Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC bxx6qKVFZnvzJVbMP6StBkH S0066-782X2018000200119 10.5935/abc.20180005 Original Articles Dyslipidemias Clinical, Anthropometric and Biochemical Characteristics of Patients with or without Genetically Confirmed Familial Hypercholesterolemia Lorenzo Andrea De 1 Silva Juliana Duarte Lopes da 1 James Cinthia E. 2 Pereira Alexandre C. 2 Moreira Annie Seixas Bello 1 Instituto Nacional de Cardiologia Rio de Janeiro RJ Brazil Instituto Nacional de Cardiologia, Rio de Janeiro, RJ - Brazil Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina Instituto do Coração São Paulo SP Brazil Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular, Instituto do Coração (InCor) - Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP - Brazil Universidade de São Paulo Mailing Address: Annie Seixas Bello Moreira, Rua das Laranjeiras, 374, 5 andar. CEP 22240-006, Laranjeiras, Rio de Janeiro - Brazil. E-mail: anniebello@gmail.com, debora.gapanowicz@gmail.com.

Author contributions

Conception and design of the research: Lorenzo A, James CE, Pereira AC, Moreira ASB; Acquisition of data: Silva JDL, James CE, Pereira AC; Analysis and interpretation of the data: Lorenzo A; Statistical analysis: Silva JDL; Obtaining financing: Moreira ASB; Writing of the manuscript: Lorenzo A, Silva JDL; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Lorenzo A, Moreira ASB.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 2 2018 110 2 119 123 10 05 2017 03 08 2017 07 08 2017 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Familial hypercholesterolemia (FH) is a common autosomal dominant disorder, characterized by a high level of low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and a high risk of premature cardiovascular disease.

 Objective:

To evaluate clinical and anthropometric characteristics of patients with the familiar hypercholesterolemia (FH) phenotype, with or without genetic confirmation of FH.

 Methods:

Forty-five patients with LDL-C > 190 mg/dl were genotyped for six FH-related genes: LDLR, APOB, PCSK9, LDLRAP1, LIPA and APOE. Patients who tested positive for any of these mutations were considered to have genetically confirmed FH. The FH phenotype was classified according to the Dutch Lipid Clinic Network criteria.

 Results:

Comparing patients with genetically confirmed FH to those without it, the former had a higher clinical score for FH, more often had xanthelasma and had higher LDL-C and apo B levels. There were significant correlations between LDL-C and the clinical point score for FH (R = 0.382, p = 0.037) and between LDL-C and body fat (R = 0.461, p = 0.01). However, patients with mutations did not have any correlation between LDL-C and other variables, while for those without a mutation, there was a correlation between LDL-C and the clinical point score.

 Conclusions:

LDL-C correlated with the clinical point score and with body fat, both in the overall patient population and in patients without the genetic confirmation of FH. In those with genetically confirmed FH, there were no correlations between LDL-C and other clinical or biochemical variables in patients.

 Keywords: Hyperlipoproteinemia Type II Body Weights and Measurements, LDL Lipoproteins, Dyslipidemias, Mutation, Phenotype Introduction

Familial hypercholesterolemia (FH) is characterized by a high level of low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and a high risk of premature cardiovascular disease.1 It is a common autosomal dominant disorder, affecting up to 1 in 200-250 people in its heterozygous form.2 According to the Dutch Lipid Clinic Network, the clinical diagnosis of FH (FH phenotype) is based on high LDL-C and a score in which points are assigned for family history of hyperlipidemia or heart disease, clinical characteristics such as tendinous xanthomata, elevated LDL cholesterol, and/or an identified mutation. A total point score greater than eight is considered "definite" FH, 6-8 is "probable" FH, and 3-5 is "possible" FH.3

Despite being helpful as they provide a standardization of the diagnosis of the FH phenotype, scores may not necessarily result in consistent diagnoses of FH, as cholesterol levels for FH patients overlap with those of the general population. Genetic diagnosis is considered evidence of definite FH according to some criteria.1 Mutations in 3 genes- the LDL-receptor gene (LDLR), the gene coding for apolipoprotein B and the gene encoding the proprotein convertase subtilisin/kexin type 9-are usually responsible for FH.4-6 However, other mutations have been identified in the LDLR gene, as well as mutations in other genes leading to the clinical FH phenotype, and there is also evidence that some mutations lead to more severe manifestations of FH than others. Additionally, a large proportion of the patients with a clinical diagnosis of FH do not have a detectable mutation in any of these genes.7,8

In view of the complexity of this scenario, there is continuing need for additional information on the clinical and laboratory profile of patients with either genetically defined FH or with only the phenotype of FH, since such data might help optimize patient management, in the sense of their cardiovascular risk burden. Therefore, this study sought to evaluate clinical and anthropometric characteristics of patients with or without genetic confirmation of FH.

