Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC gyX499qpwNnbJ7QFPXzQ4rc S0066-782X2018001300050 S0066-782X2018005008101 10.5935/abc.20180107 Original Article Genetic Risk Analysis of Coronary Artery Disease in a Population-based Study in Portugal, Using a Genetic Risk Score of 31 Variants Pereira Andreia 1 Mendonça Maria Isabel 1 Borges Sofia 1 Freitas Sónia 1 Henriques Eva 1 Rodrigues Mariana 1 Freitas Ana Isabel 2 Sousa Ana Célia 1 Brehm António 2 Reis Roberto Palma dos 3 Hospital Dr. Nélio Mendonça Unidade de Investigação Funchal Portugal Unidade de Investigação, Hospital Dr. Nélio Mendonça, Funchal - Portugal Universidade da Madeira Laboratório de Genética Humana Funchal Portugal Laboratório de Genética Humana, Universidade da Madeira, Funchal - Portugal Universidade Nova de Lisboa Faculdade de Ciências Médicas Lisboa Portugal Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa, Lisboa - Portugal Mailing Address: Andreia Pereira, Avenida Luís de Camões, nº 57. Postal Code 9004-514, Funchal - Portugal. E-mail: andreiapereira21@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research and Writing of the manuscript: Pereira A; Acquisition of data: Pereira A, Freitas AI, Sousa AC, Brehm A; Analysis and interpretation of the data and Statistical analysis: Pereira A, Freitas S, Henriques E, Rodrigues M; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Pereira A, Mendonça MI, Borges S, Brehm A, Reis RP.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 02 07 2018 07 2018 111 1 50 61 14 06 2017 12 10 2017 22 02 2018 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited Abstract Background:

Genetic risk score can quantify individual’s predisposition to coronary artery disease; however, its usefulness as an independent risk predictor remains inconclusive.

 Objective:

To evaluate the incremental predictive value of a genetic risk score to traditional risk factors associated with coronary disease.

 Methods:

Thirty-three genetic variants previously associated with coronary disease were analyzed in a case-control population with 2,888 individuals. A multiplicative genetic risk score was calculated and then divided into quartiles, with the 1st quartile as the reference class. Coronary risk was determined by logistic regression analysis. Then, a second logistic regression was performed with traditional risk factors and the last quartile of the genetic risk score. Based on this model, two ROC curves were constructed with and without the genetic score and compared by the Delong test. Statistical significance was considered when p values were less than 0.05.

 Results:

The last quartile of the multiplicative genetic risk score revealed a significant increase in coronary artery disease risk (OR = 2.588; 95% CI: 2.090-3.204; p < 0.0001). The ROC curve based on traditional risk factors estimated an AUC of 0.72, which increased to 0.74 when the genetic risk score was added, revealing a better fit of the model (p < 0.0001).

 Conclusions:

In conclusion, a multilocus genetic risk score was associated with an increased risk for coronary disease in our population. The usual model of traditional risk factors can be improved by incorporating genetic data.

 Keywords: Coronary Artery Disease / history Coronary Artery Disease / morbidity Mortality Polymorphism, Genetic Epidemiology Risk Factors Introduction

Coronary artery disease (CAD) has become a major health problem worldwide, with increasing prevalence and high morbidity and mortality. Traditional risk factors (TRFs) are insufficient to identify asymptomatic high-risk individuals. Epidemiology and family studies have long documented that approximately 50% of the susceptibility for heart disease is genetic.1 Knowledge of genetic predisposition to cardiac disease is crucial for its comprehensive prevention and treatment.

Although much of the genetic basis of coronary disease remains to be discovered, some progress has been made using both candidate gene and genome-wide association studies (GWAS).2 In fact, a number of genetic variants have been previously identified at several genomic regions associated with CAD.2

Until now, the risk attributable to any individual variant has been modest. However, discovering and combining multiple loci with modest effects into a global genetic risk score (GRS) could improve the identification of high-risk populations and improve individual risk assessment.

Therefore, the purpose of this work was to generate a multilocus GRS based on common variants previously shown to be associated with CAD, and evaluate whether it is independent of TRFs and improves the predictive ability of a model based only on TRFs.

 Methods Study Population

Study population was enrolled from GENEMACOR (GENEs in Madeira Island Population with CORonary artery disease), a population-based ongoing case-control registry of CAD with 2,888 participants, 1,566 cases (mean age 53.3 ± 8.0 years, 79.1% male) and 1322 controls (mean age 52.7 ± 7.8 years, 76.4% male). Cases were selected from patients discharged after being admitted for myocardial infarction/unstable angina diagnosed according to the previously described criteria,3 or with CAD confirmed by coronary angiography with ≥ 1 coronary lesions of ≥ 70% stenosis in ≥ 1 major coronary artery or its primary branches. Absent or non-flow limiting atheroma was excluded from the analysis. The control group consisted of healthy volunteers, without symptoms or history of CAD, selected from the same population. All controls underwent clinical assessment of conventional cardiovascular risk factors, an electrocardiogram (ECG), and, in doubtful cases, an exercise stress test, a stress echocardiography or computerized tomography for calcium scoring. Cases and controls were matched for gender and age.

Inclusion criteria comprised an age limit of 65 years and being a permanent resident to avoid genetic admixture. Principal Component Analysis (PCA)4 was used for analysis of population stratification for possible genetic admixture and detection of significant genetic outliers (< 5%).4

The study was approved by the Hospital ethics committee according to the Declaration of Helsinki and all patients provided written informed consent.

 Data collection

Data was collected from all subjects in a standardized file comprising demographic, clinical characteristics and TRFs traditional risk factors (gender, age, level of exercise, smoking status, arterial hypertension, dyslipidemia, diabetes, family history of CAD, body mass index (BMI), heart rate and pulse wave velocity (PWV).

“Smokers” referred to current smokers or subjects with less than 5 years of smoking cessation.5

Essential hypertension was considered when patients, at the entry into this study, were already diagnosed and/or had been on antihypertensive medication for more than 3 months or newly diagnosed hypertensives with systolic blood pressure (SBP)/diastolic blood pressure (DBP) ≥ 140/90 mmHg measured on at least 3 occasions.6

Dyslipidemia was defined for control population as low-density lipoprotein (LDL) > 140 mg/dL, high-density lipoprotein (HDL) < 45 mg/dL for women and < 40 mg/dL for men, Triglycerides > 150 mg/dL and apolipoprotein (Apo) B > 100 mg/dL. For patients (at high risk) dyslipidemia was considered when LDL > 100, HDL < 45 mg/dL for women and < 40 mg/dL for men, triglycerides > 150 mg/dL, Apo B > 100 mg/dL and non-HDL (total cholesterol-HDL) > 130 mg/dL.7

Subjects were classified as having diabetes if they were taking oral anti-diabetic medication or insulin or if their fasting plasma glucose was higher than 7.0 mmol/L or 126 mg/dL.8

Subjects were considered to have a family history of premature cardiovascular disease (CVD) if the father or brother had been diagnosed with CVD under the age of 55 or mother or sister under the age of 65.

The definition of other TRFs was based on the standard criteria, as previously reported.9,10

Biochemical analysis

Blood samples were extracted after 12 hours’ fasting. Biochemical analyses were performed at the Central Laboratory of the Hospital, according to standard techniques. In order to determine total cholesterol, HDL, LDL, triglycerides and glucose, blood samples were placed in dry tubes, centrifuged half an hour later at 3,500 g and subsequently quantified by an enzymatic technique using an “AU 5400” (Beckman Coulter) autoanalyzer. Biochemical markers such as lipoprotein-a - Lp(a), (Apo B), and high-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP) were quantified by immunoturbidimetry also using an “AU 5400” (Beckman Coulter) automatic system.

 Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) selection

Two parallel approaches were employed to identify SNPs for the GRS. In the first approach, we searched the National Human Genome Research Institute database, which included SNPs identified by means of GWAS and catalogued based on phenotype and/or trait. We searched for the keywords: “coronary artery disease”, “coronary disease”, “myocardial infarction” and “early myocardial infarction.” The second approach included SNPs that were identified through candidate gene approaches, included in a published GRS for CAD.

Including criteria included genes described in previous studies with an Odds Ratio (OR) for CAD ≥ 1.1 and a minor allele frequency (MAF) > 5%. Genes with low Hardy-Weinberg equilibrium (p < 0.002) (after Bonferroni correction) were excluded.

In total, 33 SNPs were selected according to their possible CAD-related function: association with cell cycle, cellular migration and inflammation (rs1333049 (9p21.3), rs4977574 (CDKN2B), rs618675 (GJA4), rs17228212 (SMAD3), rs17465637 (MIA3), rs12190287 (TCF21), rs3825807 (ADAMTS7), rs11556924 (ZC3HC1), rs12526453 (PHACTR1)); genes involved in pro-oxidative status (rs1801133 (MTHFR 677), rs1801131 (MTHFR 1298), rs705379 (PON 1), rs662 (PON 192), rs854560 (PON 55), rs6922269 (MTHFD1L); genes associated with modifiable risk factors such as lipids metabolism, hypertension and diabetes/obesity (rs3798220 (LPA), rs2114580 (PCSK9), rs20455 (KIF6), rs7412/rs429358 (APOE), rs964184 (ZNF259), rs599839 (PSRC1), rs5186 (AT1R), rs699 (AGT), rs4340 (ACE), rs4402960 (IGF2BP2), rs1326634 (SLC30A8), rs266729 (ADIPOQ), rs7903146 (TCF7L2), rs17782313 (MC4R), rs1801282 (PPARG), rs1884613 (HNF4A), rs8050136 (FTO) and rs1376251 (TAS2R 50)) (Supplementary Table 1).

