Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC Pw8jXxdhQLkrf9KDsFgJpRp S0066-782X2017001500579 10.5935/abc.20170176 Original Articles Cell Therapy Bone-Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSC) from Diabetic and Nondiabetic Rats Have Similar Therapeutic Potentials José Vitória Santório de São * Monnerat Gustavo * Guerra Barbara Paredes Bruno Dias Kasai-Brunswick Tais Hanae Carvalho Antonio Carlos Campos de Medei Emiliano Universidade Federal do Rio de Janeiro Rio de Janeiro RJ Brazil Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro, RJ - Brazil Universidade Federal do Rio de Janeiro Mailing Address: Gustavo Monnerat, Av. Carlos Chagas Filho, CCS, Bloco G sala G2-45. Postal Code 21941-590, 21941-590, Cidade Universitária, Rio de Janeiro, RJ - Brazil. Email: gmc@biof.ufrj.br, monnerat1988@gmail.com

Equal contribution

Author contributions

Conception and design of the research: José VSS, Monnerat G, Medei E; Acquisition of data, Analysis and interpretation of the data and Statistical analysis: José VSS, Monnerat G, Guerra B, Paredes BD, Kasai-Brunswick TH, Medei E; Obtaining financing: Carvalho ACC, Medei E; Writing of the manuscript: José VSS, Monnerat G, Carvalho ACC, Medei E; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Monnerat G, Carvalho ACC, Medei E.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 12 2017 109 6 579 589 23 01 2017 19 04 2017 28 04 2017 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited Abstract Background:

Diabetes mellitus is a severe chronic disease leading to systemic complications, including cardiovascular dysfunction. Previous cell therapy studies have obtained promising results with the use bone marrow mesenchymal stromal cells derived from healthy animals (MSCc) in diabetes animal models. However, the ability of MSC derived from diabetic rats to improve functional cardiac parameters is still unknown.

 Objectives:

To investigate whether bone-marrow-derived MSC from diabetic rats (MSCd) would contribute to recover metabolic and cardiac electrical properties in other diabetic rats.

 Methods:

Diabetes was induced in Wistar rats with streptozotocin. MSCs were characterized by flow cytometry, morphological analysis, and immunohistochemistry. Cardiac electrical function was analyzed using recordings of ventricular action potential. Differences between variables were considered significant when p < 0.05.

 Results:

In vitro properties of MSCc and MSCd were evaluated. Both cell types presented similar morphology, growth kinetics, and mesenchymal profile, and could differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. However, in an assay for fibroblast colony-forming units (CFU-F), MSCd formed more colonies than MSCc when cultured in expansion medium with or without hydrocortisone (1 µM). In order to compare the therapeutic potential of the cells, the animals were divided into four experimental groups: nondiabetic (CTRL), diabetic (DM), diabetic treated with MSCc (DM + MSCc), and diabetic treated with MSCd (DM + MSCd). The treated groups received a single injection of MSC 4 weeks after the development of diabetes. MSCc and MSCd controlled hyperglycemia and body weight loss and improved cardiac electrical remodeling in diabetic rats.

 Conclusions:

MSCd and MSCc have similar in vitro properties and therapeutic potential in a rat model of diabetes induced with streptozotocin.

 Keywords: Diabetes Mellitus Mesenchymal Stromal Cells Cardiac Electrophysiology Cell and Tissue-Based Therapy Rats Introduction

Diabetes mellitus is a metabolic disease mainly characterized by chronic hyperglycemia leading to several complications in different organs and systems.1 Despite insulin therapy, exercise programs, and nutritional interventions, most patients with diabetes are unable to maintain blood glucose levels within the normal range, resulting in pathological complications. Even though diabetes is a systemic disease, cardiac complications are the main cause of morbidity and mortality related to this condition. Over 75% of all deaths in patients with diabetes are caused by cardiovascular complications.2-4 In this context, diabetic cardiomyopathy leads to cardiac electrical abnormalities, including increased QT and QTc intervals and QT dispersion. Indeed, these proarrhythmic electrocardiographic abnormalities are triggered by a prolongation of the action potential (AP) duration as a consequence of the cardiac electrical remodeling that occurs in the disease.5-9

A small population of mononuclear bone marrow cells named mesenchymal stromal cells (MSC) is an attractive source of cells to treat diabetes and related cardiovascular complications.7,10,11 MSC have clonogenic potential12 and under specific culture conditions are able to differentiate into cells of various mesenchymal lineages such as osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.13,14 Additionally, MSC are multipotent stem cells with immunomodulatory properties able to regulate several physiological responses.15 Inflammation control is a potential therapeutic intervention for several autoimmune diseases, as well as sterile inflammatory processes such as diabetes.15-20

The mechanisms underlying the therapeutic effects of MSC are mainly due to their secretion of paracrine factors, stimulated by hyperglycemic and inflammatory microenvironments. Indeed, MSC have been described as secreting cardioprotective factors that may improve cardiac function.15,16,21-24 Additionally, the therapeutic potential of MSC in rescuing metabolic control in mice with diabetes has been demonstrated.25,26 A previous study from our group has shown that rats with diabetes transplanted with bone marrow MSC derived from healthy rats (MSCc) showed improved metabolic regulation and reversal of diabetes-induced cardiac electrical and mechanical abnormalities through systemic immunomodulation.7

Several studies have reported that bone marrow MSC derived from healthy donors are beneficial in the treatment of diabetes, based on the immunomodulatory and regenerative properties of these cells. However, the possibility of MSC autotransplantation would simplify the clinical application of this cell therapy in patients with diabetes, considering that autologous cell transplantation minimizes complications for the recipient such as rejection, immunosuppressive treatment, and transmission of infectious agents.

Based on this clinical perspective, the purpose of the present work was to verify whether the transplantation of bone marrow MSC from donor diabetic rats (MSCd) could contribute to recovering the metabolic and cardiac functions of other diabetic rats. In order to achieve that, a comparative study between MSCc and MSCd derived from rats was performed.

 Methods Animals and protocols

All animal procedures were carried out in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health [NIH], USA) and approved by our local institutional committee under the number IBCCF 217-09/16. In this study, 1-month-old male Wistar rats (100 ± 20 g) were housed under controlled temperature (23 ± 2ºC) with 12-hour light cycles and fed standard chow and water ad libitum. Diabetes was induced as described below. Four weeks after diabetes was established, the animals were divided into four experimental groups: (a) nondiabetic rats receiving only the vehicle (CTRL; n = 7); (b) diabetic rats receiving only the vehicle (DM; n = 7), (c) diabetic rats transplanted with bone marrow MSC derived from healthy rats (DM + MSCc; n = 7); and (4) diabetic rats transplanted with bone marrow MSC derived from other diabetic rats (DM + MSCd; n = 8). Both vehicle and cells were injected into the animals’ retroocular plexus. Body weight and blood glucose levels were measured weekly during 4 weeks after cell therapy in all four experimental groups. Figure 1 illustrates the study design.

Experimental study design. (A) Animals were treated with vehicle and streptozotocin (STZ) at week 0. Bone marrow cells were harvested on the 4th week for culture and in vitro analyses. (B) MSC therapy scheme. Diabetic animals (STZ) were divided into two groups: the first one received 5 x 106 cells from healthy rats (DM + MSCc) and the second received the same quantity of cells from diabetic rats (DM + MSCd) after 4 weeks of disease. The cells were injected into the animals’ retroocular plexus. Blood glucose levels and body weight were evaluated during 4 weeks after transplantation. At the end of the protocol, the animals were sacrificed, and their hearts were isolated for potential recording.

