Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC tHYcpLTCD4VD8mpDVytq4Xn S0066-782X2018000100044 10.5935/abc.20180008 Original Articles Cell Physiology Melatonin-Induced Protective Effects on Cardiomyocytes Against Reperfusion Injury Partly Through Modulation of IP3R and SERCA2a Via Activation of ERK1 Hu Shunying Zhu Pingjun Zhou Hao Zhang Ying Chen Yundai Chinese PLA General Hospital Beijing China Chinese PLA General Hospital, Beijing - China Mailing Address: Shunying Hu, 28 Fuxing Road, 100853, Beijing - China. E-mail: hsylily@163.com

Author contributions

Conception and design of the research: Hu S, Zhu P, Zhou H, Zhang Y, Chen Y; Acquisition of data: Hu S, Zhu P, Zhou H, Zhang Y; Analysis and interpretation of the data, Statistical analysis and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Hu S, Zhou H; Obtaining financing and Writing of the manuscript: Hu S.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 01 2018 110 1 44 51 24 01 2017 31 07 2017 22 09 2017 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited Resumo Background:

Melatonin is a neuroendocrine hormone synthesized primarily by the pineal gland that is indicated to effectively prevent myocardial reperfusion injury. It is unclear whether melatonin protects cardiac function from reperfusion injury by modulating intracellular calcium homeostasis.

 Objective:

Demonstrate that melatonin protect against myocardial reperfusion injury through modulating IP3R and SERCA2a to maintain calcium homeostasis via activation of ERK1 in cardiomyocytes.

 Methods:

In vitro experiments were performed using H9C2 cells undergoing simulative hypoxia/reoxygenation (H/R) induction. Expression level of ERK1, IP3R and SERCA2a were assessed by Western Blots. Cardiomyocytes apoptosis was detected by TUNEL. Phalloidin-staining was used to assess alteration of actin filament organization of cardiomyocytes. Fura-2 /AM was used to measure intracellular Ca2+ concentration. Performing in vivo experiments, myocardial expression of IP3R and SERCA2a were detected by immunofluorescence staining using myocardial ischemia/ reperfusion (I/R) model in rats.

 Results:

In vitro results showed that melatonin induces ERK1 activation in cardiomyocytes against H/R which was inhibited by PD98059 (ERK1 inhibitor). The results showed melatonin inhibit apoptosis of cardiomyocytes and improve actin filament organization in cardiomyocytes against H/R, because both could be reversed by PD98059. Melatonin was showed to reduce calcium overload, further to inhibit IP3R expression and promote SERCA2a expression via ERK1 pathway in cardiomyocytes against H/R. Melatonin induced lower IP3R and higher SERCA2a expression in myocardium that were reversed by PD98059.

 Conclusion:

melatonin-induced cardioprotection against reperfusion injury is at least partly through modulation of IP3R and SERCA2a to maintain intracellular calcium homeostasis via activation of ERK1.

 Keywords: Melatonin Myocardial Reperfusion Cardiac Myocytes Myocardial Infarction Heart Failure National Natural Science Foundation of China 81770237 This study was funded by National Natural Science Foundation of China (Nº.81770237) and partially funded by China Postdoctoral Science Foundation. Introduction

Myocardial ischemia-reperfusion injury typically arises in patients presenting with acute ST-segment elevation myocardial infarction (STEMI), in whom the most effective therapeutic intervention for reducing acute myocardial ischemic injury and limiting the size of myocardial infarction (MI) is timely and effective myocardial reperfusion therapy.1 However, the process of myocardial reperfusion can itself induce further myocardial reperfusion injury.1-4 Myocardial reperfusion injury weakens the benefit of reperfusion therapy and brings to patients larger MI size, more severe heart failure and worse prognosis. Restoration of cardiac circulation is accompanied by cell damages and death (lethal reperfusion injury), reperfusion arrhythmias, myocardial stunning, and no-reflow phenomenon. Lethal reperfusion injury (cardiomyocyte death induced by reperfusion) is a key therapeutic target with anticipated significant impact on the patient’s prognosis.1-6 Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine) is a neuroendocrine hormone, which is synthesized primarily by the pineal gland.7,8 Melatonin presents profound protective effects against myocardial ischemia-reperfusion injury through antioxidant actions.9-18 Ca2+ overload is the primary stimulator to ischemia/reperfusion injury and induce cardiomyocytes apoptosis in ischemia/reperfusion condition. It is unclear whether melatonin protects cardiac function from reperfusion injury by modulating intracellular calcium homeostasis. Yeung et al.19 suggested that melatonin is cardioprotective against chronic hypoxia-induced myocardial injury because it improves calcium handling in the sarcoplasmic reticulum (SR) of cardiomyocytes via an antioxidant mechanism.

However, the evidence about melatonin’s effect and underlying mechanism on Ca2+ overload under acute ischemia/reperfusion is rare. The cardiac inositol 1,4,5-trisphosphate receptors (IP3R) and sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA2a) are key mediators for intracellular calcium handling, contractility and death in cardiac cells.20-23 So in the present study we hypothesized melatonin has protective effects on cardiomyocyte against reperfusion injury through modulating IP3R and SERCA2a to maintain intracellular calcium homeostasis. Ischemia-reperfusion has been shown to activate the anti-apoptotic pro-survival kinase signalling cascades including p42/p44 extra-cellular signal-regulated kinases (ERK 1/2) which have been implicated in cellular survival.24,25 It is not clear if ERK1 plays important role during modulation of melatonin on calcium homeostasis in cardiomyocytes. The present study aimed to elucidate whether melatonin protects cardiomyocytes against reperfusion injury through modulating IP3R and SERCA2a to reduce calcium overload via ERK1 pathway.

 Methods Ethics statement

The present study was performed in accordance with the guidelines of the Ethic Committee of Chinese PLA (People's Liberation Army) General Hospital, Beijing, China.

 H9C2 Cells culture

H9C2 cells (derived from the rat embryonic cardiomyoblast) were obtained from Chinese Academy of Medical Sciences (Shanghai, China) were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12, Thermo Fisher Biochemical Products, Beijing, China) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) and 100 mg/mL penicillin/streptomycin (Beyotime Institute of Biotechnology, China).

 H/R injury induction in vitro and melatonin or plus with PD98059 treatment

Hypoxic conditions were produced using fresh Hanks solution with 95% N2 and 5 % CO2. The pH was adjusted to 6.8 with lactate to mimic ischemic conditions. The dishes were put into a hypoxic incubator (Invivo2-400, Ruskinn) that was equilibrated with 95% N2 and 5% CO2and the actual oxygen concentration was zero. Ambient O2 levels in the hypoxia incubator were monitored by an O2 analyzer (series-2000, Alpha Omega Instruments). After hypoxic treatment, the culture medium was rapidly replaced with fresh DMEM with 1% FBS to initiate reoxygenation. Hypoxia/reoxygenation procedure was achieved by 4 h of hypoxia treatment (anoxia) and 4 h of reoxygenation treatment. For melatonin treatment, cultured cells were pre-incubated with melatonin (5 uM) 12 h before hypoxia, or plus with PD98059 with concentration of 10 uM prior to melatonin treatment. The dose of melatonin was chosen according to previous studies.18,26

In vitro TUNEL apoptosis assay of cardiomyocytes by confocal microscopy

The apoptosis of H9C2 cells was examined by TUNEL assay. Briefly, cultured cardiomyocytes were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) (Millipore, USA) and permeabilized with 1% Triton X-100 (Sigma Aldrich, USA) in phosphate-buffered saline (PBS) (Invitrogen, USA) for 30 minutes, followed by 3 times (3×10 mins) wash with fresh PBS. Then, an Apo-BrdU in Situ DNA Fragmentation Assay Kit (BioVision, USA) was applied for 1 hour, followed by incubating the treated plates with 5 µl anti-BrdUFITC antibody. Fifteen minutes of DAPI immunostaining were performed to identify the nuclei of cardiomyocytes. Then, the images were taken with an inverted Leica TCS-SP2 AOBS confocal laser-scanning microscope (Leica, Germany). Apoptosis was quantified as the percentage of cultured cardiomyocytes.

