Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC TN4QLtchqLZBgwZY54Gwm7G S0066-782X2018000300263 10.5935/abc.20180053 Original Articles Hypertension Exercise Training Attenuates Sympathetic Activity and Improves Morphometry of Splenic Arterioles in Spontaneously Hipertensive Rats Lemos Marina de Paiva 1 Mota Gustavo Ribeiro da 1 Marocolo Moacir 2 Sordi Carla Cristina de 1 Chriguer Rosângela Soares 3 Barbosa Octávio Neto 1 Universidade Federal do Triângulo Mineiro Uberaba MG Brazil Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), Uberaba, MG - Brazil Universidade Federal do Triângulo Mineiro Universidade Federal de Juiz de Fora Juiz de Fora MG Brazil Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), Juiz de Fora, MG - Brazil Universidade Federal de Juiz de Fora Universidade Federal de São Paulo São Paulo SP Brazil Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP - Brazil Universidade Federal de São Paulo Mailing Address: Marina de Paiva Lemos, Rua dos Inconfidentes, 242 apt. 102. Postal Code 38025-410, Nossa Senhora da Abadia, Uberaba, MG - Brazil. E-mail: marina_plemos@hotmail.com

Author contributions

Conception and design of the research: Barbosa Neto O; Acquisition of data: Lemos MP, Sordi CC; Analysis and interpretation of the data: Lemos MP, Mota GR, Marocolo Júnior M, Sordi CC, Chriguer RS, Barbosa Neto O; Statistical analysis: Lemos MP, Barbosa Neto O; Writing of the manuscript: Lemos MP; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Mota GR, Marocolo Júnior M, Sordi CC, Chriguer RS, Barbosa Neto O.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 03 2018 110 3 263 269 23 06 2017 06 10 2017 06 10 2017 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited Abstract Background:

Alterations in the structure of resistance vessels contribute to elevated systemic vascular resistance in hypertension and are linked to sympathetic hyperactivity and related lesions in target organs.

 Objective:

To assess the effects of exercise training on hemodynamic and autonomic parameters, as well as splenic arteriolar damages in male Wistar Kyoto (WKY) and Spontaneously Hypertensive Rats (SHR).

 Methods:

Normotensive sedentary (WKYS) and trained (WKYT) rats, and hypertensive sedentary (SHRS) and trained (SHRT) rats were included in this study. After 9 weeks of experimental protocol (swimming training or sedentary control), arterial pressure (AP) and heart rate (HR) were recorded in freely moving rats. We assessed the autonomic control of the heart by sympathetic and vagal autonomic blockade. Morphometric analyses of arterioles were performed in spleen tissues. The statistical significance level was set at p < 0.05.

 Results:

Resting bradycardia was observed in both trained groups (WKYT: 328.0 ± 7.3 bpm; SHRT: 337.0 ± 5.2 bpm) compared with their respective sedentary groups (WKYS: 353.2 ± 8.5 bpm; SHRS: 412.1 ± 10.4 bpm; p < 0.001). Exercise training attenuated mean AP only in SHRT (125.9 ± 6.2 mmHg) vs. SHRS (182.5 ± 4.2 mmHg, p < 0.001). The WKYT showed a higher vagal effect (∆HR: 79.0 ± 2.3 bpm) compared with WKYS (∆HR: 67.4 ± 1.7 bpm; p < 0.05). Chronic exercise decreased sympathetic effects on SHRT (∆HR: -62.8 ± 2.8 bpm) in comparison with SHRS (∆HR: -99.8 ± 9.2 bpm; p = 0.005). The wall thickness of splenic arterioles in SHR was reduced by training (332.1 ± 16.0 µm2 in SHRT vs. 502.7 ± 36.3 µm2 in SHRS; p < 0.05).

 Conclusions:

Exercise training attenuates sympathetic activity and AP in SHR, which may be contributing to the morphological improvement of the splenic arterioles.

 Keywords: Exercise Physical Exertion Hypertension Vascular Resistance Arterioles Rats Introduction

Essential hypertension is inwardly connected to the blood vessels and is characterized by chronic increases in peripheral vascular resistance, mainly resulting from functional and structural alterations of the microcirculation. These lesions can be both the cause and the consequence of the elevation of arterial pressure (AP).1 The major pathways that interact to develop morphological changes in arteriolar vessels in hypertension may compromise the splenic vessels (arteriolar hyalinosis, fibrinoid necrosis) and the interstitial space, causing fibrosis.2-5 The arteriolar hyalinosis occurs by filtration of plasma proteins through the endothelium. It is not exclusive of any disease, being observed in arterioles of normal aging, especially in arterioles of the spleen. However, it occurs earlier and more intense in arterial hypertension.6

The autonomic nervous system plays a key role in the stabilization of AP control for maintaining homeostasis. In this respect, the literature data show that the sympathetic nervous system (SNS) can reciprocate incisively in the development of some forms of hypertension. Evidence of the participation of this system in the control of normal cardiovascular and metabolic functions and its role in the genesis and maintenance of several diseases is broad. The importance of understanding the workings of the SNS and systems related to it is essential not only to elucidate the path physiology of some diseases, but to understand how drugs that act on the adrenergic system interfere with the evolution of pathologies significantly altering the prognosis of patients.7

Experimental evidence has shown that chronic exercise produces beneficial effects on the cardiovascular system via alterations in neural control of the circulation. These effects include reductions in AP, sympathetic activity8 and vascular resistance9 concomitantly with attenuation in the target-organ damage.10 If there is relation between exercise training and decrease of vascular resistance, the mechanisms by which chronic exercise training improves splenic arteriolar morphometry are not well established. Thus, the aim of this study was to assess the effects of exercise training on sympathetic activity and arteriolar damages in spleens of spontaneously hypertensive rats (SHR).

