Arq Bras CardiolabcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCBqCRcKVMqh5gMTJ4h4LNPwvS0066-782X201800060056810.5935/abc.20180088Original ArticlesHeart FailurePressure Overload-induced Cardiac Hypertrophy Varies According to Different Ligation Needle Sizes and Body Weights in MiceJiaZhen1ChenZhijun2XuHongfei1ArmahMalik Akuffu1TengPeng1LiWeidong1JianDongdong1MaLiang1NiYiming1Zhejiang UniversitySchool of MedicineThe First Affiliated HospitalZhejiangChinaDepartment of Cardio-Thoracic Surgery, The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Zhejiang - ChinaZhejiang UniversityZhoushan HospitalDepartment of Cardio-Thoracic SurgeryZhejiangChinaDepartment of Cardio-Thoracic Surgery, Zhoushan Hospital, Zhejiang - ChinaMailing Address: Yiming Ni. Department of Cardio-Thoracic Surgery, The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang 310003 - China. E-mail: 1183020@zju.edu.cn
Author contributions
Conception and design of the research: Zhen J, Yiming N; Acquisition of data: Zhen J, Chen Z, Hongfei X, Dongdong J; Analysis and interpretation of the data: Zhen J, Chen Z; Statistical analysis: Zhen J, Chen Z, Peng T; Obtaining financing: Hongfei X; Writing of the manuscript: Zhen J, Dongdong J; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Armah MA, Weidong L, Liang M.
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
0620181106568576210820172510201724112017This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.AbstractBackground:
The cardiac hypertrophy (CH) model for mice has been widely used, thereby providing an effective research foundation for CH exploration.
Objective:
To research the effects of CH modeling under abdominal aortic constriction (AAC) using different needles and weights in mice.
Methods:
Four needles with different external diameters (0.35, 0.40, 0.45, and 0.50 mm) were used for AAC. 150 male C57BL/6 mice were selected according to body weight (BW) and divided into 3 weight levels: 18 g, 22 g, and 26 g (n = 50 in each group). All weight levels were divided into 5 groups: a sham group (n = 10) and 4 AAC groups using 4 ligation intensities (n = 10 per group). After surgery, survival rates were recorded, echocardiography was performed, hearts were dissected and used for histological detection, and data were statistically analyzed, P < 0.05 was considered statistically significant.
Results:
All mice died in the following AAC groups: 18g/0.35 mm, 22 g/0.35 mm, 26 g/0.35 mm, 22 g/0.40 mm, and 26 g/0.40 mm. All mice with AAC, those ligated with a 0.50-mm needle, and those that underwent sham operation survived. Different death rates occurred in the following AAC groups: 18 g/0.40 mm, 18 g/0.45 mm, 18 g/0.50 mm, 22 g/45 mm, 22 g/0.50 mm, 26 g/0.45 mm, and 26 g/0.50 mm. The heart weight/body weight ratios (5.39 ± 0.85, 6.41 ± 0.68, 4.67 ± 0.37, 5.22 ± 0.42, 4.23 ± 0.28, 5.41 ± 0.14, and 4.02 ± 0.13) were significantly increased compared with those of the sham groups for mice with the same weight levels.
Conclusion:
A 0.45-mm needle led to more obvious CH than did 0.40-mm and 0.50-mm needles and caused extraordinary CH in 18-g mice.
KeywordsCardiomegalyBody WeightHeart FailureNeedles/utilizationRatsThe National Natural Science Foundation of China81570343This study was funded by The National Natural Science Foundation of China (number 81570343).Introduction
Cardiac hypertrophy (CH) is a compensatory pathological change that is usually induced by pressure overload (PO), neurohumoral abnormality, and the effects of cytokines. It is characterized by cardiomyocyte hypertrophy and interstitial hyperplasia, and it results in an enlarged heart and thickening of the heart walls. Clinically, CH is involved in the development of many diseases, such as valvular disease, hypertension, arterial stenosis, and primary myocardial hypertrophy. If these diseases develop at their own pace, then cardiac function (CF) will gradually decompensate, leading to heart failure (HF), which severely lowers the quality of life and increases the mortality rate. Therefore, CH is a widespread concern and has been explored at the molecular level by researchers. Due to the high genomic homology between mice and humans, an established CH model for mice has been widely used in animal experiments, thereby providing an effective research foundation for CH exploration.
Currently, PO-induced CH is a common way to establish the model. Abdominal aortic constriction (AAC) is highly recommended by researchers because of the high success rate and the ability to perform surgery without the need for thoracotomy or a ventilator. However, the modeling effects with different ligating intensities for certain body weights (BWs) have not yet been reported. Therefore, we used 3 frequently used mice BWs (18 g, 22 g, and 26 g) and 4 different needle sizes (0.35, 0.40, 0.45, and 0.50 mm) to establish the CH model for each weight level for AAC, summarized the survival rates, and evaluated the CH effects.
MethodsAnimal groups and handling
One-hundred fifty male C57BL/6 wild-type mice were obtained from the Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd (Shanghai, China). All animals were treated and cared for in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health, Washington, DC, 1996). Experimental protocols were approved by our Institutional Animal Care and Use Committee of Zhejiang University (Hangzhou, China). Mice were selected according to weights of approximately 18 g (range, 17.3-18.7 g), 22 g (range, 20.8-23.0 g), and 26 g (range, 25.1-27.0 g), and they were divided into the following 3 weight levels: 18 g (18.0 ± 0.3 g; n = 50), 22 g (22.0 ± 0.6 g; n = 50), and 26 g (26.1 ± 0.5 g; n = 50). All weight levels were divided using sortition randomization method to create a sham group (n = 10) and 4 AAC groups according to ligating intensities (0.35, 0.40, 0.45, and 0.50mm; n = 10 per group). Regarding BW, no significant differences were found among the 5 groups for each weight level (Table S1), and the preoperative BWs of mice that died and those that survived were not significant (Table S2).
Mice were anesthetized with 4% chloralhydrate (0.1ml/1g BW, intraperitoneal injection). When the mice did not respond when their toe was pinched, the limbs were fixed on the operating board in the supine position and the skin was prepared by shaving and disinfection with alcohol. Sterile gauze was placed on the right side of the abdomen and a ventrimesal incision approximately 1.5 cm was created starting from the xiphoid. The skin was fixed with a spreader and the viscera was pulled out gently with a swab and placed on the gauze. Then, the abdominal aorta was isolated using a blunt dissection technique with curved microforceps under a microscope. A 6-0 silk suture was snared and pulled back around the aorta 1mm above the superior mesenteric artery. A 2-mm blunt acupuncture needle (external diameters: 0.35 mm, 0.40 mm, 0.45 mm, and 0.50 mm; Huatuo; Suzhou Medical Appliance Factory, Suzhou, China; criterion number GB2024-1994) was then placed next to the aorta. The suture was tied snugly around the needle and the aorta. The needle was removed immediately after ligation, the viscera were replaced, the peritoneum and skin were sutured, and the mice were allowed to recover. Aortic ligation was omitted only for the sham group. After surgery, the ears were cut to differentiate the mice. Then, mice were placed in an incubator at 30°C until they woke, and they were returned to their cages. Survival status was recorded daily. To observe the physical development of mice under different conditions, BW differences before surgery and at week 8 post-surgery were calculated as the change in BW.
Echocardiography imaging
After post-surgery weeks 4 and 8, mice were weighed and anesthetized with 4% chloralhydrate and placed on a warming pad after skin preparation. Transthoracic 2-dimensional (2D) echocardiography was performed using the GE Vivid E9 Ultrasound echocardiographic system (General Electric Company, Fairfield, CT, USA) with the GE 9L probe (8-MHz linear array transducer; General Electric Company). M-mode parasternal long-axis scans of the left ventricle at the mitral chordae level were used to quantify the interventricular septum thickness at end-diastole (IVSd), interventricular septum thickness at end-systole (IVSs), left ventricular internal dimension at end-diastole (LVIDd), left ventricular internal dimension at end-systole (LVIDs), left ventricular posterior wall thickness at end-diastole (LVPWd), left ventricular posterior wall thickness at end-systole (LVPWs), ejection fraction (EF), and fractional shortening (FS). All mice were tested using the same parameters.
Heart weight, heart weight/body weight, and heart weight/tibial length
After echocardiographic analysis at 8 weeks post-surgery, mice were sacrificed by cervical dislocation and the hearts were dissected. Then, atrial and vascular tissues were snipped carefully, leaving the ventricles. The hearts were rinsed with phosphate-buffered saline (PBS), drained by gently squeezing on absorbent paper, weighed, photographed under natural light, and fixed in 4% paraformaldehyde. The tibial lengths (TLs; mean value of the bilateral tibia) were recorded. Heart weight (HW), BW, and TL were measured, and the HW/BW ratio and HW/TL ratio were calculated to evaluate the hypertrophic response to PO.
Histological examination of the heart
Extracted hearts were fixed in 4% paraformaldehyde for 24h and dehydrated. After routine histologic procedures, the hearts were embedded in paraffin and cut into 4-µm sections. Sections were stained with hematoxylin and eosin (HE) and picrosirius red (PSR). Cardiac cross-sections were captured at 20 × microscopic views from HE sections, and 5 thicknesses of the left ventricle in each view were selected in systematic sampling, and measured using Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). Then, the mean values were calculated. Cardiomyocyte morphological changes were captured at 400×microscopic views from HE sections. Interstitial and/or perivascular collagen depositions were captured at 200×microscopic views under standard lights. Collagen was stained red using PSR, thereby indicating fibrosis. At least 6 views were selected in a blinded manner, and each photograph was analyzed to reveal the ratio of red collagen to the entire tissue area using Image-Pro Plus 6.0. Then, the mean values were calculated.
Statistical Analysis
SPSS 17.0 statistical software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) was used for all statistical analyses. The Kolmogorov-Smirnov (K-S) test was used to verify the normality of the quantitative variables as appropriate. Data are presented as mean ± standard deviation (SD). One-way ANOVA and post-hoc Tukey tests were used to evaluate differences between groups. p < 0.05 was considered statistically significant.
ResultsExcessive AAC may lead to death
We monitored mice deaths after surgery according to acute heart failure (AHF) criteria. Data (Table 1) showed that all deaths occurred within 5 days, and a high incidence of death occurred during the initial 24h post-surgery.