Diabetes induction and glucose measurement

Diabetes was induced with a single intravenous streptozotocin dose (Sigma-Aldrich, USA) 80 mg/kg diluted in citrate buffer (0.05 M) in anesthetized animals (isoflurane, Baker Norton, UK).7 Nondiabetic animals (CTRL group) received only the vehicle. At 72 hours after induction, the animals fasted for 5 hours during early morning and had their blood glucose levels measured. Only animals with glucose levels higher than 250 mg/dL were considered to have diabetes. Blood glucose levels were analyzed with a standard glucometer (Contour TS, Bayer HealthCare LLC, USA). The blood samples were obtained from the tail vein of unanesthetized animals.

 Mesenchymal stromal cell: isolation and culture

The animals were anesthetized and then sacrificed by cervical dislocation. Their legs were cleaned with alcohol 70%, and their tibial and femoral bones were isolated and centrifuged at 1,000 xg for 3 min at 4ºC for collection of marrow cells. The cell suspension was diluted in phosphate buffered saline (PBS) and centrifuged at 300 xg for 5 min at 4ºC. Pelleted cells were diluted in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and centrifuged in Histopaque gradient (1.083 g/mL, Sigma-Aldrich, USA) at 400 xg for 30 min. Mononuclear cells were collected from the interface and washed three times with PBS, and their viability was checked using 0.4 % trypan blue solution (Sigma-Aldrich). Finally, the cells were plated at a density of 1.2 x 106cells/cm2 and maintained at 37ºC in a 5% CO2 atmosphere. The medium (DMEM supplemented with 20% fetal bovine serum [Gibco-Invitrogen, USA] and penicillin G/streptomycin 1% [Gibco-Invitrogen]) was changed twice weekly, preserving only the adherent cells. When 80-90% confluence was reached, the adherent cells were detached from the culture plates with 0.25% trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich) and expanded at a density of 1.2 x 104 cells/cm2 until passage 3, as previously described.7

Immunophenotypic characterization

For the immunophenotypic analysis, third passage MSCc and MSCd were dissociated and suspended in blocking solution containing cold PBS supplemented with 0.5% bovine serum albumin (BSA). The cells were treated with rat Fc block (CD32, Cat#550271; BD Biosciences, San Jose, CA, USA) for 20 minutes before incubation with antibodies. The following antibodies conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), or biotin were used: CD29 (clone Ha2/5, Cat#555005, dilution 1:50; BD Biosciences), CD90-1 (clone OX-7, Cat#551401, dilution 1:25; BD Biosciences), CD45 (clone 30-F11, Cat#553077, dilution 1:50; BD Biosciences), and CD34 (clone RAM34, Cat#551387, dilution 1:50; BD Biosciences). The corresponding isotypes (BD Biosciences) were used as nonspecific binding controls. After incubation at 4ºC for 20 minutes, the cells were washed with PBS/0.5% BSA, centrifuged at 300 xg for 5 minutes, and suspended in PBS for data acquisition. DAPI 0.1 µg/mL (Cat# D9452, Sigma-Aldrich) was added to exclude dead cells. The samples were acquired in a BD FACSAria II flow cytometer (BD Biosciences) and the resulting data were analyzed using the software FlowJo, version 10.1.

 Adipogenic and osteogenic differentiation

Third passage MSCc (n = 3) and MSCd (n = 3) were plated in a 6-well plate at 3 x 104 cells per well. The media was changed twice a week, and no passages were made during the differentiation protocols. In order to induce adipogenic differentiation, the expansion medium was supplemented with dexamethasone 1 µM (Sigma-Aldrich), IBMX 0.5 mM (Sigma-Aldrich), insulin 10 µg/mL (Sigma-Aldrich), and indomethacin 200 µM (Vetec Química Fina, Duque de Caxias, RJ, Brazil). The cells were incubated at 37 ºC in a 5% CO2 atmosphere for 21 days and then fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes, while cytoplasmic lipid droplets were stained with 0.5% oil red O. Osteogenic differentiation was performed by culturing MSCc and MSCd in expansion medium supplemented with dexamethasone 1 µM (Sigma-Aldrich), β-glycerophosphate 10 mM (Sigma-Aldrich), and ascorbic acid 0.5 µM (Sigma-Aldrich) for 21 days. The cells were then fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes, and extracellular calcium deposits were stained after incubation with 1% alizarin red in water.

 Population doubling time (PDT)

For evaluation of growth kinetics, MSCc and MSCd (passage 3) were cultured in 35-mm cell culture dishes with a 2-mm grid (Sarstedt, Newton, NC, USA) at a density of 1.2 x 103 cells/cm2. The cells were maintained in expansion medium and incubated at 37ºC in a 5% CO2 atmosphere for 7 days. Four random grids were counted daily, and the mean number of cells per mm2 was calculated. The obtained values were used to build a cell/mm2 versus time curve. Linear regression was performed with base-2 logarithm transformation of the cell/mm2 axis, in which the inverse of the angular coefficient α was used to calculate the PDT.

 Fibroblast colony-forming units (CFU-F)

In order to perform this experiment, freshly isolated mononuclear cells derived from diabetic (MSCd; n = 3) and nondiabetic (MSCc; n = 3) rats were isolated and seeded into 6-well plates at a density of 2.08 x 105 cells/cm2 in each well. The cells were cultured in expansion medium with and without hydrocortisone 1 µM. After 16 days, the cells were fixed with methanol PA (Vetec Química Fina) for 5 minutes, and the number of colonies was counted manually after Giemsa (Merck, Darmstadt, Germany) staining.

 Cell therapy protocol

Diabetic rats were transplanted with 5 x 106 MSCc from healthy rats (DM + MSCc; n = 7) or 5 x 106 MSCd from diabetic rats (DM + MSCd; n = 8). The cells were transplanted into the retroocular plexus (200 L). Blood glucose levels and body weight were evaluated for 4 weeks after the transplantation. At the end of the protocol, the animals were sacrificed, and their hearts were isolated for AP recording. Control and diabetic rats received retroocular injections with the same volume of saline solution.

