Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC g9K4PSwgCwSxP4HSHcQXJHy S0066-782X2018000400348 S0066-782X2018005003104 10.5935/abc.20180038 Original Article Vimentin and Anti Vimentin Antibodies in Chagas' Disease Nascimento Marilda Savoia Stolf Anna Maria Simonsen Andrade Heitor Franco de Junior Pandey Ramendra Pati Umezawa Eufrosina Setsu Universidade de São Paulo São Paulo SP Brazil Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP - Brazil Universidade de São Paulo Mailing Address: Marilda Savoia Nascimento, Av. Senador Vergueiro, 608. Postal Code 09750-000, Centro, São Bernardo do Campo, São Paulo, SP - Brazil. E-mail: marildasavoia@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research: Nascimento MS, Stolf AMS, Umezawa ES; Acquisition of data: Nascimento MS, Stolf MAS; Analysis and interpretation of the data: Nascimento MS, Stolf AMS, Andrade Junior HF, Pandey RP, Umezawa ES; Statistical analysis: Nascimento MS, Andrade Junior HF; Obtaining financing: Nascimento MS, Umezawa ES; Writing of the manuscript: Nascimento MS, Stolf AMS, Pandey RP; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Nascimento MS, Andrade Junior HF, Pandey RP.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 12 03 2018 04 2018 110 4 348 353 13 06 2017 05 09 2017 06 10 2017 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Vimentin is a main structural protein of the cell, a component of intermediate cell filaments and immersed in cytoplasm. Vimentin is mimicked by some bacterial proteins and anti-vimentin antibodies occur in autoimmune cardiac disease, as rheumatic fever. In this work we studied vimentin distribution on LLC-MK2 cells infected with T. cruzi and anti-vimentin antibodies in sera from several clinical pictures of Chagas' disease or American Trypanosomiasis, in order to elucidate any vimentin involvement in the humoral response of this pathology.

 Objective:

We standardized an indirect immunofluorescence assay (IFI) to determine sub cellular expression in either parasites and host cells, and ELISA to evaluate anti-vimentin antibodies in sera fron chagasic patients.

 Methods:

We analyzed the distribution of vimentin in culture cells using indirect fluorescent assays, using as external controls anti-T. cruzi sera, derived from chronic infected patients for identification of the parasites in the same model. After infection and growth of T.cruzi amastigotes, those cells express larger amounts of vimentin, with heavy staining of cytoplasm outside the parasitophorous vacuole and some particle shadowing patterns, suggesting that vimentin are associated with cell cytoplasm. Anti-vimentin antibodies were present in most American trypanosomiasis samples, but notably, they are much more present in acute (76, 9%) or clinical defined syndromes, especially cardiac disease (87, 9%). Paradoxically, they were relatively infrequent in asymptomatic (25%) infected patients, which had a clearly positive serological reaction to parasite antigens, but had low frequency of anti-vimentin antibodies, similar to controls (2,5%).

 Conclusion:

Our current data revealed that anti-vimentin antibodies induced during T. cruzi infection could be a marker of active disease in the host and its levels could also justify drug therapy in American Trypanosomiasis chronic infection, as a large group of asymptomatic patients would be submitted to treatment with frequent adverse reactions of the available drugs. Anti-vimentin antibodies could be a marker of cardiac muscle cell damage, appearing in American Trypanosomiasis patients during active muscle cell damage.

 Keywords: Chagas Disease Heart Diseases Trypanossoma Cruzi Rheumatic Fever Vimentin Antibodies, Monoclonal Introduction

Chagas' disease or American Trypanosomiasis is a peculiar parasitic infection as Trypanosoma cruzi is a unique intracellular parasite which resulted in cytoplasmic presence of amastigotes forms, a rare cellular event in nature, as cytoplasm is usually free from parasites in almost all intracellular infections1. After its reproduction, the parasite had a set of enzymes, as sialidases, that transfers host cell molecules to their surface, allowing cell evasion without disruption2. All those processes could alter cell cytoskeleton and its proteins, probably generating in the host cell signals that alters the protein synthesis of structural proteins. Vimentin is a main structural protein of the cell, a component of intermediate cell filaments and immersed in cytoplasm3. Vimentin is expressed in normal cardiac muscle and their tumors, and autoantibodies against a vimentin re found in allograft rejection4. or cardiac models of allograft rejection5.Vimentin is mimicked by some bacterial proteins and anti-vimentin antibodies occur in autoimmune cardiac disease, as rheumatic fever6. In this work we studied vimentin distribution on LLC-MK2 cells infected with T.cruzi and anti-vimentin antibodies in sera from several clinical pictures of American Trypanosomiasis, in order to elucidate any vimentin involvement in the humoral response of this pathology.