 Methods Animal model and exercise training protocol

Forty male SHR and Wistar Kyoto rats (WKY) aged 45-50 weeks were randomly assigned into four experimental groups of 10 rats each: SHRT and WKYT (that were submitted to exercise training protocol by swimming) or SHRS and WKYS (that were kept sedentary for a similar period of time). The sample size (n) was determined based on studies that evaluated the effects of exercise training on hypertension. These studies served as the basis for the present study that investigates the cardiovascular effects of the accumulated exercise.11,12 All animals were kept in grouped cages (n = 3) at room temperature around 23ºC, humidity of 40-70% and photoperiod of 12-hour light/dark cycle. Efforts were made to avoid any unnecessary distress to the rats, in accordance to the Brazilian Council for Animal Experimentation. All animal protocols were approved by the local Experimental Animal Use Committee (#271/2013), and were performed according to the regulations set forth by the National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals.

The swimming exercise protocol was performed in a glass tank and ambient water temperature was kept at 30º ± 1ºC. The trained animals received a 20-min adaptation period on the first day, with increases of 10 min each day until reaching 1 hour on the fifth day.13 After this period, the rats trained 5 days/week with a gradual progression toward a 2-hour session during nine weeks. This protocol is defined as an aerobic endurance and low-intensity training, as the animals swam without additional work load, this method corresponds the intensity below the anaerobic threshold in rats.14 Sedentary animals were placed in the swimming apparatus for 10 min twice a week to mimic the water stress associated with the experimental protocol.

 Surgical procedures and hemodynamic parameters recording

Twenty-four hours after the last exercise training session, all animals were anesthetized with sodium pentobarbital (40 mg/kg ip) and cannulas of polyethylene (PE-10) were implanted into the femoral artery for cardiovascular recording and into the femoral vein for drug infusion. Then, the polyethylene catheters were exteriorized at the posterior neck region of the animal. Rats received food and water ad libitum and were studied 1 day after catheter placement. Prophylactic treatment with antibiotics and anti-inflammatory drugs were performed to prevent postsurgical infections and inflammation, respectively.15 After 48 hours of recovery from the anesthesia and surgery, the arterial cannula was connected to an AP transducer and a signal amplifier (Model 8805A, Hewlett-Packard, USA) was converted by the analog-digital signal plate (sampling frequency - 1000 Hz) by a computerized system data acquisition (Aqdados, Tec Lynx. Eletron. SA, Sao Paulo, Brazil) and stored on computer. The animals were maintained in a peaceful environment for a period of 15 minutes and adaptive later pulsatile AP was continuously recorded at baseline for 30 minutes. During the experimental procedure, systolic AP (SAP), diastolic AP (DAP), mean AP (MAP) and heart rate (HR) were derived from pulsatile AP.

 Cardiac autonomic tonus

To evaluate the exercise training influence on the tonic autonomic control of the heart, we also performed the sympathetic and vagal autonomic blockade after propranolol (5 mg/kg, i.v.) and atropine (4mg/kg, i.v.) injections, respectively, to calculate the sympathetic and vagal effects, as well as the intrinsic HR (iHR) and tonic sympathovagal index.14 The autonomic blockers were administered in a random sequence with a 15-min interval between them. After double blockade, the cardiovascular recordings lasted for 15 min. Briefly, the sympathetic effect was considered as the difference between the HR after sympathetic blockade and resting HR. Vagal effect was calculated as the difference between HR after vagal blockade and resting HR. The tonic sympathovagal index was obtained as the ratio between resting HR and iHR, considering that the iHR was the HR obtained after double autonomic blockade.16

Analysis of splenic arteriolar morphometry

All animals were anesthetized with sodium pentobarbital and euthanatized with a lethal dose of potassium chloride. Their spleens were excised postmortem and immersed in saline (0.9%) to remove excess blood. Shortly after, the organs were placed on foil, previously treated and weighed in a semi-analytical Gehaka BG2000®. Subsequently, the material was cut and placed inside a sterilized glass with 10% formaldehyde. Thereupon, the material was dehydrated using ethanol at concentrations of 80%, 90% and 95%. Diaphanization was performed with xylol. The material was placed in containers containing liquid paraffin at 60ºC. Then, the material was placed in blocks. Histological 2-µm cuts were performed using a microtome and then the material were mounted in glass slides and stained with Masson's Trichrome Blue. The area of the inner and outer layers of each arteriole was quantified by using common light microscope for capturing the images and the imageJ program to check the area of each layer. At the end of the procedures for quantification of the area of each layer, the thickness of each arteriole was obtained.

 Statistical analysis

Shapiro-Wilks and Levene's tests were used to evaluate the normality and homogeneity of the sample. Results were expressed as mean ± SD (for normally distributed variables) or median with upper and lower quartiles (for non-normally distributed variables). For parametric data, we used two-way ANOVA (etiology vs. intervention), with the Tukey as a post hoc test. The nonparametric data were analyzed by the Mann-Whitney test. Pearson coefficient was used to test the correlation between sympathetic effect with area of outer wall thickness and total area thickness. Probability values of P < 0.05 were considered statistically significant. Analyses were performed using SigmaStat® v. 2.03 (SPSS, Chicago, IL, USA).

 Results

The SHRS showed higher resting HR in comparison to WKYS (p < 0.001). As expected, both trained groups presented higher resting bradycardia compared with their respective sedentary groups (p < 0.001; Figure 1A).

Baseline recording of heart rate (1A), systolic arterial pressure (1B), mean arterial pressure (1C) and diastolic arterial pressure (1D) in freely moving rats. WKY<sub>S</sub> (sedentary normotensive rats); WKY<sub>T</sub> (trained normotensive rats); SHR<sub>S</sub> (sedentary hypertensive rats); SHR<sub>T</sub> (trained hypertensive rats). Bars in figures 1A and 1C represent mean ± SD. Results in figures 1B and 1D are expressed as median (interquartile range). <sup>#</sup>p < 0.05 vs. WKY<sub>S;</sub> *p < 0.001 vs. WKY<sub>S</sub>; <sup>†</sup>p < 0.001 vs. WKY<sub>T</sub> and <sup>‡</sup>p < 0.001 vs. SHR<sub>S</sub>.