 Genetic analyses

Genetic analyses were performed at the Human Genetics Lab of the University of Madeira. Genomic DNA was extracted from 80 µl of peripheral blood using a standard phenol-chloroform method. A TaqMan allelic discrimination assay for genotyping was performed using labelled probes and primers pre-established by the supplier (TaqMan SNP Genotyping Assays, Applied Biosystems).

All reactions were done on an Applied Biosystems 7300 Real Time PCR System and genotypes were determined using the 7300 System SDS Software (Applied Biosystems, Foster City, USA) without any prior knowledge of individual’s clinical data. Quality of genotyping techniques was controlled by the inclusion of one non-template control (NTC) in each plate of 96 wells. All SNPs TaqMan assays had blind duplicates accounting for 20% of all samples. Some SNP genotypes were randomly confirmed by conventional direct DNA sequencing, as 10-15% of all samples were re-amplified for sequencing. Call rates for SNPs in the GRS were 98%-100% and a minimum 95% call rate was set for quality control.

 Computation of the GENETIC RISK SCORE

We have tested several models to construct the GRS using both non-weighted and weighted scores, taking into consideration each pattern of inheritance for each gene locus. An additive score (AGRS) was generated, i.e., for each one of the 31 variants a score of 0, 1, and 2 was defined as there were 0, 1 or 2 risk alleles, by calculating the accumulated sum of the risk alleles in these variants. Each individual could be assigned a GRS of 0-62. Additionally, a multiplicative GRS (MGRS) was calculated by multiplying the relative risk for each genotype.

Validation of the risk score calculation was performed in a random sample of 597 patients (20%).

 Statistical analysis

Categorical variables were expressed by frequencies and percentages and compared by the Chi-squared test or Fisher’s exact test. Continuous variables were expressed as mean ± standard deviation (SD) or median (1st quartile - 3rd quartile) and compared by Student's t-test (unpaired) or Mann-Whitney, as appropriate. The Kolmogorov-Smirnov test and the Levene´s test were used to test the assumption of normality and the homogeneity of the variables. All analyses were considered significant when p values were less than 0.05.

Binary logistic regression was used to determine the combined and separate effects of the variables on the risk for angiographic CAD. GRS was modeled using as a continuous variable and as quartiles, using the first quartile as the reference category. Multivariate analyses were used to adjust for 7 covariates also reported to be associated with CAD. We plotted receiver operating characteristic (ROC) curves and calculated the area under the curve (AUC) for logistic regression models including TRFs without and with GRS (quartiles). Pairwise comparison of ROC curves was performed using the Delong test.11 The model calibration was tested with Hosmer-Lemeshow goodness-of-fit test. A P-value less than 0.05 was considered statistically significant. Collinearity between the variables was measured by assessment of tolerance and variance inflation factor (VIF).

Associations of SNPs with CAD were considered significant at p < 0.05 and in aggregate with GRS models at p < 0.0015 applying Bonferroni correction.

For MAF of 30%, the study had 70% power to detect an OR for CAD of 1.3 and > 90% for OR ≥ 1.35, for 2-sided alpha of < 0.05 for 2,000 cases and 1,000 controls. Power calculations used G power Statistical Power Analyses.

The potential of GRS to improve individual risk stratification then was measured using the net reclassification improvement (NRI) method,12 defined as the percentage of subjects in each subgroup changing categories when the new model of GRS (in quartiles) was added. The integrated discrimination improvement (IDI), defined as the incremental improvement prognostic value of GRS, was compared between cases and controls. NRI was computed by categorical and non-categorical (continuous) variables using the PredictABEL package available in R software (version 3.2.0).

Statistical analyses were performed using SPSS version 19.0 (IBM), MedCalc version 13.3.3.0 and R software version 3.1.2.

 Results Baseline characteristics of the population

Table 1 shows the baseline characteristics of our population. As expected, cases and controls showed no significant differences concerning gender and age, since this was a selection criterion. Higher frequency of dyslipidemia, diabetes, hypertension, physical inactivity, smoking habit, alcohol consumption, and family history of premature cardiovascular disease was found in CAD patients when compared to the controls (p < 0.0001). Also, PWV, BMI and waist-to-height ratio were higher in cases than in controls, with statistical significance (p < 0.05) (Table 1). The other biochemical variables analyzed such as hemoglobin, leucocytes, fibrinogen, homocysteine and hs-CRP > 3 showed significantly higher levels in the coronary patients group when compared to the controls (p < 0.05) (Table 1).

Baseline characteristics of our study population
Variables Cases (n = 1566) Controls (n = 1322) P value
Age, years 53.3 ± 8.0 52.7 ± 7.8 0.053
Male Gender, n (%) 1238 (79.1%) 1010 (76.4%) 0.087
Dyslipidemia†, n (%) 1398 (89.3) 1103 (83.4) 0.0001
Total Cholesterol, mg/dl 180.0 (154.0 – 213.0) 205.0 (181.0 – 234.0) < 0.0001
LDL, mg/dl 104.6 (82.8 – 128.7) 127.2 (104.7 – 152.3) < 0.0001
HDL, mg/dl 41.0 (35.0 – 49.0) 48.0 (41.0 – 57.0) < 0.0001
Triglycerides, mg/dl 141.0 (102.0 – 210.0) 121.0 (89.0 – 174.0) < 0.0001
Apolipoprotein B, mg/dl 93.9 (75.5 – 113.3) 92.5 (43.0 – 115.8) < 0.0001
Lipoprotein (a), mg/dl 20.4 (9.2 – 62.0) 12.8 (8.8 – 29.3) < 0.0001
Diabetes, n (%) 533 (34.0) 175 (13.2) < 0.0001
Fasting glucose, mg/dl 106.0 (96.0 – 129.0) 99.0 (91.0 – 109.0) < 0.0001
Hypertension, n (%) 1114 (71.1) 700 (53.0) < 0.0001
SBP, mmHg 137.9 ± 20.8 136.2 ± 18.1 0.024
DBP, mmHg 82.6 ± 11.8 83.9 ± 11.1 0.002
Heart rate, bpm 68.8 ± 12.5 72.3 ± 11.5 < 0.0001
PWV, m/s 8.6 ± 1.9 8.3 ± 1.7 < 0.0001
Smoking status•, n (%) 730 (46.6) 309 (23.4) < 0.0001
Level of exercise*, n (%) 573 (36.6) 761 (57.6) < 0.0001
Alcohol, g/day 24.7 ± 49.7 18.2 ± 28.2 < 0.0001
BMI, kg/m2 28.6 ± 4.2 28.1 ± 4.5 0.007
Waist/Height 0.61 ± 0.06 0.59 ± 0.07 < 0.0001
Family history, n (%) 373 (23.8) 167 (12.6) < 0.0001
Hemoglobin, g/dl 14.6 (13.8 – 15.4) 14.7 (14 – 15.4) 0.001
Leucocytes, 103/µl 7.1 (6 – 8.3) 6.6 (5.6 – 7.8) < 0.0001
Fibrinogen, mg/dl 387 (337 – 444) 361 (315 – 409) < 0.0001
Homocysteine, µmol/L 12.2 (10 – 14.9) 11.4 (9.7 – 13.6) < 0.0001
Hs-CRP, mg/L > 3, n (%) 648 (41.4) 496 (37.5) 0.035

Controls: LDL > 140 mg/dL, HDL < 40 mg/dL for men and < 45 mg/dLfor women; triglycerides > 150mg/dL, APO B > 100 mg/dL. Cases: LDL > 100 mg/dL; triglycerides > 150 mg/dL, HDL < 40 mg/dL for men and < 45 mg/dL for women; APO B > 100 mg/dL, non HDL > 130 mg/dL;

More than 40 min/week;

Current smokers or < 5 years of cessation; HDL: high density lipoprotein; LDL: low density lipoprotein; SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure; PWV: pulse wave velocity; BMI: body mass index; Hs-CRP: high sensitivity C-reactive protein. Categorical variables compared by the Chi-square test. Continuous variables expressed as mean ± standard deviation (using Student’s t-test) and biochemical variables as median (1st quartile – 3rd quartile) (using Mann-Whitney’s test). Statistical significance: p < 0.05.

 Computation and analysis of Genetic Risk Score

Deviation from Hardy-Weinberg equilibrium for the 33 genotypes at individual loci were assessed using the Chi-squared test and p < 0.002 with Bonferroni correction for all SNPs included. LPA gene variant was excluded for further analyses due to its low Hardy-Weinberg p-value (p < 0.002). Linkage disequilibrium for the mutually adjusted SNPs within the genes was studied. CDKN2B gene was excluded because of the strong linkage disequilibrium with another selected SNP, rs1333049, which resides in the 9p21 region. The remaining 31 SNPs were included for further analysis (Supplementary Table 1).

In this study, the MGRS had the highest AUC value for assessing the risk for CAD disease with a specificity of 62.3% and sensitivity of 54% (data not shown) and therefore this model was computed in the subsequent analyzes (Supplementary Table 2).

The MGRS of 31 SNPs was significantly higher in CAD cases than in controls (0.67 ± 0.73 vs 0.48 ± 0.53; p < 0.0001), even by quartile and gender discrimination (Table 2).