 METHODS Parasites and serum samples

Trypanosoma cruzi epimastigotes were grown from Y strain routinely maintained in our lab on Liver Infusion Tryptose (LIT) culture media supplemented with 10% fetal calf serum. T. cruzi trypomastigotes were obtained from cell culture supernatants of LLC-MK2 cells previously infected. Monoclonal mouse Anti-Vimentin antibody (V6630) and vimentin from bovine lens was obtained commercially (Sigma Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA). A serum from patient with cardiac chronic American Trypanosomiasis was used as anti T.cruzi antibody. Human sera from American Trypanosomiasis patients and controls were used from the biorepository of T.cruzi patients samples from E.S.Umezawa, Lab.Protozoology, IMTSP, serologically characterized in TESA specific serology tests and published previously in several articles, were recovered and comprising 26 sera from acute disease, 33 from isolated cardiac disease, 17 from isolated digestive disease, 20 without clinical disease (asymptomatic disease) and 40 sera from patients outside endemic area. All clinical data were maintained by the attendant physician and not available for this study.

 Antigen expression and morphology

All morphological assays were performed in a Zeiss Axioplan epifluorescent microscope with fluorescein filters. For antigen detection, we fixed LLC-MK2 control cells, T.cruzi infected LLC-MK2 cells and T.cruzi epimastigotes and permeated cell surface with Triton X-1007 with either anti-Vimentin mAb or anti-T.cruzi antibodies as elsewhere described. After this step, bound antibodies were revealed with adequate fluorescein conjugate, carefully washed and mounted in glycerin for observation. Representative Fields were digitalized at high power field using a Canon camera.

TESA and vimentin ELISA

T.cruzi trypomastigotes excreted secreted antigen was obtained as elsewhere described8. TESA (1/80) and Vimentin (0.06ug/ml) in carbonate 0.05 M pH9.6 were adsorbed overnight to wells of 96 wells high binding ELISA plates (Corning Inc. New York, USA). After washing and blocking with PBS Tween 20, 0,05% plus 5% milk or BSA 0.5%, adequate dilution of sera (1/50 vimentin and 1/200 TESA) were incubated for one hour. After new washings, adequate dilution of peroxidase conjugate were added for another hour, washed and bound conjugate revealed by 1 h with orto-phenylenediamine and hydrogen peroxide. After 30 min in 37°C, reaction was stopped with 4N HCl and 492 nm absorbance determined in a microplate reader (Multiskan-Titertek II).

 Statistical analysis

All quantitative data, such as O.D. ELISA, were analyzed using ANOVA after the Levene test for variance check, with intragroup comparisons by the Bonferroni's test, if there are uniformity of variances. In the absence of this homogeneity, data were analyzed by Kruskal-Wallis tests with Dunns post-tests. We opt for graphical representation of individual data in dot plot with association of mean and SEM for comparison. Qualitative analysis, as frequency of positive sera in the group, was analyzed by Fisher exact tests in two group analysis. We also included 95% confidence interval of estimated proportion. Significant difference was considered when the probability of equality (H1 = H0) was less than 0.05(p≤0.05), using two-tailed analysis and power greater than 90%. We used the statistical package GraphPad Prism 7.0 for all statistical analysis and plotting.

 Results

We analyzed the distribution of Vimentin in culture cells using indirect fluorescent assays as described in Methods, using as external controls anti-T.cruzi sera, derived from chronic infected patients for identification of the parasites in the same model, as could be seen in figure 1. LLC-MK2 cells, the host cell used for intracellular growth of T.cruzi, showed a discrete and uniform cytoplasmic staining, uniform in most cells (Figure 1A). Those cells are no reactive to anti-T-cruzi antibodies, without any staining (Figure 1B). After infection and growth of T.cruzi amastigotes, those cells express larger amounts of vimentin, with heavy staining of cytoplasm outside the parasitophorous vacuole and some particle shadowing patterns, suggesting that vimentin are associated with cell cytoplasm (Figure 1C). Vimentin could involve unstained cytoplasmic parasites, but no specific staining of parasites was seen. Those parasites were easily identified by anti-T.cruzi antibodies showing a typical morular pattern in the cytoplasm of infected cells (Figure 1D). No staining of those parasites was observed with anti-vimentin mAbs, which demonstrate the absence of antigen mimicry, both for amastigotes (Figure 1C) or extracellular parasites (Figure 1E). Those extracellular parasites are heavily stained by anti T.cruzi antibodies as well as intracellular amastigotes (Figure 1F).