Mice deaths after surgery
Needles (mm) for 18 g
Needles (mm) for 22 g
Needles (mm) for 26 g
0.35
0.40
0.45
0.35
0.40
0.45
0.35
0.40
0.45
0-24 h
10
4
1
10
7
1
10
8
3
24 h-3 d
0
0
0
0
2
0
0
1
2
3 d-5 d
0
0
1
0
1
2
0
1
1
There were no mice deaths in the AAC0.50-mm group or the sham group. Deaths were recorded during 3 time periods (0-24h, 24h-3d, and 3-5 d); 54 deaths occurred within 0-24h post-surgery. The total number of deaths was 65.
AAC increases cardiac dimensions and reduces cardiac function
Echocardiography was performed at the end of post-operative weeks 4 and 8. At week 4 post-surgery, data (Table 2) showed a trend of heart enlargement for mice with AAC, including thickening of the ventricular wall and an increase in chamber dilation; however, differences in EF and FS were not significant, indicating that changes in the heart structure did not have a pronounced effect on cardiac function at that time point. At week 8 post-surgery, the trend of heart enlargement continued; however, the EF and FS values for the AAC groups decreased significantly. This change in cardiac function from week 4 to week 8 was consistent with systolic function beginning to be markedly affected at week 4 after PO surgery.
Echocardiographic outcomes of 18-g, 22-g, and 26-g mice
18 g/0.40 mm(n = 6)
18 g/0.45 mm(n = 8)
18 g/0.50 mm(n = 10)
18 g/Sham(n = 10)
22 g/0.45 mm(n = 7)
22 g/0.50 mm(n = 10)
22 g/Sham(n = 10)
26 g/0.45 mm(n = 4)
26 g/0.50 mm(n = 10)
26 g/Sham(n = 10)
Week 4
IVSd
0.92 ± 0.05*
0.96 ± 0.05*
0.86 ± 0.05
0.81 ± 0.04
0.82 ± 0.06
0.83 ± 0.04
0.78 ± 0.04
0.84 ± 0.03
0.80 ± 0.04
0.80 ± 0.04
IVSs
1.12 ± 0.05
1.24 ± 0.15*
1.08 ± 0.10
1.05 ± 0.04
1.06 ± 0.07*
1.00 ± 0.04
0.98 ± 0.03
1.15 ± 0.08
1.11 ± 0.07
1.08 ± 0.08
LVIDd
3.21 ± 0.31
3.33 ± 0.26
3.00 ± 0.16
3.08 ± 0.28
3.04 ± 0.20
3.01 ± 0.17
3.00 ± 0.19
3.40 ± 0.11*
3.11 ± 0.15
2.96 ± 0.22
LVIDs
2.13 ± 0.26
2.37 ± 0.26*
2.03 ± 0.11
2.09 ± 0.21
1.92 ± 0.13
1.98 ± 0.14
2.07 ± 0.18
2.24 ± 0.18*
2.02 ± 0.13
1.93 ± 0.14
LVPWd
0.94 ± 0.04*
1.01 ± 0.08*
0.87 ± 0.04
0.81 ± 0.09
0.85 ± 0.04
0.87 ± 0.05*
0.81 ± 0.07
0.90 ± 0.06
0.89 ± 0.05
0.87 ± 0.06
LVPWs
1.13 ± 0.06
1.24 ± 0.06*
1.08 ± 0.09
1.04 ± 0.03
1.04 ± 0.04
1.00 ± 0.07
1.04 ± 0.10
1.27 ± 0.04*
1.12 ± 0.07
1.10 ± 0.05
EF %
70.7 ± 3.8
66.0 ± 3.9
67.9 ± 3.5
68.5 ± 2.6
72.1 ± 4.5
68.3 ± 3.7
70.6 ± 3.6
70.5 ± 5.4
71.2 ± 3.1
73.1 ± 4,.7
FS %
34.5 ± 2.4
31.2 ± 2.1*
34.5 ± 2.3
34.3 ± 2.4
36.9 ± 2.3
35.7 ± 3.0
36.7 ± 2.8
36.3 ± 2.6
37.5 ± 2.3
36.6 ± 3.2
Week 8
IVSd
0.93 ± 0.08*
0.97 ± 0.05*
0.88 ± 0.04
0.83 ± 0.07
0.99 ± 0.06*
0.91 ± 0.02*
0.84 ± 0.07
0.93 ± 0.08
0.91 ± 0.06
0.85 ± 0.06
IVSs
1.18 ± 0.20
1.33 ± 0.14*
1.15 ± 0.07
1.10 ± 0.10
1.26 ± 0.07*
1.16 ± 0.10*
1.04 ± 0.08
1.19 ± 0.10
1.17 ± 0.11
1.14 ± 0.07
LVIDd
3.34 ± 0.24
4.12 ± 0.34*
3.30 ± 0.41
3.14 ± 0.15
3.26 ± 0.13
3.15 ± 0.13
3.23 ± 0.15
3.50 ± 0.12*
3.29 ± 0.16
3.20 ± 0.15
LVIDs
2.13 ± 0.11
3.02 ± 0.27*
2.21 ± 0.40
1.94 ± 0.18
2.25 ± 0.11
2.11 ± 0.14
2.19 ± 0.12
2.50 ± 0.15*
2.33 ± 0.26
2.14 ± 0.15
LVPWd
0.96 ± 0.08*
1.03 ± 0.08*
0.93 ± 0.04*
0.84 ± 0.08
0.99 ± 0.05*
0.96 ± 0.04*
0.90 ± 0.06
1.02 ± 0.07*
0.96 ± 0.04*
0.90 ± 0.04
LVPWs
1.23 ± 0.08*
1.35 ± 0.13*
1.20 ± 0.07*
1.07 ± 0.07
1.22 ± 0.06*
1.14 ± 0.07
1.07 ± 0.08
1.30 ± 0.08*
1.13 ± 0.05*
1.04 ± 0.06
EF %
64.7 ± 4.6*
60.9 ± 2.4*
67.6 ± 4.7*
75.5 ± 5.5
63.3 ± 3.0*
67.7 ± 3.3*
74.2 ± 3.2
62.8 ± 2.6*
67.5 ± 5.3*
73.1 ± 2.9
FS %
33.2 ± 3.0*
29.4 ± 1.9*
35.8 ± 4.3*
41.0 ± 5.5
32.9 ± 1.6*
35.5 ± 2.4*
40.8 ± 3.1
31.0 ± 3.2*
32.7 ± 3.8*
36.9 ± 2.5
IVSd: interventricular septum thickness at end-diastole; IVSs: interventricular septum thickness at end-systole; LVIDd: left ventricular internal dimension at end-diastole; LVIDs: left ventricular internal dimension at end-systole; LVPWd: left ventricular posterior wall thickness at end-diastole; LVPWs: left ventricular posterior wall thickness at end-systole; EF: ejection fraction; FS: fractional shortening. The cardiac dimensions (inclding IVSd, IVSs, LVIDd, LVIDs, LVPWd, and LVPWs) (mm) and functional indices (inclding EF and FS) changes measured by echocardiography. Data were statistically analyzed and presented as the mean ± SD. At week 4, cardiac dimensions for the AAC groups significantly increased compared with the sham groups (*p < 0.05); at week 8 , more cardiac dimensions significantly increased, and that EF and FS values for the AAC groups all decreased significantly compared to those of the sham groups for 3 weight levels (*p < 0.05).
AAC increases HW, HW/BW, and HW/TL ratio
Generally, the increased HW, HW/BW, and HW/TL ratio are the three main indicators of CH. In our study, as shown in Table 3, we found that AAC significantly increased HW and caused a significantly higher HW/BW ratio and HW/TL ratio compared to the sham groups for all weight levels. The HW, HW/BW, and HW/TL values for the AAC0.45 mm groups were significantly higher than those for the AAC0.50 mm groups. These HW-related indices for the 18 g/0.45 mm groups were even significantly higher than those for the 18 g/0.40 mm groups.
Heart weight–related indices of 18-g, 22-g, and 26-g mice
18 g/0.40 mm(n = 6)
18 g/0.45 mm(n = 8)
18 g/0.50mm(n = 10)
18 g/Sham(n = 10)
22 g/0.45 mm(n = 7)
22 g/0.50 mm(n = 10)
22 g/Sham(n = 10)
26 g/0.45 mm(n = 4)
26 g/0.50 mm(n = 10)
26 g/Sham(n = 10)
HW
136.5 ± 22.3*
170.0 ± 21.4**
124.0 ± 9.9*
103.5 ± 7.0
137.1 ± 7.4**
115.5 ± 7.6*
104.3 ± 7.4
153.5 ± 4.8**
114.3 ± 5.1*
103.2 ± 5.6
HW/BW
5.39 ± 0.85*
6.41 ± 0.68**
4.67 ± 0.37*
3.86 ± 0.18
5.22 ± 0.42**
4.23 ± 0.28*
3.62 ± 0.26
5.41 ± 0.14**
4.02 ± 0.13*
3.59 ± 0.16
HW/TL
63.8 ± 10.3*
74.4 ± 9.3**
57.6 ± 4.6*
47.8 ± 3.6
59.6 ± 3.3**
54.2 ± 3.8*
48.3 ± 3.9
65.6 ± 1.3**
49.2 ± 2.6*
44.1 ± 2.8
HW: heart weight; BW: body weight; TL: tibial length. HW(mg), HW/BW(mg/g), and HW/TL(mg/cm) were measured and calculated from AAC and sham groups of 3 BW levels. Data are presented as the mean ± SD.
Compared to the sham group in the same BW level, the heart weight–related indices of AAC groups increased significantly (p < 0.05).
Compared to the rest groups in the same BW level, the heart weight–related indices of the AAC 0.45-mm group increased significantly (p < 0.05).
AAC leads to cardiomyocyte hypertrophy and increases collagen depositions
For mice undergoing AAC surgery, the hearts demonstrated different degrees of enlargement (Figure 1A), enlargement of the papillary muscles, and thickening of the ventricular walls (Figure 1B). Wall thickening increased significantly compared with that of the sham group (Table 4). The sham groups showed normal architecture of the cardiomyocytes compared with the AAC groups. Pathological changes including enlarged, disarrayed, and eosinophilic cardiomyocytes and cardiomyocytes rich in cytoplasm and trachychromatic and pantomorphic nuclei were observed in each of the AAC groups (Figure 1C). Scattered collagen depositions in the interstitial and perivascular spaces were observed in the sham groups. In comparison, in some AAC groups, a larger quantity and wider range of red deposits were observed in the interstitial space (Figure 1D), and thickened collagen was observed in the perivascular space, especially in the external vascular wall (Figure 1E). Statistical analysis indicated that the AAC group had a significantly greater collagen area than the sham group (Table 5). These results imply that AAC is capable of inducing PO-induced CH and fibrosis.