 Action potential recording

For AP recording, left ventricular cardiac muscle strips were obtained and pinned to the bottom of a Sylgard-coated tissue bath to expose the endocardial side. The strips were continuously perfused with oxygenated Tyrode solution at 37ºC. The composition of the Tyrode solution (mM) was: 150.8 NaCl, 5.4 KCl, 1.8 CaCl2, 1.0 MgCl2, 11.0 D-glucose, and 10.0 HEPES (pH 7.4 adjusted with NaOH at 37.0 ± 0.5ºC). The tissue was stimulated at a basic cycle length of 1,000 ms. The transmembrane potential was recorded using glass microelectrodes (10-40 MΩ DC resistance) filled with 2.7 M KCl, connected to a high input impedance microelectrode amplifier (MEZ7200, Nihon Kohden, Japan). Amplified signals were digitized (1440 Digidata A/D interface, Axon Instrument, Inc., Sunnyvale, USA) and stored in a computer for later analysis using the software LabChart, 7.3 (ADInstruments, Bella Vista, Australia). The following AP parameters were analyzed: resting membrane potential, AP amplitude (APA), and AP duration at 90% of repolarization (APD90), as previously described.27

Statistical analysis

Values are expressed as mean ± standard deviation (SD). For in vitro assays, comparisons between MSCc and MSCd were performed using unpaired Student’s t test, and for in vivo analysis, analysis of variance (ANOVA) was used, followed by the Bonferroni test for multiple comparisons. Data showing non-Gaussian distribution (Kolmogorov-Smirnov test) were compared by the Kruskal-Wallis test followed by Dunn’s multiple comparison test. Differences between variables were considered significant when p < 0.05. All analyses were performed using GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). The sample size was not predetermined with statistical methods and was estimated on the basis of sample availability and previous experimental cardiovascular studies using stem cell treatment.7

Results MSCc and MSCd morphology and surface phenotype

MSCc and MSCd adhered to plastic and presented a fibroblast-like morphology 3-4 days after being seeded onto culture flasks. Nonadherent cells seen on primary cultures were discarded with media changes. Figure 2A shows third passage MSCc and MSCd. The mesenchymal profile of MSCc and MSCd was evaluated by surface expression of key markers on third passage cells by flow cytometry. Both types of cells were positive for the MSC-related markers (CD29 and CD90, > 90%) and negative for hematopoietic markers (CD45 and CD34, ≤ 2.5%) (Figures 2B and 2C). MSCc and MSCd phenotypes were similar.

Characterization of MSC profile on third passage. (A) Similar fibroblast-like morphology of MSCc and MSCd 4 days after the cells were seeded onto culture dishes. (B) Flow cytometry analysis of MSC derived from healthy animals (MSCc) and (C) MSC derived from diabetic animals (MSCd). Color histograms showing high expression of mesenchymal surface proteins (CD29 and CD90) and low expression of hematopoietic markers (CD34 and CD45). The gray histograms represent the isotype controls.

Adipogenic and osteogenic differentiation

During the adipogenic differentiation process, lipid droplet formation was already observed in the first week (Figure 3A). Adipogenic differentiation remained for 21 days. During this period, the droplets showed increasing volume and number. At the end of the protocol, lipid-rich vacuoles were stained with oil red O.

Adipogenic and osteogenic differentiation assays. The adipogenic and osteogenic differentiation assays were performed during 21 days using MSCc and MSCd. We started the protocol with 60% confluence culture. (A) In the adipogenic assay, small lipid droplets were present in both MSCc and MSCd at day 7 and increased in volume and number on day 14. At day 21, the cultures were stained with oil red O, and the lipid droplets were stained in red. Both MSCc and MSCd differentiated into adipocytes at the end of the protocol. (B) In the osteogenic assay, we observed dramatic morphologic changes starting at day 7 in both MSCc and MSCd, accentuating at day 14. At day 21, the cultures were stained with alizarin red and the calcium deposits stained in red. Both MSCc and MSCd generated a mineralized matrix at the end of the protocol.

Osteogenic differentiation of both MSCc and MSCd also started during the first week (Figure 3B). Both experimental groups showed fast morphologic changes, which remained until 21 days later, at the end of the experiment. At 21 days after alizarin red staining, calcium deposits were observed, characterizing matrix mineralization.

As controls for both differentiation protocols, cultures of cells were obtained from diabetic and healthy animals and cultivated with expansion medium during the entire protocol and, as expected, showed no formation of lipid vacuoles or calcium deposits.

 Growth kinetics

In order to evaluate the growth kinetics of MSCc and MSCd, the cells were plated in dishes and observed until reaching 100% confluence on day 7. The proliferation rate was determined by daily monitoring of the culture dishes (Figure 4A). As shown in Figure 4B, MSC from both healthy and diabetic rats showed similar grow kinetic characteristics.

Growth kinetic evaluation by population doubling time (PDT) assay. (A) The number of MSC was counted daily (cells/mm<sup>2</sup>) after plating 104 cells at day zero for 7 days. (B) Linear regression of logarithmic cell growth (cells/mm<sup>2</sup>). There was no statistic difference between groups. The results are represented as mean ± standard deviation (SD). Abbreviations: MSCc - MSC derived from healthy animals; MSCd - MSC: derived from diabetic animals.

Clonogenic properties

In order to assess the capacity of colony formation of each group, CFU-F assays of MSCc and MSCd in DMEM/high in the presence and absence of hydrocortisone (1 µM) were performed. Both cell types were able to generate CFU-F under both conditions (Figures 5A and 5B). However, the number of colonies was greater in the cultures with medium supplemented with hydrocortisone in both experimental groups (Figure 5B). Additionally, MSCd formed more CFU-F than MSCc, regardless of the protocol used (Figures 5D and 5E).

Fibroblast colony-forming units (CFU-F) assay. (A) Representative photomicrographs of colonies from MSCc and MSCd obtained after CFU-F assay using two different conditions, with and without hydrocortisone. (B) Macroscopic view of CFU-F formation after cells were cultured with no hydrocortisone condition. MSCc formed fewer CFU-F colonies than did MSCd. (C) Macroscopic view of CFU-F formation after cells were cultured with a 1 <italic>μ</italic>M hydrocortisone condition. Once again, MSCc formed fewer CFU-F colonies than did MSCd. (D-E) Quantitative comparisons between the numbers of CFU-F colonies forming a greater number in MSCd than MSCc in both conditions. The results are represented as mean ± standard deviation (SD) and * represents p < 0.05.

Metabolic improvement after MSC transplantation

In order to assess the therapeutic potential of both cell types, 4 weeks after establishing the diabetic rat model, MSCc or MSCd (5 x 106 cells) were transplanted with a single injection into diabetic rats. MSCd and MSCc showed similar therapeutic potentials, with improvement of glucose levels (Figure 6A). In both cell-treated groups, blood glucose levels were lower than those in the placebo group but higher than those in rats without diabetes. Body weight loss in the diabetic groups was also partially rescued by both MSCc and MSCd transplantation (Figure 6B).

Metabolic profile after MSC transplantation. (A) Blood glucose levels were monitored during the 8 weeks of the protocol. Both cell types improved glucose levels compared with placebo but were unable to restore glucose levels to those of control animals. (B) Body weight improvement through the 60 days of the protocol. Both cell types were able to increase the animals’ body weight 30 days after cell injection when compared with placebo but were unable to restore their weights to those of control animals. Results are expressed as mean ± standard deviation (SD), *** represents p < 0.001 versus CTRL; # represents p < 0.05 versus DM and p < 0.01 versus CTRL.

MSCd improves the cardiac action potential profile

Previous results from our group have shown that MSCc transplantation was able to reverse diabetes-induced prolongation of the cardiac AP at 90% of repolarization.7 In the present study, we observed that MSCd transplantation was also able to reverse the AP prolongation at 90% of repolarization (Figures 7A and 7B).

MSCc and MSCd improved cardiac remodeling 4 weeks after MSC transplantation. (A) Representative action potential traces from left ventricle endocardial tissue for all experimental groups. (B) Action potential duration at 90% repolarization (APA90). (C) Resting membrane potential (RMP) and action potential amplitude (APA), respectively. Results are presented as mean ± standard deviation (SD) and *** represents p < 0.01 versus other groups.

