Arq Bras CardiolabcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC5JmYH9Q9gBmTkrpySXF3XtDS0066-782X201800060055810.5935/abc.20180086Original ArticlesSystemic Arterial HypertensionEndothelial Dysfunction and Inflammation Precedes Elevations in Blood Pressure Induced by a High-Fat DietOishiJorge Camargo1CastroCynthia Aparecida1SilvaKarina Ana1FabricioVictor1CárnioEvelin Capelari2PhillipsShane A.3DuarteAna Claudia Garcia de Oliveira1RodriguesGerson Jhonatan1Universidade Federal de São CarlosSão PauloSPBrazilUniversidade Federal de São Carlos (UFSCar), São Paulo, SP - BrazilUniversidade Federal de São CarlosUniversidade de São PauloRibeirão PretoSPBrazilUniversidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP - BrazilUniversidade de São PauloUniversity of Illinois at ChicagoChicagoIllinoisUSAUniversity of Illinois at Chicago, Illinois - USAUniversity of IllinoisMailing Address: Jorge Camargo Oishi. Rua Rosalino Belline, 455. Postal Code 13564-050, Santa Paula, São Carlos, SP - Brazil. E-mail: jorgeoishi@hotmail.com
Author contributions
Conception and design of the research and Obtaining financing: Oishi JC, Duarte ACGO, Rodrigues GJ; Acquisition of data: Oishi JC, Castro CA, Silva KA, Fabricio V, Cárnio EC, Duarte ACGO, Rodrigues GJ; Analysis and interpretation of the data: Oishi JC, Castro CA, Silva KA, Fabricio V, Cárnio EC, Phillips SA, Duarte ACGO, Rodrigues GJ; Statistical analysis: Oishi JC; Writing of the manuscript: Oishi JC, Castro CA, Silva KA, Fabricio V, Duarte ACGO, Rodrigues GJ; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Oishi JC, Castro CA, Silva KA, Cárnio EC, Phillips SA, Duarte ACGO, Rodrigues GJ.
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
0620181106558567180720171409201706102017This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.AbstractBackground:
Obesity leads to a chronic inflammatory state, endothelial dysfunction and hypertension.
Objective:
To establish the time-course of events regarding inflammatory markers, endothelial dysfunction, systolic blood pressure (SBP) in obesity in only one experimental model.
Methods:
We fed male Wistar rats (eight-week age) with a standard diet (Control - CT, n = 35), or palatable high-fat diet (HFD, n = 35) for 24 weeks. Every six weeks, 7 animals from each group were randomly selected for euthanasia. SBP and serum levels of interleukin-6, tumor necrosis factor-α, C-reactive protein, adiponectin and nitric oxide were determined. Endothelial and vascular smooth muscle functions were determined in dissected aorta and lipid peroxidation was measured. Statistical significance was set at p < 0.05.
Results:
Levels of pro-inflammatory cytokines began to increase after six weeks of a high-fat diet, while those of the anti-inflammatory cytokine adiponectin decreased. Interestingly, the endothelial function and serum nitric oxide began to decrease after six weeks in HFD group. The SBP and lipid peroxidation began to increase at 12 weeks in HFD group. In addition, we showed that total visceral fat mass was negatively correlated with endothelial function and positively correlated with SBP.
Conclusion:
Our results show the time-course of deleterious effects and their correlation with obesity.
Currently, obesity and associated comorbidities are one of the major health problems in developed and developing countries, reducing both the quality and quantity of life and increasing the risk of mortality.1 Obesity is characterized by excessive fat tissue storage and is strongly associated with the development of cardiovascular diseases, dyslipidemia and hypertension. There is an associated pro-inflammatory environment that appears to worsen cardiovascular outcomes2,3 and according to the World Health Organization,4 cardiovascular diseases are currently one of the major causes of mortality in the world.
A great number of metabolic disorders are caused by obesity; among them endothelial dysfunction plays an important role in the development of insulin resistance and hypertension.5 Almost thirty-five years ago, it was discovered that endothelial cells could modulate relaxations and contractions of the underlying vascular smooth muscle, which allowed for the concept that vascular tonus control is endothelium-dependent of the underlying vascular smooth muscle.6-8
The endothelium produces several "relaxing factors" (EDRFs, endothelium-derived relaxing factors), hyperpolarizing factors (EDHFs), as well as contractile factors (EDCFs). Through a fine balance between the release of EDRFs and EDCFs, the endothelium plays a vital role in maintaining circulatory homeostasis. Any change in this balance may result in endothelial dysfunction.5,8
Previous studies have demonstrated the onset of hypertension and endothelial dysfunction in obesity induced by a high-fat diet.9,10 However, whether and in which order they appear has not been well defined and the temporal relationships between weight gain, endothelial dysfunction and blood pressure following a high-fat diet have not been determined. Therefore, the aim of the present study was to determine the time course of inflammation, endothelial dysfunction and the increase in blood pressure following a high-fat diet designed to induce obesity.
MethodsAnimals and dietary treatments
The experimental protocol was in accordance with the guidelines of the Brazilian College for Animal Experimentation (COBEA) and was approved by the Ethical Committee of the Federal University of São Carlos (026/2013).
Seventy male (8-week-old) Wistar rats (250-300 g) were assigned to two experimental groups with food and water ad libitum for 24 weeks: Control (CT, n = 35) was fed a standard diet or HFD (n = 35) fed with high-fat diet, that consisted of a standard rat diet plus peanuts, milk chocolate, and biscuits at a proportion of 3:2:2:1 as previously described.11 Standard diet and high-fat diet contained, respectively, 20/20% of protein, 4.5/20% of fat and 55/40% of carbohydrate.11 The caloric values of the diets were approximately 4.07 kcal/g for the standard diet and 5.12 Kcal/g for HFD. At time 0 and after every 6 weeks, 7 rats from CT and 7 from HFD group were randomly euthanized, and blood was collected for experimental analysis.
Blood pressure measurements in Conscious Rats
Indirect systolic blood pressure (SBP) was measured two days before euthanasia every 6 weeks using tail-cuff plethysmography (Power Lab 8/35, AD Instruments, Pty Ltda, CO), as described by Rodrigues et al.12 Mean SBP was calculated from an average of four successive measurements in each animal.
Vascular reactivity studies
The animals were anaesthetized with isoflurane and euthanized by decapitation. Thoracic aortas were isolated and cleaned of adherent connective tissues, and placed in a Krebs solution, as described previously.13 Aortas were carefully mounted as ring preparations (≅ 4 mm in length) and placed in bath chambers containing Krebs solution at 37°C continuously bubbled with 95% O2 and 5% CO2, pH 7.4 in an isometric myograph (model 610 DMT-USA) and recorded by a PowerLab8/SP data acquisition system (AD Instruments Pty Ltd., Colorado). The aortic rings were submitted to a tension of 1.5 g, which was readjusted every 15 min during a 60 min equilibration period before adding the given drug. Experiments were done in aortic rings with intact endothelium and also in denude endothelium aortic rings. Endothelial integrity was assessed by the degree of relaxation induced by 1 µmol/l acetylcholine (ACH) in the presence of contractile tone induced by phenylephrine (0.1 µm/l). The ring was considered with intact endothelium if the relaxation with acetylcholine was higher than 80%. In endothelium-denuded aortas, the relaxation to ACH was less than 5%. After the endothelial integrity test, aortic rings were pre-contracted with phenylephrine (100 nM). When the plateau was reached, concentration-effect curves to acetylcholine (0.1nM to 0.1mM) in intact endothelium aortic rings or concentration-effect curves for NO donor sodium nitroprusside (SNP) in denude endothelium aortic rings were constructed. Concentration curves were fitted with a sigmoidal dose-response equation which disclosed the maximal effect (MaxE) and the negative logarithm of the agonist that produces half-maximal response (pD2) using GraphPad Prism (GraphPad Software In, USA).
Body fat composition
Visceral adipose tissue (VAT) was dissected (mesenteric, epididymal and retroperitoneal white adipose tissues) and weighed to evaluate central adiposity.
Thoracic aortas were isolated and cleaned of adherent connective tissues. The methodology was described by Jiang et al.14 The ferrous oxidation−xylenol orange (FOX), measures lipid peroxides (cumene hydroperoxide - CHP), one of the main products of lipid peroxidation. For the standard assay, the following reagents were added sequentially: 0.25 mM FeSO4, 25 mM H2SO4, 0.1 mM xylenol orange, and water to a total of 0.9 ml. A sample of tissue extract (20-100 µL) was added, and the final volume was adjusted to 1 ml with water. Blanks were prepared by replacing tissue extract with water. Samples were incubated at room temperature until the reaction was complete (40 min), and absorbance at 560 nm was measured.
Serum nitrite and nitrate (NOx)
Serum nitric oxide levels were obtained by measuring the serum concentrations of its stable end-products nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-), collectively known as NOx, as described previously.15 The NO/ozone chemiluminescence method was performed using the NO Analyzer 280i (Sievers, Boulder, CO, USA).
Determination of adiponectin and inflammatory cytokines
Quantification of adiponectin and inflammatory cytokines tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin 6 (IL-6) and C-reactive protein (CRP) in serum was performed using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit. IL-6 and TNF-α were evaluated using commercial OptEIA kits (BD Biosciences, Pharmingen, USA). Adiponectin and CRP were analyzed using Duo Set kits (R&D Systems, USA). All kits were used according to the manufacturers' instructions, and the results were expressed in pg/mL for all cytokines evaluated.