 Methods Study population

This was a cross-sectional study of adult outpatients with severe hypercholesterolemia recruited at the National Institute of Cardiology in Rio de Janeiro, Brazil. Subjects with LDL-C > 190 mg/dl and in use of lipid-lowering drug were selected after review of the lipid panel results over 6 months. These patients were invited by phone call to take part in the study, and those with acute coronary syndromes or myocardial revascularization in the previous 30 days, autoimmune diseases, thyroid disorders, chronic renal failure, liver diseases, malignancy, using steroids, or pregnant or breastfeeding were excluded. For this study, a convenience sample was used, including all patients who had been genetically screened to date. Once considered eligible, all participants read and signed an informed consent document approved by the institutional Ethics Committee. The study was undertaken in accordance with the Helsinki Declaration of 1975, revised in 2000.

The study patients underwent clinical evaluation and peripheral blood collection. The FH phenotype was classified according to the Dutch Lipid Clinic Network criteria.3 Prior cardiovascular disease was defined as a history of myocardial infarction, evidence of obstructive coronary artery disease at coronary angiography (> 50% stenosis of any epicardial coronary artery), myocardial revascularization (either percutaneous or coronary artery bypass surgery) or stroke. Hypertension was defined as blood pressure ≥ 140/90 mmHg and/or antihypertensive drug use. Diabetes mellitus was defined by history and use of insulin or oral hypoglycemic medications, or fasting glucose levels > 126 mg/dl.

 Anthropometric measurement

All patients underwent assessment of body composition. Body mass index (BMI) was calculated as weight in Kg/ (height)2. Body composition (body fat percentage [%], visceral fat area [cm2] and phase angle [degrees]) was estimated by bioelectrical impedance, using the multifrequency analyzer octopolar (In-Body 720; Biospace). The measurements were made with the patient in the supine position, with the arms lying parallel and separated from the trunk and with the legs separated, so that the thighs were not touching. Two electrodes were placed on the hand and wrist and another two were positioned on the foot and ankle of the non-dominant side of the body. An electrical current measured at six different frequencies (1, 5, 50, 250, 500 and 1000 KHz) was introduced into the subject, and resistance and reactance were measured. The phase angle was calculated according to the following equation: Phase Angle = arctangent (inductance / resistance) × 180º/ π.9

Laboratory measurements

For biochemical testing, venous blood samples were obtained in the morning after 12 h of fasting. The patients took their usual medications on the morning of the tests. Laboratory evaluations were performed by an automated method (ARCHITECT ci8200, Abbott ARCHITECT®, Abbott Park, IL, USA) using commercial kits (Abbott ARCHITECT c8000®, Abbott Park, IL, USA). Serum triglyceride levels, total cholesterol, LDL cholesterol (LDL-C), HDL-cholesterol (HDL-C), apolipoproteins A (apo A) and B (apo B) and C-reactive protein (CRP) were evaluated.

Genomic DNA was extracted from peripheral blood following a standard salting-out procedure. All DNA stock samples were quantified with Qubit dsDNA BR Assay Kit (Thermo Fisher) and diluted to 10 ng/ul for enrichment with Ion AmpliSeq Custom Kit (Thermo Fisher). Samples were enriched for six FH-related genes: LDLR, APOB, PCSK9, LDLRAP1, LIPA and APOE.

Patients who tested positive for any of these mutations were considered to have genetically confirmed FH. Target regions were considered as coding exons plus 10bp of introns up and downstream. Templates were prepared on Ion One Touch System and sequenced in Ion Torrent PGM ® platform, with 32 samples per run in a 316v2 Ion Chip. All FASTQ files were imported to CLC Genomics Workbench 9.5 (QIAGEN) and analyzed in a custom pipeline.

Minimum quality requirements for variant call were: Base quality of PhredQ ≥ 20; Target-region coverage ≥ 10x; Frequency of variant allele ≥ 20% and bidirectional presence of variant allele. After polymorphism filtering with control populations (NHLBI-ESP6500, ExAC and 1000Genomes), all potential mutations were consulted for previous description in ClinVar, Human Genome Mutation Database (HGMD), British Heart Foundation and Jojo Genetics databases. Functional impact prediction was performed with SIFT, PROVEAN and PolyPhen-2 and mutations without previous description should be pointed as damaging in at least two algorithms to be considered as potentially pathogenic. Individuals with negative results were also screened for large insertions and deletions via MLPA (MRC-Holland).

 Statistical analysis

Continuous data were analyzed using two-tailed unpaired Student's t test or Mann-Whitney's test, and categorical variables with chi-squared test. Kolmogorov - Smirnov test was performed t o determine whether sample data was normally distributed. Continuous variables are reported as means ± standard deviations, and categorical variables are presented as percentages. Correlations between continuous variables were analyzed with Pearson's test. Analyses were performed with SPSS software, version 21.0, and p values < 0.05 were considered statistically significant. Statistical review of the study was performed by a biomedical statistician.