Discussion

The potential of MSCc therapy in DM has been demonstrated by several groups, showing metabolic benefits such as improvements in blood glucose levels,21,25 renal function,28 neuropathy,29 microvascular complications,30 and cardiac function.7 However, most of these studies have used allogeneic MSC. Therefore, the use of autologous MSC from donors with diabetes should be performed to evaluate the effect on a diabetic animal model.

Our first goal was to determine how similar MSCc and MSCd were phenotypically and functionally by using in vitro analyses. Since both cell types could be isolated and cultivated, a full characterization was performed. These cells showed to be quite similar in several aspects, maintaining their morphological fibroblast-like shapes, mesenchymal profiles, growth kinetics, and differentiation capabilities, even at 4 weeks after diabetes induction. Aligned with our findings, previous studies have demonstrated that bone marrow MSC derived from healthy individuals compared with those derived from patients with diabetes share similar properties.31,32

Since changes in glucose levels could interfere with the clonogenic potential33 of the cells, CFU-F assays were performed. Our findings showed that cells derived from rats with diabetes had higher clonogenic potential than those derived from healthy ones. These data are in agreement with the results obtained in a previous study that demonstrated that the total number of CFU-F in diabetic male Wistar rats were higher compared with that in nondiabetic rats 4 weeks after diabetes establishment.34 Considering that the ability to generate clones correlates with the number of stem cells in the original sample, our data suggest that diabetic rats have a greater number of MSC than healthy rats.

The beneficial metabolic effects attributed to MSC therapy from healthy animals in a diabetic animal model have been well demonstrated by us and several other groups.7,22,25,35 Our findings show that MSC obtained from diabetic rats were also able to improve the metabolic profile of other diabetic rats, highlighting the therapeutic potential of these cells. As mentioned, the main causes of morbidity and mortality in patients with diabetes are cardiovascular complications.2-4 Thus, a previous study from our group aimed to investigate whether MSC from nondiabetic rats would reverse cardiac electrical changes induced by diabetes. The results obtained demonstrated that MSCc were able to improve diabetes-induced cardiac electrical abnormalities.7 In line with these results, the data presented here demonstrated that MSCd are also able to rescue cardiac AP properties impaired by the diabetic condition.

Even though the present study has a translational potential, some limitations must be considered. First, the animal model of type 1 diabetes used in this study does not exactly mimic the disease in humans. Second, the ion current contributing to ventricular repolarization in rats is different from that in humans. Third, the pathway used to deliver the vehicle in the present study (retroocular) would certainly not be appropriate for translational purposes.

 Conclusions

We characterized and showed several similarities between MSCc and MSCd derived from rats. Despite a superior clonogenic potential by MSCd, both cell types presented similar ability to restore blood glucose levels and body weight. In addition, both cells were able to reverse cardiac AP prolongation induced by diabetes. These combined in vivo and in vitro data demonstrate that MSC from diabetic animals can be an option for transplantation in diabetic animal models, indicating a potential application for humans as well.

Sources of Funding

This study was funded by CNPQ and FAPERJ.

Study Association

This article is part of the undergratuate thesis submitted by Vitória Santório de São José, from Instituto federal do Rio de Janeiro.

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Zhou JY Zhang Z Qian GS Mesenchymal stem cells to treat diabetic neuropathy: a long and strenuous way from bench to the clinic Cell Death Discov 11 07 2016 2 16055 10.1038/cddiscovery.2016.55. 30 Davey GC, Patil SB, O’Loughlin A, O’Brien T. Mesenchymal stem cell-based treatment for microvascular and secondary complications of diabetes mellitus. Front Endocrinol (Lausanne). 2014 Jun 6;5:86. doi: 10.3389/fendo.2014.00086. Davey GC Patil SB O’Loughlin A O’Brien T Mesenchymal stem cell-based treatment for microvascular and secondary complications of diabetes mellitus Front Endocrinol (Lausanne) 06 06 2014 5 86 10.3389/fendo.2014.00086. 31 Yaochite JN, de Lima KW, Caliari-Oliveira C, Palma PV, Couri CE, Simões BP, et al. Multipotent mesenchymal stromal cells from patients with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus exhibit preserved in vitro and in vivo immunomodulatory properties. Stem Cell Res Ther. 2016 Jan 18;7:14. doi: 10.1186/s13287-015-0261-4. Yaochite JN de Lima KW Caliari-Oliveira C Palma PV Couri CE Simões BP Multipotent mesenchymal stromal cells from patients with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus exhibit preserved in vitro and in vivo immunomodulatory properties Stem Cell Res Ther 18 01 2016 7 14 10.1186/s13287-015-0261-4. 32 Davies LC, Alm JJ, Heldring N, Moll G, Gavin C, Batsis I, et al. Type 1 Diabetes Mellitus donor mesenchymal stromal cells exhibit comparable potency to healthy controls in vitro. Stem Cells Transl Med. 2016;5(11):1485-1495. doi: 10.5966/sctm.2015-0272. Davies LC Alm JJ Heldring N Moll G Gavin C Batsis I Type 1 Diabetes Mellitus donor mesenchymal stromal cells exhibit comparable potency to healthy controls in vitro Stem Cells Transl Med 2016 5 11 1485 1495 10.5966/sctm.2015-0272. 33 Stolzing A, Bauer E, Scutt A. Suspension cultures of bone-marrow-derived mesenchymal stem cells: effects of donor age and glucose level. Stem Cells Dev. 2012;21(14):2718-23. doi: 10.1089/scd.2011.0406. Stolzing A Bauer E Scutt A Suspension cultures of bone-marrow-derived mesenchymal stem cells: effects of donor age and glucose level Stem Cells Dev 2012 21 14 2718 2723 10.1089/scd.2011.0406. 34 Stolzing A, Sellers D, Llewelyn O, Scutt A. Diabetes induced changes in rat mesenchymal stem cells. Cells Tissues Organs. 2010;191(6):453-65. doi: 10.1159/000281826. Stolzing A Sellers D Llewelyn O Scutt A Diabetes induced changes in rat mesenchymal stem cells Cells Tissues Organs 2010 191 6 453 465 10.1159/000281826. 35 Lee RH, Seo MJ, Reger RL, Spees JL, Pulin AA, Olson SD, et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(46):17438-43. doi: 10.1073/pnas.0608249103. Lee RH Seo MJ Reger RL Spees JL Pulin AA Olson SD Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice Proc Natl Acad Sci U S A 2006 103 46 17438 17443 10.1073/pnas.0608249103. Artigos Originais Terapia Celular Células Estromais Mesenquimais (CEM) Derivadas de Medula Óssea de Ratos com e sem Diabetes têm Potencial Terapêutico Similar José Vitória Santório de São 2 Monnerat Gustavo 2 Guerra Barbara 2 Paredes Bruno Dias 2 Kasai-Brunswick Tais Hanae 2 Carvalho Antonio Carlos Campos de 2 Medei Emiliano 2 Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro, RJ - Brazil Correspondência: Gustavo Monnerat, Av. Carlos Chagas Filho, CCS, Bloco G sala G2-45. CEP 21941-590, 21941-590, Cidade Universitária, Rio de Janeiro, RJ - Brasil. Email: gmc@biof.ufrj.br, monnerat1988@gmail.com

Equal contribution

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: José VSS, Monnerat G, Medei E; Obtenção de dados, Análise e interpretação dos dados, Análise estatística: José VSS, Monnerat G, Guerra B, Paredes BD, Kasai-Brunswick TH, Medei E; Obtenção de financiamento: Carvalho ACC, Medei E; Redação do manuscrito: José VSS, Monnerat G, Carvalho ACC, Medei E; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Monnerat G, Carvalho ACC, Medei E.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamentos:

O diabetes mellitus é uma doença crônica grave que leva a complicações sistêmicas, como a disfunção cardiovascular. Estudos anteriores de terapia celular obtiveram resultados promissores com utilização de células estromais mesenquimais (CEM) derivadas de medula óssea de animais saudáveis (CEMc) em modelos de animais diabéticos. No entanto, a capacidade das CEM derivadas de ratos diabéticos em melhorar parâmetros cardíacos funcionais é ainda desconhecida.