Morphological and histological evaluation
Aorta segments were quickly cleaned from the surrounding tissues and blood, cut into rings fixed in formalin 37% and embedded in paraffin blocks. Later, 4-µm thick sections were cut with a microtome (Leitz 1512, IMEB, USA), placed onto glass microscope slides and stained with hematoxylin and eosin using the standard methods. Images of transverse sections of the arterial segments were captured using a camera connected to an optical microscope (Leica DM 2000). External diameter (ED) was obtained by measuring the surfaces of the adventitia and internal diameter (ID) from the endothelium surface. The media thickness was obtained by dividing the difference ED - ID by 2 (δ = ED - ID/2). The media/lumen ratio was calculated from the area data. The images were analyzed using the ImageJ analysis software, as described previously.16
Statistical analysis
The normality of distribution (of all quantitative and continuous variables) was checked using the Kolmogorov-Smirnov test. A sample of 7 animals in each group was required to provide 85% statistical power with a two-tailed alpha of 0.05 for pD2 and 90% for all other variables analyzed in this study. Differences between the CT and HFD groups were compared using two-way repeated measures analysis of variance ANOVA. When differences were indicated, a Newman-Keuls post hoc analysis was used with a statistical significance set at p < 0.05. These data were expressed as mean ± SD (Statistica software 7.0, StatSoft. Inc, USA). Vascular reactivity data of pD2 and Emax were expressed as mean ± SD with a statistical significance set at p < 0.05 (Graphpad Prism 3.0). Pearson correlation was made between pD2 and the SBP, pD2 and VAT, blood pressure and VAT, IL-6 and pD2, TNF-α and pD2, CRP and pD2 and between adiponectin and pD2, with a statistical significance of 5%.
ResultsTotal visceral adipose tissue
The sum of the weight of the retroperitoneal, visceral and epididymal adipose tissues - (VAT) was higher in HFD than in the CT group at 6 weeks. At 24 weeks, fat weight was 300% higher in the HFD than the CT group. VAT in the CT group increased at 12 weeks compared to 6 weeks, but remained unchanged for the rest of the experimental period (Figure 1).
Visceral adipose fat (VAT) in control (CT) and high-fat diet (HFD) groups over the weeks. *P < 0.05, compared with CT; + p < 0.05, within-group comparison (0 vs. 6, 6 vs. 12, 12 vs. 18, 18 vs. 24 weeks). Seven rats from each group were compared at each time point.
Inflammatory status
The inflammatory cytokines IL-6, TNF-α and CRP were increased in serum of HFD animals in 6, 12, 18 and 24 weeks when compared to the CT group (Figure 2A, B, C). On the other hand, the levels of serum adiponectin decreased in the HFD group after 6, 12, 18 and 24 weeks of the experimental protocol (Figure 2 D). In the CT group, no changes were found in these cytokine levels.
Serum interleukin-6 (IL-6) (A), tumor necrosis factor-α (TNF-α) (B), C-reactive protein (CRP) (C) and adiponectin (D) in the control (CT) and high-fat diet (HFD) groups over time. *P < 0.05, CT compared with HFD group; + p < 0.05, within-group comparison (0 vs. 6, 6 vs. 12, 12 vs. 18, 18 vs. 24 weeks). Seven rats from each group were compared at each time point
Vascular reactivity
No differences were found (Figure 3A) in the endothelium-dependent relaxation induced by acetylcholine (pD2) in the CT group over the entire experimental period. On the other hand, the pD2 was impaired in aortas of obese animals at 6, 12, 18 and 24 weeks compared to CT rats. Moreover, we observed a decrease in pD2 throughout the experimental period in HFD group (Figures 3B, C).
Concentration-response curve to acetylcholine (endothelium-dependent relaxation) in aortic rings of rats of the control (CT) (A) and high-fat diet (HFD) group (B) groups and half-maximal response pD2 (C) in both groups. *P < 0.05, CT compared with HFD group in each 6 weeks; + p < 0.05, within-group comparison (0 vs. 6, 6 vs. 12, 12 vs. 18, 18 vs. 24 weeks); seven rats from each group were compared at each time point
No differences were observed in the maximum relaxant effect (MaxE) in both CT and HFD groups. In endothelium-denuded aortic rings, there were no differences in the pD2 and MaxE to endothelium-independent relaxation induced by SNP in the CT and HFD groups in all the weeks evaluated (Table 1).
Half-maximal response (pD2) and maximal effect (MaxE) in aortic rings of the rats of the control (CT) and high-fat (HFD) groups. *P < 0.05, compared with CT group; + p < 0.05, within-group comparison (0 <italic>vs</italic>. 6, 6 <italic>vs</italic>. 12, 12 <italic>vs</italic>. 18, 18 <italic>vs</italic>. 24 weeks)
Weeks
Intact Endothelium
Denude Endothelium
pD2
MaxE(%)
pD2
MaxE(%)
CT
HFD
CT
HFD
CT
HFD
CT
HFD
0
7.58 ± 0.25
7.58 ± 0.22
90.67 ±7.40
90.87 ± 7.14
8.69 ± 0.13
8.68 ± 0.23
103.8 ± 2.77
104.6 ± 3.38
6
7.52 ± 0.07
7.37 ± 0.18*+
93.42 ±6.80
90.31 ± 7.64
8.67 ± 0.21
8.66 ± 0.22
98.3 ± 4.10
100.2 ± 7.67
12
7.48 ± 0.18
7.23 ± 0.11*+
89.17 ±8.80
90.90 ± 7.67
8.69 ± 0.10
8.71 ± 0.13
102.5 ± 2.48
103.9 ± 3.43
18
7.42 ± 0.22
7.12 ± 0.15*+
88.98 ±9.90
89.34 ± 10.05
8.71 ± 0.10
8.69 ± 0.07
105.8 ± 3.70
104.3 ± 1.85
24
7.34 ± 0.19
6.99 ± 0.23*+
91.46 ±6.61
89.80 ± 8.59
8.69 ± 0.07
8.68 ± 0.14
105.9 ± 2.98
105.9 ± 2.11
There was a strong negative correlation between pD2 and SBP (r = -0.722, p < 0.01). Moreover, we found a negative correlation between pD2 and VAT (r = -0.729, p < 0.01), between pD2 and inflammatory cytokines (pD2 and IL-6, r = -0.74; pD2 and TNF-α, r = -0.86; pD2 and CRP, r = -069, p < 0.05) and a positive correlation between pD2 and adiponectin (r = 0.77, p < 0.01).
Serum nitric oxide (NO) and aorta lipid peroxidation
By quantification of serum NO metabolites, we observed that NO level decreased at 6 weeks in HFD rats and remained lower throughout the experimental period when compared to the CT group. The time of experiment had no effect on NO concentrations in CT and the HFD groups (Figure 4).
Serum nitric oxide (NO) concentration in rats of the control (CT) and high-fat diet (HFD) groups. *P < 0.05, compared with CT group; + p < 0.05, within-group comparison (0 vs. 6, 6 vs. 12, 12 vs. 18, 18 vs. 24 weeks); seven rats from each group were compared at each time point
Levels of lipid peroxidation in aorta increased at 12 weeks of a high-fat diet and remained high throughout the experimental period when compared to the CT group. In the HFD group, there was an increase in lipid peroxidation at 12 weeks when compared to 6 weeks (Figure 5).
Lipid peroxidation in aortic rings from rats of control (CT) and high-fat diet (HFD) groups. *P < 0.05, compared with CT group; + p < 0.05, within-group comparison (0 vs. 6, 6 vs. 12, 12 vs. 18, 18 vs. 24 weeks); seven rats from each group were compared at each time point. CHP: cumene hydroperoxide.
Systolic blood pressure
As shown in Figure 6, high-fat diet induced an increase in SBP at 12, 18 and 24 weeks in the HFD group when compared to the CT group. Moreover, a positive correlation was found between SBP and VAT (r = 0.756, p < 0.01) in the HFD, and no significant differences in blood pressure were found in the CT group.
Systolic blood pressure in rats of control (CT) and high-fat diet (HFD) groups over 24 weeks. *P < 0.05, compared with CT group; + p < 0.05, within-group comparison (0 vs. 6, 6 vs. 12, 12 vs. 18, 18 vs. 24 weeks); seven rats from each group were compared at each time point
Alterations in the vascular structure
Table 2 shows that high-fat diet induced an increase in aortic medial thickness after 18 weeks and 24 weeks, and decreased the ID after 24 weeks in HFD compared to CT group (p < 0.05), resulting in an increase in the media thickness/lumen ratio after 18 and 24 weeks. In HFD group, there was an increase in the intima-media thickness after 18 weeks of high-fat diet, a decrease in the ID after 12 weeks, and an increase in the media thickness/lumen ratio in the aorta after 18 weeks of high-fat diet.
Quantitative values obtained from morphometrical analysis of thoracic aorta thickness from control group (CT, n = 7) and high-fat group (HFD, n = 7) rats. Results are expressed as means ± SD. * P < 0.05, compared with CT group; + p < 0.05, within-group comparison (0 <italic>vs</italic>. 6, 6 <italic>vs</italic>. 12, 12 <italic>vs</italic>. 18, 18 <italic>vs</italic>. 24 weeks)
Weeks
Media Thickness (µm)
Internal diameter (ID) (µm)
Media:lumen ratio
CT
HFD
CT
HFD
CT
HFD
0
157.99 ± 7.18
157.88 ± 4.75
2830.64 ± 75.20
2832.64 ± 75.98
0.056 ± 0.00
0.056 ± 0.01
6
163.51 ± 7.51
163.64 ± 11.98
2967.21 ± 177.85+
2919.31 ± 145.46
0.054 ± 0.00
0.056 ± 0.00
12
162.82 ± 6.67
164.64 ± 9.64
2976.80 ± 167.73
2876.36 ± 99.89+
0.055 ± 0.01
0.057 ± 0.00
18
161.65 ± 9.95
178.20 ± 5.26 *+
2987.53 ± 156.18
2854.40 ± 133.40
0.054 ± 0.00
0.062 ± 0.00*+
24
164.21 ± 9.51
181.96 ± 9.73 *
3045.25 ± 168.01
2835.53 ± 167.74*
0.054 ± 0.00
0.064 ± 0.01*
Discussion
To the best of our knowledge, this is the first study that has detected the time course of vascular function, vascular structure, oxidative stress and inflammatory status during the obesity progression in just one experimental model. Our findings showed that inflammatory state and endothelial dysfunction precedes the development of high blood pressure induced by high-fat diet. Obesity progression was associated with increased predisposition to pathological conditions and to common features of cardiovascular risk factors, including hypertension and endothelial dysfunction.17
The high-fat diet used in this study induced differences in adiposity between HFD and CT groups, validating our experimental model. The risk of developing obesity-related derangements is proportional to the degree of adiposity18 and, in particular, to the accumulation of fat in the visceral region.19 In this study, the HFD group had greater VAT mass at 6, 12, 18 and 24 weeks than the CT group.