 Results

Forty-five patients with LDL-C > 190 mg/dl were studied, of which fifteen had positive testing for familial hypercholesterolemia and thirty had negative. Comparing patients with genetically confirmed FH to those without it (Table 1), the former had a higher clinical score for FH, were more frequently considered to have definite FH, and more often had xanthelasma. Of note, the prevalence of prior coronary artery disease or stroke were not significantly different between patients with or without the genetic diagnosis of FH. Mean LDL-C and apo B levels were higher in patients with a molecular diagnosis of FH (Table 2).

Demographic, anthropometric and clinical characteristics of patients with positive or negative genetic testing for familial hypercholesterolemia
Positive (n = 15) Negative (n = 30) p-value
Age (years) 51.7 ± 14.4 55.6 ± 12.6 0.376
Weight 71.4 ± 16.1 70.8 ± 15.7 0.906
Body mass index (Kg/m²) 27.9 ± 6.1 28.3 ± 5.1 0.784
Body fat (%) 39.1 ± 9.4 35.6 ± 8.2 0.262
Visceral fat area (cm²) 110.3 ± 34.0 104.6 ± 34.3 0.639
Waist circumference (cm) 95.6 ± 10.6 96.5 ± 11.9 0.589
Hip circumference (cm) 104.4 ± 11.6 102.8 ± 12.1 0.676
Women 14 (93.3) 18 (60.0) 0.019*
Clinically defined FH 10 (66.7) 4 (13.3) 0.001*
Score 9.64 ± 2.16 4.35 ± 1.58 0.001*
Risk factors and clinical data
Hypertension 8 (53.3) 20 (71.4) 0.197
Diabetes 3 (20.0) 6 (21.4) 0.619
Obesity 7 (46.7) 9 (30.0) 0.219
Smoking 0 3 (10.7) 0.265
Corneal arch 3 (20.0) 1 (3.7) 0.122
Xanthomata 0 0
Xanthelasma 3 (20.0) 0 (0) 0.04*
Angina 6 (40.0) 12 (42.0) 0.559
History of stroke 0 (0) 1 (3.6) 0.651
History of myocardial infarction 3 (20.0) 11 (39.3) 0.173
Prior coronary angioplasty 3 (20.0) 11 (40.7) 0.153
Prior coronary bypass 4 (26.7) 5 (17.9) 0.381

Numbers are n (%), for categorical variables, or mean ± SD, for continuous variables;

p < 0.05; FH: familial hypercholesterolemia.

 Laboratory data of patients with positive or negative genetic testing for familial hypercholesterolemia
Positive (n = 15) Negativo (n = 30) p-value
Total cholesterol (mg/dL) 263.1 ± 93.1 231.0 ± 57.4 0.417
LDL-C (mg/dL) 208.1 ± 41.8 151.4 ± 50.6 0.002*
HDL-C (mg/dl) 52.2 ± 9.7 50.1 ± 12.0 0.617
Apo A1 (mg/dL) 139.3 ± 19.9 140.1 ± 22.9 0.916
Apo B (mg/dL) 138.7 ± 30,2 106.3 ± 31.6 0.005*
Triglyceride (mg/dL) 127.9 ± 52.1 144.6 ± 73.5 0.484
CRP (mg/dL) 0.4 ± 0.7 0.3 ± 0.6 0.707
Glycemia (mg/dL) 116.4 ± 79.9 107.5 ± 48,2 0.667

Numbers are n (%), for categorical variables, or mean ± SD, for continuous variables;

p < 0.05; Apo A1: apolipoprotein A1; Apo B: apolipoprotein B; CRP-C: reactive protein; HDL-C: high-density lipoprotein cholesterol; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol.

When the correlations between LDL-C levels and other clinical, demographic and anthropometric variables were examined, there was a weak, although significant correlation between LDL-C and the clinical point score (R = 0.382, p = 0.037) and a moderate and significant correlation between LDL-C and body fat (R = 0.461, p = 0.01). However, when patients were stratified according to genetic testing positivity, those with any of the studied mutations did not show any correlation between LDL-C and other variables, while for those without a mutation, there was a moderate, statistically significant correlation between LDL-C and the clinical point score (R = 0.554, p = 0.01), as well as a borderline significant, moderate correlation between LDL-C and body fat (R = 0.441, p = 0.05).

 Discussion

FH is a disorder of cholesterol metabolism and indeed one of the most common inherited disorders.2,10 Rates of premature cardiovascular disease are much higher in patients with FH, but long-term drug therapy has the potential to lower cardiovascular event rates in patients with FH, leading to similar rates to those found in the general population.11 Since effective primary prevention in the setting of FH requires its early diagnosis, the largest knowledge we have on this disease, the best we may recognize it and accomplish adequate patient management.