Cardiomyocyte hypertrophy and collagen deposition histological examination. (A) Gross hearts under natural light. (B) The 20 × microscopic views of HE sections. (C) The 400 × microscopic views of HE sections. (D) Representative 200×microscopic views under standard lights of PSR sections in the interstitial space. (E) Representative 200 × microscopic views under standard lights of PSR sections in the perivascular space. Fibrosis is presented as red in the PSR sections.
Thickness of the left ventricle (mm) based on weight and needle size
Weight
0.40 mm
0.45 mm
0.50 mm
Sham
18 g
1.81 ± 0.30*
1.86 ± 0.17*
1.59 ± 0.09*
1.27 ± 0.07
22 g
1.69 ± 0.24*
1.55 ± 0.19*
1.22 ± 0.14
26 g
1.82 ± 0.30*
1.59 ± 0.22*
1.34 ± 0.07
Data are presented as the mean ± SD (n = 5).
p < 0.05 represents a significant difference between the abdominal aortic constriction (AAC) and sham groups.
Percentage of collagen deposition in the left ventricle based on weight and needle size
Weight
0.40 mm
0.45 mm
0.50 mm
Sham
18 g
5.8 ± 2.2*
8.9 ± 1.3*
5.1 ± 1.3*
2.6 ± 1.0
22 g
5.2 ± 1.6*
4.9 ± 1.5*
2.5 ± 0.9
26 g
6.1 ± 1.0*
5.3 ± 1.8*
3.1 ± 0.8
Data are presented as the mean ± SD (n = 6).
p < 0.05 represents a significant difference between the abdominal aortic constriction (AAC) and sham groups.
AAC may restrict physical development
Analysis showed that with AAC 0.45 mm, BW significantly increased in 18-g mice compared to 22-g and 26-g mice (Table 6), indicating that the 18-g groups had higher development potential. In the 18-g mice groups, data showed that the value of 18 g/0.40 mm was significantly lower than that of the 18 g/0.45 mm and 18 g/sham groups, and that there were no significant differences between the 18 g/0.45 mm and 18 g/sham groups (Table 7), indicating that the 18 g/0.45 mm group had nearly normal physical development. Development of the 18 g/0.40 mm group was limited.
Body weight changes with AAC under 0.45 mm needle
18 g/0.45 mm (n = 8)
22 g/0.45 mm (n = 7)
26 g/0.45 mm(n = 4)
Change in BW(g)
8.4 ± 0.8*
4.4 ± 0.8
2.4 ± 0.3
BW: body weight; AAC: abdominal aortic constriction. Data are presented as the mean ± SD.
p < 0.05 represents a significant difference between the 18 g/0.45 mm group and the 22 g/0.45 mm and 26 g/0.45 mm groups.
Body weight and BW changes in 18-g mice
18 g/0.40 mm (n = 6)
18 g/0.45 mm (n = 8)
18 g/0.50 mm (n = 10)
18 g/Sham (n = 10)
BW before surgery (g)
18.1 ± 0.4
18.1 ± 0.3
18.0 ± 0.4
17.9 ± 0.4
BW at week 8 (g)
25.3 ± 0.4*
26.5 ± 0.9
26.6 ± 0.8
26.8 ± 0.9
BW change (g)
7.2 ± 0.6*
8.4 ± 0.8
8.6 ± 0.6
8.8 ± 0.9
BW: body weight. BW changes of 18-g mice before and after surgery for 8 weeks. Data are presented as the mean ± SD.
p < 0.05 represents a significant difference between the 18 g/0.40 mm group and the rest groups after surgery.
Discussion
In this study, we performed AAC according to 4 different ligating intensities for mice of 3 different weight levels to evaluate the survival rates of mice and CH induced by PO under different conditions. This is the first study showing that CH diversities exist among groups under different ligations and BW.
AAC is widely used in the modeling of CH induced by PO in mice. Needle ligation is usually used, and the efficiency of modeling is highly dependent on ligation intensity. Nevertheless, excessive constriction will lead to death,1 and our research findings (Table 1) demonstrated this point. In this study, a 0.35-mm needle caused the death of all mice in the 3 weight levels, and the 0.40-mm needle caused the death of all mice in 22-g and 26-g groups. Contrarily, all mice with AAC that underwent surgery with a 0.50-mm needle or sham operation survived. Mice in the other groups had different mortality rates. Regarding the selection of needles for the BW ranges of this study, a needle smaller than 0.35mm in diameter caused stronger constriction and death. However, a needle larger than 0.50 mm in diameter did not alternatively affect the survival rate, but it did reduce the efficiency of CH because of the reduced PO from weaker constriction. This is why we chose needles between 0.35 mm and 0.50 mm.
Death can occur after AAC. Undoubtedly, AAC increases cardiac afterloading. To cope with the additional biodynamics, the heart exerts a series of adaptive changes, including activation and hypertrophy of cardiomyocytes and hyperplasia of the extracellular matrix.2 This compensational mechanism maintains cardiac output (CO) effectively for a period of time while maintaining the survival of the organism; it is also the basis for the establishment of the CH model. However, when the sudden afterloading is out of the range of cardiomyocyte adjustment, the bloodstream will be limited and cause constriction, resulting in AHF. AHF is typically characterized by rapid changes in heart failure (HF) symptoms.3 Sato et al.4 considered the incidence of death within 5 days as an assessment criterion of AHF. AHF could moderately or markedly improve by the second day if effectively controlled. AHF leads to high ventricular pressure, and high ventricular pressure leads to high pulmonary blood pressure, thus leading to pulmonary congestion, which is one of the causes of death after AAC.5 Liao et al.6 suggested that cardiogenic pneumo-edema is the main cause of postoperative death for PO mice. Additionally, arrhythmia may occur as part of the electrophysiological changes,7 and cardiomyocyte sarcomeres may be disordered during the pathological changes.8 These are all severe threats to the survival rate after AAC. Our record of mice death times (Table 1) showed the phenomenon of all deaths occurring within 5 days. A high incidence of death occurred during the initial 24h, which is in accordance with the aforementioned AHF criteria. In addition, there is a positive correlation between CO and BW;9,10 therefore, compared with the low-weight mice, high-weight mice require more CO and will have cardiac afterloading that is more increased than that of low-weight mice with the same aortic constriction. Results of the current study (Table 1) indicate that higher-weight mice had poorer tolerance for AAC, which is reflected in their mortality rates. Regarding mice with AAC that underwent ligation with a 0.40-mm needle, all mice in the 22-g and 26-g groups died. However, 6 out of 10 mice survived in the 18-g group.
The diagnosis of CH usually depends on changes in cardiac function and morphology.11 Echocardiography can be performed in vitro noninvasively during the first assessment of CH, and it is especially used to monitor changes in cardiac function.12 We performed echocardiographic examinations of mice at the end of week 4 and week 8 post-surgery. Data (week 4 data in Table 2) showed that at the end of week 4, the phenomena of thickened ventricular walls, enlarged ventricular chambers, and decreased cardiac functions were emerging in each AAC group compared with the sham groups, and this diversity was consistent with the characteristic cardiac changes that occur with chronic pressure overload.13,14 These trends became more pronounced at the end of week 8 (week 8 data in Table 2), when EF and FS, which represent cardiac function, were significantly lower compared with the sham groups. CH also increased HW. In our study, the HW, HW/BW ratio, and HW/TL ratio for the AAC groups were significantly increased (Table 3). Cardiac remodeling is the most typical pathological change of CH, including cardiomyocyte hypertrophy and the extracellular matrix increases.15 Our histological results showed increased external diameters and ventricular thickness in gross hearts and cross-sections under AAC (Figures 1A and B). HE staining of the AAC groups displayed the hypertrophic pathology of cardiomyocytes and nuclei (Figure 1C). PSR staining of the AAC groups displayed extensive collagen depositions (Figure 1D), particularly in the perivascular space (Figure 1E). Statistical analysis showed that the thickness of the left ventricle (Table 4) and the percentage of collagen deposition (Table 5) were significantly increased in the AAC groups compared to the sham group. Regarding the formation of collagen, Kuwahara et al.16 indicated that cardiac fibroblasts are activated on day 3 after PO, and that the neoformative fibrous tissues mainly affect the diastolic function rather than the systolic function during the initial 4 weeks. Then, excessive myocardial fibrosis is implicated in systolic dysfunction because of its more intensive traction, and cardiac function begins to deteriorate significantly. Regarding EF and FS values for the AAC groups (Table 2), the downward trends from week 4 to week 8 conform to this theory.
Choosing the proper needle is critical for establishing the CH model. Based on these results, we found that all mice with AAC died when a 0.35-mm needle was used for ligation for all 3 weight levels and when a 0.40-mm needle was used for ligation for the 22-g and 26-g groups; therefore, these 5 groups of weight-needle pairings were clearly unsuitable for use. The 18g/0.40mm group had obvious CH compared with the sham group, and its survival rate was acceptable (6 out of 10). However, it should still be excluded because the 18 g/0.45 mm group showed more obvious CH and higher survival rates (8 out of 10) (Table 1, Table 3). The 0.45-mm and 0.50-mm needles are available for all 3 weight levels, but both can result in definite myocardial hypertrophy. However, the values of the HW, HW/BW ratio, and HW/TL ratio for the AAC mice when using the 0.45-mm needle were significantly higher than those when using a 0.50-mm needle for each weight level (Table 3). Therefore, for all 3 weight levels of our study, a CH model can be established using a 0.50-mm needle and the survival rate of the mice will not be threatened. However, a 0.45-mm needle leads to more effective CH model, and higher mortality than the 0.50-mm needle.