In obesity, the inflammatory status is distinctive,19 and is characterized by low-grade inflammation, which results in tissue remodeling and systemic metabolic deterioration over time.20 Thus, detecting the time of increased inflammation is important for the development of therapeutic intervention.
Adipose tissue is fundamental to the development of inflammation by inducing the increase of pro-inflammatory cytokines, including TNF-α and IL-6,21 and a decrease in anti-inflammatory chemokines such as adiponectin.22 In addition, it has been described that TNF-α contributes to CRP elevation, which is a marker of low-grade inflammatory state, but also has a close relationship with dyslipidemia and endothelial dysfunction.23 In mice, the HFD induced an elevation of IL-6 after 2, 4 and 6 months,24 and an increase in plasma levels of pro-inflammatory mediators TNF-α, IL-6 after 15 weeks.25
In the present study, we detected that the levels of inflammatory cytokines TNF-α, IL-6 and CRP increased after 6 weeks in the HFD group and remained higher up to 24 weeks, while the adiponectin concentration was reduced and remained lower in the same period. These results indicate an early development of a low-grade inflammation state in this animal model. TNF-α is involved in the systemic inflammatory response and its levels are increased in the adipose tissue of obese mice compared with lean controls.20 On the other hand, adiponectin, which improves cardiovascular functions and has anti-inflammatory effects22 decreased after 6 weeks in HFD group and remained lower up to 24 weeks.
Obesity is also associated with an impairment of endothelial cell function and promotes endothelial dysfunction through an array of metabolic disorders including the accumulation of adipose tissue, high blood pressure, dyslipidemia and diabetes, which are linked to vascular oxidative stress.25 The endothelium comprises the inner lining of blood vessels, and forms the interface between the circulating blood and the vascular wall. It also acts as an endocrine and paracrine organ, which regulates vascular function by secreting a variety of trophic and vasoactive factors that regulate vascular tone, cell adhesion, smooth muscle cell proliferation and inflammation of the vascular wall.8
Endothelial dysfunction has a key role in the development of various cardiovascular diseases. In obesity, many factors could negatively affect the endothelium function, which include changes in blood pressure, glucose levels, lipid metabolism and inflammatory system, elevated levels of free fatty acids and oxidative stress, which in turn causes a reduction in the availability of NO.26-28
We observed that 6 weeks of high-fat diet was sufficient to induce endothelial dysfunction. Moreover, our results suggest that the impaired relaxation to acetylcholine observed in aortas from obese rats is related to a reduction of NO production. The HFD group showed the lowest serum concentration of NO at 6 weeks, which remained low up to 24 weeks. Consistent with our observations, various studies have shown obesity-induced impairment of endothelial function at different points of obesity development. Boustany-Kari et al.29 observed impaired endothelial function in rats fed for 11 weeks on a high-fat diet. In addition, 16 weeks of a high-fat diet in mice led to endothelial dysfunction and increases in systolic pressure in animals.30
Moreover, levels of TNF-α are strongly correlated with adiposity and diminished vasodilation in resistance arteries of rats, and IL-6 levels are proportional to adiposity whose elevations result in direct impairments of endothelial function.31 On the other hand, the decreased adiponectin levels are associated with dyslipidemia and cardiovascular diseases. Furthermore, adiponectin can upregulate NO production by modulation of Ser1177 phosphorylation through AMPK and, conversely, IL-6 and TNF-α decrease eNOS Ser1177 phosphorylation, resulting in diminished eNOS activity and less NO generation.32
In addition, we found a strong correlation between inflammatory cytokines (TNF-α, IL-6, CRP) and endothelial function (pD2).
Our findings are consistent with literature, showing that a high-fat diet treatment for 6 weeks was able to increase VAT. Interestingly, an inverse correlation was observed between VAT and endothelium function (pD2). In addition, the levels of these adipokines were altered at 6 weeks in the HFD group, confirming the concept of obesity-related endothelial dysfunction. We showed here that these events occur at an early stage of obesity development.
Obesity is also strongly associated with hypertension, which is a major risk factor for the development of coronary heart diseases. In fact, 79% of hypertension in men was a direct result of excess weight.33 Hypertension, characterized by chronic high blood pressure, has a multifactorial origin and an endothelial dysfunction can contribute to its genesis and maintenance.5 In the present study, the high-fat diet induced an increase in the SBP at 12 weeks and it continued to increase reaching the maximum values at 18 weeks. These results are in accordance with Boustany et al.34 that observed a rise in blood pressure, and increased activity of adipose and systemic renin angiotensin system after 11 weeks of high-fat diet in rats. The Framingham Heart Study reported a close connection between body fat levels and blood pressure in both men and women, and that adiposity emerged as a major factor which can be controlled and that contributes to hypertension.34 The same occurred in our study, which showed a strong correlation between SBP and VAT.
Interestingly, in the present study, structural alterations in the aorta occurred after a rise in blood pressure. It is well known that hypertension is associated with structural alterations in arteries that could contribute to maintaining hypertension.35 In addition, although not significantly, the media/lumen ratio starts to increase at 12 weeks, coinciding with the rise of blood pressure, and at 18 and 24 weeks, this increase becomes significant. Chen et al.36 found that the high-fat diet induced the increase in media thickness after 9 weeks. Our findings are in good agreement with these reports.
High-fat diet can also induce vascular pathogenesis, including effects on the aorta, leading to changes in vascular structure. Clinical and experimental studies have shown that increased body mass index is often associated with stiffening and increased arterial wall thickness.37 These alterations found in this study are important predictors of increased cardiovascular mortality.
Previous studies in animals suggested that hypertension is associated with an increased formation of reactive oxygen species (ROS) from all layers of the vascular wall.38 In agreement with these results, our findings showed an increase in lipid peroxidation (used as a marker of oxidative stress) in aortic rings at the same time that SBP increased, starting at 12 weeks. Moreover, Kobayasi et al.30 found a reduced antioxidant activity, increased local vascular inflammation and impaired endothelium-dependent relaxation in mice fed on a high fat diet at 16 weeks. The release of IL-6, mainly from abdominal adipocyte sources might have a pivotal role in the relationship between oxidative stress and endothelial dysfunction. IL-6 and TNF-α contribute to CRP elevation, a marker of low-grade inflammatory state, and also have a close relationship with endothelial dysfunction.23
As mentioned earlier, obesity is commonly associated with oxidative stress,39 which is able to modify vascular tonus by impeding NO bioavailability and/or signaling.38 We have observed that 6 weeks of high-fat diet decreased NO circulating levels without significant effects on aortic lipid peroxidation at this point of obesity progression. Thus, these results suggest that the decrease in circulating NO levels precedes the increase in oxidative stress. During the oxidative stress state, excessive production of ROS reduces the bioactivity of NO due to its rapid oxidative inactivation by the ROS superoxide (O2−).38
According to Victor et al.,40 while visceral fat stores expand, adipocytes generate increasing levels of ROS. In the present study, the high-fat diet induced the accumulation of abdominal fat that could trigger lipid peroxidation in the aorta at 12 weeks, which persists up to 24 weeks.
One limitation of this study was the fact that visceral fat mass was evaluated by dissection of adipose tissue. Dual-energy X-ray absorptiometry (DXA), the gold standard method for assessment of body fat mass, would provide more comprehensive data of body composition; but, unfortunately, the method could not be performed in this study.
Our data suggest that even at early stages of development, obesity (6 weeks) can trigger chronic inflammation and impairment of endothelial function. This impairment appears most closely related to inflammatory cytokines and expansion of VAT.
Conclusion
In conclusion, development of obesity first led to a reduction of endothelial function, which continued to decline over the weeks, and to systemic inflammation, followed by an increase in blood pressure, lipid peroxidation and changes in aortic structure. Our work is relevant in showing the relationship of obesity with chronic inflammation, endothelial dysfunction and hypertension. Despite many studies in this area, the results we found are a further step towards to the development of therapeutic strategies to prevent these abnormalities.
In the Original Article “Endothelial Dysfunction and Inflammation Precedes Elevations in Blood Pressure Induced by a High-Fat Diet”, pages 558-567, by authors Jorge Camargo Oishi, Cynthia Aparecida Castro, Karina Ana Silva, Victor Fabricio, Evelin Capelari Cárnio, Shane A. Phillips, Ana Claudia Garcia de Oliveira Duarte, Gerson Jhonatan Rodrigues, the correct affiliation of Dr. Shane A. Phillips is University of Illinois at Chicago, Illinois - USA.
Sources of Funding
This study was funded by CNPq and partially funded by FAPESP.
Study Association
This article is part of the thesis of Post Doctoral submitted by Jorge Camargo Oishi, from Universidade Federal de São Carlos.
Ethics approval and consent to participate
This study was approved by the Ethics Committee on Animal Experiments of Universidade Federal de São Carlos under the protocol number 026/2013.