Distribution of Vimentin or Trypanosoma cruzi antigen on control or infected cells and parasites. A and B) Uninfected LLC MK2 cells reacted to antivimentin abs(A) or anti-T.cruzi abs(B). C and D) T.cruzi infected LLC MK2 cells reacted to antivimentin abs(C) or anti-T.cruzi abs(D). E and F) T.cruzi promastigote forms from in vitro culture reacted to antivimentin abs (E) or anti-T.cruzi abs(F). Cells, infected cells or parasites forms were reacted with Anti Vimentin mAb or chronic infection chagasic serum and revealed with adequate conjugate (x1000) (see Methods).

Anti-vimentin auto antibodies

We search for anti-vimentin antibodies in human sera from controls or American trypanosomiasis patients. Our sample was composed by patients with well-defined clinical forms as described in Methods. Vimentin ELISA was prepared with commercial protein and antibody binding was revealed by commercial conjugates. Standardization was easily as controls were adequately negative, allowing an adequate cut-off definition. We also tested all samples in a reported high specificity ELISA assay, TESA, which uses an excreted secreted antigen in solid phase, with high reactivity in all clinical forms of American trypanosomiasis. Those assays could be seen in Figure 2. We clearly demonstrate that all patients from our sample of American trypanosomiasis react very well in TESA assay, without any false positive or dubious sample in control groups. All clinical forms presented a similar reactivity for parasite antigens, including those with asymptomatic infection. Anti-vimentin antibodies were present in most American trypanosomiasis samples, but notably, they are much more present in acute or clinical defined syndromes (76,9%), especially cardiac disease (87,9%) and digestive form 70,5%. Paradoxically, they were relatively infrequent in asymptomatic infected patients (25%), which had a clearly positive serological reaction to parasite antigens, but had low frequency of anti-vimentin antibodies, similar to controls (2,5%), p>0.05, Bonferroni's ANOVA post-test) or frequency of positive samples (Table 1) with similar conclusions. The main reactivity of these autoantibodies appears to be more intense in active cardiac or acute disease, which were associated to large parasite burden and inflammatory response than digestive or asymptomatic disease. The proportion of reagent sera was also shown in Table 1 assuming cutoff value estimated as defined in methods. The anti-vimentin ELISA reactivity of sera from patients with clinical active disease for any origin was in higher frequency than in patients without active disease or non-infected controls. Data were compared mainly with active or undetermined without clinical forms of Chagas' disease shows greater difference as expected with high statistical difference (p < 0.01) and also demonstrated by 95% confidence interval of the proportion

Sera reactivity profile of patients with different clinical forms of Chagas disease by ELISA with T. cruzi TESA antigens (A) and commercial vimentin (B). Groups were compare with ANOVA with Bonferronipost tests.

Percentage of positivity of sera with different clinical forms of Chagas disease for Vimentin antigen in the ELISA reaction
Clinical form Samples (n) Positives (n) Negatives (n) Positivity (%) 95% C.I.(p vs w/o Chagas) p VS undetermined
Acute 26 20 6 76.9 53-87 (p < 0.001) p < 0.001
Cardiac 33 29 4 87.8 67-93 (p < 0.001) p < 0.001
Digestive 17 12 5 25 42-84 (p < 0.001) p < 0.01
Symptomatic 76 61 15 80,2 70-88 (p < 0.001) p < 0.001
Undetermined 20 5 15 70,5 5-44 (p < 0.05)
Total Chagas 96 66 30 68,5 52-75 (p < 0.001)
Without Chagas 40 1 39 2,5 1-4%

*Fisher exact test

The Table 1 Summarizes the data obtained in Figure 2 and provides ELISA positivity indexes with commercial Vimentin, showing that the percentage of positive sera from the groups of chronic patients with clinical manifestations of Chagas' disease and the group of patients from the acute phase was higher than that observed in the indeterminate group of chagasic patients.

The positivity index of sera from patients in the acute phase was 76.9% with 20 positive sera from the 26 analyzed. In the group of chronic digestive tract positive percentage was 70.5% with 12 positive in the 17 analyzed, the cardiac patients had a positive percentage of 87.9% with 29 positive sera from the 23 analyzed and in the group of indeterminate patients, the Index was 25% with 5 positive of the 20 analyzed. The positivity of the non-chagasic sera was 2.5% or only a positive serum in 40 analyzed.