Normally, with the PO-induced CH model, thinner needles creates more severe aortic stenosis and lead to more pronounced CH, and vice versa. However, we observed an interesting phenomenon: the CH level of the 18 g/0.45 mm group was abnormally significantly higher than that of the 18 g/0.40 mm group (18-g mice in Table 3). Regarding the analysis of BW data with AAC (Table 6), the changes in BW in 18-g mice during weeks 0 to 8 were significantly higher than those for the 22-g and 26-g mice, indicating that 18-g mice have greater potential for physical development after surgery and that physical development is often accompanied by organ development.17 Therefore, the heart of 18-g mice also has greater development potential. For the same weight level, the BW change of the 18 g/0.45 mm group during weeks 0 to 8 was significantly higher than that of the 18 g/0.40 mm group (BW change in Table 7). As mentioned, BW is positively related to CO; therefore, perhaps the greater ligation limited CO in the 18 g/0.40 mm group, which also limited physical development and organ development, including development of the heart. At the end of week 8, there was no significant difference in BW for the 18g/0.45mm group and 18g/sham groups; both had significantly higher BW than the 18 g/0.40 mm group (BW at week 8 in Table 7). The 0.45-mm needle had no obvious limits in18-g mice, but the BW advantage for the 18 g/0.45 mm group compared to the 18 g/0.40 mm group depends on greater CO and requires more hypertrophic myocardium for support. So, to establish CH models for AAC in mice that have developmental potential, such as 18-g mice, there may be a special ligating intensity region that can cause more obvious CH than the two adjacent regions. However, this phenomenon must comprise multiple factors and is worth further study.
Conclusion
We established CH models using 4 ligation needle sizes and 3 weights for mice. Data showed that both of 0.45-mm and 0.50-mm needles lead to CH. However, 0.45mm needle brings more effective model and causes obvious CH in 18-g mice.
Sources of Funding
This study was funded by The National Natural Science Foundation of China (number 81570343).
Study Association
This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Zhen Jia, from Zhejiang University.
Ethics approval and consent to participate
This study was approved by the Ethics Committee of the First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University under the protocol number 2014-17. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.
Supplementary Materials
Mice body weights before surgery
Weight
0.35 mm
0.40 mm
0.45 mm
0.50 mm
Sham
18 g
18.0 ± 0.4
18.0 ± 0.3
18.1 ± 0.3
18.0 ± 0.4
17.9 ± 0.4
22 g
22.1 ± 0.4
22.0 ± 0.6
21.9 ± 0.6
22.2 ± 0.7
22.1 ± 0.6
26 g
26.0 ± 0.7
26.1 ± 0.5
26.0 ± 0.5
25.9 ± 0.3
26.3 ± 0.5
No significant differences were found among the 5 groups according to pair-wise comparisons of each weight level (p > 0.05); therefore, body weight could be considered one index for the same weight level. Data are presented as the mean ± SD (g) (n = 10). Body weights did not differ significantly from each other (p > 0.05).
Mice body weights before abdominal aortic constriction
Weight
Survival
Death
18 g
18.1 ± 0.3 (n = 24)
18.0 ± 0.3 (n = 16)
22 g
22.1 ± 0.7 (n = 17)
22.0 ± 0.5 (n = 23)
26 g
25.9 ± 0.4 (n = 14)
26.1 ± 0.6 (n = 26)
Retrospective data showed that the difference between weight at death and survival were not significant for each weight level (p > 0.05), indicating that individual weight differences for the same weight level had no influence on postoperative death. Data are presented as mean ± SD (g).
References1 Zhao CZ, Zhao XM, Yang J, Mou Y, Chen B, Wu HD, et al. Inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase improves pressure overload induced chronic cardiac remodeling. Sci Rep. 2016 Dec 23;6:39186. doi: 10.1038/srep39186.ZhaoCZZhaoXMYangJMouYChenBWuHDInhibition of farnesyl pyrophosphate synthase improves pressure overload induced chronic cardiac remodelingSci Rep231220166391863918610.1038/srep391862 Frey N, Olson EN. Cardiac hypertrophy: the good, the bad, and the ugly. Annu Rev Physiol. 2003;65:45-79. doi: 10.1146/annurev.physiol.65.092101.142243.FreyNOlsonENCardiac hypertrophy: the good, the bad, and the uglyAnnu Rev Physiol200365457910.1146/annurev.physiol.65.092101.1422433 Alla F, Zannad F, Filippatos G. Epidemiology of acute heart failure syndromes. Heart Fail Rev. 2007;12(2):91-5. doi: 10.1007/s10741-007-9009-2.AllaFZannadFFilippatosGEpidemiology of acute heart failure syndromesHeart Fail Rev2007122919510.1007/s10741-007-9009-24 Sato N, Lam CS, Teerlink JR, Greenberg BH, Tsutsui H, Oh BH, et al. Evaluating the efficacy, safety, and tolerability of serelaxin when added to standard therapy in Asian patients with acute heart failure: design and rationale of RELAX-AHF-ASIA trial. J Card Fail. 2017;23(1):63-71. doi: 10.1016/j.cardfail.2016.10.016.SatoNLamCSTeerlinkJRGreenbergBHTsutsuiHOhBHEvaluating the efficacy, safety, and tolerability of serelaxin when added to standard therapy in Asian patients with acute heart failure: design and rationale of RELAX-AHF-ASIA trialJ Card Fail2017231637110.1016/j.cardfail.2016.10.0165 Yamamoto K, Ohishi M, Katsuya T, Ito N, Ikushima M, Kaibe M, et al. Deletion of angiotensin-converting enzyme 2 accelerates pressure overload-induced cardiac dysfunction by increasing local angiotensin II. Hypertension. 2006;47(4):718-26. doi: 10.1161/01.HYP.0000205833.89478.5b.YamamotoKOhishiMKatsuyaTItoNIkushimaMKaibeMDeletion of angiotensin-converting enzyme 2 accelerates pressure overload-induced cardiac dysfunction by increasing local angiotensin IIHypertension200647471872610.1161/01.HYP.0000205833.89478.5b6 Liao Y, Bin J, Asakura M, Xuan W, Chen B, Huang Q, et al. Deficiency of type 1 cannabinoid receptors worsens acute heart failure induced by pressure overload in mice. Eur Heart J. 2012;33(24):3124-33. doi: 10.1093/eurheartj/ehr246.LiaoYBinJAsakuraMXuanWChenBHuangQDeficiency of type 1 cannabinoid receptors worsens acute heart failure induced by pressure overload in miceEur Heart J201233243124313310.1093/eurheartj/ehr2467 Martinez-Rubio A, Schwammenthal Y, Schwammenthal E, Block M, Reinhardt L, Garcia-Alberola A, et al. Patients with valvular heart disease presenting with sustained ventricular tachyarrhythmias or syncope: results of programmed ventricular stimulation and long-term follow-up. Circulation. 1997;96(2):500-8. doi: https://doi.org/10.1161/01.CIR.96.2.500.Martinez-RubioASchwammenthalYSchwammenthalEBlockMReinhardtLGarcia-AlberolaAPatients with valvular heart disease presenting with sustained ventricular tachyarrhythmias or syncope: results of programmed ventricular stimulation and long-term follow-upCirculation1997962500508https://doi.org/10.1161/01.CIR.96.2.5008 Massengill MT, Ashraf HM, Chowdhury RR, Chrzanowski SM, Kar J, Warren SA, et al. Acute heart failure with cardiomyocyte atrophy induced in adult mice by ablation of cardiac myosin light chain kinase. Cardiovasc Res. 2016;111(1):34-43. doi: 10.1093/cvr/cvw069.MassengillMTAshrafHMChowdhuryRRChrzanowskiSMKarJWarrenSAAcute heart failure with cardiomyocyte atrophy induced in adult mice by ablation of cardiac myosin light chain kinaseCardiovasc Res20161111344310.1093/cvr/cvw0699 Foppa M, Arora G, Gona P, Ashrafi A, Salton CJ, Yeon SB, et al. Right ventricular volumes and systolic function by cardiac magnetic resonance and the impact of sex, age, and obesity in a longitudinally followed cohort free of pulmonary and cardiovascular disease: the Framingham Heart Study. Circ Cardiovasc Imaging. 2016;9(3):e003810. doi: 10.1161/CIRCIMAGING.115.003810.FoppaMAroraGGonaPAshrafiASaltonCJYeonSBRight ventricular volumes and systolic function by cardiac magnetic resonance and the impact of sex, age, and obesity in a longitudinally followed cohort free of pulmonary and cardiovascular disease: the Framingham Heart StudyCirc Cardiovasc Imaging201693e00381010.1161/CIRCIMAGING.115.00381010 Karimian S, Stein J, Bauer B, Teupe C. Impact of severe obesity and weight loss on systolic left ventricular function and morphology: assessment by 2-dimensional speckle-tracking echocardiography. J Obes. 2016;2016:2732613. doi: 10.1155/2016/2732613.KarimianSSteinJBauerBTeupeCImpact of severe obesity and weight loss on systolic left ventricular function and morphology: assessment by 2-dimensional speckle-tracking echocardiographyJ Obes201620162732613273261310.1155/2016/273261311 Elliott P, McKenna WJ. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 2004;363(9424):1881-91. doi: 10.1016/S0140-6736(04)16358-7.ElliottPMcKennaWJHypertrophic cardiomyopathyLancet200436394241881189110.1016/S0140-6736(04)16358-712 Zhao B, Wang S, Chen J, Ji Y, Wang J, Tian X, et al. Echocardiographic characterization of hypertrophic cardiomyopathy in Chinese patients with myosin-binding protein C3 mutations. Exp Ther Med. 2017;13(3):995-1002. doi: 10.3892/etm.2017.4089.ZhaoBWangSChenJJiYWangJTianXEchocardiographic characterization of hypertrophic cardiomyopathy in Chinese patients with myosin-binding protein C3 mutationsExp Ther Med2017133995100210.3892/etm.2017.408913 Hunter JJ, Chien KR. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. N Engl J Med. 1999;341(17):1276-83. doi: 10.1056/NEJM199910213411706.HunterJJChienKRSignaling pathways for cardiac hypertrophy and failureN Engl J Med1999341171276128310.1056/NEJM19991021341170614 Huang CK, Chen BY, Guo A, Chen R, Zhu YQ, Kutschke W, et al. Sildenafil ameliorates left ventricular T-tubule remodeling in a pressure overload-induced murine heart failure model. Acta Pharmacol Sin. 2016;37(4):473-82. doi: 10.1038/aps.2016.13.HuangCKChenBYGuoAChenRZhuYQKutschkeWSildenafil ameliorates left ventricular T-tubule remodeling in a pressure overload-induced murine heart failure modelActa Pharmacol Sin201637447348210.1038/aps.2016.1315 Tsotetsi OJ, Woodiwiss AJ, Netjhardt M, Qubu D, Brooksbank R, Norton GR. Attenuation of cardiac failure, dilatation, damage, and detrimental interstitial remodeling without regression of hypertrophy in hypertensive rats. Hypertension. 2001;38(4):846-51. doi: https://doi.org/10.1161/hy1001.092649.TsotetsiOJWoodiwissAJNetjhardtMQubuDBrooksbankRNortonGRAttenuation of cardiac failure, dilatation, damage, and detrimental interstitial remodeling without regression of hypertrophy in hypertensive ratsHypertension2001384846851https://doi.org/10.1161/hy1001.09264916 Kuwahara F, Kai H, Tokuda K, Kai M, Takeshita A, Egashira K, et al. Transforming growth factor-beta function blocking prevents myocardial fibrosis and diastolic dysfunction in pressure-overloaded rats. Circulation. 2002;106(1):130-5. doi: https://doi.org/10.1161/01.CIR.0000020689.12472.E0.KuwaharaFKaiHTokudaKKaiMTakeshitaAEgashiraKTransforming growth factor-beta function blocking prevents myocardial fibrosis and diastolic dysfunction in pressure-overloaded ratsCirculation20021061130135https://doi.org/10.1161/01.CIR.0000020689.12472.E017 Minior VK, Levine B, Ferber A, Guller S, Divon MY. Nucleated red blood cells as a marker of acute and chronic fetal hypoxia in a rat model. Rambam Maimonides Med J. 2017;8(2). doi: 10.5041/RMMJ.10302.MiniorVKLevineBFerberAGullerSDivonMYNucleated red blood cells as a marker of acute and chronic fetal hypoxia in a rat modelRambam Maimonides Med J20178210.5041/RMMJ.10302Artigos OriginaisInsuficiência CardíacaA Hipertrofia Cardíaca Induzida por Sobrecarga de Pressão Varia de Acordo com os Diferentes Tamanhos de Agulhas para Ligadura e os Pesos Corporais em RatosJiaZhen1ChenZhijun2XuHongfei1ArmahMalik Akuffu1TengPeng1LiWeidong1JianDongdong1MaLiang1NiYiming1Department of Cardio-Thoracic Surgery, The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Zhejiang - ChinaDepartment of Cardio-Thoracic Surgery, Zhoushan Hospital, Zhejiang - ChinaCorrespondência: Yiming Ni. Department of Cardio-Thoracic Surgery, The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang 310003 - China. E-mail: 1183020@zju.edu.cn
Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa: Zhen J, Yiming N; Obtenção de dados: Zhen J, Chen Z, Hongfei X, Dongdong J; Análise e interpretação dos dados: Zhen J, Chen Z; Análise estatística: Zhen J, Chen Z, Peng T; Obtenção de financiamento: Hongfei X; Redação do manuscrito: Zhen J, Dongdong J; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Armah MA, Weidong L, Liang M.