 F-actin study with fluorescent phalloidin and confocal microscopy

F-actin detection with phalloidin was done according to manufacturer’s instructions. Briefly, H9C2 were fixed on polylysine-treated glass with 3.7% paraformaldehyde and later washed with 0.1% Triton X-100-PBS. Thereafter they were stained with 0.8unit/ml fluorescent FITC-phalloidin conjugate solution (KeyGen Bio TECH Corp,China) for 10 min at room temperature. Finally, they were washed three times with PBS. Mounted samples were analyzed using confocal microscopy.

 Detection of intracellular Ca<sup>2 +</sup> concentration

Intracellular Ca2+ was measured using the calcium-dependent fluorescent dye Fura-2 according to the manufacturer’s instructions. Briefly, H9C2 cultures were transferred to 1 mL fresh DMEM containing 5 µL Fura-2-acetoxy-methylester (AM; 10 µM; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) and incubated in a CO2 incubator at 37ºC for 1 h. Fura-2-loaded cells were then placed on the stage of a confocal microscopy (Olympus) and viewed using a 60× oil immersion objective.

 Western blots

Following the appropriate treatments, cultured cells were lysed with RIPA lysis buffer (Beyotime,China) for 30 min and centrifuged at 14,000xg for 30 min. Equal amounts of protein were separated by 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (Millipore). After being blocked with 5% milk in Tris buffered saline containing 0.05% Tween20 (TBST) at room temperature for 1h, the membrane was incubated at 4ºC overnight with the following primary antibodies: t-ERK1(1:2000, Abcam), p-ERK1(1:1000, Abcam), IP3R (1:1000,Abcam), and SERCA2a (1:1000,Ab-cam). After being washed with TBST and further incubated with the appropriate secondary antibody at 37ºC for 60 min, the blots were visualized with an enhanced chemiluminescence (ECL) reagent.

 Myocardial ischemia/reperfusion (I/R) model and melatonin treatment

Male Sprague-Dawley (SD) rats (250 ± 10 g) were purchased from the Experimental Animal Center, Chinese PLA General Hospital. All procedures were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of the Chinese PLA General Hospital. Rats were divided into the following groups (n = 5 in each group): (1) Control group, (2) I/R group, (3) I/R+Melatonin group, (4) I/R+Melatonin+PD98059. Rats were intraperitoneally anaesthetized with sodium pentobarbital (50 mg/kg). The animals were then incubated and ventilated by a volume- regulated respirator during surgery. After a left lateral thoracotomy and pericardectomy, the left coronary artery was identified and gently ligated with a 6.0 prolene suture. Successful AMI was confirmed by the typical ST segment elevation in electrocardiography. Myocardial ischemia lasted for 30 mins and reperfusion for 2 hours. Freshly prepared melatonin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) was administered intraperitoneally at a dose of 20 mg/kg 12 hours prior to MI. PD98059 (ERK1 inhibitor, Sigma,USA) was administered with intraperitoneal injection at a dose of 5 mg/kg 4 hours prior to melatonin treatment. At the end of the reperfusion period, the hearts were excised for the preparation of sections (4 µm thickness) to detect the expression of SERCA2a and IP3R by immunofluorescence staining.

 Detection of myocardial SERCA2a and IP3R expression by immunofluorescence staining

After being treated as above, the heart sections were fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 15 min at room temperature, permeabilized with 0.1% Triton X-100 for 10 min, and then blocked with 5% BSA for 1 h. Then, samples were incubated overnight at 4ºC with monoclonal mouse anti-rat SERCA2a antibody (1:100;Abcam, Cambridge, USA). After being washed with PBS for three times, samples were incubated with goat anti-mouse polyclonal IgG (1:400; Abcam,Cambridge, USA) at room temperature in the dark for 2 h. For nuclear counterstaining, samples were incubated with 4’, 6-diamidino-2-phenylidone (DAPI; Sigma, USA) for 5 min. Finally, the immunofluorescence images were obtained by inverted fluorescence microscope (Olympus, Tokyo, Japan).

 Statistical analysis

Data were described as the mean ± SD of at least three independent analyzed experiments. The differences among more than 2 groups were evaluated through 1-way ANOVA (all data met the variances homogeneity and normal distribution),and LSD method was used to compare the statistical difference in the post-hoc analysis. A value of P < 0.05 was considered statistically significant. All of the statistical analyses were performed with SPSS for Windows version 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

 Results Melatonin promoted activation of ERK1 in cardiomyocytes against H/R

At 4h after reoxygenation, we investigated the effect of melatonin on phosphorylation of ERK1 (p-ERK1) using Western blot. The expression level of p-ERK1 did not show significant difference between control and H/R group. Melatonin significantly promoted the expression of p-ERK1 in cardiomyocytes which was reversed by PD98059 (ERK1 inhibitor) (Figure 1).

Melatonin promoted activation of ERK1 in H9C2 cells against H/R. H9C2 cells incubated in normal condition or in simulated H/R condition, in simulated H/R condition plus pretreatment with melatonin, or in simulated H/R condition plus pretreatment with melatonin and PD98059 (ERK1 inhibitor).The expression levels of phosphorylated ERK1 (p-ERK1) were evaluated by Western blotting (A) and were quantitatively analyzed (B). All values are presented as the mean±SD. n = 3. SSp < 0.01 vs. H/R group; #p < 0.05 vs. H/R+Mel group.(Control: control group; H/R:H/R group; H/R+mel: H/R+ melatonin group; H/R+mel+PD: H/R+ melatonin+PD98059 group)

Melatonin prevents H/R-induced apoptosis of cardiomyocytes via ERK1 pathyway in vitro

The apoptosis of H9C2 cells was detected at 4h after reoxygenation by TUNEL staining. The results demonstrated H/R induce apoptosis of H9C2 cells in vitro. Pretreament with melatonin decreased H/R-induced apoptosis of H9C2. The results showed percentage of apoptotic cells was obviously higher in H/R group compared to control group, however, which was significantly lower in melatonin group than H/R group. PD98059 (ERK1 inhibitor) reduced the effect of melatonin on preventing cardiomyocytes apoptosis against H/R (Figure 2).

Melatonin prevents H9C2 cells apoptosis against H/R via ERK1 in vitro. Apoptosis was assessed by fluorescence TUNEL. Representative TUNEL staining images (A) and quantitative analysis in H9C2 cells(B). bar = 50 µm. All values are presented as the mean±SD. n = 3.**p < 0.01 vs. control group; Sp < 0.05 vs. H/R group; #p < 0.05 vs. H/R+Mel group. (Control: control group; H/R:H/R group; H/R+mel: H/R+ melatonin group; H/R+mel+PD: H/R+ melatonin+PD98059 group)

Melatonin protects F-actin organization in H9C2 cells against H/R via ERK1 pathway

We investigated F-actin organization in H9C2 cells at 4h after reoxygenation by fluorescent FITC-phalloidin staining. Control cardiomyocytes showed regular and well-defined actin organization, while cardiomyocytes in H/R group showed a more diffuse and irregular F-actin disposition. The differences can be visualized in the representative cardiomyocytes. Pretreatment of melatonin improved F-actin organization in cardiomyocytes compared with H/R group, but PD98059 damaged F-actin organization by inhibiting melatonin’s effect (Figure 3).

