
camadas arteriais
Grupo A1
Grupo A2
Grupo A3
p valor (α = 0,05)
n
média
DP
n
média
DP
n
média
DP
3 grupos
1 vs 2
1 vs 3
2 vs 3
CD40
médio-intimal
16
1,37
2,02
27
1,51
1,73
23
1,11
1,56
0,55
ns
ns
ns
adventícia
13
0,70
0,77
26
0,82
0,71
19
1,27
1,66
0,58
ns
ns
ns
tecido adiposo
3
0,73
0,12
6
0,62
0,58
9
0,58
0,74
0,45
ns
ns
ns
ICAM
médio-intimal
18
3,27
3,00
27
3,47
3,77
20
2,81
4,23
0,16
ns
ns
ns
adventícia
14
4,07
3,67
25
4,22
4,82
19
3,99
5,39
0,76
ns
ns
ns
tecido adiposo
1
5,93
-
7
1,99
1,37
5
1,52
1,64
0,22
ns
ns
ns
VCAM
médio-intimal
14
11,88
16,01
24
10,33
9,64
23
7,88
6,12
0,76
ns
ns
ns
adventícia
11
4,69
8,39
19
4,09
4,74
21
2,56
2,26
0,68
ns
ns
ns
tecido adiposo
2
4,31
5,28
4
1,76
1,22
4
0,32
0,36
0,10
ns
ns
ns
MHC II
total area
7
0,74
0,59
8
0,47
0,12
30
0,75
0,52
0,307
ns
ns
ns
TNF-alfa
médio-intimal
15
5,16
5,05
24
3,11
3,01
21
1,90
2,27
0,03
ns
0,023
ns
adventícia
14
4,05
2,82
21
2,28
2,24
20
3,57
5,95
0,10
ns
ns
ns
tecido adiposo
4
6,69
3,88
4
1,27
0,84
9
2,27
4,00
0,05
0,001
ns
ns
NFKB
médio-intimal
14
1,11
1,14
24
0,93
0,88
20
0,92
1,07
0,96
ns
ns
ns
adventícia
14
0,64
0,61
21
0,83
0,78
19
0,76
0,55
0,65
ns
ns
ns
tecido adiposo
2
1,18
0,87
6
0,52
0,44
6
1,63
2,58
0,66
ns
ns
ns
Interleucina-6
médio-intimal
16
1,15
1,12
23
1,27
1,61
21
0,66
0,88
0,17
ns
ns
ns
adventícia
15
1,65
2,04
20
1,65
2,02
21
0,91
0,74
0,69
ns
ns
ns
tecido adiposo
4
1,12
1,03
3
2,29
1,96
11
0,28
0,33
0,01
ns
0,061
0,048
IFN-gama
médio-intimal
14
0,67
0,70
25
0,66
0,69
22
0,56
0,84
0,36
ns
ns
ns
adventícia
12
0,52
0,41
20
0,59
0,54
21
0,40
0,46
0,36
ns
ns
ns
tecido adiposo
3
0,54
0,53
4
0,14
0,10
7
0,10
0,11
0,13
ns
ns
ns
DP: desvio-padrão. Os grupos foram comparados com o teste de Kruskal-Wallis ou ANOVA: A1 (artérias sem stent); A2 (artérias nativas de pacientes com stent em outra artéria); e A3 (controle, pacientes sem implantação prévia de stent). Adotou-se o nível de significância estatística de p < 0,05.
Comparação da coloração das proteínas TNF-alfa e IL-6 em diferentes camadas do tecido arterial. Três grupos foram comparados: A1 (artérias com stent), A2 (artérias nativas de pacientes com stent em outra artéria) e A3 (controle, pacientes sem implantação prévia de stent). A coloração da proteína TNF-alfa foi maior no tecido adiposo do grupo A1 (6,69 ± 3,87 vs 2,27 ± 4,00; p < 0,001) (a), assim como na camada médio-intimal (5,16 ± 5,05 vs 1,90 ± 2,27; p = 0,02) (b). A coloração da proteína IL-6 foi maior no tecido adiposo do grupo A1 do que no do grupo A3 (2,29 ± 1,96 vs 0,28 ± 0,33; p = 0,048) (c). O teste de Kruskall-Wallis e o teste de Tukey para comparações múltiplas não paramétricas foram usados para a análise estatística. A diferença foi considerada significativa para p-valores < 0,05.