Potencial conflito de interesses
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
ResumoFundamentos:
O modelo de hipertrofia cardíaca (HC) para ratos foi amplamente utilizado, proporcionando assim uma base de pesquisa efetiva para a exploração de HC.
Objetivo:
pesquisar os efeitos do modelamento de HC sob constrição da aorta abdominal (CAA) usando diferentes agulhas e pesos em ratos.
Métodos:
foram utilizadas quatro agulhas com diâmetros externos diferentes (0,35, 0,40, 0,45 e 0,50 mm) para CAA. Foram selecionados 150 ratos C57BL / 6 machos de acordo com o peso corporal (PC) e divididos em 3 níveis de peso: 18 g, 22 g e 26g (n = 50 em cada grupo). Todos os níveis de peso foram divididos em 5 grupos: um grupo sham (n = 10) e 4 grupos CAA usando 4 intensidades de ligadura (n = 10 por grupo). Após a cirurgia, foram registradas as taxas de sobrevivência, foi realizada ecocardiografia, os corações foram dissecados e utilizados para detecção histológica, e os dados foram analisados estatisticamente, p < 0,05 foi considerado estatisticamente significante.
Resultados:
Todos os ratos morreram nos seguintes grupos de CAA: 18 g/0,35 mm, 22 g/0,35 mm, 26 g/0,35 mm, 22 g/0,40 mm e 26 g/0,40 mm. Todos os ratos com CAA, aqueles ligados com uma agulha de 0,50 mm, e aqueles que sofreram operação sham sobreviveram. Ocorreram diferentes taxas de mortalidade nos seguintes grupos de CAA: 18 g/0,40 mm, 18 g/0,45 mm, 18 g/0,50 mm, 22 g/45 mm, 22 g/0,50 mm, 26 g/0,45 mm e 26 g/0,50 mm. As proporções de peso do coração/peso corporal (5,39 ± 0,85, 6,41 ± 0,68, 4,67 ± 0,37, 5,22 ± 0,42, 4,23 ± 0,28, 5,41 ± 0,14 e 4,02 ± 0,13) aumentaram significativamente em comparação com os grupos sham para ratos com os mesmos níveis de peso.
Conclusão:
uma agulha de 0,45mm levou a HC mais óbvia do que as agulhas de 0,40 mm e 0,50mm e causou HC extraordinária em ratos de 18 g.
Palavras-chaveCardiomegaliaPeso CorporalInsuficiência CardíacaAgulhas/utilizaçãoRatosThe National Natural Science Foundation of China81570343O presente estudo foi financiado pelo The National Natural Science Foundation of China (número 81570343).Introdução
A hipertrofia cardíaca (HC) é uma alteração patológica compensatória que geralmente é induzida por sobrecarga de pressão (SP), anormalidade neurohumoral e os efeitos das citocinas. Caracteriza-se por hipertrofia de cardiomiócitos e hiperplasia intersticial, e resulta em um coração aumentado e espessamento das paredes do coração. Clinicamente, a HC está envolvida no desenvolvimento de muitas doenças, como doença valvular, hipertensão, estenose arterial e hipertrofia miocárdica primária. Se essas doenças se desenvolvem em seu próprio ritmo, a função cardíaca (FC) irá gradualmente se descompensar, levando à insuficiência cardíaca (HF), que reduz a qualidade de vida e aumenta a taxa de mortalidade. Portanto, a HC é uma preocupação generalizada e tem sido explorada no nível molecular pelos pesquisadores. Devido à alta homologia genômica entre ratos e seres humanos, um modelo de HC estabelecido para ratos tem sido amplamente utilizado em experiências com animais, proporcionando assim uma base de pesquisa efetiva para a exploração de HC.
Atualmente, a HC induzida por SP é uma maneira comum de estabelecer o modelo. A constrição da aorta abdominal (CAA) é altamente recomendada pelos pesquisadores devido à alta taxa de sucesso e à capacidade de realizar cirurgia sem necessidade de toracotomia ou ventilação. No entanto, os efeitos de modelagem com diferentes intensidades de ligadura para certos pesos corporais (PCs) ainda não foram relatados. Portanto, utilizamos 3 ratos PC usados com frequência (18 g, 22 g e 26 g) e 4 diferentes tamanhos de agulha (0,35, 0,40, 0,45 e 0,50 mm) para estabelecer o modelo de HC para cada nível de peso para CAA, resumir as taxas de sobrevivência, e avaliar os efeitos da HC.
MétodosGrupos de animais e manipulação
Cento e cinquenta ratos machos de tipo selvagem C57BL/6 foram obtidos do Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd (Xangai, China). Todos os animais foram tratados e atendidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Institutes of Health, Washington, DC, 1996). Os protocolos experimentais foram aprovados pelo nosso Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal da Universidade de Zhejiang (Hangzhou, China). Os ratos foram selecionados de acordo com pesos de aproximadamente 18 g (intervalo 17,3-18,7 g), 22 g (intervalo, 20,8-23,0 g) e 26 g (intervalo, 25,1-27,0 g) e foram divididos nos seguintes três níveis de peso: 18g (18,0 ± 0,3 g; n = 50), 22 g (22,0 ± 0,6 g; n = 50) e 26 g (26,1 ± 0,5 g; n = 50). Todos os níveis de peso foram divididos usando um método de randomização para criar um grupo sham (n = 10) e 4 grupos de CAA de acordo com as intensidades de ligadura (0,35, 0,40, 0,45 e 0,50mm; n = 10 por grupo). Em relação ao PC, não foram encontradas diferenças significativas entre os 5 grupos para cada nível de peso (Tabela S1) e os PC pré-operatórios de ratos que morreram e dos que sobreviveram não foram significativos (Tabela S2).
Os ratos foram anestesiados com 4% de hidrato de cloral (0,1 ml / 1 g de PC, injeção intraperitoneal). Quando os ratos não responderam quando o dedo do pé foi comprimido, os membros foram fixados na placa de operação na posição supina e a pele foi preparada barbeando e desinfestando com álcool. Uma gaze estéril foi colocada no lado direito do abdômen e uma incisão medioventral foi criada cerca de 1,5 cm a partir do xifoide. A pele foi fixada com um espalhador e as vísceras foram puxadas suavemente com um cotonete e colocadas na gaze. Em seguida, a aorta abdominal foi isolada usando uma técnica de dissecção sem corte com microforceps curvados no microscópio. Uma sutura de seda de 6-0 foi enrolada e puxada para trás em torno da aorta 1 mm acima da artéria mesentérica superior. Uma agulha de acupuntura blunt de 2 mm (diâmetros externos: 0,35 mm, 0,40 mm, 0,45 mm e 0,50 mm; Huatuo; Suzhou Medical Appliance Factory, Suzhou, China; critério número GB2024-1994) foi então colocada ao lado da aorta. A sutura estava amarrada confortavelmente ao redor da agulha e da aorta. A agulha foi removida imediatamente após a ligadura, as vísceras foram substituídas, o peritoneu e a pele foram suturados, e os ratos foram colocados para se recuperar. A ligadura aórtica foi omitida apenas para o grupo sham. Após a cirurgia, as orelhas foram cortadas para diferenciar os ratos. Em seguida, os ratos foram colocados em uma incubadora a 30°C até que eles acordaram e foram devolvidos às suas gaiolas. O estado de sobrevivência foi registrado diariamente. Para observar o desenvolvimento físico de ratos sob diferentes condições, as diferenças de PC antes da cirurgia e na semana 8 pós-cirurgia foram calculadas como a mudança no PC.
Imagem ecocardiográfica
Após as semanas pós-operatório 4 e 8, os ratos foram pesados e anestesiados com 4% de hidrato de cloral e colocados em uma almofada de aquecimento após a preparação da pele. O ecocardiograma bidimensional transtorácico (2D) foi realizado utilizando o sistema ecocardiográfico ultra-som GE Vivid E9 (General Electric Company, Fairfield, CT, EUA) com a sonda GE 9L (transdutor de matriz linear de 8 MHz, General Electric Company). As varreduras do eixo longo paraesternal do modo M do ventrículo esquerdo no nível das cordas mitrais foram utilizadas para quantificar a espessura do septo interventricular no final da diástole (ESId), espessura do septo interventricular no final da sístole (ESIs), dimensão interna do ventrículo esquerdo no final da diástole (DIVEd), dimensão interna do ventrículo esquerdo no final da sístole (DIVEs), espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo no final da diástole (EPPVEd), espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo no final da sístole (EPPVEs), fração de ejeção (FE) e encurtamento fraccionário (EF). Todos os ratos foram testados usando os mesmos parâmetros.