Melatonin protects F-actin organization in H9C2 cells against H/R via ERK1 in vitro. Representative confocal microscopy images show H9C2 cells stained with FITC-phalloidin. The results showed that simulated H/R induced more diffuse and irregular actin disposition compared with control group. Melatonin preserved more regular and well-defined actin organization and PD98059 (ERK1 inhibitor) reduced the protection of melatonin. bar = 20µm. (Control: control group; H/R:H/R group; H/R+mel: H/R+ melatonin group; H/R+mel+PD: H/R+ melatonin+PD98059 group)

Melatonin reduces Ca<sup>2 +</sup> overload in cardiomyocytes against H/R via ERK1

At 4h after reoxygenation, we investigated effect of melatonin on H/R-induced Ca2+ overload in cardiomyocytes using the calcium-dependent fluorescent dye Fura-2. The results showed the fluorescence was stronger in H/R group than in control group, meanwhile the fluorescence was decreased in melatonin group compared with H/R group, which indicated that H/R caused a marked increase of cytosolic Ca2+ concentration and that melatonin pretreatment significantly inhibited H/R-induced increase of cytosolic Ca2+ concentration which was reduced by PD98059 (Figure 4).

Melatonin reduces Ca<sup>2+</sup> overload in H9C2 cells against H/R via ERK1 in vitro. Ca<sup>2+</sup> content was assessed using Fura-2/AM in H9C2 cells incubated in normal condition or in simulated H/R condition, in simulated H/R condition plus pretreatment with melatonin, or in simulated H/R condition plus pretreatment with melatonin and PD98059 (ERK1 inhibitor). The green fluorescence intensity by Fura-2 was obviously stronger in H/R group, and melatonin pretreatment reversed the change which was inhibited by ERK1 inhibitor.bar = 30 µm. All values are presented as the mean ± SD. n = 3.**p < 0.01 vs. control group; Sp < 0.05 vs. H/R group; #p < 0.05 vs. H/R+Mel group. (Control: control group; H/R:H/R group; H/R+mel: H/R+ melatonin group; H/R+mel+PD: H/R+ melatonin+PD98059 group)

Melatonin modulated expression of IP3R and SERCA2a in cardiomyocytes against H/R via ERK1

At 4h after reoxygenation, we investigated the effect of melatonin on expression of IP3R and SERCA2a in H9C2 by Western blot. The results indicated H/R increase expression of IP3R and reduce expression of SERCA, respectively. Pretreatment of melatonin inhibited expression of IP3R and induced expression of SERCA, which were reversed by PD98059. (Figure 5).

Melatonin modulated expression of SERCA2a and IP3R in H9C2 cells against H/R via ERK1 pathway in vitro. The results indicated melatonin inhibited expression of IP3R and promoted expression of SERCA2a which was reduced by PD98059. Representative Western blot images (A) and quantitative analysis (B-C) showed melatonin’s effect on expression of IP3R and SERCA2a via ERK1 pathway in H9C2 cells against H/R.bar = 30 µm. **p < 0.01 vs. control group; Sp < 0.05 vs. H/R group; #p < 0.05 vs. H/R+Mel group. (Control: control group; H/R:H/R group; H/R+mel: H/R+ melatonin group; H/R+mel+PD: H/R+ melatonin+PD98059 group)

Melatonin modulated expression of IP3R and SERCA2a via ERK1 pathway in reperfused rat hearts

In vivo, we investigated the effect of melatonin on expression of IP3R and SERCA2a in reperfused rat hearts. IP3R expression was higher in I/R group compared with control group, and melatonin reversed the change. The results demonstrated expression of SERCA2a was lower in I/R group compared with control group, but expression of SERCA2a was higher in melatonin group than I/R group. The pretreament of PD98059 reduced the effect of melatonin on expression of IP3R and SERCA2a in rat hearts against I/R (Figure 6).

Melatonin modulated expression of IP3R and SERCA2a via ERK1 pathway in reperfused rat hearts. In reperfused myocardium, expression of IP3R and SERCA2a were assessed by immunofluorescence staining (A) and quantitative analysis (B-C). The results showed that fluorescence intensity of IP3R was increased in I/R group more than in control group, but was lower in melatonin group compared with I/R group. On the contrary, melatonin increased expression of SERCA2a in reperfused myocardium. Both of the effects of melatonin on expression of IP3R and SERCA2a were inhibited by PD98059 (ERK1 inhibitor). bar = 30 µm. All values are presented as the mean ± SD. n = 5.*p < 0.05 vs. control group; Sp < 0.05 vs. I/R group; #p < 0.05 vs. I/R+Mel group. (Control: control group; I/R:I/R group; I/R+mel: I/R+ melatonin group; I/R+mel+PD: I/R+ melatonin+PD98059 group).

Discussion

Reperfusion-induced death of cardiomyocytes that were viable at the end of the ischemic event is defined as lethal myocardial reperfusion injury (reperfusion infarction).1,3,27 The existence of lethal myocardial reperfusion injury has been inferred in both experimental MI models and in patients with STEMI(1). The major contributory factors for reperfusion-induced death of cardiomyocytes include oxidative stress, calcium overload, mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening, and hypercontracture.28,29 Ca2+ overload is one of the main actors of this lethal reperfusion injury,30 which results in part from excessive sarco/endoplasmic reticulum (SR/ER) Ca2+ release and Ca2+ influx through the plasma membrane.31 Although ryanodine receptors (RyRs) are the major cardiac SR/ER Ca2+-release channels involved in excitation-contraction coupling and ischemia-reperfusion injury,32,33 some studies reported an increasing role for inositol 1,4,5-trisphosphate receptors (IP3R) Ca2+-release channels in the modulation of excitation-contraction coupling and cell death.22,23 Gomez et al34 indicated that inhibition of IP3R Ca2+ channeling complex limited SR/ER Ca2+ release and reduced both cytosolic and mitochondrial Ca2+ overload and inhibited subsequent PTP opening. Meantime, the cardiac SERCA2a is a key pump responsible for intracellular calcium handling and contractility in cardiac cells. Impaired calcium reuptake resulting from decreased expression and activity of SERCA2a is a hallmark of HF.20 IP3R and SERCA2a have been confirmed to play important roles in maintaining intracellular calcium homeostasis in cardiomyocytes.20,22,23,35

Melatonin as one type of neuroendocrine hormone, is synthesized primarily by the pineal gland.7,8 Previous studies showed melatonin confers important protective effects against myocardial ischemia-reperfusion injury.9-14 Melatonin administration showed to contribute to the rehabilitation of contractile function on isolated heart during reperfusion and to reduce the sensitivity of mPTP opening to Ca2+.36

Melatonin has also demonstrated to play a role in the mitochondrial adaptive changes.37 Melatonin and its metabolites efficiently interact with various ROS and reactive nitrogen species, and additionally they up regulate antioxidant enzymes and downregulate pro-oxidant enzymes.9,15,16 Previous studies confirmed that melatonin pretreatment attenuated IR injury by reducing oxidative damage and inhibiting mPTP opening. However, the evidence about melatonin’s effect and underlying mechanism on Ca2+ overload under acute ischemia/reperfusion is rare. The present study demonstrated that melatonin performs cardioprotection through modulation of IP3R and SERCA2a to maintain calcium homeostasis via ERK1 pathway in cardiomyocytes. ERK1 pathway has been shown to have anti-apoptotic effect during the process of reperfusion injury.24,25 It is not clear if melatonin maintains calcium homeostasis through modulating IP3R and SERCA2a via ERK1.