References1 Beleigoli AM, Boersma E, Diniz MD, Lima-Costa MF, Ribeiro AL. Overweight and class I obesity are associated with lower 10-year risk of mortality in Brazilian older adults: the Bambuí Cohort Study of Ageing. PLoS One. 2012;7(12):e52111. doi: 10.1371/journal.pone.0052111.BeleigoliAMBoersmaEDinizMDLima-CostaMFRibeiroALOverweight and class I obesity are associated with lower 10-year risk of mortality in Brazilian older adults: the Bambuí Cohort Study of AgeingPLoS One2012712e5211110.1371/journal.pone.00521112 Field AE, Coakley EH, Must A, Spadano JL, Laird MA, Dietz WH, et al. Impact of overweight on the risk of developing common chronic diseases during a 10 year period. Arch Intern Med. 2001;161(13):1581-6. doi:10.1001/archinte.161.13.1581.FieldAECoakleyEHMustASpadanoJLLairdMADietzWHImpact of overweight on the risk of developing common chronic diseases during a 10 year periodArch Intern Med2001161131581158610.1001/archinte.161.13.15813 Iantorno M, Campia U, Di Daniele N, Nistico S, Forleo GB, Cardillo C, et al. Obesity, inflammation and endothelial dysfunction. J Biol Regul Homeost Agents. 2014;28(2):169-76. PMID: 25001649.IantornoMCampiaUDi DanieleNNisticoSForleoGBCardilloCObesity, inflammation and endothelial dysfunctionJ Biol Regul Homeost Agents2014282169176250016494 World Health Organization. (WHO) Cardiovascular diseases. [Cited in 2016 Feb 10]. Available from: http://www.who.int/cardiovasculardiseases/enWorld Health Organization. (WHO)Cardiovascular diseases2016 Feb 10Available from: http://www.who.int/cardiovasculardiseases/en5 Davel AP, Wenceslau CF, Akamine EH, Xavier FE, Couto, GK, Oliveira HT, et al. Endothelial dysfunction in cardiovascular and endocrine-metabolic diseases: an update. Braz J Med Biol Res. 2011;44(9):920-32. doi: http://dx.doi.org/10.1590/S0100-879X2011007500104.DavelAPWenceslauCFAkamineEHXavierFECoutoGKOliveiraHTEndothelial dysfunction in cardiovascular and endocrine-metabolic diseases: an updateBraz J Med Biol Res2011449920932http://dx.doi.org/10.1590/S0100-879X20110075001046 Furchgott RF, Zawadzki JV. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 1980;288(5789):373-6. PMID: 6253831.FurchgottRFZawadzkiJVThe obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholineNature1980288578937337662538317 Vanhoutte PM. The endothelium - modulator of vascular smooth-muscle tone. N Engl J Med. 1988;319(8):512-3. doi: 10.1056/NEJM198808253190809.VanhouttePMThe endothelium - modulator of vascular smooth-muscle toneN Engl J Med1988319851251310.1056/NEJM1988082531908098 Furchgott RF, Vanhoutte PM. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. FASEB J. 1989;3(9):2007-18. PMID: 2545495.FurchgottRFVanhouttePMEndothelium-derived relaxing and contracting factorsFASEB J1989392007201825454959 Costa RR, Villela NR, Souza MG, Boa BC, Cyrino FZ, Silva SV, et al. High fat diet induces central obesity, insulin resistance and microvascular dysfunction in hamsters. Microvasc Res. 2011;82(3):416-22. doi: 10.1016/j.mvr.2011.08.007.CostaRRVillelaNRSouzaMGBoaBCCyrinoFZSilvaSVHigh fat diet induces central obesity, insulin resistance and microvascular dysfunction in hamstersMicrovasc Res201182341642210.1016/j.mvr.2011.08.00710 Kurtel H, Rodrigues SF, Yilmas CE, Yildirim A, Granger DN. Impaired vasomotor function induced by combination of hypertension and hypercholesterolemia. J Am Soc Hypertens. 2013;7(1):14-23. doi:10.10.16/j.jash.2012.11.005.KurtelHRodriguesSFYilmasCEYildirimAGrangerDNImpaired vasomotor function induced by combination of hypertension and hypercholesterolemiaJ Am Soc Hypertens201371142310.10.16/j.jash.2012.11.00511 Estadella D, Oyama LM, Bueno AA, Habitante CA, Souza GI, Ribeiro EB, et al. A palatable hyperlipidic diet causes obesity and affects brain glucose metabolism in rats. Lipids Health Dis. 2011;Sep 23;10:168. doi: 10.1186/1476-511X-10-168.EstadellaDOyamaLMBuenoAAHabitanteCASouzaGIRibeiroEBA palatable hyperlipidic diet causes obesity and affects brain glucose metabolism in ratsLipids Health Dis092320111016816810.1186/1476-511X-10-16812 Rodrigues GJ, Pereira AC, Vercesi JA, Lima RG, Silva RS, Bendhack LM. Long-lasting hypotensive effect in renal hypertensive rats induced by nitric oxide released from a ruthenium complex. J Cardiovasc Pharmacol. 2012;60(2):193-8. doi: 10.1097/FJC.0b013e31825bacc4.RodriguesGJPereiraACVercesiJALimaRGSilvaRSBendhackLMLong-lasting hypotensive effect in renal hypertensive rats induced by nitric oxide released from a ruthenium complexJ Cardiovasc Pharmacol201260219319810.1097/FJC.0b013e31825bacc413 Oishi JC, Buzinnari TC, Pestana CR, De Moraes TF, Vatanabe IP, Wink DA, et al. In vitro treatment with cis-[(Ru(H-dcbpy-)2(Cl)(NO)]) improves the endothelial function in aortic rings with endothelial dysfunction. J Pharm Pharm Sci. 2015;18(5):696-704. PMID: 26670366.OishiJCBuzinnariTCPestanaCRDe MoraesTFVatanabeIPWinkDAIn vitro treatment with cis-[(Ru(H-dcbpy-)2(Cl)(NO)]) improves the endothelial function in aortic rings with endothelial dysfunctionJ Pharm Pharm Sci20151856967042667036614 Jiang ZY, Woollard AC, Wolff S. Lipid hydroperoxide measurement by oxidation of Fe2+ in the presence of xylenol orange. Comparison with the TBA Assay and a lodometric Method. Lipids. 1991;26(10)853-6. PMID: 1795606.JiangZYWoollardACWolffSLipid hydroperoxide measurement by oxidation of Fe2+ in the presence of xylenol orange. Comparison with the TBA Assay and a lodometric MethodLipids19912610853856179560615 Pereira FH, Batalhão ME, Cárnio EV. Correlation between body temperature, blood pressure and plasmatic nitric oxide in septic patients. Rev Lat Am Enfermagem. 2014;22(1):123-8. doi: 10.1590/0104-1169.2896.2392.PereiraFHBatalhãoMECárnioEVCorrelation between body temperature, blood pressure and plasmatic nitric oxide in septic patientsRev Lat Am Enfermagem201422112312810.1590/0104-1169.2896.239216 Coura MA, Pacheco ME, Simões HF, Moraes JF, Campbell CS. Estudo morfoquantitativo da parede da aorta de ratos wistar idosos treinados com exercício aeróbio. Motri. 2012;8(4):71-9. doi: http://dx.doi.org/10.6063/motricidade.8(4).1554.CouraMAPachecoMESimõesHFMoraesJFCampbellCSEstudo morfoquantitativo da parede da aorta de ratos wistar idosos treinados com exercício aeróbioMotri2012847179http://dx.doi.org/10.6063/motricidade.8(4).155417 Huang PL. eNOS, metabolic syndrome and cardiovascular disease. Trends Endocrinol Metab. 2009;20(6):295-302. doi: 10.1016/j.tem.2009.03.005.Huang eNOSPLmetabolic syndrome and cardiovascular diseaseTrends EndocrinolMetab200920629530210.1016/j.tem.2009.03.00518 Gomez-Ambrosi J, Silva C, Galofre JC, Escalada J, Santos S, Millán D, et al. Body mass index classification misses subjects with increased cardiometabolic risk factors related to elevated adiposity. Int J Obes. (Lond). 2012;36(2):286-94. doi: 10.1038/ijo.2011.100.Gomez-AmbrosiJSilvaCGalofreJCEscaladaJSantosSMillánDBody mass index classification misses subjects with increased cardiometabolic risk factors related to elevated adiposityInt J Obes. (Lond)201236228629410.1038/ijo.2011.10019 Tchernof A, Despres JP. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 2013;93(1):359-404. doi: 10.1152/physrev.00033.2011.TchernofADespresJPPathophysiology of human visceral obesity: an updatePhysiol Rev201393135940410.1152/physrev.00033.201120 Gregor MF, Hotamisligil GS. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu Rev Immunol. 2011;29:415-45. doi: 10.1146/annurev-immunol-031210-101322.GregorMFHotamisligilGSInflammatory mechanisms in obesityAnnu Rev Immunol20112941544510.1146/annurev-immunol-031210-10132221 Jung UJ, Choi MS. Obesity and Its metabolic complications: the role of adipokines and the relationship between obesity, inflammation, insulin resistance, dyslipidemia and nonalcoholic fatty liver disease. J Mol Sci. 2014;15(4):6184-223. doi:10.3390/ijms15046184.JungUJChoiMSObesity and Its metabolic complications: the role of adipokines and the relationship between obesity, inflammation, insulin resistance, dyslipidemia and nonalcoholic fatty liver diseaseJ Mol Sci20141546184622310.3390/ijms1504618422 Li FY, Lam KS, Xu A. Therapeutic perspectives for adiponectin: an update. Curr Med Chem. 2012;19(32):5513-23. doi: 10.2174/092986712803833173.LiFYLamKSXuATherapeutic perspectives for adiponectin: an updateCurr Med Chem201219325513552310.2174/09298671280383317323 Van Gaal LF, Mertens IL, De Block CE. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 2006;444(7121):875-80. doi: 10.1038/nature05487.Van GaalLFMertensILDe BlockCEMechanisms linking obesity with cardiovascular diseaseNature2006444712187588010.1038/nature0548724 Barbosa-da-Silva S, Fraulob-Aquino JC, Lopes JR, Mandarim-de-Lacerda CA, Aguila MB. Weight cycling enhances adipose tissue inflammatory responses in male mice. PLoS One. 2012;7(7):e39837. doi: 10.1371/journal.pone.0039837.Barbosa-da-SilvaSFraulob-AquinoJCLopesJRMandarim-de-LacerdaCAAguilaMBWeight cycling enhances adipose tissue inflammatory responses in male micePLoS One201277e3983710.1371/journal.pone.003983725 Carvalho KM, Marinho Filho JD, de Melo TS, Araújo AJ, Quetz Jda S, da Cunha Mdo P, et al. The resin from protium heptaphyllum prevents high-fat diet-induced obesity in mice: scientific evidence and potential mechanisms. Evid Based Complement Alternat Med. 2015;2015:106157. doi: 10.1155/2015/106157.CarvalhoKMMarinhoJDFilhode MeloTSAraújoAJQuetz JdaSda Cunha MdoPThe resin from protium heptaphyllum prevents high-fat diet-induced obesity in mice: scientific evidence and potential mechanismsEvid Based Complement Alternat Med2015201510615710615710.1155/2015/10615726 Chantemele EJ, Stepp DW. Influence of obesity and metabolic dysfunction on the endothelial control in the coronary circulation. Mol Cell Cardiol. 