Distribution of multiplicative genetic risk score (MGRS) for cases and controls by quartiles and gender
Variables Cases (n = 1566) Controls (n = 1322) p value
MGRS 0.67 ± 0.73 0.48 ± 0.53 < 0.0001
1st Quartile 0.18 ± 0.05 0.17 ± 0.05 < 0.0001
2nd Quartile 0.33 ± 0.05 0.33 ± 0.05
3th Quartile 0.52 ± 0.07 0.52 ± 0.07
4 th Quartile 1.35 ± 1.02 1.18 ± 0.88
MGRS male 0.67 ± 0.77 0.48 ± 0.44 < 0.0001
MGRS female 0.65 ± 0.58 0.51 ± 0.74 0.006

MGRS was expressed as mean ± standard deviation (SD) (using Student’s t-test). Statistical significance: p < 0.05.

A normal distribution of risk alleles in the total sample set including cases and controls is shown in Figure 1. While CAD patients exhibited lower GRS values, risk alleles were more prevalent in this group than in controls. In CAD patients, a mean of 27 risk alleles was seen in 52% of the individuals, and a mean of 26 risk alleles was found in 53% of controls (Figure 1).

Distribution of the number of risk alleles by cases and controls. A logistic regression model was used to determine the coronary artery disease risk by the number of risk alleles compared to the number of reference alleles (23 alleles, in relation to the median value of the controls). Dots: regression analysis odds ratio for coronary artery disease.

When analyzed in deciles, GRS showed that the increase in the number of risk alleles was significantly associated with CAD as shown by inter-deciles p values (1st decile: OR = 0.612 (0.439 - 0.853), p = 0.004; 9th decile: OR =0.957 (01.400 - 2.734), p < 0.0001 and last decile: OR = 2.472 (1.755 - 3.482), p < 0.0001) (Figure 2).

Distribution of genetic risk score in deciles by cases and controls. A logistic regression model was used with the 5th decile of the controls as the reference class.

A logistic regression analysis was performed with GRS quartiles, using the first as the reference category. Results showed an increase in CAD risk with statistical significance across the 2nd, 3rd and 4th quartiles with respective ORs and CIs of 1.372 (1.114 - 1.689), 1.878 (1.522 - 2.317) and 2.588 (2.090 - 3.204), respectively (data not shown).

A multivariable predictive model for CAD incorporating GRS quartiles and TRFs is presented in Table 3. The 4th GRS quartile has intermediate contribution to CAD phenotype - OR = 2.727 (2.162 - 3.439), greater than dyslipidemia - OR = 1.298 (1.023 - 1.646) and hypertension - OR = 2.067 (1.744 - 2.450). The reduced contribution of dyslipidemia on CAD risk may be due to standard use of statins in CAD patients. Extended adjustment for cofounding variables (gender, age, heart rate, PWV, low exercise level, BMI and family history of CAD) revealed modest increases in the OR for TRFs and the 2nd and 3rd quartiles of GRS.

Multivariate analysis performed with the multiplicative genetic risk score (MGRS) (quartiles) and traditional risk factors
Variables OR* (95% CI) p value OR+ (95% CI) p value
MGRS (Quartiles) ------ ------ ------ < 0.0001
2nd 1.355 (1.082 – 1.698) 0.008 1.406 (1.107 – 1.786) 0.005
3rd 1.934 (1.539 – 2.429) < 0.0001 2.006 (1.575 – 2.554) < 0.0001
4th 2.727 (2.162 – 3.439) < 0.0001 2.657 (2.083 – 3.389) < 0.0001
Smoking 3.440 (2.887 – 4.100) < 0.0001 3.651 (3.030 – 4.401) < 0.0001
Diabetes 3.138 (2.559 – 3.847) < 0.0001 3.436 (2.763 – 4.273) < 0.0001
Hypertension 2.067 (1.744 – 2.450) < 0.0001 2.187 (1.816 – 2.633) <0.0001
Dyslipidemia 1.298 (1.023 – 1.646) 0.032 1.344 (1.044 – 1.731) 0.022
Constant 0.186 < 0.0001

Using forward Wald method (SPSS vs. 19.0); Dyslipidemia. Controls: LDL > 140 mg/dL, HDL < 40 mg/dL for men and < 45 mg/dLfor women; triglycerides> 150 mg/dL, APO B > 100 mg/dL. Cases: LDL > 100 mg/dL; triglycerides > 150 mg/dL, HDL < 40 mg/dL for men and < 45 mg/dL for women; APO B > 100 mg/dL, non HDL > 130 mg/dL;

OR: odds ratio adjusted for age and gender;

OR: odds ratio adjusted for gender, age, heart rate, pulse wave velocity, sedentary life style, alcohol, body mass index and family history; CI: confidence interval; Statistically significant for p < 0.05.

We used VIF to test for multi-collinearity among the variables included in our GRS adjusted logistic regression model. Tolerance and VIF were respectively > 0.1 and < 10 attesting for no significant collinearity between variables included in the adjustment model.

Two ROC curves were plotted based on the TRFs without and with the GRS (Figure 3). The first ROC curve estimated an AUC of 0.72, which increased to 0.74 when the GRS was added, revealing a better fit of the model (p < 0.0001) (Figure 3).

ROC curves based on the baseline model (traditional risk factors, TRFs) and after adding the genetic risk score (GRS) (quartiles) in predicting the risk for coronary artery disease. The two curves are based on logistic regression models incorporating conventional risk factors (diabetes, dyslipidemia, smoking and hypertension) with and without the GRS. AUC indicates area under curve. The Delong test compares the difference between the two AUCs (p < 0.0001).

The NRI and its p value were used to make conclusions about improvements in prediction performance gained by adding a set of biomarkers to an existing risk prediction model. The addition of GRS quartiles to TRF improved the risk classification of the models (Table 4). This new marker provided a continuous NRI of 31% (95% CI: 23.8-38.3%; p < 0.0001) with 14.6% reclassification of CAD patients and 16.4% of healthy control population (Table 4).

The category-free net reclassification index (cfNRI) after addition of the GRS quartiles
Group n Higher risk n (%) Lower risk n (%) p (cfNRI) cfNRI (%) cfNRI (95% CI)
CAD patients 1566 897 (57.3%) 669 (42.7%) < 0.0001 14.6% (9.7-19.5%)
Healthy controls 1322 553 (41.8%) 769 (58.2%) < 0.0001 16.4% (11.2-21.8%)
Total 2888 --- --- < 0.0001 31% (23.8-38.3%)

GRS: genetic Risk Score; CAD: coronary Artery Disease; CI: confidence Interval; cfNRI: category-free net reclassification index. This analysis uses the function “improveProb” from R software package “Hmisc”.

NRI was also computed using categorical variables and applied to this case-control study and was defined as the percentage of subjects changing categories in each subgroup when adding the new marker (CAD quartile score). Movement towards a better category (higher in patients than in controls) was calculated to address a potential impact for clinical use. NRI showed higher improvement capacity in reclassifying 19.5% of patients from the 50-75% category to the highest risk (75-100%) category. Likewise, 14.1% of healthy controls were moved down into a lower risk category, from 25-50% risk category to < 25% one (Table 5).

Reclassification table comparing predicted coronary artery disease (CAD) risk with and without genetic risk score (GRS) quartiles
Predicted risk (without GRS) Reclassified predicted risk (with GRS) % Increase %/ Decrease
CAD patients (n = 1,566) < 25% 25-50% 50-75% 75-100%
< 25% 6 11 0 0 0,7% 0%
25-50% 44 335 123 0 7,9% 2.8%
50-75% 0 59 471 305 19,5% 3.8%
75-100% 0 0 9 203 0% 0.6%
NRI CAD patients 20.9%
Healthy controls (n = 1,322)
< 25% 65 36 0 0 2,7% 0%
25-50% 186 504 88 0 6,7% 14.1%
50-75% 0 60 268 79 6% 4.5%
75-100% 0 0 1 35 0% 0.1%
NRI controls 3.3%
NRI total 24.2%

NRI: net reclassification improvement (categorical NRI); CAD: coronary artery disease.

Furthermore, the inclusion of GRS quartiles to TRF also provided an IDI of 2.5% (95%CI: 1.9-3.1%; p < 0.0001) (data not shown).

 Discussion

Several years ago, polymorphisms involved in specific biological pathways, relevant to coronary atherosclerosis, were genotyped to determine their association with CAD. This candidate gene approach revealed about 30 high-confidence SNPs loci with significant effects on atherosclerosis.13 However, following traditional candidate gene approach has generated many conflicting results or with weak associations; replication studies are necessary for consistent validation of these results.

In 2004, Mendonça et al. first genotyped angiotensin-converting enzyme (ACE) I/D polymorphisms in a Portuguese population yielding similar reports as described in literature.14

After the development of high capacity arrays in 2008,15 GWAS examined millions of polymorphisms simultaneously in several ethnical subpopulations with a case-control design. The standardized minimum significance level set at 1x10-5 added reliability to cardiovascular genetics and put it into perspective.16

In 2007, Samani et al.17 first identified chromosomal loci that were strongly associated with CAD in the Wellcome Trust Case Control Consortium (WTCCC) study (which involved 1,926 case subjects with CAD and 2938 controls) and looked for replication in the German MI (Myocardial Infarction) Family Study.17

In the following years, a surprisingly large number of gene variants were consistently reported to be associated with CAD. The 9p21 variant was the most frequently gene variant reported across populations. The huge consortium of Wellcome Trust and three other European research groups joined for the CARDIOGRAM project that confirmed, in a very large sample (> 22,000 cases) of individuals of European ancestry, a 29% increase in risk for MI per copy of the rs1333049 9p21 variant (p = 2×10-20).18

Our research group replicated this 9p21 variant analysis in the Portuguese population and found a CC genotype prevalence of 35.7% in CAD patients, with an adjusted OR of 1.34, p = 0.010. The adjusted OR for TRF of CC genotype was 1.7 (p = 0.018) and CG genotype of OR = 1.5, p = 0.048. The authors concluded that although the mechanism underlying the risk is still unknown, the robustness of this risk allele in risk stratification for CAD has been consistent, even in very different populations. The presence of the CC or CG genotype may thus prove to be useful for predicting the risk of developing CAD in the Portuguese population.19

The most recent meta-analysis of GWAS for (CAD) identified 46 genome-wide loci with significant association and 104 genome-wide loci potentially associated with increased risk.20,21

In our study, we found a gradual and continual increase in CAD risk with increasing number of CAD risk alleles carried. Individuals in the bottom decile are naturally protected and subjects in top decile of the GRS had a CAD risk of 2.472 (1.755 - 3.482). Even though the score distribution overlaps between cases and controls, the GRS is significantly associated with CAD risk and can be used to identify subjects at highest risk in terms of lifestyle or therapeutic interventions.