Exercise training also was able to decrease baseline SAP (p < 0.001; Figure 1B), MAP (p < 0.001; Figure 1C) and DAP (p < 0.001; Figure 1D) in hypertensive animals compared with their respective sedentary group. The SHRS presented higher pressure levels than WKYS (p < 0.001) and WKYT (p < 0.001) groups. After the 9-week training period, the AP was similar in WKYT and WKYS.

To evaluate the influence of chronic exercise on the tonic autonomic control of the heart, we performed the vagal and sympathetic autonomic blockade with atropine and propranolol injections, respectively, to calculate the vagal (Figure 2A) and sympathetic effects (Figure 2B), as well as the tonic sympathovagal index (Figure 2C) and iHR (Figure 2D). No difference on vagal effect was observed between the hypertensive groups. However, the WKYT group evidenced a higher vagal effect than the WKYS group (p < 0.05). Both hypertensive groups presented a lower vagal effect when compared with their respective normotensive groups (p < 0.001). In addition, no difference in the sympathetic effect was observed between the normotensive groups (p = 0.563). On the other hand, the SHRT group showed a lower sympathetic effect as compared with SHRS group (p = 0.005). Both normotensive groups had a lower sympathetic effect when compared with their respective hypertensive groups (p < 0.001). The sympathovagal index was lower in SHRT than in SHRS (p < 0.05). No difference was observed between the groups regarding iHR.

Effects of exercise training on the tonic autonomic control of the heart rate (HR) in non-anesthetized rats. (2A) vagal and (2B) sympathetic effects were obtained, respectively, by the difference between vagal blockade (by atropine) or sympathetic blockade (by propranolol) and resting HR. (2C) Sympathovagal balance was expressed by the tonic sympathovagal index, which is the ratio between resting and intrinsic HR (iHR). (2D) Intrinsic HR (bpm) obtained after autonomic double pharmacological blockade. Bars represent mean ± SD. *p < 0.05 vs. WKY<sub>S;</sub> <sup>†</sup>p < 0.05 vs. WKY<sub>T</sub> and <sup>‡</sup>p < 0.05 vs. SHR<sub>S</sub>.

Morphometric analysis after histological processing revealed profound changes in microcirculatory profile of spleen circulation induced by training in hypertensive animals (Table 1). As expected, hypertensive splenic arterioles had a thicker wall than normotensive arterioles (p < 0.001). Despite this, exercise training was effective to normalize SHR arteriole wall/lumen ratio in spleen tissues analyzed when compared with that of SHRS (p < 0.001). The SHRS also presented a greater area of outer wall thickness when compared to WKYS and WKYT (p < 0.001). After exercise training protocol, the SHRT obtained a reduction in the area of the outer wall thickness compared to SHRS (p < 0.001). Similar results were observed in the total area thickness. The SHRS had a higher total area thickness of the splenic arterioles than the normotensive groups (p < 0.005). In addition, the SHRT evidenced an attenuation in total area thickness of splenic arterioles when compared with SHRS (p < 0.005).

Values related to morphological analysis of the area of the wall thickness of splenic arterioles.
Thickness area WKYS (n = 10) WKYT (n = 10) SHRS (n = 10) SHRT (n = 10)
Inner wall (µm2) 60.5 ± 3.4 58.8 ± 2.3 87.3 ± 3.3*† 58.0 ± 2.6‡
Outer wall (µm2) 419.8 ± 29.3 405.6 ± 21.7 632.4 ± 29.1*† 418.8 ± 16.4‡
Total area (µm2) 335.6 ± 44.7 349.7 ± 35.8 502.7 ± 36.3*† 332.1 ± 16.0‡

Data are expressed as mean ± SD. Abbreviations: WKYS, sedentary normotensive rats; WKYT, trained normotensive rats; SHRS, sedentary hypertensive rats; SHRT, trained hypertensive rats. Data expressed as mean ± SEM

p < 0.05 vs. WKYS;

p < 0.05 vs. WKYT and

p < 0.05 vs. SHRS.

Further analysis showed a significant association between sympathetic effect and area of outer wall thickness (r = 0.67, p < 0.005; Figure 3A), sympathetic effect and total area thickness (r = 0.52, p < 0.05; Figure 3B), sympathovagal index and area of outer wall thickness (r = 0.72, p < 0.001; Figure 3C) and sympathovagal index and total area thickness (r = 0.64, p < 0.005; Figure 3D).

Correlation coefficient between sympathetic effect and outer wall thickness (A), sympathetic effect and total area thickness (B), sympathovagal index and outer wall thickness (C), sympathovagal index and total area thickness (D).

Discussion

Our main findings confirmed the efficacy of exercise training to attenuate sympathetic overactivity and to lower AP in hypertensive animals, showing, in addition, that the training-induced, sympathetic-lowering effect was associated with normalization of abnormal splenic artery diameter, decreasing the degree of vascular injury in spleen. The morphometric analysis of small vessels employed in the present study revealed that the splenic vascular adjustments are specific for the SHRT. It is well documented that chronic physical exercise attenuates sympathetic hyperactivity10 and arteriolar damage on hypertension.17 To our knowledge, however, this is one of the first reports to evidence association between a reduction in splenic arteriole injury and sympathetic activity.

The cause-effect relation between hypertension and arteriolar damage (hypertrophy) is well established.18-20 In this sense, the literature evidences that an effective antihypertensive treatment should aim not only to reduce AP but also to correct injuries associated with hypertension, such as the altered vascular structure. A previous study has shown the efficacy of training to normalize arteriole wall/lumen ratio, evidencing that arteriolar response as well as vascular resistance reduction after exercise training were significantly correlated with AP reduction.21 Experimental study has found that arteriole wall/lumen ratios were reduced by increased internal and/or external diameter, which is a characteristic pattern for vascular remodeling.21 Of importance is the demonstration that exercise training, by reversing lumen encroachment, normalizes enlarged wall/lumen ratio of small arterioles in hypertensive rats. These data are in accordance with the results found in our study.