Peso cardíaco, peso cardíaco/peso corporal e peso cardíaco/comprimento tibial
Após a análise ecocardiográfica às 8 semanas após a cirurgia, os ratos foram sacrificados por deslocação cervical e os corações foram dissecados. Então, os tecidos auriculares e vasculares foram cortados cuidadosamente, deixando os ventrículos. Os corações foram enxaguados com solução salina tamponada com fosfato (SSTF), drenados apertando suavemente sobre papel absorvente, pesados, fotografados sob luz natural e fixados em paraformaldeído a 4%. Os comprimentos tibiais (CTs, valor médio da tíbia bilateral) foram registrados. O peso cardíaco (PCo), PC e CT foram medidos e a relação PCo/PC e a relação PCo/CT foram calculadas para avaliar a resposta hipertrófica à SP.
Exame histológico do coração
Corações extraídos foram fixados em paraformaldeído a 4% por 24h e desidratados. Após os procedimentos histológicos de rotina, os corações foram incorporados em parafina e cortados em seções de 4 µ-m. As seções foram coradas com hematoxilina e eosina (HE) e picrosirius Red (PSR). As seções transversais cardíacas foram adquiridas em vistas microscópicas 20x a partir de seções HE e 5 espessuras do ventrículo esquerdo em cada visão foram selecionadas em amostragem sistemática e medidas usando Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, EUA). Então, os valores médios foram calculados. As mudanças morfológicas dos cardiomiócitos foram adquiridas em vistas microscópicas 400 × a partir de seções HE. Os depósitos intersticiais e/ou perivasculares de colágeno foram capturados em vistas microscópicas 200 x sob luzes padrão. O colágeno foi corado com PSR, indicando fibrose. Pelo menos 6 visualizações foram selecionadas de forma cega, e cada fotografia foi analisada para revelar a proporção de colágeno vermelho para toda a área de tecido usando o Image-Pro Plus 6.0. Então, os valores médios foram calculados.
Análise estatística
O software estatístico SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) foi utilizado para todas as análises estatísticas. O teste de Kolmogorov-Smirnov (K-S) foi utilizado para verificar a normalidade das variáveis quantitativas conforme apropriado. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). A ANOVA unidirecional e os testes pós-hoc Tukey foram utilizados para avaliar as diferenças entre os grupos. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significante.
ResultadosCAA excessivo pode levar à morte
Monitoramos as mortes de ratos após a cirurgia de acordo com critérios de insuficiência cardíaca aguda (ICA). Os dados (Tabela 1) mostraram que todos os óbitos ocorreram dentro de 5 dias, e uma alta incidência de óbito ocorreu durante o período inicial de 24 h pós-cirurgia.
Mortes de ratos após a cirurgia
Agulhas (mm) para 18 g
Agulhas (mm) para 22 g
Agulhas (mm) para 26 g
0,35
0,40
0,45
0,35
0,40
0,45
0,35
0,40
0,45
0-24 h
10
4
1
10
7
1
10
8
3
24 h-3 d
0
0
0
0
2
0
0
1
2
3 d-5 d
0
0
1
0
1
2
0
1
1
Não houve mortes de ratos no grupo CAA 0.50-mm ou no grupo sham. As mortes foram registradas durante 3 períodos (0-24h, 24h-3d e 3-5 d); 54 mortes ocorreram dentro de 0-24h após a cirurgia. O número total de óbitos foi de 65.
CAA aumenta as dimensões cardíacas e reduz a função cardíaca
A ecocardiografia foi realizada no final das semanas pós-operatórias 4 e 8. Na semana 4 pós-operatório, os dados (Tabela 2) mostraram uma tendência de aumento do coração para ratos com CAA, incluindo espessamento da parede ventricular e um aumento na dilatação da câmara; no entanto, as diferenças em FE e EF não foram significativas, indicando que mudanças na estrutura do coração não tiveram um efeito pronunciado na função cardíaca nesse momento. Na semana 8 pós-cirurgia, a tendência do aumento do coração continuou; no entanto, os valores FE e EF para os grupos CAA diminuíram significativamente. Essa alteração na função cardíaca da semana 4 à semana 8 foi consistente com a função sistólica, começando a ser marcadamente afetada na semana 4 após a cirurgia de SP.
Resultados ecocardiográficos de ratos de 18 g, 22 g e 26 g
18 g/0,40 mm(n = 6)
18 g/0,45 mm(n = 8)
18 g/0,50 mm(n = 10)
18 g/Sham(n = 10)
22 g/0,45 mm(n = 7)
22 g/0,50 mm(n = 10)
22 g/Sham (n=10)
26 g/0,45 mm(n = 4)
26 g/0,50 mm(n = 10)
26 g/Sham(n = 10)
Semana 4
ESId
0,92 ± 0,05*
0,96 ± 0,05*
0,86 ± 0,05
0,81 ± 0,04
0,82 ± 0,06
0,83 ± 0,04
0,78 ± 0,04
0,84 ± 0,03
0,80 ± 0,04
0,80 ± 0,04
ESIs
1,12 ± 0,05
1,24 ± 0,15*
1,08 ± 0,10
1,05 ± 0,04
1,06 ± 0,07*
1,00 ± 0,04
0,98 ± 0,03
1,15 ± 0,08
1,11 ± 0,07
1,08 ± 0,08
DIVEd
3,21 ± 0,31
3,33 ± 0,26
3,00 ± 0,16
3,08 ± 0,28
3,04 ± 0,20
3,01 ± 0,17
3,00 ± 0,19
3,40 ± 0,11*
3,11 ± 0,15
2,96 ± 0,22
DIVEs
2,13 ± 0,26
2,37 ± 0,26*
2,03 ± 0,11
2,09 ± 0,21
1,92 ± 0,13
1,98 ± 0,14
2,07 ± 0,18
2,24 ± 0,18*
2,02 ± 0,13
1,93 ± 0,14
EPPVEd
0,94 ± 0,04*
1,01 ± 0,08*
0,87 ± 0,04
0,81 ± 0,09
0,85 ± 0,04
0,87 ± 0,05*
0,81 ± 0,07
0,90 ± 0,06
0,89 ± 0,05
0,87 ± 0,06
EPPVEs
1,13 ± 0,06
1,24 ± 0,06*
1,08 ± 0,09
1,04 ± 0,03
1,04 ± 0,04
1,00 ± 0,07
1,04 ± 0,10
1,27 ± 0,04*
1,12 ± 0,07
1,10 ± 0,05
FE %
70,7 ± 3,8
66,0 ± 3,9
67,9 ± 3,5
68,5 ± 2,6
72,1 ± 4,5
68,3 ± 3,7
70,6 ± 3,6
70,5 ± 5,4
71,2 ± 3,1
73,1 ± 4,,7
EF %
34,5 ± 2,4
31,2 ± 2,1*
34,5 ± 2,3
34,3 ± 2,4
36,9 ± 2,3
35,7 ± 3,0
36,7 ± 2,8
36,3 ± 2,6
37,5 ± 2,3
36,6 ± 3,2
Semana 8
ESId
0,93 ± 0,08*
0,97 ± 0,05*
0,88 ± 0,04
0,83 ± 0,07
0,99 ± 0,06*
0,91 ± 0,02*
0,84 ± 0,07
0,93 ± 0,08
0,91 ± 0,06
0,85 ± 0,06
ESIs
1,18 ± 0,20
1,33 ± 0,14*
1,15 ± 0,07
1,10 ± 0,10
1,26 ± 0,07*
1,16 ± 0,10*
1,04 ± 0,08
1,19 ± 0,10
1,17 ± 0,11
1,14 ± 0,07
DIVEd
3,34 ± 0,24
4,12 ± 0,34*
3,30 ± 0,41
3,14 ± 0,15
3,26 ± 0,13
3,15 ± 0,13
3,23 ± 0,15
3,50 ± 0,12*
3,29 ± 0,16
3,20 ± 0,15
DIVEs
2,13 ± 0,11
3,02 ± 0,27*
2,21 ± 0,40
1,94 ± 0,18
2,25 ± 0,11
2,11 ± 0,14
2,19 ± 0,12
2,50 ± 0,15*
2,33 ± 0,26
2,14 ± 0,15
EPPVEd
0,96 ± 0,08*
1,03 ± 0,08*
0,93 ± 0,04*
0,84 ± 0,08
0,99 ± 0,05*
0,96 ± 0,04*
0,90 ± 0,06
1,02 ± 0,07*
0,96 ± 0,04*
0,90 ± 0,04
EPPVEs
1,23 ± 0,08*
1,35 ± 0,13*
1,20 ± 0,07*
1,07 ± 0,07
1,22 ± 0,06*
1,14 ± 0,07
1,07 ± 0,08
1,30 ± 0,08*
1,13 ± 0,05*
1,04 ± 0,06
FE %
64,7 ± 4,6*
60,9 ± 2,4*
67,6 ± 4,7*
75,5 ± 5,5
63,3 ± 3,0*
67,7 ± 3,3*
74,2 ± 3,2
62,8 ± 2,6*
67,5 ± 5,3*
73,1 ± 2,9
EF %
33,2 ± 3,0*
29,4 ± 1,9*
35,8 ± 4,3*
41,0 ± 5,5
32,9 ± 1,6*
35,5 ± 2,4*
40,8 ± 3,1
31,0 ± 3,2*
32,7 ± 3,8*
36,9 ± 2,5
ESId: espessura do septo interventricular no final da diástole; ESIs: espessura do septo interventricular no final da sístole; DIVEd: dimensão interna do ventrículo esquerdo no final da diástole; DIVEs: dimensão interna do ventrículo esquerdo no final da sístole; EPPVEd: espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo no final da diástole; EPPVEs: espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo no final da sístole; FE, fração de ejeção; EF, encurtamento fracionário. As dimensões cardíacas (incluindo ESId, ESIs, DIVEd, DIVEs, EPPVEd e EPPVEs) (mm) e os índices funcionais (incluindo FE e EF) modificaram-se por meio de ecocardiografia. Os dados foram analisados estatisticamente e apresentados como a média ± DP. Na semana 4, as dimensões cardíacas para os grupos CAA aumentaram significativamente em comparação com os grupos shams (*p < 0,05); na semana 8, mais dimensões cardíacas aumentaram significativamente, e os valores de FE e EF para os grupos CAA diminuíram significativamente comparativamente aos dos grupos shams para 3 níveis de peso (* p < 0,05).