2012;52(4):840-7. doi:10.1016/j.yjmcc.2011.08.018.ChantemeleEJSteppDWInfluence of obesity and metabolic dysfunction on the endothelial control in the coronary circulationMol Cell Cardiol201252484084710.1016/j.yjmcc.2011.08.01827 Bray GA. Medical consequence of obesity. J Clin Endocrinol Metab. 2004;89(6):2583-9. doi: 10.1210/jc.2004-0535.BrayGAMedical consequence of obesityJ Clin Endocrinol Metab20048962583258910.1210/jc.2004-053528 De Kreutzenberg SV, Crepaldi C, Marchetto S, Calò L, Tiengo A, Del Prato S, et al. Plasma free fatty acids and endothelium-dependent vasodilation: effect of chain-length and cyclooxygenase inhibition. J Clin Endocrinol Metab. 2000;85(2):793-8. doi: 10.1210/jcem.85.2.6352.De KreutzenbergSVCrepaldiCMarchettoSCalòLTiengoADel PratoSPlasma free fatty acids and endothelium-dependent vasodilation: effect of chain-length and cyclooxygenase inhibitionJ Clin Endocrinol Metab200085279379810.1210/jcem.85.2.635229 Boustany-Kary CM, Gong M, Akers WS, Guo Z, Cassis LA. Enhanced vascular contractility and diminished coronary artery flow in rats made hypertensive from diet-induced obesity. Int J Obes (Lond). 2007;31(11):1652-9. doi: 10.1038/sj.ijo.0803426.Boustany-KaryCMGongMAkersWSGuoZCassisLAEnhanced vascular contractility and diminished coronary artery flow in rats made hypertensive from diet-induced obesityInt J Obes (Lond)200731111652165910.1038/sj.ijo.080342630 Kobayasi R, Akamine EH, Davel AP, Rodrigues MA, Carvalho CR, Rossoni LV. Oxidative stress and inflammatory mediators contribute to endothelial dysfunction in high-fat diet-induced obesity in mice. J Hypertens. 2010;28(10):2111-9 doi: 10.1097/HJH.0b013e32833ca68c.KobayasiRAkamineEHDavelAPRodriguesMACarvalhoCRRossoniLVOxidative stress and inflammatory mediators contribute to endothelial dysfunction in high-fat diet-induced obesity in miceJ Hypertens201028102111211910.1097/HJH.0b013e32833ca68c31 Stapleton PA, James ME, Goodwill AG, Frisbee JC. Obesity and vascular dysfunction. Pathophysioloy. 2008;15(2):79-89. doi: 10.1016/j.pathophys.2008.04.007.StapletonPAJamesMEGoodwillAGFrisbeeJCObesity and vascular dysfunctionPathophysioloy2008152798910.1016/j.pathophys.2008.04.00732 Prieto D, Contreras C, Sánchez A. Endothelial dysfunction, obesity and insulin resistance. Curr Vasc Pharmacol. 2014;12(3):412-26. doi: 10.2174/1570161112666140423221008.PrietoDContrerasCSánchezAEndothelial dysfunction, obesity and insulin resistanceCurr Vasc Pharmacol201412341242610.2174/157016111266614042322100833 Garrison RJ, Kannel WB, Stokes J 3rd, Castelli WP. Incidence and precursors of hypertension in young adults: the Framingham Offspring Study. Prev Med. 1987;16(2):235-51. doi: https://doi.org/10.1016/0091-7435(87)90087-9.GarrisonRJKannelWBStokes 3rdJCastelliWPIncidence and precursors of hypertension in young adults: the Framingham Offspring StudyPrev Med1987162235251https://doi.org/10.1016/0091-7435(87)90087-934 Boustany CN, Bharadwaj K, Daugherty A, Brown DR, Randall DC, Cassis LA. Activation of the systemic and adipose renin-angiotensin system in rats with diet-induced obesity and hypertension. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2004;287(4):R943-9. doi: 10.1152/ajpregu.00265.2004.BoustanyCNBharadwajKDaughertyABrownDRRandallDCCassisLAActivation of the systemic and adipose renin-angiotensin system in rats with diet-induced obesity and hypertensionAm J Physiol Regul Integr Comp Physiol20042874R943R94910.1152/ajpregu.00265.200435 Arribas SM, Hinek A, Gonzalez MC. Elastic fibres and vascular structure in hypertension. Pharmacol Ther. 2006;111(3):771-91. doi: 10.1016/j.pharmthera.2005.12.003.ArribasSMHinekAGonzalezMCElastic fibres and vascular structure in hypertensionPharmacol Ther2006111377179110.1016/j.pharmthera.2005.12.00336 Chen J, Wang S, Luo M, Zhang Z, Dai X, Kong M, et al. Zinc deficiency worsens and supplementation prevents high-fat diet induced vascular inflammation, oxidative stress, and pathological remodeling. Toxicol Sci. 2016;153(1):124-36. doi: 10.1093/toxsci/kfw110.ChenJWangSLuoMZhangZDaiXKongMZinc deficiency worsens and supplementation prevents high-fat diet induced vascular inflammation, oxidative stress, and pathological remodelingToxicol Sci2016153112413610.1093/toxsci/kfw11037 Martínez-Martínez E, Miana M, Jurado-López R, Bartolomé MV, Souza Neto FV, Salaices M, et al. The potential role of leptin in the vascular remodeling associated with obesity. Int J Obes (Lond). 2014;38(12):1565-72. doi: 10.1038/ijo.2014.37.Martínez-MartínezEMianaMJurado-LópezRBartoloméMVSouzaFVNetoSalaicesMThe potential role of leptin in the vascular remodeling associated with obesityInt J Obes (Lond)201438121565157210.1038/ijo.2014.3738 Schulz E, Gori T, Münzel T. Oxidative stress and endothelial dysfunction in hypertension. Hypertens Res. 2011;34(6):665-73. doi:10.1038/hr.2011.39SchulzEGoriTMünzelTOxidative stress and endothelial dysfunction in hypertensionHypertens Res201134666567310.1038/hr.2011.3939 Vincent HK, Innes KE, Vincent KR. Oxidative stress and potential interventions to reduce oxidative stress in overweight and obesity. Diabetes Obes. Metab. 2007;9(6):813-39. doi: 10.1111/j.1463-1326.2007.00692.x.VincentHKInnesKEVincentKROxidative stress and potential interventions to reduce oxidative stress in overweight and obesityDiabetes Obes. Metab.20079681383910.1111/j.1463-1326.2007.00692.x40 Victor VM, Apostolova N, Herance R, Hernandez-Mijares A, Rocha M. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in atherosclerosis: mitochondria-targeted antioxidants as potential therapy. Curr Med Chem. 2009;16(35):4654-67. doi: 10.2174/092986709789878265.VictorVMApostolovaNHeranceRHernandez-MijaresARochaMOxidative stress and mitochondrial dysfunction in atherosclerosis: mitochondria-targeted antioxidants as potential therapyCurr Med Chem200916354654466710.2174/092986709789878265Artigos OriginaisHipertensão Arterial SistêmicaDisfunção Endotelial e Inflamação Precedem a Elevação da Pressão Arterial Induzida por Dieta HiperlipídicaOishiJorge Camargo1CastroCynthia Aparecida1SilvaKarina Ana1FabricioVictor1CárnioEvelin Capelari2PhillipsShane A.3DuarteAna Claudia Garcia de Oliveira1RodriguesGerson Jhonatan1Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), São Paulo, SP - BrasilUniversidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP - BrasilUniversity of Illinois at Chicago, Illinois - USACorrespondência: Jorge Camargo Oishi. Rua Rosalino Belline, 455. CEP 13564-050, Santa Paula, São Carlos, SP - Brasil. E-mail: jorgeoishi@hotmail.com
Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa e Obtenção de financiamento: Oishi JC, Duarte ACGO, Rodrigues GJ; Obtenção de dados: Oishi JC, Castro CA, Silva KA, Fabricio V, Cárnio EC, Duarte ACGO, Rodrigues GJ; Análise e interpretação dos dados: Oishi JC, Castro CA, Silva KA, Fabricio V, Cárnio EC, Phillips SA, Duarte ACGO, Rodrigues GJ; Análise estatística: Oishi JC; Redação do manuscrito: Oishi JC, Castro CA, Silva KA, Fabricio V, Duarte ACGO, Rodrigues GJ; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Oishi JC, Castro CA, Silva KA, Cárnio EC, Phillips SA, Duarte ACGO, Rodrigues GJ.
Potencial conflito de interesses
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
ResumoFundamento:
A obesidade leva a um estado de inflamação crônica, disfunção endotelial e hipertensão.
Objetivo:
Estabelecer a sequência de eventos relacionados a marcadores inflamatórios, disfunção endotelial e pressão arterial sistólica (PAS) na obesidade em um modelo experimental.
Métodos:
Ratos Wistar machos (8 semanas de idade) receberam dieta padrão (Controle - CT, n = 35) ou uma dieta palatável hiperlipídica (DHL, n = 35) por 24 semanas. A cada seis semanas, 7 animais de cada grupo foram aleatoriamente selecionados para eutanásia. Foram determinados a PAS, e níveis séricos de interleucina-6, fator de necrose tumoral-a, proteína C reativa, adiponectina e óxido nítrico. As funções do músculo liso endotelial e vascular foram determinadas na aorta dissecada, e medida a peroxidação lipídica. A significância estatística foi estabelecida em p < 0,05.
Resultados:
os níveis das citocinas pró-inflamatórias começaram a aumentar após seis semanas de dieta hiperlipídica, enquanto os níveis da citocina anti-inflamatória adiponectina diminuíram. Um resultado interessante foi a redução da função endotelial e do óxido nítrico após seis semanas no grupo DHL. Além disso, mostramos que a massa de tecido adiposo visceral total esteve negativamente correlacionada com função endotelial e positivamente correlacionada com a PAS.
Conclusão:
Nossos resultados demonstram a progressão temporal dos efeitos deletérios e sua correlação com a obesidade.