In this study, patients with genetically confirmed FH had, as expected, a higher clinical score for FH. In addition, they had more clinical evidence of severe hypercholesterolemia such as xanthelasma, possibly since the monogenic group have had severely elevated LDL-C level since birth, and thus, a greater cumulative "LDL-C burden".12 Finally, LDL-C and Apo B levels were higher than in those patients with negative genetic testing, as previously demonstrated.13,14 Apo B is the main protein constituent of lipoproteins such as VLDL and LDL, and concentrations of Apo B tend to mirror those of LDL-C.15 Plasma levels of apolipoprotein B represent all atherogenic lipoproteins in the circulation; however, because every atherogenic particle contains a single apolipoprotein B molecule, Apo B levels also provide an accurate reflection of the number of atherogenic particles.16

Of note, LDL-C levels were correlated with the clinical point score and with body fat, both in the overall patient population and in patients without the genetic confirmation of FH. In those with genetically confirmed FH, there were no correlations between LDL-C and other clinical or biochemical variables in patients. This might suggest that the former might have less severe forms of FH related to other mutations, or severe hypercholesterolemia due to other etiologies, and in those cases the level of LDL-C would be also associated with modifiable or environmental factors. In contrast, in patients with FH, the severity of the derangements caused by the mutations would be the predominant factor determining LDL-C levels, what would turn other correlations with anthropometric or biochemical variables less significant.

This study is limited by the small sample size, which turns the results hypothesis-generating. Importantly, it may be possible that a proportion of the patients have a mutation in whomever as a yet unidentified gene. With standard molecular diagnostic techniques, a known mutation can be detected in 20-30% of patients with possible FH and 60-80% of patients with definite FH.17,18 Since approximately 2/3 of patients have possible FH, no mutations are detected in about 60% of tested patients with this disorder17 what has led to a search for additional FH-causing genes. However, some clinically diagnosed cases of FH may be polygenic, due to the inheritance of a greater than average number of common LDL-C raising alleles (each causing a slight effect) leading to an increase in LDL-C above the diagnostic cut off.19

Conclusions

The present results suggest that in patients with severe hypercholesterolemia and the FH phenotype, even in the absence of genetic confirmation of FH, patient management should have special attention directed towards modifiable factors associated with LDL-C, as body fat. A decrease in body fat might determine a reduction of LDL-C, what is known to decrease cardiovascular risk.20

Sources of Funding

This study was funded by FAPERJ.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Juliana Duarte Lopes da Silva, from Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee of the Instituto Nacional de Cardiologia under the protocol number #26802514.4.0000.5272. All the procedures in this study were in accordance with the 1975 Helsinki Declaration, updated in 2013. Informed consent was obtained from all participants included in the study.

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Atherosclerosis. 2005;182(2):331-40. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2005.02.016. Graham CA McIlhatton BP Kirk CW Beattie ED Lyttle K Hart P Genetic screening protocol for familial hypercholesterolemia which includes splicing defects gives an improved mutation detection rate Atherosclerosis 2005 182 2 331 340 10.1016/j.atherosclerosis.2005.02.016 19 Talmud PJ, Shah S, Whittall R, Futema M, Howard P, Cooper JA, et al. Use of low-density lipoprotein cholesterol gene score to distinguish patients with polygenic and monogenic familial hypercholesterolaemia: a case-control study. Lancet. 2013;381(9874):1293-301. doi: 10.1016/S0140-6736(12)62127-8. Talmud PJ Shah S Whittall R Futema M Howard P Cooper JA Use of low-density lipoprotein cholesterol gene score to distinguish patients with polygenic and monogenic familial hypercholesterolaemia: a case-control study Lancet 2013 381 9874 1293 1301 10.1016/S0140-6736(12)62127-8 20 Wald DS, Bestwick JP, Morris JK, Whyte K, Jenkins L, Path FR, et al. Child-parent familial hypercholesterolemia screening in primary care. N Engl J Med. 2016;375(17):1628-37. doi: 10.1056/NEJMoa1602777. Wald DS Bestwick JP Morris JK Whyte K Jenkins L Path FR Child-parent familial hypercholesterolemia screening in primary care N Engl J Med 2016 375 17 1628 1637 10.1056/NEJMoa1602777 Artigos Originais Dyslipidemias Características Clínicas, Antropométricas e Bioquímicas de Pacientes com ou sem Diagnóstico Confirmado de Hipercolesterolemia Familiar Lorenzo Andrea De 1 Silva Juliana Duarte Lopes da 1 James Cinthia E. 2 Pereira Alexandre C. 2 Moreira Annie Seixas Bello 1 Brasil Instituto Nacional de Cardiologia, Rio de Janeiro, RJ – Brasil Brasil Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular, Instituto do Coração (InCor) - Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP – Brasil Correspondência: Annie Seixas Bello Moreira, Rua das Laranjeiras, 374, 5 andar. CEP 22240-006, Laranjeiras, Rio de Janeiro - Brasil. E-mail: anniebello@gmail.com, debora.gapanowicz@gmail.com.