In the present study, the results showed that melatonin promote phosphorylation of ERK1 in cardiomyocytes against H/R, and pretreatment of PD98059 (ERK1 inhibitor) reduced phosphorylation of ERK1. In vitro results indicated melatonin prevents cardiomyocytes apoptosis against H/R. Meantime, melatonin can preserve structure of cardiomyocytes against reperfusion injury. Moreover, calcium overload induced by H/R is significantly reversed by melatonin. Moreover, the pretreatment of PD98059 inhibited the effect of melatonin on apoptosis, F-actin organization and calcium overload in cardiomyocytes against H/R. To further elucidate the underlying mechanism for protective effect of melatonin cardiomyocytes against H/R, we observed the effects of melatonin on expression of IP3R and SERCA2a. The results showed SERCA2a expression is decreased in H/R group compared with control group, but melatonin promoted SERCA2a expression in cardiomyocytes. Contrarily, H/R induces IP3R expression, and melatonin inhibits the expression of IP3R. Pretreatment of PD98059 reversed the effect of melatonin on expression of IP3R and SERCA2a. In vivo, myocardial IP3R level is reduced and SERCA2a expression is increased by pretreatment of melatonin, however, PD98059 reversed the effect of melatonin on expression of IP3R and SERCA2a. Melatonin in the dose used in the study did not show obvious side effects compared with other groups. In vivo results further confirmed that melatonin regulates the expression of IP3R and SERCA2a via ERK1. From the above results, it is reasonable to infer that melatonin could protect cardiomyocytes against reperfusion injury through affecting IP3R and SERCA2a expression to inhibit calcium overload via ERK1 pathway.

 Conclusion

Melatonin can protect cardiomyocytes against reperfusion injury through modulation of IP3R and SERCA2a attenuating calcium overload via ERK1 pathway. Improved calcium homeostasis followed by preserved function and structure of cardiomyocytes can decrease cardiomyocytes apoptosis and improve heart function. The present study provide more evidence for the use of melatonin to protect cardiac function in patients with STEMI undergoing myocardial reperfusion therapy.

Sources of Funding

This study was funded by National Natural Science Foundation of China (Nº.81770237) and partially funded by China Postdoctoral Science Foundation.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Ethics approval and consent to participate

This study was approved by the Ethics Committee on Animal Experiments of the Chinese PLA General Hospital.

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Yu L Liang H Dong X Zhao G Jin Z Zhai M Reduced silent information regulator 1 signaling exacerbates myocardial ischemia-reperfusion injury in type 2 diabetic rats and the protective effect of melatonin J Pineal Res 2015 59 3 376 390 10.1111/jpi.12269 11 Yu L, Liang H, Lu Z, Zhao G, Zhai M, Yang Y, et al. Membrane receptor-dependent Notch1/Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury: in vivo and in vitro studies. J Pineal Res 2015;59(4):420-33. doi: 10.1111/jpi.12272. Yu L Liang H Lu Z Zhao G Zhai M Yang Y Membrane receptor-dependent Notch1/Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury: in vivo and in vitro studies J Pineal Res 2015 59 4 420 433 10.1111/jpi.12272 12 Sahna E, Parlakpinar H, Turkoz Y, Acet A. Protective effects of melatonin on myocardial ischemia/reperfusion induced infarct size and oxidative changes. Physiol Res. 2005;54(5):491-5. PMID: 15641932. Sahna E Parlakpinar H Turkoz Y Acet A Protective effects of melatonin on myocardial ischemia/reperfusion induced infarct size and oxidative changes Physiol Res 2005 54 5 491 495 15641932 13 Petrosillo G, Colantuono G, Moro N, Ruggiero FM, Tiravanti E, Di Venosa N, et al. Melatonin protects against heart ischemia-reperfusion injury by inhibiting mitochondrial permeability transition pore opening. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2009;297(4):H1487-93. doi: 10.1152/ajpheart.00163.2009. Petrosillo G Colantuono G Moro N Ruggiero FM Tiravanti E Di Venosa N Melatonin protects against heart ischemia-reperfusion injury by inhibiting mitochondrial permeability transition pore opening Am J Physiol Heart Circ Physiol 2009 297 4 H1487 H1493 10.1152/ajpheart.00163.2009 14 Tan DX, Manchester LC, Reiter RJ, Qi W, Kim SJ, El-Sokkary GH. Ischemia/reperfusion-induced arrhythmias in the isolated rat heart: prevention by melatonin. J Pineal Res. 1998;25(3):184-91. PMID: 9745988. Tan DX Manchester LC Reiter RJ Qi W Kim SJ El-Sokkary GH Ischemia/reperfusion-induced arrhythmias in the isolated rat heart: prevention by melatonin J Pineal Res 1998 25 3 184 191 9745988 15 Galano A, Tan DX, Reiter RJ. On the free radical scavenging activities of melatonin's metabolites, AFMK and AMK. J Pineal Res. 2013;54(3):245-57. doi: 10.1111/jpi.12010. Galano A Tan DX Reiter RJ On the free radical scavenging activities of melatonin's metabolites, AFMK and AMK J Pineal Res 2013 54 3 245 257 10.1111/jpi.12010 16 Galano A, Tan DX, Reiter RJ. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 2011;51(1):1-16. doi: 10.1111/j.1600-079X.2011.00916.x. Galano A Tan DX Reiter RJ Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination J Pineal Res 2011 51 1 1 16 10.1111/j.1600-079X.2011.00916.x 17 Sahna E, Deniz E, Bay-Karabulut A, Burma O. Melatonin protects myocardium from ischemia-reperfusion injury in hypertensive rats: role of myeloperoxidase activity. Clin Exp Hypertens. 2008;30(7):673-81. doi: 10.1080/10641960802251966. Sahna E Deniz E Bay-Karabulut A Burma O Melatonin protects myocardium from ischemia-reperfusion injury in hypertensive rats: role of myeloperoxidase activity Clin Exp Hypertens 2008 30 7 673 681 10.1080/10641960802251966 18 Yang Y, Duan W, Jin Z, Yi W, Yan J, Zhang S, et al. JAK2/STAT3 activation by melatonin attenuates the mitochondrial oxidative damage induced by myocardial ischemia/reperfusion injury. J Pineal Res. 2013;55(3):275-86. doi: 10.1111/jpi.12070. Yang Y Duan W Jin Z Yi W Yan J Zhang S JAK2/STAT3 activation by melatonin attenuates the mitochondrial oxidative damage induced by myocardial ischemia/reperfusion injury J Pineal Res 2013 55 3 275 286 10.1111/jpi.12070 19 Yeung HM, Hung MW, Fung ML. 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Hayashi T Su TP Sigma-1 receptor chaperones at the ER-mitochondrion interface regulate Ca(2+) signaling and cell survival Cell 2007 131 3 596 610 10.1016/j.cell.2007.08.036 24 Hausenloy DJ, Yellon DM. New directions for protecting the heart against ischaemia-reperfusion injury: targeting the Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK)-pathway. Cardiovasc Res. 2004;61(3):448-60. doi: 10.1016/j.cardiores.2003.09.024. Hausenloy DJ Yellon DM New directions for protecting the heart against ischaemia-reperfusion injury: targeting the Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK)-pathway Cardiovasc Res 2004 61 3 448 460 10.1016/j.cardiores.2003.09.024 25 Skyschally A, Gent S, Amanakis G, Schulte C, Kleinbongard P, Heusch G. Across-species transfer of protection by remote ischemic preconditioning with species-specific myocardial signal transduction by reperfusion injury salvage kinase and survival activating factor enhancement pathways. Circ Res 2015;117(3):279-88. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.117.306878. Skyschally A Gent S Amanakis G Schulte C Kleinbongard P Heusch G Across-species transfer of protection by remote ischemic preconditioning with species-specific myocardial signal transduction by reperfusion injury salvage kinase and survival activating factor enhancement pathways Circ Res 2015 117 3 279 288 10.1161/CIRCRESAHA.117.306878 26 Patino P, Parada E, Farre-Alins V, Molz S, Cacabelos R, Marco-Contelles J, et al. Melatonin protects against oxygen and glucose deprivation by decreasing extracellular glutamate and Nox-derived ROS in rat hippocampal slices. Neurotoxicology. 2016 Dec;57:61-8. doi: 10.1016/j.neuro.2016.09.002. Patino P Parada E Farre-Alins V Molz S Cacabelos R Marco-Contelles J Melatonin protects against oxygen and glucose deprivation by decreasing extracellular glutamate and Nox-derived ROS in rat hippocampal slices Neurotoxicology 2016 12 57 61 68 10.1016/j.neuro.2016.09.002 27 Piper HM, Garcia-Dorado D, Ovize M. A fresh look at reperfusion injury. 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Domenech RJ Sanchez G Donoso P Parra V Macho P Effect of tachycardia on myocardial sarcoplasmic reticulum and Ca2+ dynamics: a mechanism for preconditioning? J Mol Cell Cardiol 2003 35 12 1429 1437 14654369 34 Gomez L, Thiebaut PA, Paillard M, Ducreux S, Abrial M, Crola Da Silva C, et al. The SR/ER-mitochondria calcium crosstalk is regulated by GSK3beta during reperfusion injury. Cell Death Differ. 2016;23(2):313-22. doi: 10.1038/cdd.2015.101. Erratum in: Cell Death Differ. 2015;22(11):1890. Gomez L Thiebaut PA Paillard M Ducreux S Abrial M Crola Da Silva C The SR/ER-mitochondria calcium crosstalk is regulated by GSK3beta during reperfusion injury Cell Death Differ 2016 23 2 313 322 10.1038/cdd.2015.101 Erratum in: Cell Death Differ. 2015;22(11):1890 35 Younce CW, Burmeister MA, Ayala JE. Exendin-4 attenuates high glucose-induced cardiomyocyte apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress and activation of SERCA2a. 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PMID: 17896956. Giacomo CG Antonio M Melatonin in cardiac ischemia/reperfusion-induced mitochondrial adaptive changes Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets 2007 7 3 163 169 17896956 Artigos Originais Fisiologia Celular Efeitos Protetores Induzidos pela Melatonina nos Cardiomiócitos Contra Lesões de Reperfusão Parcialmente Através da Modulação Dde IP3R e SERCA por Meio da Ativação de ERK1 Hu Shunying Zhu Pingjun Zhou Hao Zhang Ying Chen Yundai Chinese PLA General Hospital, Beijing - China Correspondência: Shunying Hu, 28 Fuxing Road, 100853, Beijing - China. E-mail: hsylily@163.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Hu S, Zhu P, Zhou H, Zhang Y, Chen Y; Obtenção de dados: Hu S, Zhu P, Zhou H, Zhang Y; Análise e interpretação dos dados, Análise estatística e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Hu S, Zhou H; Obtenção de financiamento e Redação do manuscrito: Hu S.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