Visão panorâmica (esquerda) e de grande aumento (direita) da camada arterial médio-intimal corada por imuno-histoquímica de indivíduos com implantação prévia de stent. Painéis A e B mostram células MHCII-positivas, com morfologia de macrófagos (setas), circundando o núcleo lipídico (LC). Painéis C e D mostram grande quantidade de TNF-alfa no citoplasma de células inflamatórias (setas) e no núcleo lipídico (LC). Painéis E e F exibem menor número de células inflamatórias positivas para a proteína IL-6 em sítios semelhantes (setas).
Detectou-se maior quantidade de IL-6 nas artérias do tecido adiposo do grupo A1 do que naquelas do grupo A3 (2,29 ± 1,96 vs 0,28 ± 0,33; p = 0,048) (Figura 2-c), também observada ao microscópio (Figura 3-E e F). Não houve diferença entre os grupos quanto à quantificação da coloração de CD40, ICAM, VCAM, NFKB e IFN-gama.
O exame histológico evidenciou células positivas para complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHCII) circundando o núcleo lipídico, provavelmente macrófagos (Figura 3-A e B). Essas células também coraram para TNF-alfa, sendo detectadas no tecido adiposo e na camada íntima (Figuras 3-C e 3-D). Menos células positivas para IL-6 foram observadas na mesma camada arterial (Figura 3-E e 3-F).
Discussão
Este estudo analisou a expressão de genes nas células de sangue periférico e a localização de proteína no tecido de artérias coronárias, para avaliar inflamação sistêmica e local simultânea. Observou-se expressão sistêmica persistentemente maior de TNF-alfa nas células do sangue periférico, além de produção local exacerbada de TNF-alfa e IL-6 nas artérias coronárias.
Nosso estudo avaliou, em pacientes estáveis, inflamação local coronária e sistêmica após a implantação de stent em comparação a controles. Todos os pacientes incluídos haviam sido submetidos a ICP mais de 6 meses antes e tinham indicação para cirurgia de RVM. Com relação ao tempo de implantação de stent, 9 dos 41 pacientes (22%) haviam sido submetidos à ICP há menos de um ano, e 32 pacientes (78%) haviam sido submetidos à ICP há mais de um ano. Um estudo anterior mostrou que a reação inflamatória inerente à ICP não mais existia nesse período.12 Nenhum paciente com stent farmacológico (SF) foi arrolado no presente estudo. A literatura prévia relata um maior número de linfócitos T e macrófagos nas lesões de SF do que nas de SC, sugerindo que o mecanismo de reestenose após a implantação do SF seja diferente daquele observado após a implantação do SC.13
Neste estudo, a expressão de gene nas células do sangue periférico e a localização de proteína no tecido das artérias coronárias foram consideradas para avaliar inflamação sistêmica e local, respectivamente. Vale a pena mencionar que a cirurgia de RVM representa uma rara oportunidade para se obter amostras de tecido arterial coronariano para pesquisa sem prejuízo para o paciente, sendo essa a razão pela qual tão poucos estudos trabalharam com esse tipo de amostra biológica. Na maioria deles, as amostras foram obtidas de placas ateroscleróticas por endarterectomia.14,15
Análise do sangue
A análise da expressão do mRNA das células do sangue circulante indicou uma expressão significativamente maior do gene TNF no grupo com prévia implantação de stent do que nos controles (Figura 1-f), sugerindo maior ativação desse gene em leucócitos de pacientes submetidos à implantação de stent. Esse gene codifica uma citocina pleiotrópica envolvida em ampla gama de atividades biológicas, como inflamação, sobrevida celular, proliferação celular e, paradoxalmente, morte celular.16
Observamos ainda uma expressão significativamente maior do gene CD40 nas células do sangue do grupo de stent do que nas dos controles (Figura 1-a). O CD40 é o receptor para CD40L, estando presente nas plaquetas. Gerdes et al.,17 demonstraram em camundongos knockout para CD40 e ApoE que as plaquetas têm papel crucial na inflamação, estimulando a ativação de leucócitos e células endoteliais, promovendo, assim, aterosclerose.
Amostras de tecido de artéria coronária
Analisamos o tecido arterial separado em três camadas (adventícia, médio-intimal e tecido adiposo) corado com hematoxilina-eosina e imuno-histoquímica. Vale ressaltar que, embora apenas poucas amostras coletadas contenham tecido adiposo, devido à dificuldade em obter todas as camadas em fragmentos tão diminutos, pudemos distinguir uma maior quantidade das proteínas TNF-alfa e IL-6 no tecido adiposo dos grupos A1 e A2 do que naquele dos controles (Figuras 2-a e 2-c). O tecido adiposo branco é considerado uma glândula endócrina, sendo sua principal característica a resistência à insulina e à leptina, assim como a produção de citocinas inflamatórias (TNF-alfa e IL-6) e proteína quimioatrativa de monócitos,18,19 envolvidas na aterogênese.20,21 Interessante notar que a análise histológica mostrou células imunes ativadas, com expressão de MHCII na membrana (Figura 3), circundando o núcleo lipídico. Além disso, tais células foram colocalizadas com coloração para TNF-alfa e IL-6, sugerindo uma maior resposta inflamatória no tecido adiposo em torno de artérias de indivíduos com implantação prévia de stent.