 Objetivos:

Investigar se CEM derivadas de medula óssea de ratos diabéticos (CEMd) poderiam contribuir para a recuperação metabólica e de propriedades elétricas cardíacas em outros ratos também com diabetes.

 Métodos:

O diabetes foi induzido em ratos Wistar com estreptozotocina. As CEM foram caracterizadas por citometria de fluxo, análise morfológica e imunohistoquímica. A função elétrica cardíaca foi analisada através de registro do potencial de ação ventricular. As diferenças entre as variáveis foram consideradas significativas quando p < 0,05.

 Resultados:

As propriedades in vitro das CEMc e CEMd foram avaliadas. Ambos os tipos celulares apresentaram morfologia, cinética de crescimento e perfil mesenquimal semelhante, e puderam ser diferenciadas em linhagens adipogênica e osteogênica. No entanto, em ensaios para unidades formadoras de colônias de fibroblastos (UFC-F), as CEMd formaram mais colônias em comparação às CEMc quando cultivadas em meio com ou sem hidrocortisona (1 µM). Para comparar o potencial terapêutico das células, os animais foram divididos em quatro grupos experimentais: não diabéticos (CTRL), diabéticos (DM), diabéticos tratados com CEMc (DM + CEMc) e diabéticos tratados com CEMd (DM + CEMd). Os grupos tratados receberam uma única injeção de CEM 4 semanas após o estabelecimento do diabetes. Ambas CEMc e CEMd controlaram a hiperglicemia e a perda de peso corporal e melhoraram o remodelamento elétrico cardíaco em ratos com diabetes.

 Conclusão:

As CEMd e CEMc possuem propriedades in vitro e potencial terapêutico semelhante em um modelo de rato com diabetes induzido por estreptozotocina. (Arq Bras Cardiol. 2017; 109(6):579-589)

 Palavras-chave: Diabetes Mellitus Células Mesenquimais Estromais Eletrofisiologia Cardíaca Terapia Baseada em Transplante de Células e Tecidos Ratos Introdução

O diabetes mellitus é uma doença metabólica caracterizada principalmente por hiperglicemia crônica, que ocasiona diversas complicações em diferentes órgãos e sistemas.1 Apesar de terapia com insulina, programas de exercício e intervenções nutricionais, a maioria dos pacientes com diabetes é incapaz de manter os níveis glicêmicos dentro da faixa normal, levando a complicações patológicas. Embora o diabetes seja uma doença sistêmica, as principais causas de morbidade e mortalidade relacionadas a esta condição são as complicações cardíacas. Mais de 75% de todas as mortes em pacientes com diabetes são causadas por complicações cardiovasculares.2-4 Neste contexto, a cardiomiopatia diabética ocasiona alterações elétricas cardíacas, incluindo aumento dos intervalos QT e QTc e dispersão do QT. De fato, estas anormalidades eletrocardiográficas pró-arrítmicas são desencadeadas por um prolongamento da duração do potencial de ação (AP) como consequência do remodelamento elétrico cardíaco que ocorre na doença.5-9

Uma pequena população de células mononucleares da medula óssea denominada células estromais mesenquimais (CEM) é uma fonte atraente de células para tratar o diabetes e suas complicações cardiovasculares.7,10,11 As CEM têm potencial clonogênico12 e sob condições específicas de cultura, são capazes de se diferenciar em células de diferentes linhagens mesenquimais como osteoblastos, condrócitos e adipócitos.13,14 Além disso, as CEM são células-tronco multipotentes com propriedades imunomoduladoras capazes de regular diversas respostas fisiológicas.15 O controle da inflamação é uma potente intervenção terapêutica para várias doenças autoimunes, bem como processos inflamatórios estéreis como o diabetes.15-20

Os mecanismos subjacentes aos efeitos terapêuticos das CEM são principalmente devidos à sua secreção de fatores parácrinos, estimulada por microambientes hiperglicêmicos e inflamatórios. Com efeito, as CEM têm sido descritas como secretoras de fatores cardioprotetores que podem melhorar a função cardíaca.15,16,21-24 Além disso, o potencial terapêutico das CEM na restauração do controle metabólico em ratos com diabetes já foi demonstrado.25,26 Um estudo prévio do nosso grupo demonstrou que ratos diabéticos transplantados com CEM de medula óssea de ratos sadios (CEMc) apresentou melhora da regulação metabólica e reversão de anormalidades elétricas e mecânicas cardíacas induzidas pelo diabetes através de imunomodulação sistêmica.7

Vários estudos têm relatado que as CEM de medula óssea derivadas de doadores saudáveis são benéficas no tratamento do diabetes, com base nas propriedades imunomoduladoras e regenerativas dessas células. No entanto, a possibilidade do autotransplante de CEM simplificaria a aplicação clínica desta terapia celular em pacientes com diabetes, considerando que o transplante de células autólogas minimiza complicações para o recipiente como a rejeição, tratamento imunossupressor e transmissão de agentes infecciosos.

Com base nesta perspectiva clínica, o objetivo do presente estudo foi verificar se o transplante de CEM de medula óssea de ratos doadores diabéticos (CEMd) poderia contribuir para a recuperação das funções metabólicas e cardíacas de outros ratos igualmente diabéticos. A fim de conseguir isso, um estudo comparativo entre CEMc e CEMd foi realizado em ratos.

 Métodos Animais e protocolos

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com o Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório (National Institutes of Health [NIH], EUA) e aprovado pelo nosso comitê institucional local sob o número de protocolo IBCCF 217-09/16. Neste estudo, ratos Wistar machos (100 ± 20 g) com 1 mês de idade foram alojados sob temperatura controlada (23 ± 2ºC) com ciclos luminosos de 12 horas e alimentados com ração padrão e água ad libitum. O diabetes foi induzido como descrito abaixo. Quatro semanas após o estabelecimento do diabetes, os animais foram divididos em quatro grupos experimentais: (A) ratos não diabéticos que receberam apenas o veículo (CTRL; n = 7), (b) ratos diabéticos que receberam apenas o veículo (DM; n = 7), (c) ratos diabéticos transplantados com CEM de medula óssea de animal saudável (DM + CEMc; n = 7) e (4) ratos diabéticos transplantados com CEM de medula óssea de outros ratos diabéticos (DM + CEMd; n = 8). O veículo e as células foram injetados no plexo retro-ocular dos animais. O peso corporal e os níveis glicêmicos foram medidos semanalmente durante 4 semanas após a terapia com as células em todos os quatro grupos experimentais. A Figura 1 ilustra o delineamento do estudo.