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Lorenzo A, James CE, Pereira AC, Moreira ASB; Obtenção de dados: Silva JDL, James CE, Pereira AC; Análise e interpretação dos dados:Lorenzo A; Análise estatística: Silva JDL; Obtenção de financiamento: Moreira ASB; Redação do manuscrito:Lorenzo A, Silva JDL; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Lorenzo A, Moreira ASB.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamentos:

A hipercolesterolemia familiar (HF) é uma doença autossômica dominante, caracterizada por altos níveis plasmáticos do colesterol da lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) e pelo alto risco de desenvolvimento prematuro de doenças cardiovasculares.

 Objetivo:

Avaliar características clínicas e antropométricas de pacientes com fenótipo para hipercolesterolemia familiar (HF), com ou sem diagnóstico genético de HF.

 Métodos:

Quarenta e cinco pacientes com LDL-C > 190 mg/dL foram genotipados para seis genes relacionados com a HF: LDLR, APOB, PCSK9, LDLRAP1, LIPA e APOE. Pacientes que apresentaram resultado positivo para qualquer uma das mutações foram diagnosticados com HF por confirmação genética. O fenótipo para HF foi classificado pelo critério da Dutch Lipid Clinic Network.

 Resultados:

Comparando os pacientes com a HF geneticamente confirmada com aqueles sem a confirmação, os primeiros apresentaram maior pontuação do escore para HF, uma maior frequência de xantelasma e maiores níveis de LDL-C e apo B. Houve correlações significativas entre o LDL-C e a pontuação do escore para HF (R = 0,382, p = 0,037) e entre LDL-C e gordura corporal (R = 0,461, p = 0,01). Os pacientes com mutações, no entanto, não apresentaram qualquer correlação entre o LDL-C e outras variáveis, enquanto aqueles sem mutação apresentaram correlação entre o LDL-C e a pontuação do escore.

 Conclusão:

O LDL-C correlacionou-se com a pontuação do escore e com a gordura corporal, tanto na população total de pacientes quanto nos pacientes sem a confirmação genética de HF. Naqueles com HF geneticamente confirmada, não houve correlação entre o LDL-C e outras variáveis clínicas ou bioquímicas dos pacientes.

 Palavras-chave: Hiperlipoproteinemia Tipo II Pesos e Medidas Corporais Lipoproteínas LDL Dislipidemias Mutação Fenótipo Introdução

A hipercolesterolemia familiar (HF) é caracterizada por um alto nível de colesterol de lipoproteínas de baixa densidade (LDL-C) e um alto risco de doença cardiovascular prematura.1 É um distúrbio autossômico dominante comum, que afeta até 1 em 200-250 pessoas em sua forma heterozigótica.2 De acordo com a Dutch Lipid Clinic Network, o diagnóstico clínico de HF (fenótipo HF) se baseia em LDL-C elevado e um escore no qual os pontos são atribuídos por história familiar de hiperlipidemia ou doença cardíaca, características clínicas como xanthomata tendinosa, colesterol LDL elevado e/ou uma mutação identificada. Um escore total superior a oito é considerado HF "definida", 6-8 é HF "provável", e 3-5 é HF "possível".3

Apesar de serem úteis, pois fornecem uma padronização do diagnóstico do fenótipo HF, os escores podem não resultar necessariamente em diagnósticos consistentes de HF, já que os níveis de colesterol para pacientes com HF se sobrepõem com aqueles da população em geral. O diagnóstico genético é considerado evidência de HF definida de acordo com alguns critérios.1 As mutações em 3 genes - o gene do receptor de LDL (LDLR), o gene que codifica a apolipoproteína B e o gene que codifica a subtilisina/kexina de pró-proteína convertase tipo 9 - são geralmente responsáveis pela HF.4-6 No entanto, outras mutações foram identificadas no gene LDLR, bem como mutações em outros genes que conduzem ao fenótipo clínico HF, e também há evidências de que algumas mutações levam a manifestações mais severas de HF do que outras. Além disso, uma grande proporção dos pacientes com diagnóstico clínico de HF não possui mutação detectável em nenhum desses genes.7,8 Em vista da complexidade deste cenário, continua a ser necessária informação adicional sobre o perfil clínico e laboratorial de pacientes com HF geneticamente definido ou com apenas o fenótipo de HF, uma vez que esses dados podem ajudar a otimizar o tratamento de pacientes, no sentido da sua carga de risco cardiovascular. Portanto, este estudo procurou avaliar características clínicas e antropométricas de pacientes com ou sem confirmação genética de HF.