CAA aumenta o PCo, e as relações PCo/PC e PCo/CT
Geralmente, o aumento do PCo, e das relações PCo/PC e PCo/CT são os três principais indicadores de HC. Em nosso estudo, como é mostrado na Tabela 3, descobrimos que o CAA aumentou significativamente o PCo e causou uma relação PCo/PC e PCo/CT significativamente maior em comparação com os grupos shams para todos os níveis de peso. Os valores PCo, PCo/PC e PCo/CT para os grupos CAA 0,45 mm foram significativamente maiores que os dos grupos CAA 0,50 mm. Estes índices relacionados ao PCo para os grupos de 18 g/0,45 mm foram significativamente maiores mesmo que os dos grupos de 18 g/0,40 mm.
Índices relacionados ao peso cardíaco de ratos de 18 g, 22 g e 26 g
18 g/0,40 mm(n = 6)
18 g/0,45 mm(n = 8)
18 g/0,50 mm(n = 10)
18 g/Sham(n = 10)
22 g/0,45 mm(n = 7)
22 g/0,50 mm(n = 10)
22 g/Sham(n = 10)
26 g/0,45 mm(n = 4)
26 g/0,50 mm(n = 10)
26 g/Sham(n = 10)
PCo
136,5 ± 22,3*
170,0 ± 21,4**
124,0 ± 9,9*
103,5 ± 7,0
137,1 ± 7,4**
115,5 ± 7,6*
104,3 ± 7,4
153,5 ± 4,8**
114,3 ± 5,1*
103,2 ± 5,6
PCo/PC
5,39 ± 0,85*
6,41 ± 0,68**
4,67 ± 0,37*
3,86 ± 0,18
5,22 ± 0,42**
4,23 ± 0,28*
3,62 ± 0,26
5,41 ± 0,14**
4,02 ± 0,13*
3,59 ± 0,16
PCo/CT
63,8 ± 10,3*
74,4 ± 9,3**
57,6 ± 4,6*
47,8 ± 3,6
59,6 ± 3,3**
54,2 ± 3,8*
48,3 ± 3,9
65,6 ± 1,3**
49,2 ± 2,6*
44,1 ± 2,8
PCo: peso do coração; PC: peso corporal; CT: comprimento tibial. PCo (mg), PCo/PC (mg/g) e PCo/CT (mg/cm) foram medidos e calculados a partir de CAA e grupos shams de 3 níveis de PC. Os dados são apresentados como a média ± DP.
Comparados com o grupo sham no mesmo nível PC, os índices relacionados ao peso cardíaco dos grupos CAA aumentaram significativamente (p < 0,05).
Comparados com os grupos restantes no mesmo nível de PC, os índices relacionados ao peso do coração do grupo CAA 0.45-mm aumentaram significativamente (p < 0,05).
CAA leva à hipertrofia dos cardiomiócitos e aumenta os depósitos de colágeno
Para os ratos submetidos à cirurgia CAA, os corações demonstraram diferentes graus de aumento (Figura1A), aumento dos músculos papilares e espessamento das paredes ventriculares (Figura 1B). O espessamento da parede aumentou significativamente em comparação com o do grupo sham (Tabela 4). Os grupos shams apresentaram arquitetura normal dos cardiomiócitos em comparação com os grupos CAA. Foram observadas mudanças patológicas, incluindo cardiomiócitos e cardiomiócitos aumentados, desordenados e eosinofílicos, ricos em citoplasma e núcleos traquicromaticos e pantomórficos em cada um dos grupos CAA (Figura1C). Depósitos dispersos de colágeno nos espaços intersticial e perivasculares foram observados nos grupos shams. Em comparação, em alguns grupos CAA, uma maior quantidade e uma maior amplitude de depósitos vermelhos foram observados no espaço intersticial (Figura 1D) e observou-se colágeno espessado no espaço perivascular, especialmente na parede vascular externa (Figura1E). A análise estatística indicou que o grupo CAA apresentou uma área de colágeno significativamente maior do que o grupo sham (Tabela 5). Estes resultados implicam que CAA é capaz de induzir HC induzida por SP e fibrose.
Espessura do ventrículo esquerdo (mm) com base no peso e tamanho da agulha
Peso
0,40 mm
0,45 mm
0,50 mm
Sham
18 g
1,81 ± 0,30*
1,86 ± 0,17*
1,59 ± 0,09*
1,27 ± 0,07
22 g
1,69 ± 0,24*
1,55 ± 0,19*
1,22 ± 0,14
26 g
1,82 ± 0,30*
1,59 ± 0,22*
1,34 ± 0,07
Os dados são apresentados como a média ± DP (n = 5).
P < 0,05 representa uma diferença significativa entre a constrição da aorta abdominal (CAA) e os grupos shams.
Percentagem do depósito de colágeno no ventrículo esquerdo com base no peso e tamanho da agulha
Peso
0,40 mm
0,45 mm
0,50 mm
Sham
18 g
5,8 ± 2,2*
8,9 ± 1,3*
5,1 ± 1,3*
2,6 ± 1,0
22 g
5,2 ± 1,6*
4,9 ± 1,5*
2,5 ± 0,9
26 g
6,1 ± 1,0*
5,3 ± 1,8*
3,1 ± 0,8
Os dados são apresentados como a média ± DP (n = 6).
p < 0,05 representa uma diferença significativa entre a constrição da aorta abdominal (CAA) e os grupos shams.
Hipertrofia de cardiomiócitos e depósitos de colágeno no exame histológico. (A) Corpos grossos sob luz natural. (B) Vistas 20 x microscópicas das seções HE. (C) Vistas microscópicas de 400 × das seções HE. (D) Exibições microscópicas representativas de 200 × sob luzes padrão de seções PSR no espaço intersticial. (E) Exibições microscópicas representativas de 200 × sob luzes padrão de seções PSR no espaço perivascular. A fibrose é apresentada como vermelha nas seções do PSR.
CAA pode restringir o desenvolvimento físico
A análise mostrou que com CAA 0.45mm, o PC aumentou significativamente em ratos de 18 g em relação aos ratos de 22 g e 26 g (Tabela 6), indicando que os grupos de 18 g tinham maior potencial de desenvolvimento. Nos grupos de ratos de 18 g, os dados mostraram que o valor de 18 g/0,40 mm foi significativamente menor que o dos grupos 18 g/0,45 mm e 18 g/sham, e que não houve diferenças significativas entre os 18 g/0,45 mm e 18 g/grupos sham (Tabela 7), indicando que o grupo 18 g/0,45 mm teve desenvolvimento físico quase normal. O desenvolvimento do grupo 18 g/0,40 mm foi limitado.
Mudanças de peso corporal com CAA sob agulha de 0,45 mm
18 g/0,45 mm (n = 8)
22 g/0,45 mm (n = 7)
26 g/0,45 mm (n = 4)
Mudança no PC (g)
8,4 ± 0,8*
4,4 ± 0,8
2,4 ± 0,3
PC: peso corporal; CAA: constrição da aorta abdominal. Os dados são apresentados como média ± DP.
P < 0,05 representa uma diferença significativa entre os grupos 18 g/0,45 mm e 22 g/0,45 mm e 26 g/0,45 mm.
Peso corporal e mudanças no PC em ratos de 18 g
18 g/0,40 mm (n = 6)
18 g/0,45 mm (n = 8)
18 g/0,50 mm (n = 10)
18 g/Sham (n = 10)
PC antes da cirurgia (g)
18,1 ± 0,4
18,1 ± 0,3
18,0 ± 0,4
17,9 ± 0,4
PC na semana 8 (g)
25,3 ± 0,4*
26,5 ± 0,9
26,6 ± 0,8
26,8 ± 0,9
Mudança PC (g)
7,2 ± 0,6*
8,4 ± 0,8
8,6 ± 0,6
8,8 ± 0,9
PC: peso corporal. Mudanças no PC de ratos de 18 g antes e após a cirurgia para 8 semanas. Os dados são apresentados como a média ± DP.
P < 0,05 representa uma diferença significativa entre o grupo 18 g/0,40 mm e os grupos restantes após a cirurgia.
Discussão
Neste estudo, realizamos CAA de acordo com 4 intensidades de ligadura diferentes para ratos de 3 diferentes níveis de peso para avaliar as taxas de sobrevivência de ratos com HC induzida por SP sob diferentes condições. Este é o primeiro estudo que mostra que existem diversidades de HC existem entre grupos sob ligaduras e PC diferentes.
CAA é amplamente utilizada na modelagem de HC induzida por SP em ratos. A ligadura da agulha é usualmente utilizada e a eficiência da modelagem é altamente dependente da intensidade da ligadura. No entanto, a constrição excessiva levará à morte,1 e os achados da nossa pesquisa (Tabela 1) demonstraram esse ponto. Neste estudo, uma agulha de 0,35 mm causou a morte de todos os ratos nos três níveis de peso e a agulha de 0,40 mm causou a morte de todos os ratos nos grupos de 22 g e 26 g. Ao contrário, todos os ratos com CAA submetidos a cirurgia com uma agulha de 0,50 mm ou operação sham sobreviveram. Os ratos nos outros grupos apresentaram taxas de mortalidade diferentes. Em relação à seleção de agulhas para os intervalos PC deste estudo, uma agulha menor que 0,35 mm de diâmetro causou maior constrição e morte. No entanto, uma agulha com mais de 0,50 mm de diâmetro não alterou a taxa de sobrevivência, mas reduziu a eficiência de HC devido ao SP reduzido por uma constrição mais fraca. É por isso que escolhemos agulhas entre 0,35 mm e 0,50 mm.