Our results are similar to others reports in Caucasians populations where GRS with 13, 29 or 109 SNPs22-24 were independent and marginally increased the predictive power of TRF conferred either by AUC increases, C-index changes or more modern discriminative statistical methods like reclassification measures or improved discrimination.

We report a higher OR for the 4th quartile of GRS (2.59) compared to 1.66 reported by Ripatti et al. in the highest quintile.22 When comparing the relative weight of the GRS in the multivariate logistic analysis we found slightly lower OR than smoking, hypertension, and dyslipidemia. In Ripatti´s22 cohort, a weighted GRS was also an independent predictor even after adjusting for age, sex and TRFs in a Northern European population-based trial. The relative risk of the GRS based on 13-SNP was also lower than that of dyslipidemia and comparable to the effects of hypertension.22

An increased power to TRFs definition has been given in this study. For instance, we have used a broad dyslipidemia term including Apo B levels as indicated by 2016 lipid guidelines.7 Moreover, we have not considered ex-smokers until 5 years of cessation to account for the risk for CV disease events decrease be comparable to a nonsmoker.5

Thanassoulis et al.24 demonstrated that adding to a 13 SNP-based GRS, 89 SNPs associated with modifiable risk factors did not increase the power of the GRS reporting a HR of 1.01 (95% CI 0.99 -1.03; p = 0.48). This revealed that the weak association of polymorphisms with CAD risk factors in GRS analysis could be masked by the relative stronger effect of other polymorphisms. Considering the lack of a significant association of lipid profiles with CAD risk, Jansen et al. reported in 2015 that several SNPs associated with type 2 diabetes mellitus were related with CAD risk.25 Recently, Webb et al. identified 6 new loci associated with CAD at genome-wide significance. The study confirmed a pleiotropy between lipid traits, blood pressure phenotypes, body mass index, diabetes, and smoking behavior.26 Our GRS is an assembly of risk factors and non-risk factors-related SNP, reinforcing the genotype-phenotype interactions.

Limitations of this study

The main clinical utility of the GRS in our population is a modest improvement in risk stratification. GRS seems to be a better indicator of patients at a higher than average risk for DAC as compared with TRF stratification. The number and type of SNPs included is limited in our study and a larger number of GWAS hit SNPs should be included in further studies. Nevertheless, the increasing capability of analyzing multiple SNPs in GRS so far have not been translated into increasing ability of risk prediction.

Finally, this study did not include a gene-gene (G-G) and gene-environment (G-E) analysis. It is expected that, as better statistical significance arises from those interplays, the G-G and G-E incorporation in GRS plus TRF will increase our ability to accurately and individually predict risk.

 Conclusions

We conclude that a multilocus GRS based on multiple variants of genetic risk was associated to an increased cardiovascular risk in a Portuguese population. We found that a GRS calculated with the 31 studied SNPs was significantly associated to CAD and that 25% of individuals who carry the greatest risk alleles have, approximately, 2.5 times increased CAD risk when compared to those in the lowest quartile. This GRS has provided a slight improvement of the predictive ability compared to the initial model and can enhance individual risk stratification. These results highlight the potential value of including genetic information in the usual models.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This article is part of the thesis of Doctoral submitted byAndreia Pereira, from Universidade Nova de Lisboa.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the SESARAM, EPE under the protocol number 50/2012. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.

 Acknowledgments

We are very grateful to Elsa Sousa who made all the administrative procedures and to Rita Freitas (CIDEHUS, Évora University, Portugal) who reviewed the paper for statistical analysis.

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Keating BJ Tischfield S Murray SS Bhangale T Price TS Glessner JT Concept, design and implementation of a cardiovascular gene-centric 50 k SNP array for large-scale genomic association studies PLoS One 2008 3 10 e3583 16 McCarthy MI, Abecasis GR, Cardon LR, Goldstein DB, Little J, Ioannidis JP, et al. Genome-wide association studies for complex traits: consensus, uncertainty and challenges. Nat Rev Genet. 2008;9(5):356-69. McCarthy MI Abecasis GR Cardon LR Goldstein DB Little J Ioannidis JP Genome-wide association studies for complex traits: consensus, uncertainty and challenges Nat Rev Genet 2008 9 5 356 369 17 Samani NJ, Erdmann J, Hall AS, Hengstenberg C, Mangino M, Mayer B, et al; WTCCC and the Cardiogenics Consortium. Genomewide association analysis of coronary artery disease. N Engl J Med 2007;357(5):443-53. Samani NJ Erdmann J Hall AS Hengstenberg C Mangino M Mayer B WTCCC and the Cardiogenics Consortium Genomewide association analysis of coronary artery disease N Engl J Med 2007 357 5 443 453 18 Preuss M, König IR, Thompson JR, Erdman J, Absher D, Assimes TL, et al; CARDIoGRAM Consortium. Design of the Coronary ARtery DIsease Genome-Wide Replication And Meta-Analysis (CARDIoGRAM) Study: A Genome-wide association meta-analysis involving more than 22 000 cases and 60 000 controls. Circ Cardiovasc Genet. 2010;3(5):475-83. Preuss M König IR Thompson JR Erdman J Absher D Assimes TL CARDIoGRAM Consortium Design of the Coronary ARtery DIsease Genome-Wide Replication And Meta-Analysis (CARDIoGRAM) Study: A Genome-wide association meta-analysis involving more than 22 000 cases and 60 000 controls Circ Cardiovasc Genet 2010 3 5 475 483 19 Mendonça I, dos Reis RP, Pereira A, Café H, Serrão M, Sousa AC, et al. Associação independente da variante rs1333049, no locus 9p21, com a doença coronária, numa população portuguesa. Rev Port Cardiol. 2011;30(6):575-91. Mendonça I dos Reis RP Pereira A Café H Serrão M Sousa AC Associação independente da variante rs1333049, no locus 9p21, com a doença coronária, numa população portuguesa Rev Port Cardiol 2011 30 6 575 591 20 Deloukas P, Kanoni S, Willenborg C, Farrall M, Assimes TL, Thompson JR, et al; CARDIoGRAMplusC4D Consortium. Large-scale association analysis identifies new risk loci for coronary artery disease. Nat Genet. 2013;45(1):25-33. Deloukas P Kanoni S Willenborg C Farrall M Assimes TL Thompson JR CARDIoGRAMplusC4D Consortium Large-scale association analysis identifies new risk loci for coronary artery disease Nat Genet 2013 45 1 25 33 21 Roberts R. Genetics of coronary artery disease. Circ Res. 2014;114(12):1890-903. 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Vaarhorst AA Lu Y Heijmans BT Dollé ME Böhringer S Putter H Literature-based genetic risk scores for coronary heart disease: the Cardiovascular Registry Maastricht (CAREMA) prospective cohort study Circ Cardiovasc Genet 2012 5 2 202 209 24 Thanassoulis G, Peloso GM, Pencina MJ, Hoffman U, Fox CS, Cupples LA. A genetic risk score is associated with incident cardiovascular disease and coronary artery calcium: the Framingham Heart Study. Circ Cardiovasc Genet. 2012;5(1):113-21. Thanassoulis G Peloso GM Pencina MJ Hoffman U Fox CS Cupples LA A genetic risk score is associated with incident cardiovascular disease and coronary artery calcium: the Framingham Heart Study Circ Cardiovasc Genet 2012 5 1 113 121 25 Jansen H, Loley C, Lieb W, Pencina MJ, Nelson CP, Kathiresan S, et al; CARDIoGRAM consortium. Genetic variants primarily associated with type 2 diabetes are related to coronary artery disease risk. Atherosclerosis. 2015;241(2):419-26. Jansen H Loley C Lieb W Pencina MJ Nelson CP Kathiresan S CARDIoGRAM consortium Genetic variants primarily associated with type 2 diabetes are related to coronary artery disease risk Atherosclerosis 2015 241 2 419 426 26 Webb TR, Erdmann J, Stirrups KE, Stitziel NO, Masca NG, Jansen H, et al. Systematic evaluation of pleiotropy identifies 6 further loci associated with coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 2017;69(7):823-36. Webb TR Erdmann J Stirrups KE Stitziel NO Masca NG Jansen H Systematic evaluation of pleiotropy identifies 6 further loci associated with coronary artery disease J Am Coll Cardiol 2017 69 7 823 836 Artigo Original Análise de Risco Genético da Doença Arterial Coronariana em um Estudo Populacional em Portugal, Usando um Score de Risco Genético com 31 Variantes Pereira Andreia 1 Mendonça Maria Isabel 1 Borges Sofia 1 Freitas Sónia 1 Henriques Eva 1 Rodrigues Mariana 1 Freitas Ana Isabel 2 Sousa Ana Célia 1 Brehm António 2 Reis Roberto Palma dos 3 Unidade de Investigação, Hospital Dr. Nélio Mendonça, Funchal - Portugal Laboratório de Genética Humana, Universidade da Madeira, Funchal - Portugal Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa, Lisboa - Portugal Correspondência: Andreia Pereira, Avenida Luís de Camões, nº 57. CEP 9004-514, Funchal - Portugal. E-mail: andreiapereira21@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa e Redação do manuscrito: Pereira A; Obtenção de dados: Pereira A, Freitas AI, Sousa AC, Brehm A; Análise e interpretação dos dados e Análise estatística: Pereira A, Freitas S, Henriques E, Rodrigues M; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Pereira A, Mendonça MI, Borges S, Brehm A, Reis RP.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

O escore de risco genético pode quantificar a predisposição do indivíduo em desenvolver doença arterial coronariana; no entanto, sua utilidade como preditor de risco independente permanece inconclusiva.