Results from studies with animal models indicate that a sustained elevation of sympathetic tonus stimulates smooth muscle cell hypertrophy, suggesting that sympathetic overactivity may contribute to changes in arterial wall thickness.22 In this way, an interesting finding in our study was a positive and significant correlation between sympathetic hyperactivity and splenic arterioles wall thickness in hypertensive rats, corroborating with results from other investigators who demonstrated that hypertension is associated with sympathetic overactivity that alters vasomotor control resulting in several abnormalities in tissue microcirculation, such as increased arteriolar wall-to-lumen ratio and decreased vessel density, which contribute to maintain an elevated total peripheral resistance.23-28 Another important finding in our research was that exercise training was able to attenuate sympathetic activity in SHR and that this effect was associated with a reduction in splenic arteriole wall thickness. Exercise training produces beneficial effects on cardiovascular system in normal and sick people via alterations (or modifications) in the neural control of circulation.29,30 These effects include reductions in AP, sympathetic outflow in humans,31,32 as well as in animal models,33,34 and vascular resistance.35,36 In addition, there is evidence that exercise training improves the conditions of the small vessels in SHR subjected to swimming protocol.37 Although this study did not address the mechanisms responsible for training-induced effects, one might speculate that arteriole adjustments are group-specific (hypertensive rats) and probably not dependent on paracrine, autocrine, metabolic, and/or myogenic factors, since similar alterations were observed in a previous study.17

It is well established that regular physical activity reduces AP in hypertensive individuals, without significant pressure changes in normotensive individuals.38-40 In fact, several studies have suggested that exercise training intensity influences the pressure-lowering effect, with larger reductions being observed with lower exercise intensities.40 We did not analyze the effect of training intensity, but our results clearly showed that the exercise protocol used caused an important AP decrease only in the SHR group. Pressure reduction was accompanied by both resting bradycardia and specific training-induced adjustment in splenic hypertensive arterioles. Resting bradycardia is considered to be an excellent hallmark for exercise training adaptation in humans and rats.39-40 Thus, the bradycardia found in trained rats clearly demonstrates the effectiveness of the exercise protocol here used.

 Conclusion

Considering our findings, we can conclude that exercise training was effective in reducing AP and improving splenic arteriolar morphometry in hypertensive rats. Briefly, these data strongly suggest that this improvement was associated with decreased sympathetic nerve activity. In addition, regression of hypertrophied splenic arteriole is the anatomic response to exercise training specific to the SHR group. These compensatory adjustments, by reducing local resistance and augmenting physical capacity, contribute to the training-induced, pressure-lowering effect observed in hypertensive individuals.

Sources of Funding

This study was partially funded by Capes, CNPq and Fapemig.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee on Animal Experiments of the Universidade Federal do Triângulo Mineiro under the protocol number #271/2013.

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Laurent S Boutouyrie P Lacolley P Structural and genetic bases of arterial stiffness Hypertension 2005 45 6 1050 1055 10.1161/01.HYP.0000164580.39991.3d. 25 Laurent S, Briet M, Boutouyrie P. Large and small artery cross-talk and recent morbidity-mortality trials in hypertension. Hypertension. 2009;54(2):388-92. doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.109.133116. Laurent S Briet M Boutouyrie P Large and small artery cross-talk and recent morbidity-mortality trials in hypertension Hypertension 2009 54 2 388 392 10.1161/HYPERTENSIONAHA.109.133116. 26 Yasmin, O’Shaughnessy KM. Genetics of arterial structure and function: towards new biomarkers for aortic stiffness? Clin Sci (Lond). 2008;114(11):661-77. doi: 10.1042/CS20070369. Yasmin O’Shaughnessy KM Genetics of arterial structure and function: towards new biomarkers for aortic stiffness? Clin Sci (Lond) 2008 114 11 661 677 10.1042/CS20070369. 27 Martinez-Lemus LA, Hill MA, Meininger GA. 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Fetal Pediatr Pathol. 2012;31(6):423-31. doi: 10.3109/15513815.2012.659535. Abate DT Barbosa O Neto Rossi e Silva RC Faleiros AC Correa RR da Silva VJ Exercise-training reduced blood pressure and improve placental vascularization in pregnant spontaneously hypertensive rats - pilot study Fetal Pediatr Pathol 2012 31 6 423 431 10.3109/15513815.2012.659535. 38 Meredith IT, Jennings GL, Esler MD, Dewar EM, Bruce AM, Fazio VA. Time-course of the antihypertensive and autonomic effects of regular endurance exercise in human subjects. J Hypertens. 1990;8(9):859-66. PMID: 2172376. Meredith IT Jennings GL Esler MD Dewar EM Bruce AM Fazio VA Time-course of the antihypertensive and autonomic effects of regular endurance exercise in human subjects J Hypertens 1990 8 9 859 866 2172376 39 Negrão CE, Irigoyen MC, Moreira ED, Brum PC, Freire PM, Krieger EM. Effect of exercise training on RSNA, baroreflex control and blood pressure responsiveness. Am J Physiol. 1993;265(2 Pt 2):R365-70. PMID: 8368390. Negrão CE Irigoyen MC Moreira ED Brum PC Freire PM Krieger EM Effect of exercise training on RSNA, baroreflex control and blood pressure responsiveness Am J Physiol 1993 265 2 Pt 2 R365 R370 8368390 40 Gava NS, Véras-Silva AS, Negrão CE, Krieger EM. Low-intensity exercise training attenuates cardiac beta-adrenergic tone during exercise in spontaneously hypertensive rats. Hypertension. 1995;26(6 Pt 2):1129-33. doi: https:doi.org/10.1161/01.HYP.26.6.1129. Gava NS Véras-Silva AS Negrão CE Krieger EM Low-intensity exercise training attenuates cardiac beta-adrenergic tone during exercise in spontaneously hypertensive rats Hypertension 1995 26 6 Pt 2 1129 1133 https:doi.org/10.1161/01.HYP.26.6.1129 Artigo Original Hipertensão Arterial Treinamento Físico Atenua a Atividade Simpática e Melhora a Morfometria das Arteríolas Esplênicas em Ratos Espontaneamente Hipertensos Lemos Marina de Paiva 1 Mota Gustavo Ribeiro da 1 Marocolo Moacir 2 Sordi Carla Cristina de 1 Chriguer Rosângela Soares 3 Barbosa Octávio Neto 1 Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), Uberaba, MG - Brasil Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), Juiz de Fora, MG - Brasil Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP - Brasil Correspondência: Marina de Paiva Lemos, Rua dos Inconfidentes, 242 apt. 102. CEP 38025-410, Nossa Senhora da Abadia, Uberaba, MG - Brasil. E-mail: marina_plemos@hotmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Barbosa Neto O; Obtenção de dados: Lemos MP, Sordi CC; Análise e interpretação dos dados:Lemos MP, Mota GR, Marocolo Júnior M, Sordi CC, Chriguer RS, Barbosa Neto O; Análise estatística: Lemos MP, Barbosa Neto O; Redação do manuscrito:Lemos MP; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Mota GR, Marocolo Júnior M, Sordi CC, Chriguer RS, Barbosa Neto O.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