A melatonina é um hormônio neuroendócrino sintetizado principalmente pela glândula pineal que é indicado para prevenir efetivamente a lesão de reperfusão miocárdica. Não está claro se a melatonina protege a função cardíaca da lesão de reperfusão através da modulação da homeostase do cálcio intracelular.

 Objetivo:

Demonstrar que a melatonina protege contra a lesão de reperfusão miocárdica através da modulação de IP3R e SERCA para manter a homeostase de cálcio por meio da ativação de ERK1 em cardiomiócitos.

 Métodos:

Foram realizados experimentos in vitro usando células H9C2 submetidas a indução de hipoxia / reoxigenação simulada (H/R). O nível de expressão de ERK1, IP3R e SERCA foi avaliado por Western Blots. A apoptose de cardiomiócitos foi detectada por TUNEL. A coloração de faloidina foi utilizada para avaliar a alteração da organização de filamentos de actina dos cardiomiócitos. Fura-2 / AM foi utilizado para medir a concentração intracelular de Ca2+. Realizando experiências in vivo, a expressão miocárdica de IP3R e SERCA foi detectada por coloração com imunofluorescência usando modelo de isquemia miocárdica / reperfusão (I/R) em ratos.

 Resultados:

resultados in vitro mostraram que a melatonina induz a ativação de ERK1 em cardiomiócitos contra H/R que foi inibida por PD98059 (inibidor de ERK1). Os resultados mostraram que a melatonina inibe a apoptose dos cardiomiócitos e melhora a organização do filamento de actina em cardiomiócitos contra H/R, pois ambas poderiam ser revertidas pela PD98059. A melatonina mostrou reduzir a sobrecarga de cálcio, além de inibir a expressão de IP3R e promover a expressão de SERCA através da via ERK1 em cardiomiócitos contra H/R. A melatonina induziu menor IP3R e maior expressão de SERCA no miocárdio que foram revertidas pela PD98059.

 Conclusão:

a cardioproteção induzida pela melatonina contra lesão de reperfusão é pelo menos parcialmente através da modulação de IP3R e SERCA para manter a homeostase de cálcio intracelular via ativação de ERK1.

 Palavras-chave: Melatonina Reperfusão Miocárdica Miócitos Cardíacos Infarto do Miocárdio Insuficiência Cardíaca Introdução

A lesão de isquemia-reperfusão miocárdica geralmente ocorre em pacientes com infarto agudo do miocárdio com elevação do segmento ST (STEMI), em quem a intervenção terapêutica mais efetiva para reduzir a lesão isquêmica do miocárdio agudo e limitar o tamanho do infarto do miocárdio (MI) é a terapia de reperfusão miocárdica efetiva e feita em tempo oportuno.1 No entanto, o processo de reperfusão miocárdica pode induzir mais lesão de reperfusão miocárdica.1-4 A lesão de reperfusão miocárdica diminui o benefício da terapia de reperfusão e traz para os pacientes maior tamanho de IM, insuficiência cardíaca mais grave e pior prognóstico. A restauração da circulação cardíaca é acompanhada de danos e morte celulares (lesão de reperfusão letal), arritmias de reperfusão, atordoamento miocárdico e fenômeno de não refluxo. A lesão de reperfusão letal (morte de cardiomiócitos induzida por reperfusão) é um alvo terapêutico chave com significativo impacto antecipado no prognóstico do paciente.1-6 A melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina) é um hormônio neuroendócrino, que é sintetizado principalmente pela glândula pineal.7,8 A melatonina apresenta efeitos protetores profundos contra a lesão por isquemia-reperfusão no miocárdio através de ações antioxidantes.9-18 A sobrecarga de Ca2+ é o estimulador primário da lesão por isquemia / reperfusão e induz a apoptose dos cardiomiócitos na condição de isquemia / reperfusão. Não está claro se a melatonina protege a função cardíaca da lesão de reperfusão através da modulação da homeostase de cálcio intracelular. Yeung et al.,19 sugeriram que a melatonina é cardioprotectora contra a lesão miocárdica induzida por hipóxia crônica porque melhora a regulação do cálcio no retículo sarcoplasmático (RS) dos cardiomiócitos através de um mecanismo antioxidante.

No entanto, a evidência sobre o efeito da melatonina e o mecanismo subjacente à sobrecarga de Ca2+ sob isquemia / reperfusão aguda é rara. Os receptores cardíacos do inositol 1,4,5-trifosfato cardíaco (IP3R) e a ATPase do Ca2+ do retículo sarcoplasmático (SERCA) são mediadores importantes para a regulação intracelular do cálcio, a contratilidade e morte em células cardíacas.20-23 Portanto, no presente estudo, colocamos a hipótese de que a melatonina tem efeitos protetores nos cardiomiócitos contra lesões de reperfusão modulando os IP3R e SERCA para manter a homeostase do cálcio intracelular. A isquemia-reperfusão mostrou ativar as cascatas de sinalização anti-apoptóticas da quinase de sobrevivência, incluindo as quinases reguladas por sinal extracelular p42/p44 (ERK 1/2) que foram envolvidas na sobrevivência celular.24,25 Não está claro se o ERK1 tem um papel importante durante a modulação da melatonina na homeostase de cálcio nos cardiomiócitos. O presente estudo teve como objetivo elucidar se a melatonina protege os cardiomiócitos contra lesões de reperfusão através da modulação de IP3R e SERCA para reduzir a sobrecarga de cálcio através da via ERK1.