 Objetivo:

Avaliar o incremento no valor preditivo de um escore de risco genético aos fatores de risco tradicionais associados à doença arterial coronariana.

 Métodos:

Trinta e três variantes genéticas previamente associadas à doença arterial coronariana foram analisadas em uma população caso-controle com 2888 indivíduos. Um escore de risco genético multiplicativo foi calculado e dividido em quartis, com o 1º quartil como a classe de referência. O risco coronário foi determinado por análise de regressão logística. Uma segunda regressão logística foi realizada com fatores de risco tradicionais e o último quartil do escore de risco genético. Com base nesse modelo, duas curvas ROC foram construídas com e sem o escore de risco e comparadas pelo teste de DeLong. A significância estatística foi considerada quando os valores de p eram inferiores a 0,05.

 Resultados:

O último quartil do score de risco genético multiplicativo revelou um aumento significativo no risco de doença arterial coronariana (OR = 2,588; IC 95%: 2,090-3,204; p < 0,0001). A curva ROC baseada nos fatores de risco tradicionais estimou uma AUC de 0,72, que aumentou para 0,74 quando o score de risco genético foi adicionado, revelando um ajuste melhor do modelo (p < 0,0001).

 Conclusões:

Em conclusão, um escore de risco genético com múltiplos loci foi associado a um risco aumentado de doença coronariana na nossa população. O modelo usual de fatores de risco tradicionais pode ser melhorado pela incorporação de dados genéticos.

 Palavras-chave: Doença da Artéria Coronariana / história Doença da Artéria Coronariana / morbidade Mortalidade Polimorfismo Genético Epidemiologia Fatores de Risco Introdução

A doença arterial coronariana (DAC) tornou-se um importante problema de saúde pública em todo o mundo, com crescente prevalência e alta morbidade e mortalidade. Fatores de risco tradicionais (FRTs) não são suficientes para identificar indivíduos assintomáticos em alto risco. Estudos epidemiológicos e estudos com famílias já mostraram que o fator genético responde por aproximadamente 50% da susceptibilidade à doença cardíaca.1 O conhecimento da predisposição genética a doenças cardíacas é fundamental para sua prevenção e tratamento adequados.

Apesar de pouco se conhecer sobre a base genética da doença coronariana, houve progressos com a identificação de genes candidatos e estudos de associação genômica ampla (GWAS).2 De fato, muitas variantes genéticas foram identificadas em várias regiões genômicas associadas com DAC.2

Até o momento, o risco atribuível a qualquer variante individual é baixo. No entanto, a descoberta e a combinação de múltiplos loci com efeitos relativamente baixos a um escore de risco genético (ERG) global permitiria a identificação de populações em alto risco e melhoraria a avaliação de risco individual.

Portanto, o objetivo deste estudo foi desenvolver um ERG com base em variantes comuns, previamente associados com DAC, avaliar se o escore é independente de FRTs e se melhora a capacidade preditiva de um modelo baseado somente nesses fatores.

 Métodos População do estudo

A população do estudo foi selecionada a partir do GENEMACOR (GENEs na população madeirense com doença arterial CORonariana), um estudo populacional caso-controle em desenvolvimento com 2888 participantes, 1566 casos (idade média 53,3 ± 8,0 anos, 79,1% homens) e 1322 controles (idade média 52,7 ± 7,8 anos, 76,4% homens). Os casos foram selecionados entre pacientes que receberam alta após serem internados por infarto do miocárdio / angina instável diagnosticados segundo critérios previamente descritos,3 ou com DAC confirmada por angiografia com uma ou mais lesão coronariana de estenose ≥ 70% em uma ou mais artéria coronária importante ou seus ramos principais. A ausência de ateroma ou presença de ateroma sem alteração de fluxo foram excluídas das análises. O grupo controle foi composto de voluntários sadios, sem sintoma ou história de DAC, selecionados da mesma população. Todos os controles foram submetidos à avaliação clínica quanto a fatores de risco cardiovasculares convencionais, à eletrocardiografia (ECG) e, em casos de dúvida, a um teste de estresse (exercício), a um eco-stress ou à tomografia computadorizada para determinação do escore de cálcio. Casos e controles foram pareados por sexo e idade.

Como critérios de inclusão foi considerada idade limite de 65 anos e ser um residente permanente na Ilha da Madeira a fim de se evitar mistura genética. Análise de Componentes Principais (ACP) foi usada para análise de estratificação da população quanto à possível mistura genética e detecção de outliers genéticos significativos (< 5%).4

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do hospital segundo Declaração de Helsinki e todos os pacientes assinaram o termo de consentimento.

 Coleta de dados

Os dados foram coletados de todos os indivíduos utilizando-se um formulário padrão que incluiu dados demográficos, características clínicas e fatores de riscos (sexo, idade, nível de atividade física, tabagismo, hipertensão arterial, dislipidemia, diabetes, história familiar de DAC, índice de massa corporal) (IMC), frequência cardíaca e velocidade de onda de pulso (VOP).

Foram considerados “tabagistas” participantes fumantes ou aqueles que pararam de fumar há menos de 5 anos.5

Hipertensão essencial foi considerada quando os pacientes apresentavam esse diagnóstico na inclusão no estudo e/ou estavam em uso de medicamento anti-hipertensivo há mais de 3 meses, ou foram diagnosticados recentemente com pressão sanguínea sistólica ou diastólica ≥ 140/90 mmHg em pelo menos 3 ocasiões.6

Dislipidemia foi definida para a população controle como níveis de lipoproteína de baixa densidade (LDL) > 140mg/dL, lipoproteína de alta densidade (HDL) < 45 mg/dL para mulheres e < 40 mg/dL para homens, triglicerídeos > 150 mg/dL e apolipoproteína (Apo) B > 100 mg/dL. Os pacientes (em alto risco) foram considerados dislipidêmicos se os níveis de LDL fossem maiores que 100 mg/dL, HDL <45 mg/dL para mulheres e < 40 mg/dL para homens, triglicerídeos > 150 mg/dL, Apo B > 100 mg/dL e colesterol não-HDL (colesterol total-HDL) > 130 mg/dL.7

Todos os indivíduos foram classificados como diabéticos se estivessem em uso de hipoglicemiantes orais ou insulina, ou se seus níveis plasmáticos de glicose fossem superiores a 7,0 mmol/L ou 126 mg/dL.8

História familiar de doença cardiovascular (DCV) prematura foi considerada àqueles com pai ou irmão que receberam diagnóstico de DCV em idade inferior a 55 anos ou mãe ou irmã em idade inferior a 65 anos.

A definição de outros FRTs foi baseada com base em critérios padrões, como descrito anteriormente.9,10

Análise bioquímica

As amostras de sangue foram extraídas após 12 horas de jejum. As análises bioquímicas foram realizadas no laboratório central do hospital, de acordo com técnicas padrões. Para determinar os níveis de colesterol total, HDL, LDL, triglicerídeos e glicose, as amostras de sangue foram colocadas em tubos secos, centrifugados 30 minutos após coleta a 3500 g, e em seguida quantificadas por técnica enzimática por um analisador automático (Beckman Coulter). Os marcadores bioquímicos tais como lipoproteína-a - Lp(a), (Apo B), e proteína C reativa ultrassensível (PCR-us) foram quantificadas por imunoturbidimetria também utilizando-se um sistema automático “AU 5400” (Beckman Coulter).

 Seleção de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP)

Foram utilizadas duas abordagens para identificar SNPs para ERGs. Na primeira abordagem, fizemos uma busca no banco de dados do National Human Genome Research Institute que incluiu SNPs identificados por GWAs e catalogados com base no fenótipo e/ou traço, pelas palavras chave: “doença arterial coronariana”, “doença coronariana”, “infarto do miocárdio”, e “infarto precoce”. A segunda abordagem incluiu SNPs identificados por abordagens de genes candidatos, incluídos em um ERG publicado para DAC.

Os critérios de inclusão incluíram genes descritos em estudos prévios com um Odds Ratio (OR) para DAC ≥ 1,1 e uma frequência do alelo menos comum (MAF, minor allele frequency) > 5%. Genes com baixo equilíbrio de Hardy-Weinberg (p < 0,002) (após correção de Bonferroni) foram excluídos.