Delineamento do estudo experimental. (A) Os animais foram tratados com o veículo e estreptozotocina (STZ) na semana 0. Células da medula óssea foram coletadas na semana 4 para cultura e análises in vitro. (B) Esquema de terapia com CEM. Animais diabéticos (STZ) foram divididos em dois grupos: o primeiro recebeu 5 x 106 células de ratos sadios (DM + CEMc) e o segundo recebeu a mesma quantidade de células obtidas de ratos diabéticos (DM + CEMd) com 4 semanas de doença. As células foram injetadas no plexo retro-ocular dos animais. Os níveis de glicemia e o peso corporal foram avaliados durante 4 semanas após o transplante. Ao final do protocolo, os animais foram sacrificados e os corações foram isolados para gravação de potencial.

Indução do diabetes e medidas de glicose

O diabetes foi induzido com uma dose intravenosa única de estreptozotocina (Sigma-Aldrich, EUA) 80 mg/kg diluída em tampão citrato (0,05 M) administrada a animais anestesiados (isoflurano, Baker Norton, Reino Unido).7 Animais não diabéticos (grupo CTRL) receberam apenas o veículo. Após 72 horas da indução anestésica, os animais foram mantidos em jejum por 5 horas durante o início da manhã e tiveram seus níveis glicêmicos medidos. Apenas animais com glicemia acima de 250 mg/dL foram considerados diabéticos. Os níveis glicêmicos foram analisados com um glicosímetro padrão (Contour TS, Bayer Healthcare LLC, EUA). As amostras de sangue foram obtidas a partir da veia da cauda de animais não anestesiados.

 Células estromais mesenquimais: isolamento e cultura

Os animais foram anestesiados e sacrificados por deslocamento cervical. As pernas dos animais foram limpas com álcool a 70% e as tíbias e fêmures foram isolados e centrifugados a 1.000 xg por 3 min a 4ºC para coleta de células da medula óssea. A suspensão de células foi diluída em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e centrifugada a 300 xg por 5 min a 4ºC. Os grupamentos celulares foram diluídos em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco-Invitrogen, EUA) e centrifugados em gradiente Histopaque (1,083 g/mL, Sigma-Aldrich, EUA) a 400 xg por 30 minutos. As células mononucleares foram coletadas da interface e lavadas três vezes em PBS e suas viabilidades foram verificadas com utilização de solução de azul de tripano a 0,4% (Sigma-Aldrich). Por fim, as células foram plaqueadas a uma densidade de 1,2 x 106 células/cm2e mantidas a 37ºC em uma atmosfera de CO2 de 5%. O meio (DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino [Gibco-Invitrogen, EUA] e penicilina G/estreptomicina 1% [Gibco-Invitrogen]) foi mudado duas vezes por semana, preservando apenas as células aderentes. Quando 80-90% de confluência foi alcançada, as células aderentes foram destacadas das placas de cultura com tripsina-EDTA 0,25% (Sigma-Aldrich) e expandidas a uma densidade de 1,2 x 104 células/cm2 até a terceira passagem, como descrito anteriormente.7

Caracterização imunofenotípica

Para a análise imunofenotípica, CEMc e CEMd em terceira passagem foram dissociadas e suspensas em solução bloqueadora contendo PBS gelado suplementado com albumina de soro bovino (BSA) a 0,5%. As células foram tratadas com Fc Block (Cat#550271; BD Biosciences, EUA) durante 20 minutos antes da incubação com anticorpos. Os seguintes anticorpos conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), ou biotina foram utilizados: CD29 (clone Ha2/5, Cat#555005, diluição 1:50; BD Biosciences), CD90-1 (clone OX-7, Cat#551401, diluição 1:25; BD Biosciences), CD45 (clone 30-F11, Cat#553077, diluição 1:50; BD Biosciences) e CD34 (clone RAM34, Cat#551387, diluição 1:50; BD Biosciences). Os isotipos correspondentes (BD Biosciences) foram utilizados como controles de ligação não específica. Após incubação a 4ºC durante 20 minutos, as células foram lavadas com PBS / 0,5% BSA, centrifugadas a 300 xg por 5 minutos e suspensas em PBS para aquisição de dados. DAPI 0,1 µg/mL (Cat# D9452, Sigma-Aldrich) foi adicionado para excluir células mortas. As amostras foram obtidas com citometria de fluxo BD FACSAria II (BD Biosciences) e os dados obtidos foram analisados com o programa FlowJo, versão 10.1.

 Diferenciação adipogênica e osteogênica

CEMc (n = 3) e CEMd (n = 3) em terceira passagem foram plaqueadas em uma placa de seis poços a 3 x 104 células por poço. O meio foi alterado duas vezes por semana e nenhuma passagem foi realizada durante os protocolos de diferenciação. Para a diferenciação adipogênica, o meio de cultivo foi suplementado com dexametasona 1 µM (Sigma-Aldrich), IBMX 0,5 mM (Sigma-Aldrich), insulina 10 µg/mL (Sigma-Aldrich) e indometacina 200 µM (Vetec Química Fina, Brasil). As células foram incubadas a 37ºC em uma atmosfera de CO2 a 5% por 21 dias e em seguida fixadas com paraformaldeído a 4% por 15 minutos, enquanto as gotículas de lipídeos citoplasmáticos foram coradas com óleo vermelho O a 0,5%. A diferenciação osteogênica foi realizada com cultura de CEMc e CEMd em meio de cultivo suplementado com dexametasona 1 µM (Sigma-Aldrich), b-glicerofosfato 10 mM (Sigma-Aldrich) e ácido ascórbico 0,5 µM (Sigma-Aldrich) por 21 dias. As células foram então fixadas com paraformaldeído a 4% por 15 minutos e depósitos de cálcio extracelular foram corados após incubação com vermelho de alizarina a 1% em água.

 Tempo de duplicação da população (TDP)

Para avaliação da cinética de crescimento, CEMc e CEMd (passagem 3) foram cultivadas em pratos para cultura celular de 35 mm com uma grade de 2 mm (Sarstedt, EUA) a uma densidade de 1,2 x 103 células/cm2. As células foram mantidas em meio de cultivo e incubadas a 37ºC em uma atmosfera de CO2 a 5% por 7 dias. Quatro grades aleatórias foram contadas diariamente e o número médio de células por mm2 foi calculado. Os valores obtidos foram utilizados para construir uma curva de célula/mm2 versus tempo. Foi realizada regressão linear com transformação logarítmica na base 2 do eixo célula/mm2, no qual o inverso do coeficiente angular a foi utilizado para calcular a TDP.

 Unidades formadoras de colônias de fibroblastos (UFC-F)

A fim de realizar este experimento, células mononucleares recentemente isoladas derivadas de ratos diabéticos (CEMd; n = 3) e não diabéticos (CEMc; n = 3) foram isoladas e plaqueadas em placas de seis poços a uma densidade de 2,08 x 105 células/cm2 em cada poço. As células foram cultivadas em meio de cultivo suplementado ou não com hidrocortisona 1 µM. Após 16 dias, as células foram fixadas com metanol PA (Vetec Química Fina) por 5 minutos e as colônias foram contadas manualmente após coloração com Giemsa (Merck, Alemanha).

 Protocolo de terapia celular

Ratos diabéticos foram transplantados com 5 x 106 CEMc de ratos sadios (DM + CEMc; n = 7) ou 5 x 106 CEMd de ratos diabéticos (DM + CEMd; n = 8). As células foram transplantadas através do plexo retro-ocular (200 µL). Os níveis glicêmicos e o peso corporal foram avaliados por 4 semanas após o transplante. Ao final do protocolo, os animais foram sacrificados e os corações foram isolados para gravação do AP. Ratos controles e diabéticos receberam injeções retro-oculares com o mesmo volume de solução salina.