 Métodos Declaração de ética

O presente estudo foi realizado de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética do Hospital Geral do Exército de Libertação do Povo Chinês, Pequim, China.

 Cultura das células H9C2

As células H9C2 (derivadas do cardiomioblasto embrionário de ratos) foram obtidas da Academia Chinesa de Ciências Médicas (Xangai, China) cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco: Mistura Nutritiva F-12 (DMEM/F12, Thermo Fisher Biochemical Products, Pequim, China), complementada com 10% de soro bovino fetal (FBS, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e 100 mg/ml de penicilina / estreptomicina (Beyotime Institute of Biotechnology, China).

 Indução de lesão H/R in vitro e melatonina ou mais com tratamento PD98059

As condições hipóxicas foram produzidas usando solução fresca de Hanks com 95% de N2 e 5% de CO2. O pH foi ajustado para 6,8 com lactato para imitar condições isquêmicas. Os pratos foram colocados em uma incubadora hipóxica (Invivo2-400, Ruskinn) que foi equilibrada com 95% de N2 e 5% de CO2 e a concentração real de oxigênio foi zero. Os níveis ambientais de O2 na incubadora de hipóxia foram monitorados por um analisador de O2 (série-2000, Alpha Omega Instruments). Após o tratamento hipóxico, o meio de cultura foi rapidamente substituído por DMEM fresco com 1% de FBS para iniciar a reoxigenação. O procedimento de hipóxia / reoxigenação foi alcançado por 4 h de tratamento de hipóxia (anóxia) e 4 h de tratamento de reoxigenação. Para o tratamento com melatonina, as células cultivadas foram pré-incubadas com melatonina (5 uM) 12 h antes da hipóxia ou mais com PD98059 com concentração de 10 uM antes do tratamento com melatonina. A dose de melatonina foi escolhida de acordo com estudos prévios.18,26

Ensaio TUNEL in vitro de apoptose de cardiomiócitos por microscopia confocal

A apoptose das células H9C2 foi examinada pelo ensaio TUNEL. Os cardiomiócitos cultivados foram fixados com 4% de paraformaldeído (PFA) (Millipore, EUA) e permeabilizados com 1% de Triton X-100 (Sigma Aldrich, EUA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Invitrogen, EUA) durante 30 minutos, seguido por 3 vezes (3 x 10 minutos) de lavagem com PBS fresco. Em seguida, aplicou-se um Kit de Ensaio de Fragmentação de ADN in situ Apo-BrdU (BioVision, EUA) durante 1 hora, seguido por incubação das placas tratadas com 5 µl de anticorpo anti-BrdUFITC. Foram realizados 15 minutos de imunocoloração DAPI para identificar os núcleos dos cardiomiócitos. Enseguida, as imagens foram tomadas em um microscópio confocal de leitura laser Leica TCS-SP2 AOBS invertido (Leica, Alemanha). A apoptose foi quantificada como a porcentagem de cardiomiócitos cultivados.

 Estudo de F-actina com faloidina fluorescente e microscopia confocal

A detecção de F-actina com faloidina foi feita de acordo com as instruções do fabricante. As H9C2 foram fixadas em vidro tratado com polilisina com paraformaldeído a 3,7% e depois lavado com 0,1% de Triton X-100-PBS. Posteriormente, foram coradas com solução conjugada FITC-faloidina fluorescente 0,8 unidade/ml (KeyGen Bio TECH Corp, China) durante 10 min à temperatura ambiente. Finalmente, foram lavadas três vezes com PBS. As amostras montadas foram analisadas utilizando microscopia confocal.

 Detecção da concentração intracelular de Ca<sup>2+</sup>

O Ca2+ intracelular foi medido usando o corante fluorescente dependente de cálcio Fura-2 de acordo com as instruções do fabricante. As culturas de H9C2 foram transferidas para 1 mL de DMEM fresco contendo 5 µL de Fura-2-acetoxi-metiléster (AM; 10 µM; Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e incubadas em uma incubadora de CO2 a 37º C durante 1 h. As células carregadas com Fura-2 foram então colocadas na platina de um microscópio confocal (Olympus) e visualizadas usando uma objetiva de imersão em óleo de 60 ×.

 Western blots

Após os tratamentos apropriados, as células cultivadas foram lisadas com tampão de lise RIPA (Beyotime, China) durante 30 min e centrifugadas a 14 000 xg durante 30 min. Quantidades iguais de proteína foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio ao 10% e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (Millipore). Após ter sido bloqueada com 5% de leite em solução salina tamponada com tris contendo 0,05% de Tween20 (TBST) à temperatura ambiente durante 1 h, a membrana foi incubada a 4ºC durante a noite com os seguintes anticorpos primários: t-ERK1 (1: 2000, Abcam), p-ERK1 (1: 1000, Abcam), IP3R (1: 1000, Abcam) e SERCA (1: 1000, Ab-cam). Depois de ser lavada com TBST e incubada adicionalmente com o anticorpo secundário apropriado a 37ºC durante 60 min, as blots foram visualizadas com um reagente de quimioluminiscência melhorada (ECL).

 Modelo de isquemia / reperfusão miocárdica (I/R) e tratamento com melatonina

Ratos machos Sprague-Dawley (SD) (250 ± 10 g) foram adquiridos do Centro Animal Experimental, do Hospital Geral PLA da China. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal do Hospital Geral do PLA chinês. Os ratos foram divididos nos seguintes grupos (n = 5 em cada grupo): (1) Grupo de controle, (2) Grupo I/R, (3) Grupo I/R + Melatonina, (4) I/R + Melatonina + PD98059. Os ratos foram anestesiados intraperitonealmente com pentobarbital sódico (50 mg/kg). Os animais foram então incubados e ventilados por um respirador regulado por volume durante a cirurgia. Após uma toracotomia lateral esquerda e pericardectomia, a artéria coronária esquerda foi identificada e ligada suavemente com uma sutura de Prolene 6.0. O IAM bem-sucedido foi confirmado pela elevação típica do segmento ST na eletrocardiografia. A isquemia miocárdica durou 30 minutos e a reperfusão 2 horas. Melatonina recentemente preparada (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi administrada por via intraperitoneal em uma dose de 20 mg/kg 12 horas antes do IM. PD98059 (inibidor ERK1, Sigma, EUA) foi administrado com injeção intraperitoneal em uma dose de 5 mg/kg 4 horas antes do tratamento com melatonina. No final do período de reperfusão, os corações foram excisados para a preparação de seções (4 µm de espessura) para detectar a expressão de SERCA e IP3R por coloração de imunofluorescência.

 Detecção de expressão do miocárdio SERCA e IP3R por imunofluorescência

Depois de serem tratadas como foi mencionado acima, as secções do coração foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS durante 15 minutos à temperatura ambiente, permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 durante 10 min e depois bloqueadas com 5% de BSA durante 1 h. Em seguida, as amostras foram incubadas durante a noite a 4ºC com anticorpo monoclonal anti-rato SERCA (1: 100; Abcam, Cambridge, EUA). Depois de serem lavados com PBS por três vezes, as amostras foram incubadas com IgG policlonal de cabra anti-rato (1: 400; Abcam, Cambridge, EUA) à temperatura ambiente no escuro durante 2 h. Para contra-coloração nuclear, as amostras foram incubadas com 4', 6-diamidino-2-fenilidona (DAPI, Sigma, EUA) durante 5 min. Finalmente, as imagens de imunofluorescência foram obtidas por microscópio de fluorescência invertida (Olympus, Tóquio, Japão).