No total, 33 SNPs foram selecionados de acordo com suas possíveis funções relacionadas à DAC - ciclo celular, migração celular e inflamação - rs1333049 (9p21.3), rs4977574 (CDKN2B), rs618675 (GJA4), rs17228212 (SMAD3), rs17465637 (MIA3), rs12190287 (TCF21), rs3825807 (ADAMTS7), rs11556924 (ZC3HC1), rs12526453 (PHACTR1); genes envolvidos no status pró-oxidativo (rs1801133 (MTHFR 677), rs1801131 (MTHFR 1298), rs705379 (PON 1), rs662 (PON 192), rs854560 (PON 55), rs6922269 (MTHFD1L); genes associados com fatores de risco modificáveis tais como metabolismo lipídico, hipertensão e diabetes/obesidade - rs3798220 (LPA), rs2114580 (PCSK9), rs20455 (KIF6), rs7412/rs429358 (APOE), rs964184 (ZNF259), rs599839 (PSRC1), rs5186 (AT1R), rs699 (AGT), rs4340 (ACE), rs4402960 (IGF2BP2), rs1326634 (SLC30A8), rs266729 (ADIPOQ), rs7903146 (TCF7L2), rs17782313 (MC4R), rs1801282 (PPARG), rs1884613 (HNF4A), rs8050136 (FTO) e rs1376251 (TAS2R 50) (Tabela suplementar 1).

 Análises genéticas

As análises genéticas foram realizadas no laboratório de genética humana da Universidade da Madeira. O DNA genômico foi extraído de uma amostra de 80 µL de sangue periférico utilizando-se um método padrão com fenol-clorofórmio. Um ensaio de genotipagem de SNPs pelo sistema TaqMan foi realizado utilizando-se sondas e primers marcados conforme fabricante (TaqMan SNP Genotyping Assays, Applied Biosystems).

Todas as reações foram realizadas utilizando-se a técnica de PCR em tempo real pelo sistema e programa Applied Biosystems 7300 (Applied Biosystems, Foster City, EUA) sem nenhum conhecimento prévio dos dados clínicos dos indivíduos. A qualidade das técnicas de genotipagem foi controlada pela inclusão de um controle branco (non-template) em cada placa de 96 poços. Todos os ensaios TaqMan foram realizados com duplicatas (cegas), correspondendo a 20% das amostras. Alguns genótipos de SNPs foram confirmados aleatoriamente pelo procedimento convencional de sequenciamento direto do DNA, sendo que 10-15% de todas as amostras foram reamplificadas por sequenciamento. As taxas de acurácia (call rates) para SNPs no ERG foram 98-100%; uma taxa de 95% foi estabelecida como controle de qualidade.

 Cálculo do ESCORE DE RISCO GENÉTICO

Avaliamos vários modelos para elaborar o ERG com base em escores ponderados e não ponderados, considerando cada padrão de herança de cada locus gênico. Um escore aditivo (ERGA) foi gerado, isto é, para cada uma das 31 variantes, foi estabelecido um escore de 0, 1 e 2 com base na existência de 0, 1 ou 2 alelos de risco, calculando-se a soma acumulada dos alelos de risco nessas variantes. Cada indivíduo poderia receber um ERG de 0 a 62. Além disso, um ERG multiplicativo (ERGM) foi calculado, multiplicando-se o risco relativo para cada genótipo.

Para validar o cálculo do escore de risco, selecionamos uma amostra aleatória de 597 pacientes (20%).

 Análise estatística

As variáveis categóricas foram expressas em frequências e porcentagens e comparadas pelo teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher. As variáveis contínuas foram expressas em média ± desvio padrão (DP) ou mediana (1º quartil - 3º quartil) e comparadas pelo teste t para amostras não pareada ou o teste de Mann-Whitney, conforme apropriado. O teste de Kolmogorov-Smirnov e o teste de Levene foram usados para testar normalidade e homogeneidade das variáveis. Todas as análises foram consideradas significativas se os valores de p fossem menores que 0,05.

Regressão logística binária foi usada para determinar o efeito (combinado e separado) das variáveis sobre o risco para DAC angiográfica. O ERG foi delineado como uma variável contínua e em quartis, usando-se o primeiro quartil como categoria de referência. As análises multivariadas foram usadas para ajuste do modelo quanto a 7 covariáveis também associadas com DAC.

Desenvolvemos características de operação do receptor (curvas ROC) e calculamos a área sob a curva (AUC) para modelos de regressão logística incluindo FRTs com e sem o ERG (quartis). As curvas ROC foram comparadas em pares usando o teste DeLong.11 A calibração do modelo foi testada pelo teste de Hosmer-Lemeshow. Um valor de p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Colinearidade entre as variáveis foi medida avaliando-se tolerância e fator de inflação da variância (FIV).

Associações dos SNPs com DAC foram consideradas significativas para p < 0,05 e em conjunto com os modelos de ERG para p < 0,0015 aplicando-se a correção de Bonferroni. Para MAF de 30%, o estudo apresentou poder de 70% para detectar um OR para DAC de 1,3 e > 90% para OR > 1,35, para alfa bicaudal < 0,05 para 2000 casos e 1000 controles. Esses cálculos foram realizados usando o programa G power Statistical Power Analyses.

O potencial do ERG em melhorar a estratificação de risco individual foi medido pelo método net reclassification improvement (NRI),12 definido como a porcentagem de indivíduos em cada subgrupo que mudaram de categorias quando um novo modelo de ERG foi adicionado. Ainda, a melhora integrada de discriminação (integrated discrimination improvement, IDI), definida como a melhora incremental no valor prognóstico do ERG, foi comparada entre casos e controles. O NRI foi calculado para variáveis categóricas e não categóricas (contínuas) utilizando-se o programa PredictABEL disponível em software R (versão 3.2.0). As análises estatísticas foram realizadas usando os programas SPSS versão 19.0 (IBM), o MedCalc versão 13.3.3.0 e o software R versão 3.1.2.

 Resultados Característica basal da população

A Tabela 1 apresenta as características basais de nossa população. Conforme o esperado, não houve diferença entre casos e controles quanto ao sexo e idade, pois esse era um dos critérios de seleção. Uma maior frequência de dislipidemia, diabetes, hipertensão, sedentarismo, tabagismo, consumo de álcool, e história familiar de DCV prematura foi encontrada nos pacientes com DAC que nos controles (p < 0,0001). Ainda, VOP, IMC e relação cintura-quadril foram mais frequentes nos controles, com diferença estatisticamente significativa (Tabela 1). Valores das outras variáveis bioquímicas analisadas - hemoglobina, leucócitos, fibrinogênio, homocisteína e PCR-us > 3 foram significativamente mais elevados no grupo de pacientes com DAC que nos controles (p < 0,05) (Tabela 1).

Características basais da população estudada
Variáveis Casos (n = 1566) Controles (n = 1322) Valor de p
Idade, anos 53,3 ± 8,0 52,7 ± 7,8 0,053
Sexo masculino, n (%) 1238 (79,1%) 1010 (76,4%) 0,087
Dislipidemia†, n (%) 1398 (89,3) 1103 (83,4) 0,0001
Colesterol total, mg/dL 180,0 (154,0 – 213,0) 205,0 (181,0 – 234,0) < 0,0001
LDL, mg/dL 104,6 (82,8 – 128,7) 127,2 (104,7 – 152,3) < 0,0001
HDL, mg/dL 41,0 (35,0 – 49,0) 48,0 (41,0 – 57,0) < 0,0001
Triglicerídeos, mg/dL 141,0 (102,0 – 210,0) 121,0 (89,0 – 174,0) < 0,0001
Apolipoproteína B, mg/dL 93,9 (75,5 – 113,3) 92,5 (43,0 – 115,8) < 0,0001
Lipoproteína (a), mg/dL 20,4 (9,2 – 62,0) 12,8 (8,8 – 29,3) < 0,0001
Diabetes, n (%) 533 (34,0) 175 (13,2) < 0,0001
Glicose de jejum, mg/dL 106,0 (96,0 – 129,0) 99,0 (91,0 – 109,0) < 0,0001
Hipertensão, n (%) 1114 (71,1) 700 (53,0) < 0,0001
PAS, mmHg 137,9 ± 20,8 136,2 ± 18,1 0,024
PAD, mmHg 82,6 ± 11,8 83,9 ± 11,1 0,002
Frequência cardíaca, bpm 68,8 ± 12,5 72,3 ± 11,5 < 0,0001
VOP, m/s 8,6 ± 1,9 8,3 ± 1,7 < 0,0001
Tabagismo•, n (%) 730 (46,6) 309 (23,4) < 0,0001
Nível de atividade física*, n (%) 573 (36,6) 761 (57,6) < 0,0001
Álcool, g/dia 24,7 ± 49,7 18,2 ± 28,2 < 0,0001
IMC, kg/m2 28,6 ± 4,2 28,1 ± 4,5 0,007
Cintura/Altura 0,61 ± 0,06 0,59 ± 0,07 < 0,0001
História familiar, n (%) 373 (23,8) 167 (12,6) < 0,0001
Hemoglobina, g/dl 14,6 (13,8 – 15,4) 14,7 (14 – 15,4) 0,001
Leucócitos, 103/µl 7,1 (6 – 8,3) 6,6 (5,6 – 7,8) < 0,0001
Fibrinogênio, mg/dl 387 (337 – 444) 361 (315 – 409) < 0,0001
Homocisteína, µmol/L 12,2 (10 – 14,9) 11,4 (9,7 – 13,6) < 0,0001
PCR-us, mg/L > 3, n (%) 648 (41,4) 496 (37,5) 0,035

Controles: LDL > 140 mg/dL, HDL < 40 para homens e < 45 para mulheres; triglicerídeos > 150 mg/dL, APO B > 100mg/dL. Casos: LDL > 100 mg/dL; triglicerídeos > 150 mg/dL, HDL < 40 mg/dL para homens e < 45 mg/dL para mulheres; APO B > 100 mg/dL, não-HDL > 130 mg/dL.