 Discussion

This intracytoplasmic infection resulted in altered expression of cell fibrillary proteins as vimentin, as we clearly show in immunofluorescence of infected cells. This altered vimentin production is devoid of association with the parasite, which has no reactivity with antivimentin antibodies in any form. Vimentin is important for specific virus entry, another possible cytoplasmic pathogen and are used by Foot-and-mouth disease virus (FMDV) for virus mounting inside the cells.9

This intracytoplasmic infection resulted in altered expression of cell fibrillary proteins as vimentin, as we clearly show in immunofluorescence of infected cells. This altered vimentin production is devoid of association with the parasite, which has no reactivity with anti-vimentin antibodies in any form. Viral infection alters host cell architecture similarly, as parvovirus in mice10 but other pathogens also affects vimentin distribution in infected cells, with similar perivacuolar distribution, as in Salmonella infections.11 Proteomics studies in experimental models of T.cruzi infection had shown higher plasma levels of vimentin related to disease severity,12 which can offer to the immune response intracellular filaments for antibody production. Those data were expected as vimentin autoantibodies could be related to antigen exposure during active infection, as proposed in experimental models of T.cruzi infection.12 Several other immune diseases that interact with cardiac muscle cells also presented anti-vimentin antibodies. Murine models of viral myocarditis presented those antibodies13 and as well as post-streptococcal rheumatic fever patients14. Noninfectious myocarditis, as in coronary artery disease patients15 and kidney or heart transplants recipients16 also showed those antibodies resulted from any exposure of antigen, unregard the origin of cardiac muscle cell damage. Our data were similar to those findings and anti-vimentin antibodies induced during T.cruzi infection could be a marker of active disease in the host and its levels could also justify drug therapy in American Trypanosomiasis chronic infection, as a large group of asymptomatic or indeterminate patients would be submitted to treatment with frequent adverse reactions of the available drugs. Anti-vimentin antibodies could be a marker of cardiac muscle cell damage, appearing in American Trypanosomiasis patients during active muscle cell damage.

 Conclusions

Our data revealed that anti-vimentin antibodies induced during activity of T. cruzi infection could be a marker of active disease in the host, despite absence of evident clinical involvement. This assay could be also a non-invasive follow-up test during drug therapy in Chagas' disease or American Trypanosomiasis. This test could allow the selection of possible active patients for therapy and also to supply a marker of disease activity after therapy, avoiding that a large group of asymptomatic patients without active disease were submitted to treatment with frequent adverse reactions. Anti-vimentin antibodies could be a marker of cardiac muscle cell inflammatory involvement, showed by American Trypanosomiasis patients with active muscle cell damage and must be tested in other cardiac muscle inflammatory conditions as viral myocarditis.

Sources of Funding

This study was funded by FMUSP.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Marilda Savoia Nascimento, from Universidade de São Paulo.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Hospital das Clinicas da Universidade de São Paulo under the protocol number 0564/08. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.

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Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Nascimento MS, Stolf AMS, Umezawa ES; Obtenção de dados: Nascimento MS, Stolf MAS; Análise e interpretação dos dados: Nascimento MS, Stolf AMS, Andrade Junior HF, Pandey RP, Umezawa ES; Análise estatística: Nascimento MS, Andrade Junior HF; Obtenção de financiamento: Nascimento MS, Umezawa ES; Redação do manuscrito: Nascimento MS, Stolf AMS, Pandey RP; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Nascimento MS, Andrade Junior HF, Pandey RP.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

A Vimentina é uma proteína estrutural importante da célula, um componente dos filamentos celulares intermediários e imersa no citoplasma. Algumas proteínas bacterianas imitam a Vimentina e anticorpos anti-vimentina ocorrem em doenças cardíacas auto-imunes, como a febre reumática. Neste trabalho, estudamos a distribuição de vimentina em células LLC-MK2 infectadas com T. Cruzi e anticorpos anti-vimentina em soros de várias imagens clínicas da doença de Chagas ou tripanossomíases americanas, a fim de elucidar qualquer implicação da vimentina na resposta humoral desta patologia.

 Objetivo:

padronizamos um teste de imunofluorescência indireta (IFI) para determinar a expressão subcelular em parasitas e células hospedeiras, e ELISA para testar anticorpos anti-vimentina em soros de pacientes chagásicos.