Alterações na estrutura dos vasos de resistência contribuem para elevar a resistência vascular sistêmica na hipertensão, estando ligadas à hiperatividade simpática e lesões em órgãos-alvo.

 Objetivo:

Avaliar os efeitos do treinamento físico nos parâmetros hemodinâmicos e autônomos, assim como as lesões arteriolares esplênica em ratos machos Wistar Kyoto (WKY) e espontaneamente hipertensos (SHR).

 Métodos:

Ratos normotensos sedentários (WKYS) e treinados (WKYT), e ratos hipertensos sedentários (SHRS) e treinados (SHRT) foram incluídos neste estudo. Após nove semanas de aplicação do protocolo experimental (treinamento de natação ou controle sedentário), registraram-se a pressão arterial (PA) e a frequência cardíaca (FC) dos ratos em movimento livre. Avaliamos o controle autônomo do coração através de bloqueio autônomo simpático e vagal. Análises morfométricas das arteríolas esplênicas foram realizadas. Adotou-se o nível de significado estatístico de p < 0,05.

 Resultados:

Observou-se bradicardia de repouso nos dois grupos treinados (WKYT: 328,0 ± 7,3 bpm; SHRT: 337,0 ± 5,2 bpm) em comparação aos seus respectivos grupos sedentários (WKYS: 353,2 ± 8,5 bpm; SHRS: 412,1 ± 10,4 bpm; p < 0,001). O treinamento físico atenuou a PA média apenas no grupo SHRT (125,9 ± 6,2 mmHg vs. 182,5 ± 4,2 mmHg no SHRS; p < 0,001). O grupo WKYT mostrou maior efeito vagal (∆FC: 79,0 ± 2,3 bpm) em comparação ao grupo WKYS (∆FC: 67,4 ± 1,7 bpm; p < 0,05). Exercício crônico diminuiu os efeitos simpáticos em SHRT (∆FC: -62.8 ± 2.8 bpm) em comparação a SHRS (∆FC: -99,8 ± 9,2 bpm; p = 0,005). A espessura da parede das arteríolas esplênicas nos SHR foi reduzida pelo treinamento (332,1 ± 16,0 µm2 nos SHRT vs. 502,7 ± 36,3 µm2 nos SHRS; p < 0,05).

 Conclusões:

O treinamento físico atenua a atividade simpática e a PA em SHR, o que pode contribuir para melhorar a morfologia das arteríolas esplênicas.

 Palavras-chave: Exercício Esforço Físico Hipertensão Resistência Vascular Arteríolas Ratos Introdução

A hipertensão essencial está intimamente relacionada aos vasos sanguíneos, sendo caracterizada por elevação crônica da resistência vascular periférica, resultando principalmente de alterações funcionais e estruturais da microcirculação. Tais lesões podem ser tanto a causa quanto a consequência da elevação da pressão arterial (PA).1 As principais vias que interagem para desenvolver mudanças morfológicas nas arteríolas na hipertensão podem comprometer os vasos esplênicos (hialinose arteriolar, necrose fibrinoide), além do espaço intersticial, causando fibrose.2-5 A hialinose arteriolar ocorre pela filtração das proteínas plasmáticas através do endotélio. Isso não é exclusividade de nenhuma doença, sendo observada em arteríolas no envelhecimento normal, especialmente nas do baço. Entretanto, ocorre de maneira mais precoce e intensa na hipertensão arterial.6

O sistema nervoso autônomo desempenha papel-chave na estabilização do controle da PA para manter a homeostase. Quanto a isso, a literatura mostra que o sistema nervoso simpático (SNS) pode contribuir de maneira incisiva no desenvolvimento de algumas formas de hipertensão. Há larga evidência da participação desse sistema no controle das funções cardiovascular e metabólica normais, e ainda do seu papel na gênese e manutenção de várias doenças. A importância da compreensão de como funciona o SNS e os sistemas a ele relacionados é essencial não apenas para elucidar a fisiologia de algumas doenças, mas para entender como os fármacos que atuam no sistema adrenérgico interferem com a evolução das patologias, alterando de maneira significativa o prognóstico dos pacientes.7

Há evidência experimental de que o exercício crônico produza benefícios para o sistema cardiovascular através de alterações no controle neural da circulação. Tais efeitos incluem reduções na PA, atividade simpática8 e resistência vascular9 concomitantemente com a atenuação da lesão em órgãos-alvo.10 Se existe relação entre treinamento físico e diminuição da resistência vascular, os mecanismos pelos quais o exercício crônico melhora a morfometria arteriolar esplênica não estão bem estabelecidos. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do treinamento físico na atividade simpática e nas lesões arteriolares no baço de ratos espontaneamente hipertensos (SHR).