Atualmente, a obesidade e as comorbidades associadas são um dos principais problemas de saúde em países desenvolvidos e em desenvolvimento, reduzindo tanto a qualidade como a expectativa de vida, e aumentando o risco de mortalidade.1 A obesidade é caracterizada por acúmulo excessivo de tecido adiposo e está fortemente associada com o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, dislipidemia e hipertensão. Existe um meio pró-inflamatório associado à obesidade que parece piorar os desfechos cardiovasculares2,3 e, segundo a Organização Mundial da Saúde,4 as doenças cardiovasculares são atualmente uma das principais causas de mortalidade no mundo.
Um grande número de distúrbios metabólicos é causado pela obesidade. Entre eles, a disfunção endotelial exerce um papel importante no desenvolvimento de resistência insulínica e hipertensão.5 Há quase tinta e cinco anos, descobriu-se que as células endoteliais poderiam modular relaxamentos e contrações da musculatura lisa vascular, apresentando o conceito de que o controle do tônus vascular é dependente do endotélio da musculatura lisa vascular subjacente.6-8
O endotélio produz vários fatores de relaxamento (EDRFs, endothelium-derived relaxing factors), fatores de hiperpolarização (EDHFs), e fatores de contração (EDCFs). Por meio de um adequado equilíbrio entre a liberação de EDHFs e EDCFs, o endotélio exerce um papel fundamental na manutenção da homeostase circulatória. Qualquer alteração nesse equilíbrio pode resultar em disfunção endotelial.5,8
Estudos prévios demonstraram o início de hipertensão e disfunção endotelial na obesidade induzida por dieta hiperlipídica.9,10 Contudo, se e em qual ordem elas ocorrem não foi bem definido, bem como ainda não foi determinada a relação temporal entre ganho de peso, disfunção endotelial e pressão sanguínea em resposta a uma dieta hiperlipídica. Portanto, o objetivo do presente estudo foi determinar a sequência em que ocorrem a inflamação, a disfunção endotelial, e o aumento da pressão sanguínea após uma dieta hiperlipídica usada para induzir a obesidade.
MétodosAnimais e tratamentos dietéticos
O protocolo experimental estava de acordo com as diretrizes do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de São Carlos (026/2013).
Setenta ratos machos Wistar com 8 semanas de vida, pesando entre 250 e 300g foram alocados em dois grupos experimentais com comida e água ad libitum por 24 semanas - controle (CT, n = 35) que recebeu uma dieta padrão ou DHL (n = 35) que recebeu uma dieta hiperlipídica, que consistiu em uma dieta padrão acrescida de amendoim, chocolate ao leite, e biscoitos em uma proporção de 3:2:2:1 conforme descrito anteriormente.11 A dieta padrão e a dieta hiperlipídica continham, respectivamente, 20/20% de proteína, 4,5/20% de gordura e 55/40% de carboidrato.11 Os valores energéticos das dietas foram de aproximadamente 4,07 kcal/g para a dieta padrão e de 5,12 kcal/g para DHL. No tempo 0 e após cada 6 semanas, 7 ratos do grupo CT e 7 do grupo DHL foram submetidos à eutanásia aleatoriamente, e o sangue foi coletado para análise experimental.
Medidas de pressão sanguínea em ratos conscientes
A pressão arterial sistólica (PAS) indireta foi medida dois dias antes da eutanásia a cada 6 semanas, utilizando pletismografia de cauda (Power Lab 8/35, AD Instruments, Pty Ltda, CO), conforme descrito por Rodrigues et al.12 A PAS média foi calculada a partir de quatro (em média) medidas sucessivas realizadas em cada animal.
Estudos de reatividade vascular
Os animais foram anestesiados com isoflurano e submetidos à eutanásia por decapitação. As aortas foram isoladas e limpas de tecido conjuntivo aderente, e colocadas em solução de Krebs, conforme descrito.13 As aortas foram seccionadas em anéis (≅ 4 mm de comprimento), colocadas em câmara contendo solução de Krebs a 37ºC, aeradas continuamente com 95% de O2 e 5% de CO2, pH 7,4 em um miógrafo isométrico (modelo 610 DMT-EUA). O registro foi realizado por um sistema de aquisição de dados PowerLab8/SP (AD Instruments Pty Ltd., Colorado). Os anéis aórticos foram submetidos a uma tensão de 1,5 g, que foi reajustada a cada 15 minutos durante um período de equilíbrio de 60 minutos antes da adição da droga. Os experimentos foram realizados em anéis aórticos com endotélio intacto e também em anéis aórticos desprovidos de endotélio. A integridade endotelial foi avaliada pelo grau de relaxamento induzido por acetilcolina (ACH) a 1 µmol/L na presença de tônus contrátil induzido por fenilefrina (0,1 µM). Considerava-se que o anel possuía endotélio intacto se o relaxamento com acetilcolina fosse maior que 80%. Em aortas desprovidas de endotélio, o relaxamento com ACH foi menor que 5%. Após o teste de integridade endotelial, os anéis aórticos foram pré-contraídos com fenilefrina (100 nM). Quando o platô foi alcançado, curvas de concentração-efeito para nitroprussiato de sódio (SNP) doador de óxido nítrico (NO) foram construídas nos anéis aórticos sem endotélio. As curvas de concentração foram ajustadas com uma equação dose-resposta sigmoidal que revelou o efeito máximo (EMax) e o logaritmo negativo do agonista que produz metade da resposta máxima (pD2) usando o programa GraphPad Prism (GraphPad Software In, EUA).
Composição de Gordura Corporal
O tecido adiposo visceral (TAV) foi dissecado (tecido adiposo branco mesentérico, epididimal e retroperitoneal) e pesado para avaliar a adiposidade central.
Peroxidação lipídica da aorta (oxidação de íon ferroso em xilenol laranja - FOX)
As aortas foram isoladas e limpas de tecido conjuntivo aderente. A metodologia foi descrita por Jiang et al.14 A oxidação de íon ferroso em xilenol laranja (FOX) mede os peróxidos lipídicos (hidroperóxido de cumeno - HPC), um dos principais produtos da peroxidação lipídica. Para o teste padrão, os seguintes reagentes foram adicionados na sequência: 0,25 mM FeSO4, 25 mM H2SO4, 0,1 mM xilenol laranja, e água até completar o volume de 0,9 mL. Uma amostra do extrato de tecido (20-100 µL) foi adicionada, e o volume final ajustado a 1 mL com água. Os brancos foram preparados substituindo-se o extrato de tecido por água. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente até o final da reação (40 minutos), e a absorbância a 560 nm foi medida.
Nitrito e nitrato séricos (NOx)
Os níveis de óxido nítrico sérico foram obtidos medindo-se as concentrações séricas de seus produtos finais estáveis nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-), coletivamente conhecidos como NOx, conforme descrito anteriormente.15 O método de quimioluminescência de NO/ozônio foi realizado utilizando-se o aparelho de análise de NO (NO Analyzer 280i, Sievers, Boulder, CO, EUA).
Determinação de adiponectina e citocinas inflamatórias
A quantificação de adiponectina e das citocinas inflamatórias - fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina 6 (IL-6) e proteína C- reativa (PCR) no soro foi realizada utilizando-se o kit de ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA). IL-6 e TNF-α foram avaliados utilizando-se kits comerciais OptEIA (BD Biosciences, Pharmingen, EUA). A adiponectina e a PCR foram analisadas utilizando-se kits Duo Set (R&D Systems, EUA). Todos os kits foram usados de acordo com as instruções do fabricante, e os resultados de todas as citocinas avaliadas expressos em pg/mL.
Avaliação morfológica e histológica
Os segmentos da aorta foram rapidamente limpos de tecidos adjacentes e sangue, cortados em anéis e fixados em formalina 37% e em blocos de parafina. Em seguida, seções de 4 µm de espessura foram cortadas com um micrótomo (Leitz 1512, IMEB, EUA), transferidas para lâminas de microscópio e coradas com hematoxilina e eosina usando métodos padrões. Imagens de seções transversais dos segmentos arteriais foram capturadas usando uma câmera conectada a um microscópio ótico (Leica DM 2000). O diâmetro externo (DE) foi obtido medindo-se as superfícies da túnica adventícia e do diâmetro interno (DI) a partir da superfície endotelial. A espessura da camada média foi obtida dividindo-se a diferença (DE - DI) por dois (d = ED - ID/2). A razão camada média/lúmen foi calculada a partir dos dados da área. As imagens foram analisadas utilizando-se o programa ImageJ, conforme descrito anteriormente.16
Análise estatística
A normalidade da distribuição (de todas as variáveis quantitativas e contínuas) foi testada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Foi necessária uma amostra de 7 animais em cada grupo para conferir um poder estatístico de 85% com um alfa bicaudal de 0,05 para pD2 e de 90% para todas as outras variáveis analisadas neste estudo. As diferenças entre os grupos CT e DHL foram comparadas por análise de variância (ANOVA) de dois fatores com medidas repetidas. Quando diferenças eram apontadas, a análise post-hoc de Newman-Keuls foi usada com significância estatística estabelecida em p < 0,05. Esses dados são expressos em média ± DP (programa Statistica 7.0, StatSoft. Inc, EUA). Os dados de reatividade vascular de pD2 e MaxE foram expressos em média ± DP com p < 0,05 estabelecido como significância estatística (Graphpad Prism 3.0). A correlação de Pearson foi realizada entre pD2 e a PAS, pD2 e VAT, pressão arterial e VAT, IL-6 e pD2, TNF-α e pD2, CRP e pD2, e entre adiponectina e pD2, com significância estatística de 5%.
ResultadosTecido adiposo visceral total (TAV)
A soma dos pesos dos tecidos adiposos retroperitoneal, visceral e epididimal foi maior no grupo DHL que no grupo CT na sexta semana. Na semana 24, o peso do tecido adiposo foi 300% maior no grupo DHL que no grupo CT. TAV no grupo CT aumentou na semana 12 em comparação à semana 6, mas permaneceu inalterado até o final do experimento (Figura 1).
Tecido adiposo visceral (TAV) nos grupos controle (CT) e dieta hiperlipídica (DHL) ao longo das semanas. *P < 0,05, comparado ao grupo CT; + p < 0,05, comparação intragrupo (0 vs. 6, 6 vs. 12, 12 vs. 18, 18 vs. 24 semanas). A cada seis semanas, 7 animais de cada grupo foram avaliados.