 Métodos:

analisamos a distribuição de vimentina em células de cultura usando ensaios fluorescentes indiretos, utilizando como controles externos soros anti-T. Cruzi, derivados de pacientes com infecção crônica para a identificação de parasitas no mesmo modelo. Após a infecção e o crescimento de amastigotas de T. Cruzi, essas células expressam grandes quantidades de vimentina, com forte coloração do citoplasma fora da vacuola parasitófora e alguns padrões de sombreamento das partículas, sugerindo que a vimentina está associada ao citoplasma da célula. Os anticorpos anti-vimentina estavam presentes na maioria das amostras americanas de tripanossomíases, mas estão notavelmente mais presentes em síndromes agudas ou clinicamente definidas (76,9%), especialmente em doenças cardíacas (87,9%). Paradoxalmente, eram relativamente infrequentes em pacientes infectados assintomáticos (25%), que apresentavam uma reação sorológica claramente positiva aos antígenos parasitas, mas apresentavam baixa frequência de anticorpos anti-vimentina, semelhante aos controles (2,5%).

 Conclusão:

Nossos dados atuais revelaram que os anticorpos anti-vimentina induzidos durante a infecção por T. Cruzi poderiam ser um marcador de doença ativa no hospedeiro e seus níveis também poderiam justificar o tratamento farmacológico em infecção crônica com tripanossomíase americana, uma vez que um grande grupo de pacientes assintomáticos seria submetido a tratamento com reações adversas frequentes aos medicamentos disponíveis. Os anticorpos anti-vimentina poderiam ser um marcador de danos nas células do músculo cardíaco, que aparece em pacientes com tripanossomíase americana durante o dano das células musculares ativas.

 Palavras-chave: Doença de Chagas Cardiopatias Trypanossoma Cruzi Febre Reumática Vimentina Anticorpos Monoclonais Introdução

A doença de Chagas ou a tripanossomíase americana é uma infecção parasitária peculiar, uma vez que o Trypanosoma cruzi é um parasita intracelular único que causa a presença citoplasmática de formas de amastigota, um evento celular raro na natureza, já que o citoplasma é geralmente livre de parasitas em quase todas as infecções intracelulares.1 Após sua reprodução, o parasita tem um conjunto de enzimas, como as sialidases, que transferem moléculas da célula hospedeira para a sua superfície, permitindo a evasão celular sem interrupção.2 Todos esses processos poderiam alterar o citoesqueleto celular e suas proteínas, provavelmente gerando sinais nas células hospedeiras que alteram a síntese proteica de proteínas estruturais. A vimentina é uma proteína estrutural importante da célula, um componente de filamentos celulares intermediários imersos no citoplasma.3 A vimentina é expressa no músculo cardíaco normal e seus tumores, e os autoanticorpos contra a vimentina são encontrados na rejeição do aloenxerto4 ou em modelos cardíacos de rejeição de aloenxerto.5 A vimentina é imitada por algumas proteínas bacterianas e anticorpos anti-vimentina são produzidos em doenças cardíacas autoimunes, como a febre reumática.6 Neste trabalho, estudamos a distribuição de vimentina em células LLC-MK2 infectados com T.cruzi e anticorpos anti-vimentina em soros de várias imagens clínicas de tripanossomíases americanas, a fim de elucidar qualquer envolvimento da vimentina na resposta humoral dessa patologia.

 Métodos Parasitas e amostras de soro

Os epimastigotas de Trypanosoma cruzi foram cultivados a partir da cepa Y rotineiramente mantida em nosso laboratório em meio de cultura de Infusión de Hígado y Triptosa (IHT) suplementada com 10% de soro de vitelo fetal. Os tripomastigotas de T. Cruzi foram obtidos a partir de sobrenadantes de cultura de células LLC-MK2 previamente infectadas. O anticorpo monoclonal Anti-Vimentina de rato (V6630) e a vimentina da lente bovina foram obtidos comercialmente (Sigma Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA). Soro de um paciente com tripanossomíase americana cardíaca crônica foi usado como anticorpo anti-T.cruzi. Foram utilizados soros humanos de pacientes com Tripanossomíase americana e controles do biorepositório de pacientes com T.cruzi, ESUmezawa, Lab.Protozoology, foram recuperadas amostras de E.S.Umezawa, Lab.Protozoology IMTSP, serologicamente caracterizadas em testes sorológicos TESA específicos e publicadas anteriormente em vários artigos, compreendendo 26 soros de doença aguda, 33 de doença cardíaca isolada, 17 de doença digestiva isolada, 20 sem doença clínica (doença assintomática) e 40 soros de pacientes fora da área endêmica. Todos os dados clínicos foram mantidos pelo médico assistente e não estão disponíveis para este estudo.