 Métodos População do estudo

Este foi um estudo transversal de pacientes ambulatoriais adultos com hipercolesterolemia grave recrutados no Instituto Nacional de Cardiologia no Rio de Janeiro, Brasil. Os indivíduos com LDL-C > 190 mg/dl e em uso de fármaco hipolipemiante foram selecionados após revisão dos resultados do perfil lipídico ao longo de 6 meses. Estes pacientes foram convidados por telefone para participar do estudo, e foram excluídos aqueles com síndromes coronarianas agudas ou revascularização miocárdica nos 30 dias prévios, doenças autoimunes, distúrbios da tiroide, insuficiência renal crônica, doenças hepáticas, malignidade, em uso de esteroides, gravidez ou amamentação. Para este estudo, se utilizou uma amostra de conveniência, incluindo todos os pacientes que haviam sido analisados geneticamente até à data. Uma vez considerados elegíveis, todos os participantes leram e assinaram um documento de consentimento informado aprovado pelo Comitê de Ética institucional. O estudo foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque de 1975, revisada em 2000.

Os pacientes estudados foram submetidos a avaliação clínica e coleta de sangue periférico. O fenótipo HF foi classificado de acordo com os critérios da Rede Clínica Holandesa de Lipídos.3 A doença cardiovascular prévia foi definida como história de infarto do miocárdio, evidência de doença arterial coronariana obstrutiva em angiografia coronária (estenose de 50% de qualquer artéria coronária epicárdica), revascularização miocárdica (seja percutânea ou cirurgia de by-pass coronário) ou AVC. A hipertensão foi definida como pressão arterial ≥ 140/90 mmHg e/ou uso de drogas antihipertensivas. O diabetes mellitus foi definido pela história e uso de insulina ou medicamentos hipoglucêmicos orais, ou níveis de glicemia em jejum> 126 mg/dl.

 Medição antropométrica

Todos os pacientes foram submetidos à avaliação da composição corporal. O índice de massa corporal (IMC) foi calculado como peso em Kg/(altura)2. A composição corporal (porcentagem de gordura corporal [%], área de gordura visceral [cm2] e ângulo de fase [graus] foi estimada por impedância bioelétrica, utilizando o analisador de multifrequência octopolar (In-Body 720; Biospace). As medidas foram feitas com o paciente em posição supina, com os braços paralelos e separados do tronco e com as pernas separadas, de modo que as coxas não estavam em contato. Dois eletrodos foram colocados na mão e no pulso e outros dois foram posicionados no pé e no tornozelo do lado não dominante do corpo. Uma corrente elétrica medida em seis frequências diferentes (1, 5, 50, 250, 500 e 1000 KHz) foi introduzida no sujeito, e a resistência e a reatância foram medidas. O ângulo de fase foi calculado de acordo com a seguinte equação: Ângulo de fase = arcotangente (indutância/resistência) × 180º / π.9

Medições laboratoriais

Para testes bioquímicos, amostras de sangue venoso foram obtidas na manhã após 12 h de jejum. Os pacientes tomaram seus medicamentos habituais na manhã dos testes. As avaliações laboratoriais foram realizadas por um método automatizado (ARCHITECT ci8200, Abbott ARCHITECT®, Abbott Park, IL, EUA) usando kits comerciais (Abbott ARCHITECT c8000®, Abbott Park, IL, EUA). Foram avaliados níveis séricos de triglicerídeos, colesterol total, colesterol LDL (LDL-C), colesterol HDL (HDL-C), apolipoproteínas A (apo A) e B (apo B) e proteína C-reativa (PCR).

O DNA genômico foi extraído do sangue periférico após um procedimento padrão de salting-out. Todas as amostras de estoque de DNA foram quantificadas com Qubit dsDNA BR Assay Kit (Thermo Fisher) e diluídas a 10 ng/ul para enriquecimento com Ion AmpliSeq Custom Kit (Thermo Fisher). As amostras foram enriquecidas para seis genes relacionados ao HF: LDLR, APOB, PCSK9, LDLRAP1, LIPA e APOE.

Os pacientes que testaram positivo para qualquer uma dessas mutações foram considerados como HF geneticamente confirmados. As regiões alvo foram consideradas como exões de codificação mais 10 pb de intrões a montante e a jusante. Os modelos foram preparados no Ion One Touch System e sequenciados na plataforma Ion Torrent PGM®, com 32 amostras por execução em um chip de iões 316v2. Todos os arquivos FASTQ foram importados para o CLC Genomics Workbench 9.5 (QIAGEN) e analisados em uma pipeline personalizada.

Os requisitos mínimos de qualidade para variant call foram: Qualidade base de PhredQ ≥ 20; Cobertura da região-alvo ≥ 10x; Frequência do alelo variante ≥ 20% e presença bidirecional do alelo variante. Após a filtragem de polimorfismo com populações de controle (NHLBI-ESP6500, ExAC e 1000Genomes), todas as mutações em potencial foram consultadas para a descrição prévia em ClinVar, Human Genome Mutation Database (HGMD), British Heart Foundation e Jojo Genetics. A predição de impacto funcional foi realizada com SIFT, PROVEAN e PolyPhen-2 e as mutações sem descrição prévia devem ser apontadas como prejudiciais em pelo menos dois algoritmos para serem considerados potencialmente patogênicas. Indivíduos com resultados negativos também foram selecionados para grandes inserções e deleções via MLPA (MRC-Holland).