 Gravação do potencial de ação

Para a gravação do AP, tiras de músculo cardíaco do ventrículo esquerdo foram obtidas e presas à parte inferior do banho do tecido, revestido com Sylgard para exposição do lado endocárdico. As tiras foram continuamente perfundidas com solução de Tyrode oxigenada a 37ºC. A composição da solução de Tyrode (mM) era: NaCl 150,8, KCl 5,4, CaCl2 1,8, MgCl2 1,0, D-glucose 11,0 e HEPES 10,0 (pH 7,4 ajustado com NaOH a 37,0 ± 0,5ºC). O tecido foi estimulado a um ciclo básico com duração de 1.000 ms. O potencial transmembrana foi gravado com microeletrodos de vidro (10-40 MΩ resistência DC) preenchidos com 2,7 M KCl, conectados a um amplificador de microeletrodo com entrada de alta impedância (MEZ7200, Nihon Kohden, Japão). Sinais amplificados foram digitalizados (1440 Digidata A/D interface, Axon Instrument, Inc., Sunnyvale, EUA) e armazenados em um computador para posterior análise com o programa LabChart, 7.3 (ADInstruments, Bella Vista, Austrália). Os seguintes parâmetros de AP foram analisados: potencial de repouso de membrana, amplitude (APA) e duração do AP a 90% de repolarização (APD90), conforme descrito previamente.27

Análise estatística

Os valores estão expressos como média ± desvio padrão (DP). Para os ensaios in vitro, comparações entre CEMc e CEMd foram realizadas com o teste t de Student não pareado e para análises in vivo, foi utilizada análise de variância (ANOVA), seguida do teste de Bonferroni para comparações múltiplas. Dados com distribuição não Gaussiana (teste de Kolmogorov-Smirnov) foram comparados com o teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de comparações múltiplas de Dunn. As diferenças entre as variáveis foram consideradas significativas quando p < 0,05. Todas as análises foram realizadas com o programa GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). O tamanho da amostra não foi predeterminado com métodos estatísticos e foi estimado com base na disponibilidade de amostras e estudos cardiovasculares experimentais prévios utilizando tratamento com células-tronco.7

Resultados Morfologia e fenótipo de superfície das CEMc e CEMd

As CEMc e CEMd aderiram a plástico e apresentaram uma morfologia semelhante à do fibroblasto 3 a 4 dias após serem semeadas em frascos de cultura. Células não aderentes observadas nas culturas primárias foram descartadas com as trocas de meio. A Figura 2A mostra CEMc e CEMd em terceira passagem. O perfil mesenquimal das CEMc e CEMd foi avaliado pela expressão de marcadores-chave na superfície de células de terceira passagem por citometria de fluxo. Ambos os tipos celulares foram positivos para os marcadores associados às CEM (CD29 e CD90, > 90%) e negativos para os marcadores hematopoiéticos (CD45 e CD34, ≤ 2,5%) (Figuras 2B e 2C). Os fenótipos das células CEMc e CEMd foram semelhantes.

Caracterização do perfil de CEM na terceira passagem. (A) CEMc e CEMd com morfologia semelhante à de fibroblastos 4 dias após as células serem semeadas em pratos de cultura. (B) Análise de citometria de fluxo de CEM derivadas de animais saudáveis (CEMc) e (C) CEM derivadas de animais diabéticos (CEMd). Histogramas coloridos mostrando a alta expressão de proteínas de superfície mesenquimais (CD29 e CD90) e baixa expressão de marcadores hematopoiéticos (CD34 e CD45). Os histogramas cinzas representam os isotipos controles.

Diferenciação adipogênica e osteogênica

Durante o processo de diferenciação adipogênica, a formação de gotículas lipídicas foi observada já na primeira semana (Figura 3A). A diferenciação adipogênica permaneceu por 21 dias. Durante este período, as gotículas aumentaram de volume e em número. Ao final do protocolo, vacúolos ricos em lipídeos foram corados com óleo vermelho O.

Ensaios de diferenciação adipogênica e osteogênica. Os ensaios de diferenciação adipogênica e osteogênica foram realizados durante 21 dias com utilização de CEMc e CEMd. O protocolo foi iniciado com 60% de confluência da cultura. (A) No ensaio adipogênico, pequenas gotículas de lipídeos estavam presentes tanto nas CEMc quanto nas CEMd no dia 7 e aumentaram de volume e em número no dia 14. No dia 21, as culturas foram coradas com óleo vermelho O e as gotículas de lipídeos foram coradas em vermelho. Tanto as CEMc quanto as CEMd se diferenciaram em adipócitos ao final do protocolo. (B) No ensaio osteogênico, observamos dramáticas mudanças morfológicas começando no dia 7 em ambas as CEMc e CEMd, com acentuação no dia 14. No dia 21, as culturas foram coradas com vermelho de alizarina e os depósitos de cálcio coraram em vermelho. Tanto as CEMc quanto as CEMd geraram uma matriz mineralizada ao final do protocolo.

A diferenciação osteogênica das CEMc e CEMd também iniciou durante a primeira semana (Figura 3B). Ambos os grupos experimentais mostraram mudanças morfológicas rápidas que permaneceram por 21 dias, até o final do experimento. Aos 21 dias, depósitos de cálcio foram observados após coloração com vermelho de alizarina, caracterizando mineralização da matriz.

Como controles para ambos os protocolos de diferenciação, culturas de células obtidas a partir de animais diabéticos e saudáveis foram cultivadas durante todo o protocolo com meio de cultivo e, como esperado, não mostraram formação de vacúolos lipídicos ou depósitos de cálcio.

 Cinética de crescimento

A fim de avaliar a cinética de crescimento das CEMc e CEMd, as células foram plaqueadas em pratos e observadas até chegarem a 100% de confluência no dia 7. A taxa de proliferação foi determinada por monitorização diária dos pratos de cultura (Figura 4A). Como mostra a Figura 4B, CEM de ratos diabéticos e saudáveis apresentaram características cinéticas de crescimento semelhantes.

Avaliação da cinética de crescimento por ensaio de tempo de duplicação da população (TDP). (A) O número de CEM foi calculado diariamente (células/mm<sup>2</sup>) após plaqueamento de 104 células no dia zero por 7 dias. (B) Regressão linear do logaritmo do crescimento celular (células/mm<sup>2</sup>). Não houve diferença estatística entre os grupos. Os resultados estão representados como média ± desvio padrão (DP). Abreviaturas: CEMc - CEM derivadas de animais saudáveis; CEMd - CEM derivadas de animais diabéticos.

Propriedades clonogênicas

A fim de avaliar a capacidade das CEMc e CEMd em formar colônias, foram realizados ensaios para UFC-F em DMEM/alta glicose na presença e ausência de hidrocortisona (1 µM). Ambos os tipos celulares foram capazes de gerar UFC-F sob ambas as condições (Figuras 5A e 5B). No entanto, o número de colônias foi maior nas culturas com meios suplementados com hidrocortisona em ambos os grupos experimentais (Figura 5B). Além disso, as CEMd formaram mais UFC-F do que as CEMc, independente do protocolo aplicado (Figuras 5D e 5E).