 Expressão e morfologia do antígeno

Todos os testes morfológicos foram realizados em um microscópio epifluorescente Zeiss Axioplan com filtros de fluoresceína. Para a detecção do antigénio, fixamos células de controle LLC-MK2, células LLC-MK2 infectadas com T.cruzi e epimastigotas de T. Cruzi e impregnamos a superfície celular com Triton X-1007 com anticorpos anti Vimentin ou anti T.cruzi como é descrito em outra parte. Após este passo, os anticorpos ligados foram revelados com um conjugado de fluoresceína adequado, lavados cuidadosamente e montados em glicerina para observação. Os campos representativos foram digitalizados no campo de alta potência com uma câmera Canon.

 TESA e ELISA vimentina

O antígeno excretado secretado de tripomastigotas de T.cruzi foi obtido como descrito em outra parte.8 TESA (1/80) e Vimentina (0,06 ug / ml) em carbonato 0,05 M pH 9,6 foram adsorvidos durante a noite aos poços de placas ELISA de 96 poços (Corning Inc. New York, EUA). Após a lavagem e bloqueio com PBS Tween 20, 0,05% mais 5% de leite ou 0,5% de BSA, incubaram-se diluições adequadas de soro (1/50 vimentina e 1/200 TESA) durante uma hora. Após lavagens adicionais, se adicionou diluição adequada do conjugado de peroxidase durante mais uma hora, se lavou e ligou o conjugado desenvolvido durante 1 h com ortofenilenodiamina e peróxido de hidrogénio. Após 30 minutos a 37°C, a reação foi parada com HC1 4N e a absorvência de 492 nm foi determinada num leitor de microplacas (Multiskan-Titertek II).

 Análise estatística

Todos os dados quantitativos, como O.D. ELISA, foram analisados usando ANOVA após o teste Levene para verificação de variância, com comparações intragrupo pelo teste de Bonferroni, se houver uniformidade de variâncias. Na ausência dessa homogeneidade, os dados foram analisados por testes de Kruskal-Wallis com pós-testes de Dunns. Optamos pela representação gráfica de dados individuais em trama de pontos com associação de média e SEM para comparação. A análise qualitativa, como frequência de soros positivos no grupo, foi feita por testes exatos de Fisher em duas análises de grupo. Também incluímos 95% de intervalo de confiança da proporção estimada. A diferença significativa foi considerada quando a probabilidade de igualdade (H1 = H0) foi inferior a 0,05 (p ≤ 0,05), utilizando análise de duas colunas e potência superior a 90%. Utilizamos o pacote estatístico GraphPad Prism 7.0 para todas as análises estatísticas e plotagem.

 Resultados

Analisamos a distribuição de Vimentina em células de cultura usando ensaios de fluorescência indireta como descrito em Métodos, utilizando como controle externo soros de anti-T. Cruzi, derivado a partir de pacientes com infecção crónica por identificação dos parasitas no mesmo modelo, como pode ser visto na Figura 1. As células LLC-MK2, a célula hospedeira utilizada para o crescimento intracelular de T. Cruzi, apresentaram coloração citoplasmática discreta e uniforme na maioria das células (Figura 1A). Essas células não são reativas aos anticorpos anti-T-cruzi, sem qualquer coloração (Figura 1B). Após a infecção e o crescimento de amastigotas de T. Cruzi, essas células expressam quantidades elevadas de vimentina, com forte coloração de citoplasma fora do vacúolo parasitóforo e algumas partículas com padrões de sombreamento, sugerindo que a vimentina está associada com o citoplasma da célula (Figura 1C). A vimentina poderia envolver parasitas citoplasmáticos não corados, mas não foi observada coloração específica de parasitas. Estes parasitas foram facilmente identificados por anticorpos anti-T. Cruzi mostrando um padrão morfológico típico no citoplasma de células infectadas (Figura 1D). Não se observou qualquer coloração destes parasitas mAbs anti-vimentina, demonstrando a ausência de mimetismo antigénico, para os amastigotas (Figura 1C) e os parasitas extracelulares (Figura1E). Estes parasitas extracelulares são fortemente corados por anticorpos de T. Cruzi, bem como por amastigotas intracelulares (Figura 1F).