Mais que 40min/semana;

Fumantes atuais ou que parou há menos de 5 anos; HDL: lipoproteína de alta densidade; LDL: lipoproteína de baixa densidade; PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; VOP: velocidade de onda de pulso; IMC: índice de massa corporal; PCR-us: proteína C reativa ultrassensível. As variáveis categóricas foram comparadas pelo teste do qui-quadrado. Variáveis contínuas foram apresentadas em média ± desvio padrão (teste t de Student) e variáveis bioquímicas em mediana (1º quartil – 3º quartil) (teste de Mann-Whitney). Significância estatística: p < 0,05.

 Cálculo e análise do escore de risco genético

Desvios do equilíbrio Hardy-Weinberg para os 33 genótipos em loci individuais foram avaliados pelo teste do qui-quadrado e valores de p < 0,02 com correção de Bonferroni para todos os SNPs foram incluídos. A variante genética LPA foi excluída das análises devido ao baixo valor de p no modelo Hardy-Weinberg (p < 0,002). O desequilíbrio de ligação para SNPs (mutuamente ajustados) ao longo dos genes foi avaliado. O gene CDKN2B foi excluído devido ao forte desequilíbrio de ligação com outro SNP selecionado, rs1333049, que reside na região 9p21. Os demais 31 SNPs foram incluídos na análise (Tabela Suplementar 1).

No presente estudo, o ERGM apresentou a maior AUC para avaliar o risco de DAC, com uma especificidade de 62,3% e sensibilidade de 54% (dados não apresentados) e, por isso, esse modelo foi calculado nas análises subsequentes (Tabela 2 Suplementar). O ERGM de 31 SNPs foi significativamente mais alto nos casos de DAC que nos controles (0,67 ± 0,73 vs 0,48 ± 0,53; p < 0,0001), mesmo após discriminação por quartil e sexo (Tabela 2).

Distribuição do escore de risco genético multiplicativo (ERGM) para casos e controles por quartis e gênero
Variáveis Casos (n = 1566) Controles (n = 1322) Valor de p
ERGM 0,67 ± 0,73 0,48 ± 0,53 < 0,0001
1º Quartil 0,18 ± 0,05 0,17 ± 0,05 < 0,0001
2º Quartil 0,33 ± 0,05 0,33 ± 0,05
3º Quartil 0,52 ± 0,07 0,52 ± 0,07
4º Quartil 1,35 ± 1,02 1,18 ± 0,88
ERGM para homens 0,67 ± 0,77 0,48 ± 0,44 < 0,0001
ERGM para mulheres 0,65 ± 0,58 0,51 ± 0,74 0,006

ERGM expressos em média ± desvio padrão (teste t de Student). Significância estatística: p < 0,05.

Distribuição normal de alelos de risco na amostra total incluindo casos e controles está apresentada na Figura 1. Embora os pacientes com DAC apresentaram valores de ERG mais baixos, alelos de risco foram mais prevalentes nesse grupo que nos controles. Nos pacientes com DAC, uma média de 27 alelos de risco foi observado em 52% dos indivíduos, e uma média de 26 alelos de risco foi observado em 52% dos controles (Figura 1).

Distribuição dos alelos de risco por casos e controles. Um modelo de regressão logística foi usado para determinar o risco de doença arterial coronariana pelo número de alelos de risco em comparação ao número de alelos de referência (23 alelos, em relação à mediana dos controles). Cada ponto representa o odds ratio (obtido por análise de regressão) para doença arterial coronariana.

Quando analisados em decis, o ERG mostrou que o aumento no número de alelos de risco esteve significativamente associado com DAC como mostrado pelos valores de p interdecis - 1º decil: OR = 0,612 (0,439 - 0,853), p = 0,004; 9º decil: OR = 0,957 (1,400 - 2,734), p < 0,0001 e último decil: OR = 2,472 (1,755 - 3,482), p < 0,0001) (Figura 2).

Distribuição do escore de risco genético em decis por casos e controles. Utilizou-se um modelo de regressão logística com o 5º decil para os controles como classe de referência.

Análise de regressão logística foi realizada com quartis de ERG, usando o primeiro quartil como categoria de referência. Os resultados mostraram um aumento no risco para DAC com significância estatística ao longo dos quartis (2º, 3º e 4º), com respectivos valores de ORs de IC de 1,372 (1,114 - 1,689), 1,878 (1,522 - 2,317) e 2,588 (2,090 - 3,204), respectivamente (dados não apresentados).

Um modelo preditivo multivariado para DAC, incorporando os quartis de ERG e FRTs está apresentado na Tabela 3. O quarto quartil do ERG apresenta contribuição intermediária ao fenótipo de DAC - OR = 2,727 (2,162 - 3,439), maior que dislipidemia - OR = 1,298 (1,023 - 1,646) e hipertensão - OR = 2,067 (1,744 - 2.450). A contribuição reduzida de dislipidemia no risco de DAC pode ser devido ao uso rotineiro de estatina nos pacientes com DAC. O ajuste para as variáveis de confusão (sexo, idade, frequência cardíaca, VOP, baixo nível de atividade física, IMC e história familiar de DAC) mostrou aumentos discretos no OR para os FRTs e segundo e terceiro quartis do ERG.

Análise multivariada realizada com escore de risco genético multiplicativo (ERGM) e fatores de risco tradicionais
Variáveis OR* (IC 95%) Valor de p OR+ (IC 95%) Valor de p
ERGM (Quartis) ------ ------ ------ < 0,0001
2º 1,355 (1,082 – 1,698) 0,008 1,406 (1,107 – 1,786) 0,005
3º 1,934 (1,539 – 2,429) < 0,0001 2,006 (1,575 – 2,554) < 0,0001
4º 2,727 (2,162 – 3,439) < 0,0001 2,657 (2,083 – 3,389) < 0,0001
Tabagismo 3,440 (2,887 – 4,100) < 0,0001 3,651 (3,030 – 4,401) < 0,0001
Diabetes 3,138 (2,559 – 3,847) < 0,0001 3,436 (2,763 – 4,273) < 0,0001
Hipertensão 2,067 (1,744 – 2,450) < 0,0001 2,187 (1,816 – 2,633) < 0,0001
Dislipidemia 1,298 (1,023 – 1,646) 0,032 1,344 (1,044 – 1,731) 0,022
Constante 0,186 < 0,0001

Teste de Wald (forward) (SPSS vs. 19.0); Controles: LDL > 140 mg/dL, HDL < 40 para homens e < 45 para mulheres; triglicerídeos > 150 mg/dL, APO B > 100mg/dL. Casos: LDL > 100 mg/dL; triglicerídeos > 150 mg/dL, HDL < 40 mg/dL para homens e < 45 mg/dL para mulheres; APO B > 100 mg/dL, não-HDL > 130 mg/dL.

OR: odds ratio ajustado para idade e sexo;

OR: Odds ratio ajustado para sexo, idade, frequência cardíaca, velocidade de onda de pulso, estilo de vida sedentário, índice de massa corporal, e história familiar. IC: intervalo de confiança. Significância estatística: p < 0,05.

Utilizamos o FIV para testar a multicolinearidade entre as variáveis incluídas no modelo de regressão logística ajustado pelo ERG desenvolvido no estudo. A tolerância e o FIV foram > 0,1 e < 10, respectivamente, mostrando ausência de colinearidade entre as variáveis incluídas no modelo.

Duas curvas ROC foram traçadas com base nos FRTs com e sem o ERG (Figura 3). A primeira curva ROC estimou uma AUC de 0,72, aumentada para 0,74 quando o ERG foi adicionado, revelando um melhor ajuste do modelo (p < 0,0001) (Figura 3).

Curvas ROC baseadas no modelo basal (fatores de risco tradicionais, FRTs) e após inclusão do escore de risco genético (ERG) (quartis) na predição de risco para doença arterial coronariana. As duas curvas são baseadas nos modelos de regressão logística incorporando-se fatores de risco tradicionais (diabetes, dislipidemia, tabagismo e hipertensão) com e sem o escore de risco genético. AUC: área sob a curva. O teste de DeLong usado na comparação entre as duas AUCs (p < 0,0001)

O NRI e seu valor p foram usados para avaliar melhora na capacidade preditiva ocorrida após a adição de um conjunto de biomarcadores ao modelo de predição existente. A adição dos quartis de ERG ao FRT melhorou a classificação do risco dos modelos (Tabela 4). Esse novo marcador forneceu um NRI contínuo de 31% (IC 95%: 23,8-38,3%; p < 0,0001) com reclassificação de 14,6% dos pacientes com DAC e 16,4% dos indivíduos controles (Tabela 4).

Índice de reclassificação líquida livre de categorias (category-free net reclassification index, cfNRI) após adição dos quartis do escore de risco genético
Grupo n Maior risco n (%) Menor risco n (%) p (cfNRI) cfNRI (%) cfNRI (IC 95%)
Pacientes com DAC 1566 897 (57,3%) 669 (42,7%) < 0,0001 14,6% (9,7-19,5%)
Controles sadios 1322 553 (41,8%) 769 (58,2%) < 0,0001 16,4% (11,2-21,8%)
Total 2888 --- --- < 0,0001 31% (23,8-38,3%)

DAC: doença arterial coronariana; IC: intervalo de confiança; para essa análise, utilizou-se a função “improveProb” do programa R “Hmisc”.