 Métodos Modelo animal e protocolo de treinamento físico

Este estudo avaliou 40 ratos machos [SHR e Wistar Kyoto (WKY)], com idade de 45-50 semanas, que foram aleatoriamente designados para quatro grupos experimentais de 10 ratos cada: SHRT e WKYT (ratos submetidos ao protocolo de treinamento com natação); e SHRS e WKYS (ratos mantidos sedentários pelo mesmo período de tempo). O tamanho da amostra (n) foi determinado com base em estudos que avaliaram os efeitos do treinamento físico na hipertensão. Tais estudos serviram de base para a presente pesquisa para investigar os efeitos cardiovasculares do exercício acumulado.11,12 Todos os animais foram mantidos em gaiolas (n = 3) em temperatura ambiente, em torno de 23ºC, umidade de 40-70% e ciclo claro/escuro de 12 horas. Procurou-se evitar desconforto desnecessário aos animais, em conformidade com o Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Uso de Animais de Experimentação (#271/2013) local, sendo realizados de acordo com as Diretrizes para Cuidado e Utilização de Animais de Experimentação dos National Institutes of Health.

O protocolo de natação foi realizado em um tanque de vidro com água à temperatura ambiente mantida em 30º ± 1ºC. Os animais treinados foram submetidos a um período de adaptação de 20 minutos no primeiro dia, com acréscimo de 10 minutos a cada dia até se alcançar 1 hora no quinto dia.13 Após esse período, os ratos treinaram 5 dias/semana com uma gradual progressão até sessões de 2 horas de duração por 9 semanas. Esse protocolo é definido como treinamento de resistência aeróbica de baixa intensidade, pois os animais nadaram sem carga adicional, correspondendo a intensidade abaixo do limiar anaeróbico de ratos.14 Os animais sedentários foram colocados no tanque de natação por 10 minutos, duas vezes por semana para imitar o estresse associado com a água no protocolo experimental.

 Procedimentos cirúrgicos e registro dos parâmetros hemodinâmicos

Após 24 horas da última sessão de treinamento físico, todos os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/kg ip) e cânulas de polietileno (PE-10) foram implantadas na artéria femoral, para registro cardiovascular, e na veia femoral, para infusão de fármaco. Em seguida, as cânulas de polietileno foram exteriorizadas na região posterior do pescoço do animal. Os ratos receberam alimento e água ad libitum, sendo estudados um dia após a inserção das cânulas. Realizou-se tratamento profilático com antibióticos e anti-inflamatórios para prevenir infecções e inflamação após a cirurgia, respectivamente.15 Após 48 horas da recuperação da anestesia e cirurgia, a cânula arterial foi conectada ao transdutor de PA e ao amplificador de sinal (Modelo 8805A, Hewlett-Packard, EUA), com conversão para a placa de sinal analógico-digital (frequência de amostragem - 1000 Hz) por um sistema computadorizado de aquisição de dados (Aqdados, Tec Lynx. Eletron. SA, São Paulo, Brasil) e armazenamento no computador. Os animais foram mantidos em ambiente calmo por 15 minutos, com posterior registro contínuo de PA pulsátil adaptativa basal por 30 minutos. Durante o procedimento experimental, os seguintes parâmetros foram derivados da PA pulsátil: PA sistólica (PAS), PA diastólica (PAD), PA média (PAM) e frequência cardíaca (FC).

 Tônus cardíaco autônomo

Para avaliar a influência do treinamento físico no controle autônomo do coração, realizamos bloqueio autônomo simpático e vagal após injeções endovenosas de propranolol (5mg/kg) e atropina (4mg/kg), respectivamente, para calcular os efeitos simpático e vagal, assim como a FC intrínseca (FCi) e o índice simpatovagal.14 Os bloqueadores autônomos foram administrados em sequência aleatória a intervalos de 15 minutos. Após o duplo bloqueio, os registros cardiovasculares duraram 15 minutos. O efeito simpático foi considerado como a diferença entre a FC após bloqueio simpático e a FC de repouso. O efeito vagal foi calculado como a diferença entre a FC após bloqueio vagal e a FC de repouso. O índice simpatovagal foi obtido como a razão entre a FC de repouso e a FCi, considerando ser a FCi aquela obtida após duplo bloqueio autônomo.16

Análise da morfometria arteriolar esplênica

Todos os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico e sacrificados com uma dose letal de cloreto de potássio. Seus baços foram então removidos e imersos em solução salina (0,9%) para retirar o excesso de sangue. Logo depois, foram pesados em uma balança semi-analítica Gehaka BG2000®, clivados e o material colocado em um recipiente de vidro esterilizado com solução de formaldeído a 10% e posteriormente desidratado em etanol a 80%, 90% e 95% e submetido a diafanização com xilol. A seguir, o material foi colocado em recipientes contendo parafina líquida a 60ºC e incluído em blocos. Cortes histológicos de 2 µm foram realizados com um micrótomo, sendo o material montado em lâminas de vidro e corado com tricrômico de Masson. As áreas das camadas interna e externa de cada arteríola foram quantificadas usando-se o microscópio ótico comum para capturar as imagens e o programa imageJ para checar a área de cada camada. Ao final da quantificação da área de cada camada, obteve-se a espessura de cada arteríola.

 Análise estatística

Os testes de Shapiro-Wilks e Levene foram usados para avaliar a normalidade e a homogeneidade da amostra. Os resultados foram expressos como média ± desvio-padrão (para variáveis de distribuição normal) ou mediana com os quartis superior e inferior (para variáveis de distribuição não normal). Para os dados paramétricos, usou-se ANOVA de duas vias (etiologia vs. intervenção), e ainda o teste de Tukey para uma análise post-hoc. Os dados não paramétricos foram analisados com o teste de Mann-Whitney. Utilizou-se o coeficiente de Pearson para testar a correlação entre o efeito simpático e a área da espessura da camada externa da parede e a área da espessura total. Valores de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. As análises foram realizadas usando-se o programa SigmaStat®, v. 2.03 (SPSS, Chicago, IL, EUA).