Distribuição do antígeno de Vimentina ou Trypanosoma cruzi em células de controle ou infectadas e parasitas. A e B) células LLC MK2 não infectadas reagiram a anti-vimentina abs (A) ou anti-T.cruzi abs (B). C e D) Células MK2 infectadas. Células LLC MK2 infectadas com T.cruzi reagiram a anti-vimentina abs (C) ou anti-T.cruzi abs (D). E e F) Formas de cultura in vitro de promastigotas T.cruzi reagiram a anti-vimentina abs (E) ou anti- T.cruzi abs (F). As células, células infectadas ou formas parasitas foram reagidas com mAb anti-vimentina ou soro de Chagas cronicamente infectado e reveladas com um conjugado adequado (x1000) (ver Métodos).

Autoanticorpos anti-vimentina

Procuramos anticorpos anti-vimentina em soros humanos de controles ou pacientes com tripanossomíase americana. Nossa amostra foi composta de pacientes com formas clínicas bem definidas, conforme descrito em Métodos. O ELISA Vimentina foi preparado com proteína comercial e a ligação do anticorpo foi revelada por conjugados comerciais. A padronização foi fácil, pois os controles foram adequadamente negativos, permitindo uma definição de corte adequada. Nós também testamos todas as amostras em um ensaio ELISA de alta especificidade, o TESA, o qual usa um antígeno secretado excretado em fase sólida, com alta reatividade em todas as formas clínicas de tripanossomíases americanas. Esses ensaios podem ser vistos na Figura 2. Nós demonstramos claramente que todos os pacientes em nossa amostra de tripanossomíase americana reagiram muito bem no teste TESA, sem amostras falso positivas ou duvidosas nos grupos controle. Todas as formas clínicas apresentaram uma reatividade similar para os antígenos parasitas, incluindo aqueles com infecção assintomática. Os anticorpos anti-vimentina estavam presentes na maioria das amostras de tripanossomíases americanas, mas eles estão notavelmente mais presentes em síndromes agudas ou definidas clinicamente (76,9%), especialmente doenças cardíacas (87,9%) e formas digestivas em 70,5%. Paradoxalmente, eram relativamente infrequentes em pacientes infectados assintomáticos (25%), que apresentavam uma reação sorológica claramente positiva aos antígenos parasitas, mas apresentavam baixa frequência de anticorpos anti-vimentina, semelhante aos controles (2,5%), p > 0,05, teste ANOVA de Bonferroni) ou frequência de amostras positivas (Tabela 1) com conclusões semelhantes. A principal reatividade desses autoanticorpos parece ser mais intensa em doença cardíaca ativa ou aguda, que foi associada a grande carga parasitária e resposta inflamatória mais do que a doença digestiva ou assintomática. A proporção de soro reativo também foi mostrada na Tabela 1, assumindo que o valor de corte é estimado como definido nos métodos. A reatividade ELISA anti-vimentina dos soros de pacientes com doença clínica ativa para qualquer origem teve maior frequência do que em pacientes sem doença ativa ou controles não infectados. Os dados foram comparados principalmente com ativos ou indeterminados sem formas clínicas de doença de Chagas mostrando uma diferença maior como era esperado com alta diferença estatística (p < 0,01) e também foi demonstrado por um intervalo de confiança de 95% da proporção.

Perfil de reatividade dos soros de pacientes com diferentes formas clínicas de doença de Chagas por ELISA com antígenos T. Cruzi TESA (A) e vimentina comercial (B). Os grupos foram comparados com a ANOVA com testes posteriores de Bonferroni.

Porcentagem de positividade de soro com diferentes formas clínicas de doença de Chagas para o antígeno Vimentin na reação ELISA
Forma clínica Amostras (n) Positivos (n) Negativos (n) Positividade (%) 95% I.C.(p vs w/o Chagas) V p Indeterminado
Aguda 26 20 6 76.9 53-87 (p < 0,001) p < 0,001
Cardíaca 33 29 4 87.8 67-93 (p < 0,001) p < 0,001
Digestiva 17 12 5 25 42-84 (p < 0,001) p < 0,01
Simtomática 76 61 15 80,2 70-88 (p < 0,001) p < 0,001
Indeterminada 20 5 15 70,5 5-44 (p < 0,05)
Chagas Total 96 66 30 68,5 52-75 (p < 0,001)
Sem Chagas 40 1 39 2,5 1-4%

* Test exato de Fisher

A Tabela 1 Resume os dados obtidos na Figura 2 e fornece índices positivos de ELISA com Vimentina comercial, mostrando que a porcentagem de soro positivo dos grupos de pacientes crônicos com manifestações clínicas da doença de Chagas e o grupo de pacientes da fase aguda foi maior que o observado no grupo indeterminado de pacientes chagásicos.