NRI também foi calculado usando variáveis categóricas e aplicado neste estudo caso-controle, e definido como a porcentagem de indivíduos de cada grupo que mudaram de categoria na adição de um novo marcador (escore de quartil de DAC). Mudança para uma melhor categoria (maior entre os pacientes que nos controles) foi calculada para se avaliar o potencial impacto para o uso clínico. O NRI mostrou melhor capacidade de melhorar a classificação dos indivíduos ao promover a reclassificação de 19,5% dos pacientes da categoria de risco 50-75% à categoria de maior risco (75-100%). Ainda, 14,1% dos indivíduos sadios mudaram para uma categoria de menor risco, da categoria 25-50% para a categoria de risco < 25% (Tabela 5).

Tabela de reclassificação comparando-se risco predito para doença arterial coronariana com e sem os quartis do escore de risco genético
Risco predito (sem ERG) Reclassificação do risco predito (com ERG) % aumento % redução
Pacientes com DAC (n = 1566) < 25% 25-50% 50-75% 75-100%
< 25% 6 11 0 0 0,7% 0%
25-50% 44 335 123 0 7,9% 2.8%
50-75% 0 59 471 305 19,5% 3.8%
75-100% 0 0 9 203 0% 0.6%
NRI dos pacientes com DAC 20,9%
Controles sadios (n = 1322)
< 25% 65 36 0 0 2,7% 0%
25-50% 186 504 88 0 6,7% 14.1%
50-75% 0 60 268 79 6% 4.5%
75-100% 0 0 1 35 0% 0.1%
NRI controles 3,3%
NRI total 24,2%

DAC: doença arterial coronariana; NRI: Net Reclassification Improvement (melhora na reclassificação).

Ainda, a inclusão de quartis de ERG ao FRT resultou em um IDI de 2,5% (IC 95%: 1,9-3,1%; p < 0,0001) (dados não apresentados).

 Discussão

Anos atrás, polimorfismos em vias biológicas plausíveis, importantes na aterosclerose, foram genotipados para determinar sua associação com DAC. Essa abordagem de genes candidatos revelou cerca de 30 loci de SNPs de alta confiabilidade com efeitos significativos sobre a aterosclerose.13 Contudo, seguindo-se uma abordagem tradicional de genes candidatos, foram obtidos resultados conflitantes ou com fracas associações; estudos de replicação são necessários para validação consistente desses resultados.

Em 2004, Mendonça et al. genotiparam, pela primeira vez, polimorfismos I/D da enzima conversora de angiotensina (ECA) em uma população portuguesa, relatando resultados similares àqueles descritos na literatura.14

Após o desenvolvimento de microarranjos (arrays) de alta capacidade em 2008,15 GWAS examinaram milhões de polimorfismos simultaneamente em várias subpopulações étnicas com um delineamento caso-controle. O nível de significância mínima padronizado estabelecido em 1x10-5 deu confiabilidade à genética cardiovascular e a colocou em evidência.16

Em 2007, Samani et al.,17 identificaram, pela primeira vez, loci cromossômicos fortemente associados com DAC no estudo Welcome Trust Case Control Consortium (WTCCC) (que envolveu 1926 pacientes com DAC e 2938 controles) e conduziram replicação no estudo German MI (Myocardial Infarction) Family Study.17

Nos anos seguintes, a associação de um número surpreendente de variantes genéticas com DAC foi identificada. A variante 9p21 foi a variante mais frequentemente relatada nas populações. O enorme consórcio do Wellcome Trust, juntamente com três outros grupos europeus de pesquisadores, reuniram-se no projeto CARDIOGRAM que confirmou, em uma grande amostra (> 22000 casos) de indivíduos de ascendência europeia, um aumento de 29% no risco de infarto do miocárdio por cópia da variante rs1333049 9p21 (p = 2×10-20).18

Nosso grupo de pesquisadores reproduziu essa análise da variante 9p21 na população portuguesa e encontrou uma prevalência de 35,7% do genótipo CC nos pacientes com DAC, com um OR ajustado de 1,34, p = 0,010. O OR ajustado para FRT do genótipo CC foi de 1,7 (p = 0,018) e do genótipo CG, encontrou-se um OR de 1,5 (p = 0,048). Os autores concluíram que, apesar de o mecanismo subjacente ao risco não ser conhecido, encontrou-se resultado consistente desse alelo de risco na estratificação de risco para DAC, mesmo em populações muito diferentes. A presença de genótipo CC ou CG parece, então, ser útil na predição do risco de se desenvolver DAC na população portuguesa.19

A meta-análise de GWAS para DAC mais recente identificou 46 associações significativas e 104 associações potenciais com risco aumentado para DAC.20,21

Em nosso estudo, observamos um aumento contínuo e gradual no risco de DAC com o aumento no número de alelos para risco de DAC. Indivíduos no decil mais baixo estão naturalmente protegidos, ao passo que aqueles no decil superior do ERG apresentaram um risco de 2,472 (1,755 - 3,482). Apesar de haver sobreposição na distribuição do escore de casos e controles, o ERG está significativamente associado com o risco para DAC, e pode ser utilizado na identificação de indivíduos com maior risco, em termos de estilo de vida e intervenções terapêuticas.

Nossos resultados são similares a de outros estudos em populações caucasianas em que o ERG com 13, 29 ou 109 NPs22-24 eram independentes, e promoveram um pequeno aumento no poder preditivo de FRTs observado por aumentos na AUC, mudanças no index-C ou métodos estatísticos discriminatórios mais modernos como medidas de reclassificação ou de discriminação melhorada (improved discrimination).

Relatamos um OR mais alto para o 4º quartil do ERG (2,59) comparado ao OR de 1,66 relatado por Ripatti et al.,22 no quartil mais elevado. Ao se comparar o peso relativo do ERG na análise logística multivariada, encontramos um OR um pouco mais baixo para tabagismo, hipertensão e dislipidemia. No estudo de Ripatti et al.,22 um ERG ponderado também mostrou-se um preditor independente mesmo após ajuste por idade, sexo e FRTs em uma população do norte europeu. O risco relativo do ERG baseado em 13SNPs também foi mais baixo que aquele de dislipidemia em comparação aos efeitos da hipertensão.22

Neste estudo, conseguimos aumentar o poder de definição dos FRTs. Por exemplo, adotamos uma definição ampla de dislipidemia, incluindo os níveis de Apo B conforme indicado nas diretrizes de 2016.7 Além disso, nós só consideramos como “ex-fumantes” os indivíduos com mais de 5 anos sem fumar, a fim de considerar um risco de DCV semelhante ao de um não fumante.5

Thanassoulis et al.,24 demonstraram que, ao adicionar um ERG baseado em 13 SNPs, 89 SNPs associados com fatores de risco modificáveis não aumentaram o poder do ERG - HR 1,01 (IC 95% CI 0,99 -1,03; p = 0,48). Esse fato revelou que a fraca associação de polimorfismos com fatores de risco para DAC na análise do ERG poderia estar mascarada por um efeito relativamente mais forte de outros polimorfismos. Diante da ausência de uma associação significativa dos perfis lipídicos com risco para DAC, Jansen et al. relataram em 2015 que vários SNPs associados com diabetes mellitus tipo 2 estavam relacionados com o risco para DAC.25 Recentemente, em uma análise de associação genômica ampla, Webb et al.26 identificaram 6 novos loci significativamente associados com DAC. O estudo confirmou presença de pleiotropia entre perfil lipídico, fenótipo de pressão sanguínea, índice de massa corporal, diabetes e tabagismo.26 Nosso ERG reúne SNPs relacionados a fatores de riscos e a fatores que não são de risco, corroborando interações entre genótipos e fenótipos.

Limitações do estudo

A principal utilidade clínica do ERG em nossa população observada foi uma melhora discreta na estratificação de risco. Comparado à estratificação de FRTs, o ERG parece ser uma melhor ferramenta para identificação de indivíduos em risco aumentado (maior que a média) para DAC. O número e o tipo de SNPs incluídos no estudo foram limitados e um número maior de SNPs de hits genéticos deve ser incluído em estudos futuros. No entanto, até o momento, a maior capacidade de se analisar múltiplos SNPs no ERG não foi traduzida em maior capacidade de predição de risco.

Finalmente, o presente estudo não incluiu análises gene-gene ou gene-ambiente. Tais análises aumentariam a significância estatística e, por isso, sua inclusão, bem como a de FRTs no ERG melhoraria nossa capacidade de predizer o risco individualmente e com precisão.

 Conclusões

Um ERG baseado em múltiplas variantes de risco genético associou-se com risco aumentado de DCV em uma população portuguesa. Um ERG calculado com os 31 SNPs estudados apresentou associação significativa com DAC, e 25% dos indivíduos que carregam os alelos de maior risco têm, aproximadamente, 2,5 vezes maior risco para DAC em comparação àqueles situados no quartil mais baixo. O ERG promoveu uma pequena melhora na capacidade preditiva de risco em comparação ao modelo inicial, e pode melhorar a estratificação de risco individual. Esses resultados destacam o valor potencial de se incluir a informação genética aos modelos tradicionais.

Fontes de financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Andreia Pereira pela Universidade Nova de Lisboa.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do SESARAM, EPE sob o número de protocolo 50/2012. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.

 Agradecimentos

Agradecemos à Elsa Sousa, quem realizou todos os procedimentos administrativos, e à Rita Freitas (CIDEHUS, Universidade de Évora, Portugal), quem revisou o manuscrito quanto à análise estatística.