 Análise estatística

Os dados foram descritos como a média ± DP de pelo menos três experimentos independentes analisados. As diferenças entre mais de dois grupos foram avaliadas através de ANOVA de 1 via (todos os dados atendiam a homogeneidade de variâncias e distribuição normal), e o método LSD foi usado para comparar a diferença estatística na análise pós-hoc. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas com SPSS para Windows versão 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

 Resultados A melatonina promoveu ativação de ERK1 em cardiomiócitos contra H/R

Às 4 horas após a reoxigenação, investigamos o efeito da melatonina na fosforilação de ERK1 (p-ERK1) usando Western blot. O nível de expressão de p-ERK1 não mostrou diferença significativa entre o controle e o grupo H/R. A melatonina promoveu significativamente a expressão de p-ERK1 em cardiomiócitos a qual foi revertida por PD98059 (inibidor ERK1) (Figura 1).

A melatonina promoveu a ativação de ERK1 em células H9C2 contra H/R. As células H9C2 foram incubadas em condições normais ou em condições de H/R simuladas, em condições de H/R simuladas mais pré-tratamento com melatonina ou em condições de H/R simuladas mais pré-tratamento com melatonina e PD98059 (inibidor de ERK1). Os níveis de expressão de ERK1 fosforilado (p-ERK1) foram avaliados por Western Blot (A) e foram quantitativamente analisados (B). Todos os valores são apresentados como média ± DP. n = 3. <sup>SS</sup>p < 0,01 vs. grupo H/R; <sup>#</sup>p < 0,05 vs. grupo H/R + Mel. (Controle: grupo controle; H/R: grupo H/R, H/R + mel: grupo H/R + melatonina; H/R + mel + PD: H/R + melatonina + grupo PD98059)

A melatonina impede a apoptose induzida por H/R de cardiomiócitos via ERK1 in vitro

A apoptose das células H9C2 foi detectada às 4 h após a reoxigenação por coloração TUNEL. Os resultados demonstraram que H/R induzem apoptose de células H9C2 in vitro. O pré-tratamento com melatonina diminuiu a apoptose induzida por H/R de H9C2. Os resultados mostraram que a porcentagem de células apoptóticas foi obviamente maior no grupo H/R em comparação com o grupo controle, porém, que foi significativamente menor no grupo da melatonina do que o grupo H/R. PD98059 (Inibidor ERK1) reduziu o efeito da melatonina na prevenção da apoptose dos cardiomiócitos contra H/R (Figura 2).

A melatonina previne a apoptose das células H9C2 contra H/R via ERK1 in vitro. A apoptose foi avaliada por TUNEL de fluorescência. Imagens de coloração TUNEL representativas (A) e análise quantitativa em células H9C2 (B). bar = 50 µm. Todos os valores são apresentados como a média ± DP. n = 3. <sup>**</sup> p <0,01 vs. grupo controle; Sp < 0,05 vs. grupo H/R; <sup>#</sup>p < 0,05 vs. grupo H/R + Mel. (Controle: grupo de controle; H/R: grupo H/R; H/R + mel: grupo H/R + melatonina; H/R + mel + PD: grupo H/R + melatonina + PD98059)

A melatonina protege a organização de F-actina em células H9C2 contra H/R via ERK1

Investigamos a organização da F-actina em células H9C2 às 4h após a reoxigenação por coloração FITC de fluorescência de faloidina. Os cardiomiócitos de controle mostraram organização regular e bem definida da actina, enquanto os cardiomiócitos no grupo H/R apresentaram disposição de F-actina mais difusa e irregular. As diferenças podem ser visualizadas nos cardiomiócitos representativos. O pré-tratamento da melatonina melhorou a organização da actina F em cardiomiócitos em comparação com o grupo H/R, mas o PD98059 danificou a associação de F-actina pela inibição do efeito da melatonina (Figura 3).

A melatonina protege a organização da F-actina em células H9C2 contra H/R via ERK1 in vitro. Imagens representativas de microscopia confocal mostram células de H9C2 coradas com FITC-faloidina. Os resultados mostraram que a H/R simulada induziu disposição da actina mais difusa e irregular em comparação com o grupo controle. A melatonina preservou a organização de actina mais regular e bem definida e o PD98059 (inibidor ERK1) reduziu a proteção da melatonina. bar = 20 µm. (Controle: grupo de controle; H/R: grupo H/R; H/R + mel: grupo H/R + melatonina; H/R + mel + PD: grupo H/R + melatonina + PD98059)

A melatonina reduz a sobrecarga de Ca <sup>2+</sup> em cardiomiócitos contra H/R via ERK1

Às 4 horas após a reoxigenação, investigamos o efeito da melatonina sobre a sobrecarga de Ca2+ induzida por H/R em cardiomiócitos usando o corante fluorescente dependente de cálcio Fura-2. Os resultados mostraram que a fluorescência foi mais forte no grupo H/R do que no grupo controle, enquanto a fluorescência diminuiu no grupo da melatonina em comparação com o grupo H/R, o que indicou que H/R causou um aumento acentuado da concentração de Ca2+ citosólica e que o pré-tratamento de melatonina inibiu significativamente o aumento induzido por H/R da concentração de Ca2+ citosólica que foi reduzida por PD98059 (Figura 4).

A melatonina reduz a sobrecarga de Ca<sup>2+</sup> em células H9C2 contra H/R via ERK1 in vitro. O conteúdo de Ca<sup>2+</sup> foi avaliado utilizando Fura-2 / AM em células H9C2 incubadas em condições normais ou em condições de H / R simuladas, em condições de H / R simuladas, mais pré-tratamento com melatonina ou em condições simuladas de H/R mais pré-tratamento com melatonina e PD98059 (Inibidor de ERK1). A intensidade de fluorescência verde por Fura-2 foi obviamente mais forte no grupo H/R, e o pré-tratamento de melatonina reverteu a alteração que foi inibida pelo inibidor ERK1.bar = 30 µm. Todos os valores são apresentados como média ± DP. n = 3. <sup>**</sup> p < 0,01 vs. grupo controle; <sup>s</sup>p < 0,05 vs. grupo H/R; <sup>#</sup>p < 0,05 vs. grupo H / R + Mel. (Controle: grupo de controle; H/R: grupo H/R; H/R + mel: grupo H/R + melatonina; H/R + mel + PD: grupo H/R + melatonina + PD98059)

Melatonina modulou a expressão de IP3R e SERCA em cardiomiócitos contra H/R via ERK1

Às 4 horas após a reoxigenação, investigamos o efeito da melatonina na expressão de IP3R e SERCA em H9C2 por Western blot. Os resultados indicaram que H/R aumentam a expressão de IP3R e reduzem a expressão de SERCA, respectivamente. O pré-tratamento da melatonina inibiu a expressão de IP3R e induziu expressão de SERCA que foi revertida por PD98059. (Figura 5).

Expressão de SERCA e IP3R modulada por melatonina em células H9C2 contra H/R via ERK1 in vitro. Os resultados indicaram que a melatonina inibiu a expressão de IP3R e promoveu a expressão de SERCA que foi reduzida por PD98059. As imagens de Western blot representativas (A) e a análise quantitativa (B-C) mostraram o efeito da melatonina na expressão de IP3R e SERCA através da via ERK1 em células H9C2 contra H / R.bar = 30 µm. <sup>**</sup> p < 0,01 vs. grupo de controle; <sup>s</sup>p < 0,05 vs. grupo H/R; <sup>#</sup>p < 0,05 vs. grupo H/R + Mel. (Controle: grupo de controle; H/R: grupo H/R; H/R + mel: grupo H/R + melatonina; H/R + mel + PD: grupo H/R + melatonina + PD98059)

Melatonina modulou a expressão de IP3R e SERCA através da via ERK1 em corações de ratos reperfundidos

In vivo, investigamos o efeito da melatonina na expressão de IP3R e SERCA em corações de ratos reperfundidos. A expressão de IP3R foi maior no grupo I/R em comparação com o grupo controle, e a melatonina reverteu a mudança. Os resultados demonstraram que a expressão de SERCA foi menor no grupo I/R em comparação com o grupo controle, mas a expressão de SERCA foi maior no grupo da melatonina do que o grupo I/R. O pré-tratamento de PD98059 reduziu o efeito da melatonina na expressão de IP3R e SERCA em corações de rato contra I/R (Figura 6).