A morte pode ocorrer após a CAA. Indubitavelmente, a CAA aumenta a pós-carga cardíaca. Para lidar com a biodinâmica adicional, o coração exerce uma série de mudanças adaptativas, incluindo ativação e hipertrofia de cardiomiócitos e hiperplasia da matriz extracelular.2 Este mecanismo compensatório mantém o débito cardíaco (DC) efetivo por um período de tempo, mantendo a sobrevivência do organismo; é também a base para o estabelecimento do modelo HC. No entanto, quando a pós-carga súbita está fora do rango do ajuste de cardiomiócitos, a corrente sanguínea será limitada e causará constrição, resultando em ICA. A ICA é tipicamente caracterizada por mudanças rápidas nos sintomas de insuficiência cardíaca (IC).3 Sato et al.,4 consideraram a incidência de morte dentro de 5 dias como um critério de avaliação de ICA. ICA poderia melhorar moderadamente ou notavelmente no segundo dia, se for efetivamente controlada. A ICA leva a alta pressão ventricular e a alta pressão ventricular leva a alta pressão arterial pulmonar, levando a congestão pulmonar, que é uma das causas de morte após CAA.5 Liao et al.,6 sugeriram que o pneumoedema cardiogênico é a principal causa de morte pós-operatória para ratos SP. Além disso, a arritmia pode ocorrer como parte das mudanças eletrofisiológicas,7 e os sarcómeros de cardiomiócitos podem ser desordenados durante as mudanças patológicas.8 Estas são todas ameaças graves para a taxa de sobrevivência após a CAA. Nosso registro de tempos de morte de ratos (Tabela 1) mostrou o fenômeno de todas as mortes ocorrendo dentro de 5 dias. Uma alta incidência de morte ocorreu durante as 24h iniciais, o que está de acordo com os critérios de ICA acima mencionados. Além disso, há uma correlação positiva entre DC e PC; 9,10 portanto, em comparação com os ratos de baixo peso, ratos de alto peso requerem mais DC e terão pós-carga cardíaca mais aumentada do que os ratos de baixo peso com a mesma constrição aórtica. Os resultados do estudo atual (Tabela 1) indicam que os ratos de maior peso apresentaram menor tolerância para CAA, o que se reflete nas taxas de mortalidade. Em relação aos ratos com CAA submetidos a ligadura com uma agulha de 0,40 mm, todos os ratos nos grupos de 22 g e 26 g morreram. Entretanto, 6 dos 10 ratos sobreviveram no grupo de 18 g.
O diagnóstico de HC geralmente depende de mudanças na função cardíaca e na morfologia.11 A ecocardiografia pode ser realizada in vitro de forma não invasiva durante a primeira avaliação de HC, e é especialmente utilizada para monitorar mudanças na função cardíaca.12 Realizamos exames ecocardiográficos de ratos no final da semana 4 e da semana 8 pós-cirurgia. Os dados (dados da semana 4 na Tabela 2) mostraram que, no final da semana 4, surgiram fenômenos de paredes ventriculares espessadas, câmaras ventriculares aumentadas e diminuição das funções cardíacas em cada grupo CAA em comparação com os grupos shams, e essa diversidade era consistente com as mudanças cardíacas características que ocorrem com a sobrecarga de pressão crônica.13,14 Essas tendências se tornaram mais pronunciadas no final da semana 8 (dados da semana 8 na Tabela 2), quando FE e EF, que representam a função cardíaca, foram significativamente menores em comparação com os grupos shams. A HC também aumentou o PCo. No nosso estudo, o PCo, as relações PCo/PC e PCo/CT para os grupos CAA foram significativamente aumentados (Tabela 3). O remodelamento cardíaco é a alteração patológica mais típica de HC, incluindo hipertrofia de cardiomiócitos e aumento da matriz extracelular.15 Nossos resultados histológicos mostraram diâmetros externos aumentados e espessura ventricular em corações totais e seções transversais sob CAA (Figuras 1A e B). A coloração dos grupos CAA mostrou a patologia hipertrófica dos cardiomiócitos e dos núcleos (Figura 1C). A coloração com PSR dos grupos CAA mostrou depósitos extensos de colágeno (Figura 1D), particularmente no espaço perivascular (Figura 1E). A análise estatística mostrou que a espessura do ventrículo esquerdo (Tabela 4) e a porcentagem de depósito de colágeno (Tabela 5) foram significativamente aumentadas nos grupos CAA em comparação com o grupo sham. Em relação à formação de colágeno, Kuwahara et al.16 indicaram que os fibroblastos cardíacos são ativados no dia 3 após SP e que os tecidos fibrosos neoformativos afetam principalmente à função diastólica em vez da função sistólica durante as 4 semanas iniciais. Em seguida, a fibrose miocárdica excessiva está implicada na disfunção sistólica devido à sua tração mais intensa e a função cardíaca começa a se deteriorar significativamente. Quanto aos valores FE e EF para os grupos CAA (Tabela 2), as tendências descendentes da semana 4 para semana 8 estão em conformidade com essa teoria.
Escolher a agulha apropriada é fundamental para estabelecer o modelo HC. Com base nesses resultados, descobrimos que todos os ratos com CAA morreram quando uma agulha de 0,35 mm foi usada para ligadura para todos os 3 níveis de peso e quando uma agulha de 0,40 mm foi usada para ligadura nos grupos de 22 g e 26 g; portanto, esses 5 grupos de emparelhamentos de agulhas-peso eram claramente inadequados para seu uso. O grupo de 18 g/0,40 mm apresentou HC óbvia comparado com o grupo sham e sua taxa de sobrevivência foi aceitável (6 em 10). No entanto, ainda deve ser excluído porque o grupo 18 g/0,45 mm apresentou HC mais óbvia e maiores taxas de sobrevivência (8 em cada 10) (Tabela 1, Tabela 3). As agulhas de 0,45 mm e 0,50 mm estão disponíveis para todos os 3 níveis de peso, mas ambas podem resultar em hipertrofia miocárdica definitiva. No entanto, os valores do PCo e das relações PCo/PC e PCo/CT para os ratos CAA ao usar a agulha de 0,45 mm foram significativamente maiores do que aqueles quando se usa uma agulha de 0.50mm para cada nível de peso (Tabela 3). Portanto, para todos os 3 níveis de peso do nosso estudo, um modelo de HC pode ser estabelecido usando uma agulha de 0,50mm e a taxa de sobrevivência dos ratos não será ameaçada. No entanto, uma agulha de 0,45 mm leva a um modelo de HC mais eficaz e de maior mortalidade do que a agulha de 0,50 mm.
Normalmente, com o modelo HC induzido por SP, as agulhas mais finas criam estenose aórtica mais severa e conduzem a HC mais pronunciada e vice-versa. No entanto, observamos um fenômeno interessante: o nível de HC do grupo 18 g/0,45 mm foi anormalmente maior do que o grupo 18 g/0,40 mm (ratos de 18 g na Tabela 3). Quanto à análise dos dados de PC com CAA (Tabela 6), as mudanças no PC em ratos de 18 g durante as semanas 0 a 8 foram significativamente maiores do que as dos ratos de 22 g e 26 g, indicando que os ratinhos de 18 g têm maior potencial de desenvolvimento físico após a cirurgia e que o desenvolvimento físico é frequentemente acompanhado de desenvolvimento de órgãos.17 Portanto, o coração de ratos de 18 g também possui maior potencial de desenvolvimento. Para o mesmo nível de peso, a mudança de PC no grupo 18 g/0,45 mm durante as semanas 0 a 8 foi significativamente maior que a do grupo 18 g/0,40 mm (mudança de PC na Tabela 7). Como foi mencionado, o PC está positivamente relacionado ao DC; portanto, talvez a ligadura maior tenha limitado o DC no grupo 18 g/0,40 mm, que também limitou o desenvolvimento físico e o desenvolvimento de órgãos, incluindo o desenvolvimento do coração. No final da semana 8, não houve diferença significativa no PC para o grupo 18 g/0,45 mm e o 18g/grupo sham; ambos tiveram PC significativamente maior do que o grupo 18 g/0,40 mm (PC na semana 8 na Tabela 7). A agulha de 0,45 mm não tinha limites óbvios em ratos de 18 g, mas a vantagem de PC para o grupo de 18 g/0,45 mm em comparação com o grupo de 18 g/0,40 mm depende de maior DC e requer mais miocárdio hipertrófico para suporte. Assim, para estabelecer modelos de HC para CAA em ratos com potencial de desenvolvimento, como ratos de 18 g, pode haver uma região de intensidade de ligadura especial que pode causar HC mais óbvia do que as duas regiões adjacentes. No entanto, esse fenômeno deve incluir múltiplos fatores e merece maiores estudos.
Conclusão
Estabelecemos modelos de HC usando 4 tamanhos de agulha de ligadura e 3 pesos para ratos. Os dados mostraram que ambas as agulhas de 0,45 mm e 0.50mm levam a HC. No entanto, a agulha de 0,45 mm traz um modelo mais efetivo e provoca HC óbvia em ratos de 18 g.
Fontes de financiamento
O presente estudo foi financiado pelo The National Natural Science Foundation of China (número 81570343).
Vinculação acadêmica
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Zhen Jia pela Zhejiang University.
Aprovação Ética e consentimento informado
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University sob o número de protocolo 2014-17. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.
Materiais Suplementares
Peso corporal dos ratos antes da cirurgia
Peso
0,35 mm
0,40 mm
0,45 mm
0,50 mm
Sham
18 g
18,0 ± 0,4
18,0 ± 0,3
18,1 ± 0,3
18,0 ± 0,4
17,9 ± 0,4
22 g
22,1 ± 0,4
22,0 ± 0,6
21,9 ± 0,6
22,2 ± 0,7
22,1 ± 0,6
26 g
26,0 ± 0,7
26,1 ± 0,5
26,0 ± 0,5
25,9 ± 0,3
26,3 ± 0,5
Não foram encontradas diferenças significativas entre os 5 grupos de acordo com as comparações em pares de cada nível de peso (p > 0,05); portanto, o peso corporal pode ser considerado um índice para o mesmo nível de peso. Os dados são apresentados como a média ± DP (g) (n = 10). Os pesos corporais não diferiram significativamente um do outro (p > 0,05).
Pesos corporais dos ratos antes da constrição aórtica abdominal
Peso
Sobrevivência
Morte
18 g
18,1 ± 0,3 (n = 24)
18,0 ± 0,3 (n = 16)
22 g
22,1 ± 0,7 (n = 17)
22,0 ± 0,5 (n = 23)
26 g
25,9 ± 0,4 (n = 14)
26,1 ± 0,6 (n = 26)
Os dados retrospectivos mostraram que a diferença entre o peso na morte e sobrevida não era significante para cada nível de peso (p > 0,05), indicando que as diferenças de peso individuais para o mesmo nível de peso não influenciavam a morte pós-operatória. Os dados são apresentados como média ± DP (g).