O índice positivo dos soros dos pacientes na fase aguda foi de 76,9% com 20 soros positivos dos 26 analisados. Na porcentagem positiva, o grupo digestivo crônico foi de 70,5% com 12 positivos nos 17 pacientes analisados, os pacientes cardíacos tiveram uma porcentagem positiva de 87,9% com 29 soros positivos dos 23 analisados e no grupo de pacientes indeterminados, o índice foi de 25% com 5 pontos positivos dos 20 analisados. A positividade dos soros não chagásicos foi de 2,5% ou apenas um soro positivo em 40 analisados.

 Discussão

Esta infecção intracitoplasmática resultou em expressão alterada de proteínas fibrilares celulares, como a vimentina, como mostramos claramente na imunofluorescência de células infectadas. Esta produção alterada de vimentina é desprovida de associação com o parasita, a qual não possui reatividade com anticorpos anti-vimentina de qualquer forma. A vimentina é importante para a entrada de vírus específicos, outro possível patógeno citoplasmático e é utilizado pelo vírus da febre aftosa (VFA) para o crescimento de vírus dentro das células.9

A infecção viral altera a arquitetura da célula hospedeira de forma semelhante, como o parvovírus em ratos,10 mas outros agentes patogênicos também afetam a distribuição de vimentina em células infectadas, com uma distribuição perivacuolar semelhante, como nas infecções por Salmonella.11 Estudos proteômicos em modelos experimentais da infecção por T.cruzi mostrou níveis plasmáticos de vimentina relacionados à gravidade da doença,12 que podem oferecer filamentos intracelulares de resposta imune para a produção de anticorpos. Estes dados eram esperados, uma vez que os autoanticorpos da vimentina poderiam estar relacionados à exposição ao antígeno durante a infecção ativa, conforme proposto em modelos experimentais de infecção por T.cruzi.12 Várias outras doenças imunes que interagem com células musculares cardíacas também apresentaram anticorpos anti-vimentina. Os modelos murinos de miocardite viral apresentaram esses anticorpos13 assim como também pacientes com febre reumática pós-estreptocócica.14 A miocardite não infecciosa, como em pacientes com doença arterial coronária15 e receptores de transplantes renais ou cardíacos16 também mostrou os anticorpos resultantes de qualquer exposição ao antígeno, sem levar em conta a origem do dano às células do músculo cardíaco. Nossos dados foram semelhantes a esses achados e os anticorpos anti-vimentina induzidos durante a infecção por T.cruzi podem ser um marcador de doença ativa no hospedeiro e seus níveis também podem justificar o tratamento farmacológico em infecção crônica com tripanossomíase americana, já que um grande grupo de pacientes assintomáticos ou indeterminados seriam submetidos a tratamento com frequentes reações adversas aos medicamentos disponíveis. Os anticorpos anti-vimentina podem ser um marcador de danos às células do músculo cardíaco, aparecendo em pacientes com tripanossomíase americana durante o dano das células musculares ativas.

 Conclusões

Nossos dados revelaram que os anticorpos anti-vimentina induzidos durante a atividade da infecção por T. Cruzi poderiam ser um marcador de doença ativa no hospedeiro, apesar da ausência de comprometimento clínico óbvio. Este ensaio também pode ser um teste de seguimento não-invasivo durante o tratamento farmacológico na doença de Chagas ou na tripanossomíase americana. Este teste poderia permitir a seleção de potenciais pacientes ativos para terapia e também fornecer um marcador de atividade da doença após a terapia, impedindo que um grande grupo de pacientes assintomáticos sem doença ativa seja submetido ao tratamento com reações adversas frequentes. Os anticorpos anti-vimentina podem ser um marcador da afecção inflamatória das células do músculo cardíaco apresentadas por pacientes com tripanossomíase americana com dano celular ativo e devem ser analisados em outras condições inflamatórias do músculo cardíaco, como a miocardite viral.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pelo FMUSP.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Marilda Savoia Nascimento pela Universidade de São Paulo.

Aprovação ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital das Clinicas da Universidade de São Paulo sob o número de protocolo 0564/08. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.