Expressão modulada de melatonina de IP3R e SERCA através da via ERK1 em corações de ratos reperfundidos. No miocárdio reperfundido, a expressão de IP3R e SERCA foi avaliada por coloração com imunofluorescência (A) e análise quantitativa (B-C). Os resultados mostraram que a intensidade de fluorescência do IP3R aumentou no grupo I/R mais do que no grupo controle, mas foi menor no grupo da melatonina em comparação com o grupo I/R. Pelo contrário, a melatonina aumentou a expressão de SERCA no miocardio reperfundido. Ambos os efeitos da melatonina na expressão de IP3R e SERCA foram inibidos pelo PD98059 (inibidor ERK1). bar = 30 µm. Todos os valores são apresentados como média ± DP. n = 5. <sup>*</sup> p < 0,05 versus grupo controle; <sup>s</sup>p < 0,05 versus grupo I/R; <sup>#</sup>p < 0,05 vs. grupo I/R + Mel. (Controle: grupo de controle; I/R: grupo I/R; I/R + mel: grupo I/R + melatonina; I/R + mel + PD: grupo I/R + melatonina + PD98059).

Discussão

A morte induzida por reperfusão de cardiomiócitos que eram viáveis no final do evento isquêmico é definida como lesão letal de reperfusão miocárdica (infarto de reperfusão).1,3,27 A existência de lesão letal de reperfusão miocárdica foi inferida em modelos experimentais de IM e em pacientes com STEMI (1). Os principais fatores contributivos para a morte induzida por reperfusão de cardiomiócitos incluem estresse oxidativo, sobrecarga de cálcio, abertura de poros de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) e hipercontractura.28,29 A sobrecarga de Ca2+ é um dos principais atores desta lesão de reperfusão letal,30 o que resulta em parte do retículo sarco / endoplasmático excessivo (RS/RE), liberação de Ca2+ e fluxo de Ca2+ através da membrana plasmática.31 Embora os receptores de rianodina (RyRs) sejam os principais canais cardíacos de liberação RS/RE Ca2+ envolvidos no acoplamento excitação-contração e lesão isquemia-reperfusão,32,33 alguns estudos relataram um papel crescente dos receptores de inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3R) e os canais de liberação de Ca2+ na modulação do acoplamento excitação-contração e a morte celular.22,23 Gomez et al.,34 indicaram que a inibição do complexo de canais IP3R Ca2+ limitou a liberação RS/RE Ca2+ e reduziu a sobrecarga de Ca2+ citosólica e mitocondrial e inibiu a subsequente abertura de PTP. Enquanto isso, o SERCA cardíaco é uma bomba chave responsável pelo regulação do cálcio intracelular e a contratilidade em células cardíacas. A recaptação de cálcio prejudicada resultante da diminuição da expressão e atividade do SERCA é uma marca registrada de IC.20 IP3R e SERCA têm confirmado desempenhar papéis importantes na manutenção da homeostase do cálcio intracelular em cardiomiócitos.20,22,23,35

A melatonina como um tipo de hormônio neuroendócrino é sintetizada principalmente pela glândula pineal.7,8 Estudos prévios mostraram que a melatonina tem importantes efeitos protetores contra a lesão por isquemia e reperfusão miocárdica.9-14 A administração de melatonina mostrou contribuir para a reabilitação da função contrátil no coração isolado durante a reperfusão e reduzir a sensibilidade da abertura de mPTP a Ca2+.36

A melatonina também demonstrou desempenhar um papel nas mudanças adaptativas mitocondriais.37 A melatonina e seus metabólitos interagem eficientemente com várias espécies reativas de oxigênio e nitrogênio reativo e, além disso, suprarregulam as enzimas antioxidantes e infrarregulam as enzimas pró-oxidantes.9,15,16 Estudos prévios confirmaram que o pré-tratamento da melatonina atenuou a lesão por IR reduzindo o dano oxidativo e inibindo a abertura do mPTP. No entanto, a evidência sobre o efeito da melatonina e o mecanismo subjacente à sobrecarga de Ca2+ sob isquemia / reperfusão aguda é rara.

O presente estudo demonstrou que a melatonina realiza cardioproteção através da modulação de IP3R e SERCA para manter a homeostase de cálcio via ERK1 em cardiomiócitos. A via ERK1 demonstrou ter efeito anti-apoptótico durante o processo de lesão de reperfusão.24,25 Não está claro se a melatonina mantém a homeostase de cálcio através da modulação de IP3R e SERCA via ERK1.

No presente estudo, os resultados mostraram que a melatonina promove a fosforilação de ERK1 em cardiomiócitos contra H/R, e que o pré-tratamento de PD98059 (inibidor de ERK1) reduziu a fosforilação de ERK1. Os resultados in vitro indicaram que a melatonina previne a apoptose dos cardiomiócitos contra H/R. No entanto, a melatonina pode preservar a estrutura dos cardiomiócitos contra lesões de reperfusão. Além disso, a sobrecarga de cálcio induzida por H / R é significativamente revertida pela melatonina. No entanto, o pré-tratamento de PD98059 inibiu o efeito da melatonina na apoptose, organização de actina F e na sobrecarga de cálcio em cardiomiócitos contra H/R. Para elucidar ainda mais o mecanismo subjacente do efeito protetor dos cardiomiócitos de melatonina contra H/R, observamos os efeitos da melatonina na expressão de IP3R e SERCA. Os resultados mostraram que a expressão de SERCA diminuiu no grupo H/R em comparação com o grupo controle, mas a melatonina promoveu a expressão de SERCA em cardiomiócitos. Ao contrário, H/R induz a expressão de IP3R, e a melatonina inibe a expressão de IP3R. O pré-tratamento de PD98059 reverteu o efeito da melatonina na expressão de IP3R e SERCA. In vivo, o nível de IP3R do miocárdio é reduzido e a expressão de SERCA é aumentada pelo pré-tratamento da melatonina, no entanto, o PD98059 reverteu o efeito da melatonina na expressão de IP3R e SERCA. A melatonina na dose utilizada no estudo não mostrou efeitos colaterais evidentes em comparação com outros grupos. Os resultados in vivo confirmaram ainda a melatonina para regular a expressão de IP3R e SERCA através da via ERK1. A partir dos resultados acima, é razoável inferir que a melatonina poderia proteger os cardiomiócitos contra a lesão por reperfusão, afetando a expressão de IP3R e SERCA para inibir a sobrecarga de cálcio através da via ERK1.

 Conclusão

A melatonina pode proteger os cardiomiócitos contra lesões de reperfusão através da modulação de IP3R e SERCA atenuando a sobrecarga de cálcio através da via ERK1. A homeostase de cálcio melhorada, seguida de função preservada e estrutura de cardiomiócitos, pode diminuir a apoptose dos cardiomiócitos e melhorar a função cardíaca. O presente estudo fornece mais evidências para o uso da melatonina para proteger a função cardíaca em pacientes com STEMI submetidos a terapia de reperfusão miocárdica.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pelo National Natural Science Foundation of China (Nº.81770237) e parcialmente financiado pelo China Postdoctoral Science Foundation.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Aprovação Ética e consentimento informado

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal do Chinese PLA General Hospital.