 Resultados

Os SHRS apresentaram maior FC de repouso em comparação aos WKYS (p <0,001). Como esperado, os dois grupos treinados apresentaram maior bradicardia de repouso do que os seus respectivos grupos sedentários (p < 0,001; Figura 1A).

Registro basal da frequência cardíaca (1A), pressão arterial sistólica (1B), pressão arterial média (1C) e pressão arterial diastólica (1D) em ratos que se movem livremente. WKY<sub>S</sub> (ratos normotensos sedentários); WKY<sub>T</sub> (ratos normotensos treinados); SHR<sub>S</sub> (ratos hipertensos sedentários); SHR<sub>T</sub> (ratos hipertensos treinados). As barras nas figuras 1A e 1C representam média ± desvio-padrão. Os resultados nas figuras 1B e 1D são expressos como mediana (intervalo interquartil). <sup>#</sup>p < 0,05 vs. WKY<sub>S</sub>; *p < 0,001 vs. WKY<sub>S</sub>; <sup>†</sup>p < 0,001 vs. WKY<sub>T</sub>; e <sup>‡</sup>p < 0,001 vs. SHR<sub>S</sub>. FC: frequência cardíaca; PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; PAM: pressão arterial média.

O treinamento físico também reduziu a PAS basal (p < 0,001; Figura 1B), a PAM (p < 0,001; Figura 1C) e a PAD (p < 0,001; Figura 1D) nos animais hipertensos em comparação ao seu respectivo grupo sedentário. Os SHRS apresentaram níveis pressóricos mais elevados do que os WKYS (p < 0,001) e os WKYT (p < 0,001). Após o treinamento de nove semanas, a PA foi similar nos WKYT e WKYS.

Para avaliar a influência do exercício crônico no controle autônomo do coração, realizamos bloqueio autônomo vagal e simpático com injeções de atropina e propranolol, respectivamente, para calcular os efeitos vagal (Figura 2A) e simpático (Figura 2B), assim como o índice simpatovagal (Figura 2C) e FCi (Figura 2D). Não houve diferença no efeito vagal entre os grupos hipertensos. No entanto, o grupo WKYT evidenciou um maior efeito vagal do que o grupo WKYS (p < 0,05). Os dois grupos hipertensos apresentaram menor efeito vagal em comparação com seus respectivos grupos normotensos (p < 0,001). Além disso, não houve diferença no efeito simpático entre os grupos normotensos (p = 0,563). Por outro lado, o grupo SHRT mostrou menor efeito simpático do que o grupo SHRS (p = 0,005). Os dois grupos normotensos apresentaram menor efeito simpático em comparação aos seus respectivos grupos hipertensos (p < 0,001). O índice simpatovagal foi mais baixo no grupo SHRT do que no SHRS (p < 0,05). Não se observou diferença entre os grupos quanto à FCi.

Efeitos do treinamento físico no controle autônomo da frequência cardíaca (FC) de ratos não anestesiados. Obtiveram-se efeitos (2A) vagal e (2B) simpático, respectivamente, pela diferença entre a FC de bloqueio vagal (com atropina) ou de bloqueio simpático (com propranolol) e a FC de repouso. (2C) Equilíbrio simpatovagal foi expresso pelo índice simpatovagal, que é a razão entre a FC de repouso e a FC intrínseca (FCi). (2D) A FCi (bpm) foi obtida após duplo bloqueio autônomo farmacológico. As barras representam média ± desvio-padrão. *p < 0,05 vs. WKY<sub>S</sub>; <sup>†</sup>p < 0,05 vs. WKY<sub>T</sub>; e <sup>‡</sup>p < 0,05 vs. SHR<sub>S</sub>.

A análise morfométrica após o processamento histológico revelou profundas mudanças no perfil microcirculatório do baço induzidas pelo treinamento nos animais hipertensos (Tabela 1). Como esperado, as arteríolas esplênicas dos hipertensos apresentaram parede mais espessa do que as arteríolas dos normotensos (p < 0,001). A despeito disso, nos baços analisados dos SHR, o treinamento físico mostrou-se efetivo para normalizar a relação parede/lúmen da arteríola de SHRT em comparação com a de SHRS (p < 0,001). O grupo SHRS também apresentou maior espessura da camada externa da parede em comparação aos grupos WKYS e WKYT (p < 0,001). Após o protocolo de treinamento físico, o grupo SHRT mostrou redução da espessura da camada externa da parede em comparação ao grupo SHRS (p < 0,001). Resultados similares foram observados na espessura total. O grupo SHRS teve maior espessura total das arteríolas esplênicas do que os grupos normotensos (p < 0,005). Além disso, o grupo SHRT evidenciou uma atenuação na espessura total das arteríolas esplênicas em comparação ao grupo SHRS (p < 0,005).

Valores relacionados à análise morfológica da área da espessura da parede das arteríolas esplênicas
Área da espessura WKYS (n = 10) WKYT (n = 10) SHRS (n = 10) SHRT (n = 10)
Camada interna (µm2) 60,5 ± 3,4 58,8 ± 2,3 87,3 ± 3,3*† 58,0 ± 2,6‡
Camada externa (µm2) 419,8 ± 29,3 405,6 ± 21,7 632,4 ± 29,1*† 418,8 ± 16,4‡
Total (m2) 335,6 ± 44,7 349,7 ± 35,8 502,7 ± 36,3*† 332,1 ± 16,0‡

Dados expressos como média ± desvio-padrão. Abreviaturas: WKYS, ratos normotensos sedentários; WKYT: ratos normotensos treinados; SHRS: ratos hipertensos sedentários; SHRT: ratos hipertensos treinados. Dados expressos como média ± EPM.

p<0,05 vs. WKYS;

p < 0,05 vs. WKYT; e

p < 0,05 vs. SHRS.