 Análise estatística

Os dados contínuos foram analisados ​​usando o teste t de Student de duas colas ou o teste de Mann-Whitney, e as variáveis categóricas com o teste de qui-quadrado. O teste de Kolmogorov-Smirnov foi realizado para determinar se os dados da amostra estavam normalmente distribuídos. As variáveis contínuas são relatadas como médias ± desvios-padrão, e as variáveis categóricas são apresentadas como porcentagens. As correlações entre variáveis contínuas foram analisadas com o teste de Pearson. As análises foram realizadas com o software SPSS, versão 21.0, e valores p <0,05 foram considerados estatisticamente significativos. A análise estatística do estudo foi realizada por um estatístico biomédico.

 Resultados

Foram estudados quarenta e cinco pacientes com LDL-C > 190 mg/dl, dos quais quinze tiveram testes positivos para hipercolesterolemia familiar e trinta tiveram negativo. Comparando os pacientes com HF geneticamente confirmada com aqueles sem ele (Tabela 1), os primeiros apresentaram maior escore clínico para HF, foram mais frequentemente considerados como HF definida e, mais frequentemente, tinham xanthelasma. Para destacar, a prevalência de doença arterial coronariana prévia ou AVC não foi significativamente diferente entre pacientes com ou sem o diagnóstico genético de HF. Os níveis médios de LDL-C e apo B foram maiores em pacientes com diagnóstico molecular de HF (Tabela 2).

Características demográficas, antropométricas e clínicas de pacientes com testes genéticos positivos ou negativos para hipercolesterolemia familiar
Positivo (n = 15) Negativo (n = 30) Valor de p
Idade (anos) 51,7 ± 14,4 55,6 ± 12,6 0,376
Peso 71,4 ± 16,1 70,8 ± 15,7 0,906
Índice de massa corporal (Kg/m²) 27,9 ± 6,1 28,3 ± 5,1 0,784
Gordura corporal (%) 39,1 ± 9,4 35,6 ± 8,2 0,262
Área de gordura visceral (cm²) 110,3 ± 34,0 104,6 ± 34,3 0,639
Circunferência da cintura (cm) 95,6 ± 10,6 96,5 ± 11,9 0,589
Circunferência do quadril (cm) 104,4 ± 11,6 102,8 ± 12,1 0,676
Mulheres 14 (93,3) 18 (60,0) 0,019*
HF clinicamente definida 10 (66,7) 4 (13,3) 0,001*
Escore 9,64 ± 2,16 4,35 ± 1,58 0,001*
Fatores de risco e dados clínicos
Hipertensão 8 (53,3) 20 (71,4) 0,197
Diabetes 3 (20,0) 6 (21,4) 0,619
Obesidade 7 (46,7) 9 (30,0) 0,219
Tabagismo 0 3 (10,7) 0,265
Arco corneal 3 (20,0) 1 (3,7) 0,122
Xanthomata 0 0
Xanthelasma 3 (20,0) 0 (0) 0,04*
Angina 6 (40,0) 12 (42,0) 0,559
História de AVC 0 (0) 1 (3,6) 0,651
História de infarto do miocárdio 3 (20,0) 11 (39,3) 0,173
Angioplastia coronária prévia 3 (20,0) 11 (40,7) 0,153
Bypass coronário prévio 4 (26,7) 5 (17,9) 0,381

Os números são n (%), para variáveis categóricas, ou média ± DP, para variáveis contínuas;

p < 0,05; HF: hipercolesterolemia familiar.

 Dados laboratoriais de pacientes com testes genéticos positivos ou negativos para hipercolesterolemia familiar
Positivo (n = 15) Negativo (n = 30) Valor de p
Colesterol Total cholesterol (mg/dL) 263,1 ± 93,1 231,0 ± 57,4 0,417
LDL-C (mg/dL) 208,1 ± 41,8 151,4 ± 50,6 0,002*
HDL-C (mg/dl) 52,2 ± 9,7 50,1 ± 12,0 0,617
Apo A1 (mg/dL) 139,3 ± 19,9 140,1 ± 22,9 0,916
Apo B (mg/dL) 138,7 ± 30,2 106,3 ± 31,6 0,005*
Triglicerídeo (mg/dL) 127,9 ± 52,1 144,6 ± 73,5 0,484
PCR (mg/dL) 0,4 ± 0,7 0,3 ± 0,6 0,707
Glicemia (mg/dL) 116,4 ± 79,9 107,5 ± 48,2 0,667

Os números são n (%), para variáveis categóricas, ou média ± DP, para variáveis contínuas;

p < 0,05; Apo A1: Apolipoproteína A1; Apo B: Apolipoproteína B; PCR: Proteína -C-reativa; HDL-C: colesterol de lipoproteína de alta densidade; LDL-C: Colesterol de lipoproteína de baixa densidade.