Status inflamatório
As citocinas inflamatórias IL-6, TNF-α e PCR estavam aumentadas no soro dos animais do grupo DHL nas semanas 6, 12, 18 e 24 em comparação ao grupo CT (Figuras 2A, B, C). Por outro lado, os níveis de adiponectina sérica diminuíram no grupo DHL após 6, 12, 18 e 24 semanas de experimento (Figura 2D). No grupo CT, não houve alteração nos níveis de citocina.
Valores séricos das citocinas: IL-6 (A), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) (B), proteína C reativa (PCR) (C) e adiponectina (D) nos grupos controle (CT) e dieta hiperlipídica (DHL). *P < 0,05, comparado ao grupo CT; + p < 0,05, comparação intragrupo (0 vs. 6, 6 vs. 12, 12 vs. 18, 18 vs. 24 semanas). A cada seis semanas, 7 animais de cada grupo foram avaliados.
Reatividade vascular
Não houve diferenças no relaxamento dependente do endotélio induzido pela acetilcolina (pD2) no grupo CT durante todo o período de experimento. Por outro lado, pD2 foi deficiente nas aortas dos animais obesos nas semanas 6, 12, 18 e 24 em comparação aos ratos controles. Além disso, observamos uma diminuição no pD2 durante o período experimental no grupo DHL (Figuras 3B, C).
Curva concentração-resposta à acetilcolina (relaxamento dependente de endotélio) nos anéis aórticos dos ratos do grupo controle (CT) (A) e grupo dieta hiperlipídica (DHL) (B) e metade da resposta máxima (pD2) em ambos os grupos (C). *P < 0,05, CT vs. DHL a cada 6 semanas; + p < 0,05, comparação intragrupo (0 vs. 6, 6 vs. 12, 12 vs. 18, 18 vs. 24 semanas). A cada seis semanas, 7 animais de cada grupo foram avaliados.
Não foram observadas diferenças no efeito máximo de relaxamento (Emax) nos grupos CT e DHL. Nos anéis aórticos desprovidos de endotélio, não foram observadas diferenças de pD2 ou Emax ao relaxamento independente de endotélio induzido por SNP nos grupos CT e DHL em todas as semanas (Tabela 1).
Metade da resposta máxima (pD2) e efeito máximo (Emax) nos anéis aórticos dos ratos do grupo controle (CT) e grupo dieta hiperlipídica (DHL). *P < 0,05, CT vs. DHL a cada 6 semanas; + p < 0,05, comparação intragrupo (0 vs. 6, 6 vs. 12, 12 vs. 18, 18 vs. 24 semanas)
Semanas
Endotélio intacto
Desprovidos de endotélio
pD2
Emax(%)
pD2
Emax(%)
CT
DHL
CT
DHL
CT
DHL
CT
DHL
0
7,58 ± 0,25
7,58 ± 0,22
90,67 ± 7,40
90,87 ± 7,14
8,69 ± 0,13
8,68 ± 0,23
103,8 ± 2,77
104,6 ± 3,38
6
7,52 ± 0,07
7,37 ± 0,18*+
93,42 ± 6,80
90,31 ± 7,64
8,67 ± 0,21
8,66 ± 0,22
98,3 ± 4,10
100,2 ± 7,67
12
7,48 ± 0,18
7,23 ± 0,11*+
89,17 ± 8,80
90,90 ± 7,67
8,69 ± 0,10
8,71 ± 0,13
102,5 ± 2,48
103,9 ± 3,43
18
7,42 ± 0,22
7,12 ± 0,15*+
88,98 ± 9,90
89,34 ± 10,05
8,71 ± 0,10
8,69 ± 0,07
105,8 ± 3,70
104,3 ± 1,85
24
7,34 ± 0,19
6,99 ± 0,23*+
91,46 ± 6,61
89,80 ± 8,59
8,69 ± 0,07
8,68 ± 0,14
105,9 ± 2,98
105,9 ± 2,11
Houve uma forte correlação negativa entre pD2 e PAS (r = -0,722, p < 0,01). Além disso, encontramos uma correlação negativa entre pD2 e TAV (r = -0,729, p < 0,01), entre pD2 e citocinas inflamatórias (pD2 e IL-6, r = -0,74; pD2 e TNF-α, r = -0,86; pD2 e CRP, r = -069, p < 0,05), e uma correlação positiva entre pD2 e adiponectina (r = 0,77, p < 0,01).
Óxido nítrico sérico (NO) e peroxidação lipídica da aorta
A partir da quantificação dos metabólitos de NO, observamos que os níveis de NO diminuíram na sexta semana nos ratos DHL e permaneceram mais baixos durante o período experimental em comparação ao grupo CT. O tempo de experimento não teve efeito sobre as concentrações de NO nos grupos CT ou DHL (Figura 4).
Concentração sérica de óxido nítrico (NO) nos ratos do grupo controle (CT) e grupo dieta hiperlipídica (DHL) *P < 0,05, CT vs. DHL a cada 6 semanas; + p < 0,05, comparação intragrupo (0 vs. 6, 6 vs. 12, 12 vs. 18, 18 vs. 24 semanas). A cada seis semanas, 7 animais de cada grupo foram avaliados.
Os níveis de peroxidação lipídica na aorta aumentaram na 12ª semana de dieta hiperlipídica e permaneceram altos durante o experimento em comparação ao grupo CT. No grupo DHL, houve um aumento na peroxidação lipídica na semana 12 em comparação à semana 6 (Figura 5).
Peroxidação lipídica nos anéis aórticos de ratos dos grupos controle (CT) e dieta hipelipídica (DHL). *P < 0,05, CT vs. DHL a cada 6 semanas; + p < 0,05, comparação intragrupo (0 vs. 6, 6 vs. 12, 12 vs. 18, 18 vs. 24 semanas). A cada seis semanas, 7 animais de cada grupo foram avaliados. HPC: hidroperóxido de cumeno.
Pressão arterial sistólica
Como mostrado na Figura 6, a dieta hiperlipídica induziu um aumento na PAS nas semanas 12, 18 e 24 no grupo DHL em comparação ao grupo CT. Além disso, observou-se uma correlação positiva entre PAS e TAV (r = 0,756, p < 0,01) no grupo DHL, e não foram observadas diferenças significativas na pressão arterial no grupo CT.
Pressão arterial sistólica nos ratos dos grupos controle (CT) e dieta hiperlipídica (DHL) ao longo de 24 semanas. *P < 0,05, CT vs. DHL a cada 6 semanas; + p < 0,05, comparação intragrupo (0 vs. 6, 6 vs. 12, 12 vs. 18, 18 vs. 24 semanas). A cada seis semanas, 7 animais de cada grupo foram avaliados.
Alterações na estrutura vascular
A Tabela 2 mostra que a dieta hiperlipídica induziu um aumento na espessura da camada média da aorta após 18 e 24 semanas e diminuiu o DI após 24 semanas no grupo DHL em comparação ao grupo CT (p < 0,05). No grupo DHL, houve um aumento na espessura da camada íntima-média após 18 semanas de dieta hiperlipídica, uma redução no DI após 12 semanas, e um aumento na razão espessura da íntima-média/lúmen na aorta após 18 semanas de dieta hiperlipídica.
Valores quantitativos obtidos da análise morfométrica da espessura da aorta dos ratos do grupo controle (CT, n = 7) e grupo dieta hiperlipídica (DHL, n = 7). Resultados são expressos em média ± DP. *P < 0,05, CT vs. DHL a cada 6 semanas; + p < 0,05, comparação intragrupo (0 vs. 6, 6 vs. 12, 12 vs. 18, 18 vs. 24 semanas)
Semanas
Espessura da camada média (µm)
Diâmetro interno (ID) (µm)
Razão camada média:lúmen
CT
DHL
CT
DHL
CT
DHL
0
157,99 ± 7,18
157,88 ± 4,75
2830,64 ± 75,20
2832,64 ± 75,98
0,056 ± 0,00
0,056 ± 0,01
6
163,51 ± 7,51
163,64 ± 11,98
2967,21 ± 177,85+
2919,31 ± 145,46
0,054 ± 0,00
0,056 ± 0,00
12
162,82 ± 6,67
164,64 ± 9,64
2976,80 ± 167,73
2876,36 ± 99,89+
0,055 ± 0,01
0,057 ± 0,00
18
161,65 ± 9,95
178,20 ± 5,26 *+
2987,53 ± 156,18
2854,40 ± 133,40
0,054 ± 0,00
0,062 ± 0,00*+
24
164,21 ± 9,51
181,96 ± 9,73 *
3045,25 ± 168,01
2835,53 ± 167,74*
0,054 ± 0,00
0,064 ± 0,01*
Discussão
Em nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a identificar a ordem de ocorrência de mudanças na função e estrutura vascular, no estresse oxidativo e no status inflamatório durante a progressão da obesidade em um único modelo experimental. Nossos resultados mostraram que a inflamação e a disfunção endotelial precedem o desenvolvimento de hipertensão induzida por dieta hiperlipídica. A progressão da obesidade esteve associada com maior predisposição a condições patológicas e a características comuns dos fatores de risco cardiovasculares, incluindo hipertensão e disfunção endotelial.17
A dieta hiperlipídica utilizada neste estudo induziu mudanças na adiposidade entre grupos CT e DHL, validando nosso modelo experimental. O risco de se desenvolver disfunções relacionadas à obesidade é proporcional ao grau de adiposidade18 e, particularmente, ao acúmulo de gordura na região visceral.19 No presente estudo, o grupo DHL apresentou maior massa de TAV nas semanas 6, 12, 18 e 24 que o grupo CT.
O estado inflamatório na obesidade é característico,19 marcado por uma baixo grau de inflamação, o que resulta na remodelação tecidual e deterioração metabólica sistêmica ao longo do tempo.20 Assim, identificar o aumento da inflamação na obesidade é importante para o desenvolvimento de intervenção terapêutica.