A proteína TNF-alfa também foi expressa em maior quantidade na camada médio-intimal do grupo A1 do que na dos grupos A2 e A3 (Figura 2-b). Provavelmente as células imunes migraram da circulação sanguínea para aquela camada, principalmente macrófagos, que são responsáveis pela produção daquela citocina. Essas são também células positivas para MHCII, primeiramente responsáveis pela apresentação dos peptídeos antigênicos para as células T do sistema imune.
A IL-6 é uma citocina multifuncional com papel central na inflamação e na injúria tecidual.22 A IL-6 ativa o receptor de plaquetas GPIIb/IIIa e a interação leucócito-plaqueta, favorecendo, assim, a condição pró-trombótica e a aterogênese. Estudos prévios mostraram que o aumento da IL-6 circulante está associado com o risco de reestenose coronária e lesões de novo na artéria coronária,23 assim como com a gravidade da estenose.24 Observou-se aumento da expressão do mRNA e da proteína da IL-6 na parede arterial aterosclerótica humana. Nosso estudo mostrou uma quantidade significativamente maior da proteína da IL-6 no tecido coronariano de pacientes com implantação prévia de stent do que no de controles, sugerindo que a inflamação arterial local seja intensificada pela implantação de stent.
Nosso achado indicou a presença de inflamação crônica persistente sistêmica e local em indivíduos com implantação prévia de stent, podendo contribuir para o pior desfecho descrito em um estudo prévio de meta-análise.7
Sabe-se que a resposta inflamatória persistente pode resultar em várias complicações, como formação da placa aterosclerótica nas artérias. Um subestudo do estudo MASS II9 comparou os resultados de angiografias consecutivas para a progressão da aterosclerose de artérias coronárias em pacientes submetidos a tratamento médico (TM), a cirurgia de RVM e a angioplastia. Os autores observaram maior progressão em pelo menos um vaso nativo em pacientes submetidos a angioplastia do que naqueles submetidos a cirurgia de RVM e pacientes em TM, concluindo que a angioplastia tem a pior progressão nas artérias coronárias nativas, especialmente nos territórios da descendente anterior esquerda. Além disso, nosso resultado mostrou inflamação nas artérias nativas de indivíduos com implantação prévia de stent.
Limitações
Este estudo limitou-se aos SC. Tivemos muito poucos SF com reestenose e indicação de cirurgia de RVM. Devido ao diminuto tamanho das amostras, obteve-se apenas um pequeno número de amostras com tecido adiposo no grupo A2. Além disso, devido ao diminuto tamanho das amostras, muitas delas mostraram-se inadequadas para análise, sendo algumas por material insuficiente. Vale mencionar que o cirurgião primeiro assegura a segurança do paciente.
A amostra arterial foi coletada no segmento menos afetado, considerando o melhor resultado cirúrgico na implantação do enxerto, distal ao stent, local de possível menor inflamação e menos afetado pelo stent.
A reestenose associa-se com reação inflamatória local e sistêmica que pode estar relacionada com lesões obstrutivas nas artérias com stent. Entretanto, apenas nove pacientes foram operados em menos de 365 dias, e as amostras arteriais foram obtidas a pelo menos 10 mm do local de implantação do stent, o que reduz sua influência nos resultados.
As estatinas, que possuem atividade anti-inflamatória, podem ter influenciado parcialmente esses resultados, o que foi minimizado pois todos os pacientes recebiam esses medicamentos, procedimento terapêutico com indicação classe I.
Conclusão
Concluindo, a expressão sistêmica de TNF persistentemente maior em associação com a produção local exacerbada de TNF-alfa e IL-6 nas artérias coronárias com implantação prévia de SC pode contribuir para o pior desfecho clínico após cirurgia de RVM.
Fontes de financiamento
O presente estudo foi financiado pela FAPESP.
Vinculação acadêmica
Este artigo é parte de tese de Pós-Doutorado de Pedro Silvio Farsky pelo Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia / Universidade de São Paulo.
Aprovação ética e consentimento informado
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Cardiologia Dante Pazzanese sob o número de protocolo 4059-2011. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.