Quando as correlações entre os níveis de LDL-C e outras variáveis clínicas, demográficas e antropométricas foram examinadas, houve uma correlação fraca, embora significativa entre LDL-C e o escore clínico (R = 0,382, p = 0,037) e uma moderada e significativa correlação entre LDL-C e gordura corporal (R = 0,461, p = 0,01). No entanto, quando os pacientes foram estratificados de acordo com a positividade do teste genético, aqueles com qualquer uma das mutações estudadas não mostraram correlação entre LDL-C e outras variáveis, enquanto que para aqueles sem mutação, houve uma correlação moderada, estatisticamente significativa entre LDL- C e o escore clínico (R = 0,554, p = 0,01), bem como uma correlação significativa, moderada e limítrofe entre LDL-C e gordura corporal (R = 0,441, p = 0,05).

 Discussão

HF é uma desordem do metabolismo do colesterol e, de fato, um dos distúrbios hereditários mais comuns.2,10 As taxas de doenças cardiovasculares prematuras são muito maiores em pacientes com HF, mas a terapia com fármaco a longo prazo tem potencial para baixar as taxas de eventos cardiovasculares em pacientes com HF, levando a taxas semelhantes às encontradas na população geral.11 Uma vez que a prevenção primária efetiva no cenário de HF requer seu diagnóstico precoce, quanto maior seja o conhecimento que temos sobre esta doença, melhor podemos reconhecê-la e realizar uma gestão adequada do paciente.

Neste estudo, pacientes com HF geneticamente confirmada tiveram, como esperado, um maior escore clínico para HF. Além disso, eles apresentaram mais evidências clínicas de hipercolesterolemia grave, como o xanthelasma, possivelmente devido a que o grupo monogênico teria tido níveis elevados de LDL-C desde o nascimento e, portanto, um maior "Fator LDL-C" cumulativo.12 Finalmente, os níveis de LDL-C e Apo B foram superiores aos pacientes com testes genéticos negativos, como demonstrado anteriormente.13,14 Apo B é o principal componente proteico de lipoproteínas, como VLDL e LDL, e as concentrações de Apo B tendem a refletir as de LDL-C.15 Os níveis plasmáticos de apolipoproteína B representam todas as lipoproteínas aterogénicas na circulação; no entanto, como cada partícula aterogênica contém uma única molécula de apolipoproteína B, os níveis de Apo B também fornecem um reflexo preciso do número de partículas aterogênicas.16

Para destacar, os níveis de LDL-C foram correlacionados com o escore clínico e com a gordura corporal, tanto na população geral de pacientes como em pacientes sem a confirmação genética de HF. Naqueles com HF geneticamente confirmada, não houve correlação entre LDL-C e outras variáveis clínicas ou bioquímicas nos pacientes. Isso pode sugerir que o primeiro poderia ter formas menos severas de HF relacionadas a outras mutações ou hipercolesterolemia grave devido a outras etiologias e, nesses casos, o nível de LDL-C também seria associado a fatores modificáveis ou ambientais. Em contraste, em pacientes com HF, a gravidade dos distúrbios causados pelas mutações seria o fator predominante que determinaria os níveis de LDL-C, o que transformaria outras correlações com variáveis antropométricas ou bioquímicas menos significativas.

Este estudo é limitado pelo pequeno tamanho da amostra, o que transforma os resultados em geradores de hipóteses. É importante assinalar que é possível que uma proporção dos pacientes tenha uma mutação em um gene ainda não identificado. Com técnicas de diagnóstico molecular padrão, uma mutação conhecida pode ser detectada em 20-30% dos pacientes com possível HF e 60-80% de pacientes com FH definida.17,18 Uma vez que aproximadamente 2/3 dos pacientes têm HF possível, não são detectadas mutações em cerca de 60% dos pacientes testados com este distúrbio17 o que levou a uma busca de genes adicionais causadores de HF. No entanto, alguns casos clinicamente diagnosticados de HF podem ser poligênicos, devido à herança de um número maior do que a média de alelos comuns elevadores do LDL-C (cada um causando um leve efeito) levando a um aumento do LDL-C acima do corte diagnóstico.19

Conclusões

Os presentes resultados sugerem que, em pacientes com hipercolesterolemia grave e fenótipo HF, mesmo na ausência de confirmação genética de HF, o manejo do paciente deve ter especial atenção direcionada aos fatores modificáveis associados ao LDL-C, como gordura corporal. Uma diminuição da gordura corporal pode determinar uma redução do LDL-C, o que é conhecido por diminuir o risco cardiovascular.20

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela FAPERJ.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Juliana Duarte Lopes da Silva pela Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Aprovação Ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto Nacional de Cardiologia sob o número de protocolo #26802514.4.0000.5272. Todos os procedimentos envolvidos nesse estudo estão de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, atualizada em 2013. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.