Análise adicional mostrou uma significativa associação entre efeito simpático e espessura da camada externa da parede (r = 0,67; p < 0,005; Figura 3A), efeito simpático e espessura total (r = 0,52; p < 0,05; Figura 3B), índice simpatovagal e espessura da camada externa da parede (r = 0,72; p < 0,001; Figura 3C) e índice simpatovagal e espessura total (r = 0,64; p < 0,005; Figura 3D).

Coeficiente de correlação entre efeito simpático e espessura da camada externa da parede (A), efeito simpático e espessura total (B), índice simpatovagal e espessura da camada externa da parede (C), índice simpatovagal e espessura total (D).

Discussão

Nossos principais achados confirmam a eficácia do treinamento físico para atenuar a hiperatividade simpática e para reduzir a PA em animais hipertensos, mostrando, além disso, que o efeito de redução simpática induzido pelo treinamento se associou com normalização do diâmetro da artéria esplênica anormal, diminuindo o grau de lesão vascular no baço. A análise morfométrica dos pequenos vasos empregada no presente estudo revelou que os ajustes vasculares esplênicos são específicos para o grupo SHRT. Está bem documentado que o exercício físico crônico atenua a hiperatividade simpática10 e a lesão arteriolar na hipertensão.17 Até onde sabemos, entretanto, este é um dos primeiros relatos a evidenciar a associação entre a redução da lesão na arteríola esplênica e a atividade simpática.

A relação de causa-efeito entre hipertensão e lesão arteriolar (hipertrofia) está bem estabelecida.18-20 A literatura mostra que um efetivo tratamento anti-hipertensivo deve visar não apenas a reduzir a PA, mas também a corrigir as lesões associadas com a hipertensão, como a alteração da estrutura vascular. Um estudo prévio mostrou a eficácia do treinamento físico para normalizar a relação parede/lúmen da arteríola, evidenciando que tanto a resposta arteriolar quanto a redução da resistência vascular após treinamento físico correlacionaram-se significativamente com a redução da PA.21 Estudo experimental mostrou que as relações parede/lúmen da arteríola foram reduzidas pelo maior diâmetro interno e/ou externo, que é um padrão característico para remodelamento vascular.21 Importante notar a demonstração de que o treinamento físico, ao reverter a invasão do lúmen, normaliza a aumentada relação parede/lúmen das arteríolas em ratos hipertensos. Esses dados estão de acordo com os resultados do nosso estudo.

Estudos com modelos animais indicam que a elevação sustentada do tônus simpático estimula a hipertrofia das células musculares lisas, sugerindo que a hiperatividade simpática possa contribuir para mudanças na espessura da parede arterial.22 Assim, um achado interessante do nosso estudo foi a significativa correlação positiva entre hiperatividade simpática e espessura da parede de arteríolas esplênicas em ratos hipertensos, corroborando resultados de outros investigadores que demonstraram que a hipertensão está associada com hiperatividade simpática que altera o controle vasomotor, resultando em várias anormalidades na microcirculação, como o aumento da relação parede/lúmen arteriolar e a redução da densidade vascular, que contribuem para manter uma elevada resistência periférica total.23-28 Outro importante achado do nosso estudo foi a capacidade de o treinamento físico atenuar a atividade simpática em SHR e que tal efeito associou-se com uma redução na espessura da parede da arteríola esplênica. O treinamento físico produz efeitos benéficos no sistema cardiovascular em indivíduos normais e doentes através de alterações (ou modificações) no controle neural da circulação.29,30 Tais efeitos incluem reduções na PA, na descarga simpática em seres humanos,31,32 assim como em modelos animais,33,34 e na resistência vascular.35,36 Além disso, há evidência de que o treinamento físico melhora as condições dos pequenos vasos em SHR submetidos ao protocolo de natação.37 Embora este estudo não tenha contemplado os mecanismos responsáveis pelos efeitos induzidos pelo treinamento físico, pode-se especular que os ajustes da arteríola são específicos do grupo (ratos hipertensos) e provavelmente não dependentes de fatores parácrinos, autócrinos, metabólicos e/ou miogênicos, pois alterações similares foram observadas em estudo prévio.17

Já foi bem estabelecido que a atividade física regular reduz a PA em indivíduos hipertensos, sem significativas mudanças pressóricas em indivíduos normotensos.38-40 Na verdade, vários estudos sugeriram que a intensidade do treinamento físico influencia o efeito hipotensor, com maiores reduções sendo observadas com intensidades mais baixas de exercício.40 Não analisamos o efeito da intensidade do treinamento, mas nossos resultados mostraram claramente que o protocolo de exercício usado causou uma importante diminuição da PA apenas no grupo SHR. A redução da PA foi acompanhada por bradicardia de repouso e ajuste induzido por treinamento específico das arteríolas esplênicas de hipertensos. A bradicardia de repouso é considerada um excelente marcador da adaptação ao treinamento físico em humanos e ratos.39-40 Portanto, a bradicardia encontrada nos ratos treinados demonstra claramente a efetividade do protocolo de exercício usado neste estudo.

 Conclusão

Considerando-se nossos achados, podemos concluir que o treinamento físico foi eficaz para reduzir a PA e melhorar a morfometria arteriolar esplênica em ratos hipertensos. Tais dados sugerem fortemente que tal melhoria esteja associada com diminuição da atividade nervosa simpática. Além disso, a regressão da hipertrofia da arteríola esplênica é a resposta anatômica ao treinamento físico específico para o grupo SHR. Tais ajustes compensatórios, ao reduzirem a resistência local e aumentarem a capacidade física, contribuem para o efeito hipotensor induzido pelo treinamento observado em hipertensos.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi parcialmente financiado pela Capes, CNPq e Fapemig.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Aprovação Ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal do Triângulo Mineiro sob o número de protocolo #271/2013.