Ensaio de unidades formadoras de colônias de fibroblastos (UFC-F). (A) Fotomicrografias representativas das colônias de CEMc e CEMd obtidas após ensaio de UFC-F com utilização de duas condições diferentes, com e sem hidrocortisona. (B) Vista macroscópica da formação de UFC-F após as células serem cultivadas na ausência da condição com hidrocortisona. As CEMc formaram menos colônias UFC-F do que as CEMd. (C) Vista macroscópica da formação de UFC-F após as células serem cultivadas na presença da condição com hidrocortisona 1 <italic>μ</italic>M. As CEMc novamente formaram menos colônias UFC-F do que as CEMd. (D-E) Comparações quantitativas entre os números de colônias UFC-F com formação de maior número nas CEMd do que nas CEMc em ambas as condições. Os resultados estão representados como média ± desvio padrão (DP) e * representa p < 0,05.

Melhora metabólica após transplante de CEM

A fim de avaliar o potencial terapêutico de ambos os tipos celulares, 4 semanas após o estabelecimento do modelo de ratos diabéticos, CEMc ou CEMd (5 x 106 células) foram transplantadas com uma única injeção em ratos diabéticos. As CEMd apresentaram potencial terapêutico semelhante às CEMc, com melhora dos níveis de glicose (Figura 6A). Em ambos os grupos tratados com células, os níveis de glicemia foram mais baixos do que os observados no grupo placebo, porém mais altos do que nos ratos sem diabetes. A perda de peso corporal nos grupos de diabéticos foi também parcialmente resgatada pelo transplante de CEMc e CEMd (Figura 6B).

Perfil metabólico após transplante de CEM. (A) Os níveis de glicemia foram monitorados durante as 8 semanas do protocolo. Ambos os tipos celulares melhoraram os níveis de glicose em comparação com placebo, mas foram incapazes de restaurar os níveis de glicose para os níveis observados nos animais do grupo controle. (B) Melhora do peso corporal durante os 60 dias do protocolo. Ambos os tipos celulares foram capazes de aumentar o peso corporal dos animais 30 dias após a injeção das células quando comparados com placebo, mas foram incapazes de restaurar seus pesos até os níveis dos animais do grupo controle. Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão (DP), *** representa p < 0,001 versus CTRL; # representa p < 0,05 versus DM e p < 0,01 versus CTRL.

CEMd melhoram o perfil do potencial de ação cardíaco

Resultados prévios obtidos pelo nosso grupo mostraram que o transplante de CEMc foi capaz de reverter o prolongamento do AP cardíaco a 90% de repolarização induzido pelo diabetes.7 No presente estudo, observamos que o transplante com CEMd foi também capaz de reverter o prolongamento do AP a 90% de repolarização (Figuras 7A e 7B).

CEMc e CEMd melhoraram o remodelamento cardíaco 4 semanas após o transplante de CEM. (A) Traçados do potencial de ação de tecido endocárdico do ventrículo esquerdo representativos de todos os grupos experimentais. (B) Duração do potencial a 90% de repolarização (APA90). (C) Potencial de repouso da membrana (RMP) e amplitude do potencial de ação (APA), respectivamente. Os resultados estão apresentados como média ± desvio padrão (DP) e *** representa p < 0,01 versus outros grupos.

Discussão

O potencial da terapia com CEMc no diabetes tem sido demonstrado por vários grupos, indicando benefícios metabólicos tais como melhora nos níveis de glicemia,21,25 função renal,28 neuropatia,29 complicações microvasculares30 e função cardíaca.7 No entanto, a maioria destes estudos utilizou CEM alogênico. Consequentemente, a utilização de CEM autólogas obtidas de doadores com diabetes deve ser realizada para a avaliação do efeito em um modelo diabético animal.

O nosso primeiro objetivo foi determinar o grau de semelhança fenotípica e funcional entre as CEMc e CEMd através de análises in vitro. Uma vez que ambos os tipos celulares puderam ser isolados e cultivados, uma caracterização completa foi realizada. Estas células mostraram ser muito semelhantes em vários aspectos, mantendo uma forma morfológica semelhante à do fibroblasto, perfis mesenquimais, cinética de crescimento e capacidade de diferenciação mesmo após 4 semanas da indução do diabetes. Alinhados com os nossos achados, estudos anteriores demonstraram que CEM derivadas de medula óssea humana de pacientes saudáveis têm propriedades semelhantes às derivadas de pacientes com diabetes.31,32

Uma vez que as alterações dos níveis de glicose podem interferir com o potencial clonogênico33 das células, foram realizados ensaios para UFC-F. Os resultados mostraram que as células derivadas de animais com diabetes apresentaram maior potencial clonogênico do que as derivadas de animais saudáveis. Esses dados estão de acordo com os resultados obtidos em um estudo anterior no qual os autores demonstraram que o número total de UFC-F em ratos Wistar diabéticos machos foi mais elevado quando comparado ao de ratos não diabéticos 4 semanas após o estabelecimento do diabetes.34 Considerando que a habilidade de gerar clones se correlaciona com a quantidade de células-tronco na amostra original, nossos dados sugerem que ratos diabéticos têm um maior número de CEM do que ratos saudáveis.

Os efeitos metabólicos benéficos atribuídos à terapia com CEM de animais saudáveis em um modelo animal diabético foram bem demonstrados pelo nosso e vários outros grupos.7,22,25,35 Nossos achados mostram que as CEM obtidas de ratos diabéticos também foram capazes de melhorar o perfil metabólico de outros ratos diabéticos, destacando o potencial terapêutico dessas células. Como mencionado, as principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes com diabetes são as complicações cardiovasculares.2-4 Assim, um estudo prévio do nosso grupo teve o objetivo de investigar se as CEM de ratos não diabéticos reverteriam as alterações elétricas cardíacas induzidas pelo diabetes. Os resultados obtidos demonstraram que as CEMc foram capazes de melhorar os distúrbios elétricos cardíacos induzidos pelo diabetes.7 Alinhados com estes resultados, os dados apresentados aqui demonstraram que as CEMd também são capazes de resgatar as propriedades do potencial de ação cardíaco comprometido pela condição diabética.

Embora o presente estudo tenha potencial translacional, algumas limitações devem ser consideradas. Em primeiro lugar, o modelo animal de diabetes tipo 1 utilizado neste estudo não mimetiza exatamente a doença que ocorre em humanos. Segundo, a corrente de íons que contribui com a repolarização ventricular em ratos é diferente da presente em humanos. Terceiro, a via utilizada para injetar o veículo no presente estudo (retro-ocular) certamente não seria apropriada para fins translacionais.

 Conclusões

Nós caracterizamos e demonstramos várias semelhanças entre CEMc e CEMd de ratos. Apesar das CEMd terem um potencial clonogênico superior, ambos os tipos celulares apresentaram capacidade de restaurar os níveis de glicemia e o peso corporal. Além disso, ambas as células foram capazes de reverter o prolongamento do AP cardíaco induzido pelo diabetes. Os dados in vivo e in vitro combinados demonstram que CEM de animais diabéticos podem ser uma opção para transplante em modelos animais diabéticos, indicando uma potencial aplicação também em humanos.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pelo CNPq e FAPERJ.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de Conclusão de graduação de Vitória Santório de São José pelo Instituto federal do Rio de Janeiro.