O tecido adiposo é fundamental no desenvolvimento de inflamação ao induzir o aumento de citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-α e IL-6,21 e uma diminuição nas quimiocinas anti-inflamatórrias, como a adiponectina.22 Além disso, o TNF-α parece contribuir para a elevação de PCR, a qual é um marcador de inflamação de baixo grau, mas também tem uma relação próxima com dislipidemia e disfunção endotelial.23 Em camundongos, a DHL induziu um aumento no IL-6 após 2, 4 e 6 meses,24 e nos níveis plasmáticos de mediadores TNF-α, IL-6 após15 semanas.25
No presente estudo, observamos que os níveis de citocinas inflamatórias TNF-α, IL-6 e PCR aumentaram após 6 semanas no grupo DHL e permaneceram elevados até 24 semanas, enquanto que a concentração de adiponectina diminuiu e permaneceu baixa nesse período. Esses resultados indicam um desenvolvimento precoce de uma inflamação de baixo grau neste modelo animal. O TNF-α está envolvido na resposta inflamatória sistêmica, e seus níveis estão aumentados no tecido adiposo em camundongos obesos em comparação a controles magros.20 Por outo lado, a adiponectina, que melhora a função cardiovascular e possui efeitos anti-inflamatórios,22 diminuiu após 6 semanas no grupo DHL e permaneceu mais baixa até a semana 24.
A obesidade também está associada com distúrbio na função da célula endotelial e promove disfunção endotelial por meio de desordens metabólicas, incluindo acúmulo de tecido adiposo, hipertensão, dislipidemia e diabetes, os quais estão associados ao estresse oxidativo.25 O endotélio compreende a camada interna dos vasos sanguíneos, e forma a interface entre o sangue circulante e a parede vascular. Ele também atua como um órgão endócrino e parácrino, que regula a função vascular pela secreção de uma variedade de fatores tróficos e vasoativos que regulam o tônus vascular, adesão celular, proliferação de células musculares lisas e inflamação da parede vascular.8
A disfunção endotelial exerce um papel chave no desenvolvimento de várias doenças cardiovasculares. Na obesidade, muitos fatores podem afetar negativamente a função endotelial, incluindo mudanças na pressão sanguínea, nos níveis glicêmicos, no metabolismo lipídico e no sistema inflamatório, níveis elevados de ácidos graxos e estresse oxidativo, que, por sua vez, causa uma redução na disponibilidade de NO.26-28
Observamos que 6 meses de dieta hiperlipídica foi suficiente para induzir a disfunção endotelial. Ainda, nossos resultados sugerem que um distúrbio no relaxamento à acetilcolina, observado nas aortas de ratos obesos, está relacionado a uma redução na produção de NO. O grupo DHL apresentou as concentrações séricas mais baixas de NO na 6ª semana, que permaneceram baixas até a 24ª semana. Concordantes com nossos achados, vários estudos mostraram uma disfunção endotelial induzida pela obesidade em diferentes momentos de seu desenvolvimento. Boustany-Kari et al.,29 observaram função endotelial prejudicada em ratos alimentos com uma dieta hiperlipídica durante 11 semanas. Além disso, 16 semanas de uma dieta hiperlipídica em camundongos causou disfunção endotelial e aumento na pressão sistólica nesses animais.30
Ainda, níveis de TNF-α estão fortemente correlacionados com adiposidade e vasodilatação diminuída em artérias de resistência dos ratos, e níveis de IL-6 são proporcionais à adiposidade, cuja elevação resulta em implicações diretas na função endotelial.31 Por outro lado, níveis diminuídos de adiponectina estão associados à dislipidemia e a doenças cardiovasculares. Além disso, a adiponectina pode mediar um aumento na produção de NO pela modulação da fosforilação de Ser1177 pela AMPK; já IL-6 e TNF-α diminuem a fosforilação de eNOS Ser1177, resultando em atividade do eNOS diminuída e menos geração de NO.32
Encontramos também uma forte correlação entre citocinas inflamatórias - TNF-α, IL-6, CRP e função endotelial (pD2).
Nossos achados são consistentes com a literatura, que mostram que o tratamento com dieta hiperlipídica por 6 semanas foi capaz de aumentar TAV. Um resultado interessante foi a correlação inversa entre TAV e função endotelial (pD2). Ainda, os níveis dessas adipocinas estavam alterados na sexta semana no grupo DHL, o que corrobora o conceito da disfunção endotelial relacionada à obesidade. Nós demonstramos neste estudo que esses eventos ocorrem em um estágio precoce do desenvolvimento da obesidade.
A obesidade também está fortemente associada com hipertensão, a qual é um fator de risco importante para o desenvolvimento de doenças coronarianas. De fato, 79% da hipertensão em homens resultou diretamente do excesso de peso.33 A hipertensão, caracterizada por pressão elevada crônica, tem origem multifatorial, e a disfunção endotelial pode contribuir para sua gênese e manutenção.5 No presente estudo, a dieta hiperlipídica induziu a um aumento na PAS em 12 semanas, que continuou aumentando até atingir valores máximos em 18 semanas. Esses resultados estão de acordo com Boustany et al.,34 que observaram um aumento na pressão sanguínea, e na atividade do sistema renina-angiotensina do tecido adiposo e sistêmico após 11 semanas de dieta hiperlipídica nos ratos. O estudo Framingham Heart Study descreveu uma forte relação entre os níveis de gordura corporal e pressão sanguínea tanto em homens como em mulheres, e que a adiposidade surgiu como um importante fator que pode ser controlado e que contribui com a hipertensão.34 O mesmo ocorreu em nosso estudo, que mostrou uma forte correlação entre PAS e TAV.
Outro achado interessante de nosso estudo foi o fato de que alterações estruturais na aorta ocorreram após aumento na pressão sanguínea. Sabe-se que a hipertensão está associada com alterações estruturais nas artérias, que poderiam contribuir para a manutenção da hipertensão.35 Além disso, a razão camada média/lúmen começou a aumentar (embora de uma maneira não significativa) em 12 semanas, coincidindo com o aumento na pressão sanguínea; esse aumento tornou-se significativo em 18 e 24 semanas. Chen et al.,36 relataram que a dieta hiperlipídica induziu um aumento na espessura da camada média após 9 semanas. Nossos resultados estão de acordo com esses estudos.
A dieta hiperlipídica também pode induzir a patogênese vascular, incluindo efeitos sobre a aorta, levando a alterações na estrutura vascular. Estudos clínicos e experimentais mostraram que um índice de massa corporal aumentado está frequentemente associado com enrijecimento e aumento na espessura da parede arterial.37
Estudos prévios envolvendo animais sugeriram que a hipertensão está associada com formação aumentada de espécies reativas de oxigênio (EROs) a partir de todas as camadas da parede vascular.38 Em concordância com esses estudos, nossos resultados mostraram um aumento na peroxidação lipídica (usado como marcador de estresse oxidativo) em anéis aórticos, paralelamente ao aumento da PAS, iniciando nas 12 semanas. Além disso, Kobayasi et al.,30 encontraram uma atividade antioxidante reduzida, inflamação vascular local aumentada, e um relaxamento dependente de endotélio deficiente em camundongos alimentados com dieta hiperlipídica em 16 semanas. A liberação de IL-6, principalmente a partir de adipócitos abdominais, pode ter um papel fundamental na relação entre estresse oxidativo e disfunção endotelial. IL-6 e TNF-α contribuem para a elevação da PCR, um marcador de estado inflamatório de baixo grau, e estão relacionados com disfunção endotelial.23
Conforme mencionado anteriormente, a obesidade é comumente associada com estresse oxidativo,39 o qual é capaz de modificar o tônus vascular impedindo a disponibilidade e/ou a sinalização de NO.38 Observamos que a dieta hiperlipídica durante 6 semanas diminuiu os níveis de NO circulante sem efeitos significativos sobre a peroxidação lipídica nesse período de desenvolvimento da obesidade. Assim, esses resultados sugerem que a diminuição nos níveis de NO antecede o aumento no estresse oxidativo. Durante o estresse oxidativo, a produção excessiva de EROs reduz a bioatividade de NO devido à sua rápida inativação oxidativa pela ERO superóxido (O2-).38
Segundo Victor et al.,40 enquanto os estoques de gordura visceral se expandem, os adipócitos geram níveis crescentes de EROs. No presente estudo, a dieta hiperlipídica levou ao acúmulo de gordura abdominal que poderia induzir a peroxidação lipídica na aorta em 12 semanas, o que persistiria até 24 semanas.
Uma limitação deste estudo foi o fato de que a massa de gordura visceral foi avaliada por dissecção do tecido adiposo. A absorciometria com raios X de dupla energia (DXA), método padrão ouro para avaliação de gordura corporal, forneceria dados mais completos sobre a composição corporal; mas, infelizmente, o método não pôde ser utilizado neste estudo.
Nossos dados sugerem que mesmo em fases iniciais de desenvolvimento (6 semanas), a obesidade pode gerar inflamação crônica e disfunção endotelial. Tal deficiência parece mais intimamente relacionada com citocinas inflamatórias e expansão do TAV.
Conclusão
O desenvolvimento da obesidade primeiramente levou a uma diminuição da função endotelial, que continuou a diminuir ao longo das semanas, e à inflamação sistêmica, seguido de um aumento na pressão sanguínea, peroxidação lipídica e mudanças na estrutura aórtica. Nosso estudo é relevante ao mostrar a relação da obesidade com inflamação crônica, disfunção endotelial e hipertensão. Apesar de muitos estudos na área, os resultados encontrados representam um passo a mais em direção ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas para prevenir essas condições.
No Artigo Original “Disfunção Endotelial e Inflamação Precedem a Elevação da Pressão Arterial Induzida por Dieta Hiperlipídica”, páginas 558-567, dos autores Jorge Camargo Oishi, Cynthia Aparecida Castro, Karina Ana Silva, Victor Fabricio, Evelin Capelari Cárnio, Shane A. Phillips, Ana Claudia Garcia de Oliveira Duarte, Gerson Jhonatan Rodrigues, a afiliação correta do Dr. Shane A. Phillips é University of Illinois at Chicago, Illinois - USA.
Fontes de financiamento
O presente estudo foi financiado pelo CNPq e parcialmente financiado pela FAPESP.
Vinculação acadêmica
Este artigo é parte de tese de Pós-Doutorado de Jorge Camargo Oishi pela Universidade Federal de São Carlos.
Aprovação ética e consentimento informado
Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de São Carlos sob o número de protocolo 026/2013.